JP5837891B2 - 感染性インフルエンザウイルスの発生のためのトランスフェクションシステム - Google Patents

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Description

本明細書は、本明細書に参照により全体として組み込まれている２０００年４月２８日に本願の米国仮出願第６０／２００，６７９号の特典を請求するものである。
本発明につながった研究は、国立アレルギー・感染研究所からの公衆衛生研究補助金ＡＩ９５３５７、ＡＩ２９６８０、ＡＩ０８８３１、ＡＩ２９５５９およびＡＩ２９６８０の支援によった。したがって、米国政府は本発明における一定の権利を有する。
本発明は、クローン化ＤＮＡから感染性ＲＮＡウイルス、好ましくはインフルエンザウイルスを発生させるための最少のプラスミドに基づくシステムの開発に関する。特に、この多プラスミドＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩシステムは、組換えおよび再構築ウイルスの発生を促進する。好ましい実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスを発生させるための８プラスミドＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩシステムを含む。本発明はまた、クローン化ｃＤＮＡからの他のＲＮＡウイルスを完全に回収するという点における適用可能性を有する。
ＲＮＡウイルスの生活環
ＲＮＡウイルスのゲノムは、単一分子またはセグメント化分子、（＋）または（−）極性の１本鎖もしくは２本鎖などの種々のコンホメーションを有している。しかし、次の２つの本質的で、一般的な要件がウイルスの間に共有されている。（１）ゲノムＲＮＡは、子孫ウイルス粒子へのアセンブリーに効果的に使用することができる形態に効率よくコピーされなければならず、（２）ウイルスタンパク質に効率よく翻訳することができるｍＲＮＡが合成されなければならない。一般的に、ＲＮＡウイルス（レトロウイルスを除く）は、新たなゲノムＲＮＡ（子孫へのアセンブリーのため）およびｍＲＮＡ（ウイルスタンパク質への翻訳のため）の合成を触媒するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードかつ／または保有する。真核宿主細胞は一般的に、ＲＮＡ鋳型を複製する、あるいはマイナス鎖または２本鎖ＲＮＡ鋳型からポリペプチドを翻訳する機構を含んでいないので、ゲノム内にこれらの核酸を含むウイルスは、ウイルス粒子中にＲＮＡポリメラーゼタンパク質を保有しなければならない。このような理由から、マイナス鎖または２本鎖ＲＮＡウイルスの脱タンパク質ＲＮＡ分子（関連ＲＮＡポリメラーゼを欠いている）は、非感染性である。これと対照的に、プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムからの脱タンパク質ＲＮＡは、一般的に、コードされたウイルスタンパク質が宿主細胞の機構により翻訳されるので、感染性である。
ウイルスが伝播するためには、ゲノムウイルスＲＮＡがウイルス粒子内にパッケージングされていなければならない。あるＲＮＡウイルスのキャプシドは感染宿主細胞からの脂質膜によって包まれており、また、あるＲＮＡウイルスは脂質二重層のない外側ウイルスタンパク質殻を有している。これらのようなウイルスキャプシドの差異があるにもかかわらず、子孫ウイルス粒子がアセンブルされる過程およびアセンブリー中に起こるタンパク質／タンパク質相互作用は同様である。ウイルスタンパク質は、一般的に構造タンパク質と非構造タンパク質とに分類されている。一般的に、非構造タンパク質は、ゲノム複製、転写の調節およびゲノムパッケージングに関与している。構造タンパク質は一般的に、次の３種類の機能を果たしている。（１）ゲノムＲＮＡに結合する（すなわち、インフルエンザＡ型ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質）、（２）パッケージングされたＲＮＡと外層タンパク質との間を架橋する（すなわち、マトリックスタンパク質）（３）ウイルス外層を構築する（すなわち、赤血球凝集素のような表面タンパク質）。ウイルス粒子内へのアセンブリーにより、１つの宿主生物内または異なる宿主生物間の１つの宿主細胞から他の宿主細胞へのＲＮＡゲノムの効果的な伝播が保証される。
インフルエンザウイルス
オルトミクソウイルスであるインフルエンザＡ型ウイルスは、マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、セグメント化されたゲノムを有する。ゲノムＲＮＡは、５’および３’末端における非コーディング配列が両端に隣接する１つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む（デッセルベルガーら（Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｅ １９８０年、第８巻、３１５ページ）。ウイルスＲＮＡは、ビリオン中および感染細胞中でウイルス核タンパク質（ＮＰ）およびポリメラーゼタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）と結合して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する（シューら（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９８７年、８４巻、８１４０ページ）。その遺伝組成は、このウイルスが異なる株からの遺伝子セグメントの再構築によって発生することを可能にする。この再構築によって、新たに感染した生物が既往免疫応答を示さない新たな変異株が生ずる。水鳥において循環するインフルエンザの１５種の赤血球凝集素（ＨＡ）および９種のノイラミニダーゼ（ＮＡ）サブタイプのうち、３種、すなわち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２サブタイプがヒトにおける汎流行病を引き起こしたことが知られている（ウェブスターら（Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２年、第５６巻、１５２ページ）。ヒトで病原性の新しい株を発生させるための中間宿主（「混合容器」）としてブタを使用できることが示されている（ショルティセクら（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８５年、第１４７巻、２８７ページ）。１９９７年に香港でＨ５Ｎ１インフルエンザＡが大発生したことから、高度病原性インフルエンザＡ型ウイルスがトリ種から直接にヒトに伝播する可能性もあることがわかる（クラースら（Ｃｌａａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｌａｎｃｅｔ １９９８年、第３５１巻、４７２ページ；スアレツら（Ｓｕａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８年、第７２巻、６６７８ページ；スバラオら（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８年、第２７９巻、３９３ページ；ショートリッジ（Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ）、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９９年、第１７巻（増刊）、Ｓ２６−Ｓ２９ページ）。インフルエンザＡ型ウイルスが天然貯蔵庫における莫大な数の循環株から新たな病原性株を発生させる能力があることから、疾患のコントロールには、これらのウイルスをモニターすることと、進歩した抗ウイルス療法とワクチンを開発する必要があることがわかる。新株が発生する速度に対応するには、モニタリング努力の監視が必要であり、流行病または汎流行病を予防するために新たに同定された病原性株に対する十分な量のワクチンが生産できるように現行の技術を改良する必要がある。
インフルエンザＡ型ウイルスについては、逆遺伝学システムにより、ウイルスゲノムの操作が可能になった（パレセら（Ｐａｌｅｓｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９６年、第９３巻、１１３５４ページ；ニューマンおよびカワオカ（Ｎｅｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ）、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．１９９９年、第５３巻、２６５ページ）。プラス鎖ウイルス（すなわち、ポリオウイルス）と異なり、インフルエンザＡ型ウイルスのマイナスセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は感染性でない。４種のウイルスポリメラーゼ複合タンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ）で包膜されたｖＲＮＡ分子のみが、ウイルス複製と転写サイクルを開始することができる。リボ核タンパク質（ＰＮＰｓ）が細胞核に侵入した後、結合したタンパク質が（−）ｖＲＮＡをｍＲＮＡおよびプラスセンス相補的ＲＮＡ（＋）ｃＲＮＡに転写する。これらのｃＲＮＡは、ｖＲＮＡの合成のための鋳型としての役割を果たしている。インフルエンザＡ型ウイルスのために開発された最初の逆遺伝学システムは、ＲＮＡトランスフェクション法である（ルイチェスら（Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ １９８９年、第５９巻、１１０７ページ；エナミら（Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９０年、第８７巻、３８０２ページ）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるウイルス様ｖＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写およびウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＡ）分子の再構成の後に、遺伝的に改変されたＲＮＰセグメントがトランスフェクションにより真核細胞に導入された。インフルエンザヘルパーウイルスによる感染は、クローン化ｃＤＮＡから得られた遺伝子を有するウイルスの発生をもたらした。しかし、ＲＮＡ中にヘルパーウイルスが存在するため、ヘルパーウイルスを除去するための強い選択システムが必要となり、ＤＮＡトランスフェクション法の実際的価値は限定されたものとなっている。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）駆動ｖＲＮＡ分子合成の確立により、ＲＮＡ複合体の細胞内産生が可能となった（ニューマンおよびホボム（Ｎｅｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４年、第２０２巻、４７７ページ）。このシステムでは、ウイルス様ｃＤＮＡがｐｏｌＩプロモーターとターミネーター配列との間に挿入されていた（ゾベルら（Ｚｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３年、第２１巻、３６０７ページ）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）により合成されたｍＲＮＡ転写物と異なり、ｐｏｌＩにより生じたＲＮＡは５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）テイルを欠いている。機能性ｖＲＮＰ分子は、ヘルパーウイルスによる感染より、もしくはＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡまたはＮＰをコードするタンパク質発現プラスミドのコトランスフェクションにより、発生させることができた（ニューマンおよびホボム（Ｎｅｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ）、上記；フリックら（Ｆｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．）、ＲＮＡ １９９６年、第２巻、１０４６ページ；プレチカら（Ｐｌｅｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、第７０巻、４１８８ページ：ツァルら（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８年、第２４６巻、８３ページ）。
最近の研究で、ｐｏｌＩプロモーターからの８つのｖＲＮＡすべてのプラスミド駆動による発現とポリメラーゼ複合タンパク質の同時発現が感染性インフルエンザＡ型ウイルスの生成をもたらすことが示された（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３４５ページ；フォドーら（Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年、第７３巻、９６７９ページ）。プラスミドから完全に駆動されたインフルエンザＡ型ウイルスの発生にはヘルパーウイルスによる感染を必要としないので、選択システムは必要でなく、したがって、技術的制約なしに、すべての遺伝子セグメントを操作することができる。ニューマンら（上記）によって開発されたシステムでは、８つのｃＤＮＡがヒトｐｏｌＩプロモーター（４０７ｂｐ）とネズミターミネーター配列（１７４ｂｐ）との間の挿入された。４つのＲＮＰ複合タンパク質の発現は、ヒトサイトメガウイルスプロモーターによって駆動された。１０６個の２９３Ｔ細胞への１２プラスミドのトランスフェクションにより、１０３ｐｆｕを超えるウイルスが回収された。この効率は、１７プラスミドのトランスフェクションの後に５×１０７ｐｆｕに増大させることができた。フォドーら（上記）は、ｖＲＮＡの精密な３’末端を確保するために８ｃＤＮＡｓがＰｏｌＩプロモーター配列（２５０ｂｐ）とデルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイム配列との間に挿入されたシステムを開発した。ポリメラーゼ複合遺伝子の発現のために、アデノウイルス２型後期プロモーターを含むプラスミドを用いた。ベロ細胞への１２発現プラスミドのトランスフェクションの後に、１つまたは２つの感染性ウイルス粒子が１０６個のトランスフェクトされた細胞から回収されたにすぎなかった。
しかし、異なるプラスミド上のインフルエンザウイルスｃＤＮＡｓを用いるｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩを含むニューマンら（上記）によって記載されたヘルパーウイルスを含まないシステムは、ウイルスの回収のために少なくとも１２プラスミドの、また、効率のよいウイルスの回収のために１７プラスミドの構築とコトランスフェクションを必要とする。このように多数のプラスミドを用いる細胞のトランスフェクションは、このシステムの使用を高いトランスフェクション効率を有する細胞系に限定するものである。異なる細胞タイプからウイルスを回収することができることは、これらの細胞内のインフルエンザＡ型ウイルスの複製を増大させることによりウイルス収量が増大し、ワクチンの産生に適した細胞の範囲が増大する可能性がある（ゴボルコバら（Ｇｏｖｏｒｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、第７０巻、５５１９ページ）。
したがって、当技術分野において組換えインフルエンザウイルスのより効率のよい生成が必要である。さらに、当技術分野において新たに同定されたウイルス株に応じたワクチン生産のための再構築ウイルスの効率のよい生成がさらに必要である。本発明は、ウイルスゲノムマイナス鎖ＲＮＡセグメント（ｖＲＮＡ）とウイルスｍＲＮＡの合成が１つの鋳型から行われ、それにより、ウイルスの生成に必要とするプラスミドの数を最小限にし、効率のよい、かつ予測できる再構築を可能にするシステムを提供することによって、当技術分野におけるこれらおよび他の必要に対処するものである。
レオウイルス
ロタウイルス属のウイルスを含むレオウイルス科に属するウイルスは、二本鎖のセグメントＲＮＡゲノムを含んでいる。ヒトロタウイルスは、年間約５０，０００件の入院と２０−５０例の死亡の原因となっており、推定年間医療費が１０億ドルを超える米国における重症の小児下痢の最も一般的なウイルス病原体である。発展途上国では、ロタウイルスは、すべての下痢関連の入院の１／３の原因であり、また、年間約８５０，０００例の死亡の原因となっている。
２種のウイルスタンパク質（ＶＰ）、すなわちＶＰ７およびＶＰ４によって誘発される中和反応による二重システムの報告ロタウイルス血清型が存在する。ＶＰ７血清型はＧ型と称され、ＶＰ４由来の血清型はＰ型と称されている。現在までに、ヒトにおいて少なくとも１０種のＧ血清型と少なくとも７種のＰ血清型が認められている。ＶＰ４およびＶＰ７遺伝子は別個に分離するので、新たなロタウイルスは再構築によって生成する。米国では、血清型Ｐ１−Ｐ４およびＧ１−Ｇ４が最もよく見られる。インドやエジプトのような国では、他の組合せが報告された。最初の実施許諾を受けたヒトロタウイルスワクチンであるアカゲザルロタウイルスワクチンは、４種の一般的な血清型Ｇ１−Ｇ４に対して血清型特異的な防護をもたらすように製剤化された。しかし、ワクチン受容者においてワクチン接種と腸重積症の発現率の増加との関連があったため、このワクチンは撤回された。したがって、望ましくない副作用のないすべてのＧおよびＰサブタイプを提示するロタウイルスワクチンを製造する必要がある。本発明は、クローン化ｃＤＮＡからロタウイルスを完全に発生させるのに用いることができるベクター、（好ましくはプラスミド）、方法および宿主細胞を提供する。
１３種の主要な遺伝子産物が定義された。混乱を最小限にし、レオウイルス科の他の属の同様の機能を有するタンパク質との比較を容易にするために、次の命名法を用いた。すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析におけるタンパク質の移動に従って、最大のタンパク質から始めて、構造タンパク質には接頭辞「ＶＰ」を、非構造タンパク質には接頭辞「ＮＳＰ」を付け、各タンパク質の機能を括弧内に示す。例えば、略語ＶＰ１（Ｐｏｌ）は、ウイルス粒子中の最大のタンパク質がＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであることを示している。次の３層の構造を有するウイルス粒子中に７種のタンパク質が集まっている。（１）ｄｓＲＮＡゲノムを含み、３種のタンパク質がそれに結合しており、そのうちの２種（ＶＰ１（Ｐｏｌ）およびＶＰ３（Ｃａｐ））がゲノムに直接結合していて、一方、第３のタンパク質（ＶＰ２（Ｔ２））がコア殻を構成しているタンパク質を含む内側ウイルスコア、（２）２６０個の三量体ユニットで配列している７８０個のＶＰ６（Ｔ１３））分子から構成されているビリオンの中間タンパク質殻、（３）ＶＰ４およびＶＰ７から構成されている外殻。スパイクタンパク質ＶＰ４は、ＶＰ５およびＶＰ８への切断に重要であるトリプシン切断部位を含む。そして、この切断は感染力を増大させる。異なるインフレームのリーディングフレームから得られる２つの形態のＶＰ７、すなわちＶＰ７（１）およびＶＰ７（２）は、ビリオンに組み込まれるように求められる。
６種の非構造タンパク質の機能については非常にわずかのことしか知られていない。他のＲＮＡウイルスと同様に、非構造タンパク質はウイルスの複製、転写、ウイルスＲＮＡの翻訳およびゲノムパッケージングに重要な役割を果たしていると予想される。実際に、セグメント８の温度感受性ウイルスの分析に基づいて、ＮＳＰ２（ＶｉＰ）はウイルス複製に直接的役割を有すると推定される。ＮＳＰ３は、ウイルスｍＲＮＡの３’末端の保存配列および細胞キャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｇに結合し、それにより、５’キャップ構造を有するが、３’ポリ（Ａ）テイルを有さないロタウイルスｍＲＮＡの翻訳を特異的にアップグレードすると考えられている。ＮＳＰ１は、本質的なものでないと思われるが、細胞培養中でのロタウイルス複製におそらく有効な役割を果たしていると思われる。ＮＳＰ４は、ウイルスの形態形成に関与していると考えられている。２種の非構造タンパク質ＮＳＰ５およびＮＳＰ６は、セグメント１１の２種の異なるリーディングフレームによってコードされるが、ウイルスの生活環における機能は不明である。
複製サイクルは、３７℃で１０−１２時間で完結する。現在のデータから、ウイルスは受容体依存性エンドサイトーシスにより細胞に入ることができることが示唆されるが、細胞侵入の別のメカニズムが存在する可能性がある。宿主細胞に侵入した後に、ウイルス外殻は転写に有効な二重殻を有する粒子を感染細胞の細胞質内に放出する。ビリオン関連酵素は、各ビリオンゲノムセグメントのマイナス鎖からなる全長転写物である５’キャップ構造をもつ非アデニル化ｍＲＮＡを生成する。各セグメントから得られたウイルスｍＲＮＡは次の２つの機能を果たす。すなわち、第１に、それらは翻訳されて、そのセグメントによってコードされるウイルスタンパク質を生成させ、第２に、ウイルスｍＲＮＡはゲノム複製の鋳型でもある。ゲノムセグメントのアセンブリーは、プレコアＲＩを形成するのに必要とする種々のウイルスｍＲＮＡの選択によって起こる。１１個のｍＲＮＡのアセンブリーに続いて、感染細胞の細胞質内に認められる「ウイロプラスム」中に存在する「コアＲＩ」およびＶＰ６（Ｔ１３）−ＲＩ中で起こるマイナス鎖合成が起こる。子孫ビリオンの形態形成の次の段階は、ロタウイルスに特有のものであり、ＮＳＰ４を必要とする過程における二重層を有する粒子の小胞体内への出芽を伴うものである。これにより、粒子は、ＶＰ４およびＶＰ７からなるビリオンの外殻が加えられる最終成熟段階において失われる包膜を一時的に獲得する。
高度に秩序正しいゲノム構造をもち、複製サイクルが複雑であるセグメントゲノムは、ロタウイルスの発生に用いる逆遺伝学的システムの開発における重大な課題を提示している。しかしながら、本発明は、ロタウイルスの簡便な発生に用いることができる。
インフルエンザワクチン
米国および欧州における使用が公衆衛生当局によって現在認可されているインフルエンザワクチンは、不活性化インフルエンザワクチンである。疫学的に重要なインフルエンザＡおよびインフルエンザＢ株をもたらすウイルスを発育鶏卵中で成長させ、その後、ウイルス粒子を精製し、化学的手段によって不活性化する。毎年、ＷＨＯは循環する可能性のあるサブタイプを選択している。現在、インフルエンザＡの２つの株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）とＢ株がある。
安全かつ有効なワクチンの製造のためには、選択したワクチン株が循環株と密接に関連しており、それにより、ワクチン接種集団における抗体が抗原として類似のウイルスを中和することができることが重要である。しかし、鶏卵中の成長が不十分のため、密接に関連していることが認められたすべてのウイルスがワクチン製造に適しているとは限らない。したがって、予想される病原株の抗原特性を有する実験室株（Ａ／ＰＲ／８／３４）（Ｈ１Ｎ１）の高いウイルス収量を兼ね備えた高成長の再構築ウイルスの生成を試みることが望ましい。残念なことに、８セグメントを含む２種のインフルエンザによる同時感染では、理論的には２８＝２５６種の子孫ウイルスの発生がもたらされる。必要とする糖タンパク質抗原を有する高成長ウイルスを得るためには、親の高成長実験室株から対応する遺伝子セグメントを除去するための選択方法が必要である。適切な糖タンパク質を有するウイルスを得るための選択手順と遺伝子配列の立証は、わずらわしく、時間のかかる仕事である。ＲＮＰトランスフェクションシステム（ルイチェスら（Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ １９８９年、第５９巻、１１０７ページ）は、子孫ウイルスの可能な数を減少させるものであるが、良い選択方法が依然として必要である。
鼻腔内投与した弱毒生インフルエンザウイルスワクチンは、局所粘膜における細胞性および体液性免疫を誘導する。生弱毒化インフルエンザＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）またはＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６の６種の内部遺伝子ならびに同時に発生する野生型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む低温適応（ｃａ）再構築（ＣＲ）ウイルスは、確実に弱毒化されると思われる。このワクチンは、小児および若齢成人に有効であると思われる。しかし、米国においてインフルエンザ感染により毎年死亡する２０，０００−４０，０００人の主な集団である高齢者における理想的免疫応答を刺激するには弱毒化されすぎている可能性がある。ｃａウイルスの内部遺伝子の配列は報告されたが、弱毒化された表現型に対する各セグメントの寄与はまだ十分に定義されていない。この情報は、ウイルスに特定の定義された弱毒化突然変異を導入することによってのみ得ることができる。ＲＮＰトランスフェクション法はインフルエンザのゲノムへの突然変異の導入を可能にするものであるが、選択システムを必要とすることと、ウイルスＲＮＰｓをｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成することが技術的に困難であることが、内部遺伝子の操作を使用するうえでの制約となっている。
ルイチェスら（Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ １９８９年、第５９巻、１１０７ページ
したがって、当技術分野において、ヘルパーウイルスの使用を回避でき、培養（卵または細胞培養）中で十分に成長し、新ワクチンの開発のために増殖させることができる再構築ウイルスの開発を確実に可能にし、鼻腔内ワクチン接種用の弱毒化生ウイルス株を開発するための系統的突然変異を得る手だてとなる組換えインフルエンザワクチンの開発法が必要である。本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の必要に対応できるものである。
本発明は、有利なことに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に挿入されているＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）プロモーターおよびｐｏｌＩターミネーター配列を含む発現プラスミドを提供する。発現プラスミドとは、本明細書では二重プロモーター発現システムもしくは二重プロモーター発現プラスミドのことを呼ぶ。そのようなプラスミドは、最適にはｐｏｌＩプロモーターと終結シグナルとの間に挿入されているＲＮＡウイルスのウイルス遺伝子セグメントを含む。好ましくは、ＲＮＡウイルスはインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型ウイルス）である。
本発明は、クローン化遺伝子またはｃＤＮＡから感染性ＲＮＡウイルスを発生させるための２つのプラスミドに基づくシステムを含む。１つのシステム（２方向システム）においては、遺伝子またはｃＤＮＡが上流ｐｏｌＩＩプロモーターと下流ｐｏｌＩプロモーターとの間にある。ｐｏｌＩＩプロモーターからの遺伝子またはｃＤＮＡの転写により、キャップ構造を有するプラスセンスウイルスｍＲＮＡが生成し、ｐｏｌＩプロモーターからの転写により、キャップ構造を有さないマイナスセンスｖＲＮＡが生成する。他のシステム（１方向システム）においては、遺伝子またはｃＤＮＡがｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターの下流にある。ｐｏｌＩＩプロモーターがキャップ構造を有するプラスセンスウイルスｍＲＮＡを生成し、ｐｏｌＩプロモーターがキャップ構造を有さないプラスセンスウイルスｃＲＮＡを生成する。
本発明による最小限のプラスミドに基づくシステムは、クローン化ウイルスｃＤＮＡからの感染性ＲＮＡウイルスの発生を可能にする。そのようなシステムは１組のプラスミドを含でいて、各プラスミドがＲＮＡウイルスの１つの自律性ウイルスゲノムセグメントを含んでいる。各プラスミドにおいて、自律性ウイルスゲノムセグメントに対応するウイルスｃＤＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）プロモーターとターミネーター配列との間に挿入されていて、それによりｖＲＮＡの発現がもたらされ、そしてまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に挿入されていて、それによりｍＲＮＡの発現がもたらされる。したがって、このシステムは、２方向プラスミド技術を用いるものであり、細胞培養中での成長によく適応したバックグラウンド株における、または弱毒化株からの、あるいは両方の、例えば、インフルエンザＮＡおよびＨＡ遺伝子の面から循環中の現在の病原性株に対応するＲＮＡウイルスを生成する効率のよい再構築を可能にする。好ましくは、ウイルスはインフルエンザＡ型またはインフルエンザＢ型ウイルスである。
本発明は、感染性ウイルスの発生のためのプラスミドに基づくシステムを含む宿主細胞、およびＲＮＡウイルスビリオンを生成する方法であって、ウイルスタンパク質およびｖＲＮＡの生成を可能にする条件下で宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。
プラスミドに基づくシステム、宿主細胞およびウイルスを生成する方法は、ＲＮＡウイルス特異的ワクチンを調製するのに特に適している。そのような方法は、ビリオンを精製することを含む。精製したウイルスは、不活性化または弱毒化することができる。本発明によるワクチンは、ＲＮＡウイルス感染を予防するためのワクチン接種に用いることができる。例えば、不活性化ウイルスを含むワクチンの防御用量を筋肉内注射により投与することができる。あるいは、弱毒化ビリオンを含むワクチンの防御用量を対象に鼻腔内投与することができる。
本発明は、再構築ウイルスビリオン、および不活性化および弱毒化ビリオンを含むそのようなビリオンを含むワクチン組成物をさらに提供する。
他の有利な実施形態において、本発明は、弱毒化ＲＮＡウイルスを発生させる方法を提供する。この方法は、プラスミドに基づくシステムにおいて１つまたは複数のウイルス遺伝子を突然変異させることと、次いで、そのシステムによって生成した感染性ＲＮＡウイルスが弱毒化されているかどうかを判定することを含む。そのような弱毒化ウイルスは、現在の弱毒化ワクチンに対して非応答性である高齢者または他の集団における防御免疫を誘発するための高い効力を有する鼻腔内ワクチンを含む鼻腔内ワクチンを開発するのに用いることができる。
ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡの合成に用いるｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムの概略図である。８つのインフルエンザウイルスセグメントのそれぞれのｃＤＮＡがｐｏｌＩプロモーター（ｐＩｈ）とｐｏｌＩターミネーター（ｔＩ）との間に挿入されている。ｐｏｌＩ転写ユニットの両端には、ヒトサイトメガウイルスのｐｏｌＩＩプロモーター（ｐＩＩＣＭＶ）とウシ成長ホルモンをコードする遺伝子のポリアデニル化シグナル（ａＩＩＢＧＨ）とが隣接する。８つの発現プラスミドのトランスフェクションの後に、２つのタイプの分子が合成される。ヒトｐｏｌＩプロモーターから、マイナスセンスｖＲＮＡが細胞ｐｏｌＩにより合成される。合成されたｖＲＮＡは、５’および３’末端における非コーディング領域（ＮＣＲ）を含む。ｐｏｌＩＩによる転写によって、５’キャップ構造と３’ポリ（Ａ）テイルを有するｍＲＮＡが得られる。これらのｍＲＮＡはウイルスタンパク質に翻訳される。ウイルスｃＤＮＡのＡＴＧは、ｐｏｌＩＩ転写開始部位の下流の最初のＡＴＧである。 インフルエンザＡ型ウイルスの発生に用いる８プラスミドｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムを示す図である。ヒトｐｏｌＩプロモーターとｐｏｌＩＩプロモーターとの間に挿入された８つのウイルスｃＤＮＡを含む８つの発現プラスミド（図１を参照）が真核細胞中にトランスフェクトされる。各プラスミドが２種のプロモーターを含んでいるので、細胞ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩは、おそらく異なる核コンパートメント内でプラスミド鋳型を転写するであろう。その結果、ウイルスｍＲＮＡとｖＲＮＡの合成がもたらされる。ウイルスポリメラーゼ複合タンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ）の合成後に、ウイルス複製サイクルが開始される。最終的に、細胞転写および翻訳機構により、直接的（ｐｏｌＩＩ転写）に、または間接的（ｐｏｌＩ転写およびウイルス複製）に得られたすべてのウイルス分子のアセンブリーがすべての合成された分子（ｖＲＮＡおよび構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ２／ＮＥＰ）の相互作用をもたらして、感染性インフルエンザＡ型ウイルスを発生させる。 図２Ａの続きである。 Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）を回収するための８つの発現プラスミドの構築およびトランスフェクション用に開発された方法の概略図である。Ａ．ウイルス粒子からウイルスＲＮＡを抽出した。セグメント特異的ヌクレオチドを含むプライマーおよびタイプＩＩｓ制限ヌクレアーゼＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩの配列を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。８つのウイルスＰＣＲフラグメントをＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩで消化し、ｐＨＷ２０００中に挿入した（ＢｓｍＢＩで線状化）。この挿入により、ウイルスｃＤＮＡｓがｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーターに正確に融合している８つの発現構成体が得られる（ウイルス末端配列ＡＧＣ．．．ＡＣＴはＰＢ２セグメントについて黒枠の矩形中に示す）。 Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）を回収するための８つの発現プラスミドの構築およびトランスフェクション用に開発された方法の概略図である。Ｂ．ｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを含む８つの発現プラスミドが、８つのセグメントのウイルスｃＤＮＡｓのそれぞれの１つのコピーを含んでいる。１０ウイルスタンパク質の開いたリーディングフレームは、セグメント特異的非コーディング領域（グレーボックス）が両端に隣接している。用いたヒトｐｏｌＩプロモーターはヒトまたは関連動物種由来の細胞株中でのみ高い活性を示すので、ヒト２９３Ｔ細胞を、インフルエンザＡについて用いる標準細胞株（ＭＤＣＫ細胞）とともに培養した。トランスフェクション後に２９３Ｔ細胞中で生成したウイルスは、ＭＤＣＫ細胞および複製に感染することができる。 Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）を回収するための８つの発現プラスミドの構築およびトランスフェクション用に開発された方法の概略図である。 Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）を回収するための８つの発現プラスミドの構築およびトランスフェクション用に開発された方法の概略図である。 回収されたウイルスのＲＴ−ＰＣＲによるキャラクタリゼーションを示す図である。Ａ．ＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞（表２および３を参照）の上清をＭＤＣＫ細胞上での２継代培養の後にウイルス粒子から抽出した。ＮＳ遺伝子セグメントに特異的なプライマーおよびビリオンから抽出したｖＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。用いたＮＳプライマーは株に特異的なものではなかった。したがって、インフルエンザＡのＮＳセグメントの増幅が可能であった。反応生成物を２％アガロースゲル上の電気泳動に供した。増幅ＤＮＡフラグメントがｖＲＮＡから得られたものであって、トランスフェクトされた細胞から持ち越されたプラスミドＤＮＡ由来のものでないことを確保するために、逆転写酵素を添加せずに１つの反応を行った（ＲＴ）（−）。レーン１および２、組換えＡ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（表２）；レーン３および４、Ｍ再構築（表３）；レーン５および６、ＮＳ再構築（表３）レーン７および８、組換えＡ／ＷＳＮ／３３ウイルス（表２）；レーン９および１０、４（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）再構築（表３）。 回収されたウイルスのＲＴ−ＰＣＲによるキャラクタリゼーションを示す図である。Ｂ．Ａで示した断片のＮｃｏＩ消化。ＮＳ断片の同一性も増幅産物の配列解析によって立証された（示さず）。 １方向ＲＮＡＰｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムを示す図である。１方向ＰｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムにおいては、ウイルスｃＤＮＡが、ヒトｐｏｌＩプロモーター（ｐＩｈ）とターミネーター配列（ｔＩ）との間にプラスセンス配向で挿入される。この全ｐｏｌＩ転写単位の両端に、ｐｏｌＩＩプロモーター（ｐＩＩＣＭＶ：ヒトサイトメガウイルスの即時型プロモーター）とウシ成長ホルモンをコードする遺伝子のポリアデニル化部位（ａＩＩｂｇｈ）が隣接している。トランスフェクションの後に、２種類のＲＮＡ転写物が合成されると予想される。すなわち、ｐｏｌＩによって合成されるその５’末端３リン酸基を有するプラスセンスｃＲＮＡ、および５’キャップ構造とその３’末端にポリ（Ａ）テイルを有するｐｏｌＩＩによって合成されるプラスセンスｍＲＮＡである。効率のよい翻訳のためにｍＲＮＡの両要素が必要である。 タンデムに配列したｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを含むクローニングベクターｐＨＷ１１を示す図である。プラスミドは、２２５ｂｐのヒトＲＮＡｐｏｌＩプロモーター（ｐＩｈ）と３３ｂｐのマウスターミネーター（ｔＩ）を含む。ｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーター配列の両端には、ヒトサイトメガウイルスのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ｐＩＩＣＭＶ）とウシ成長ホルモンをコードする遺伝子のポリアデニル化シグナル（ａＩＩＢＧＨ）が隣接している。ｐｏｌＩプロモーターとターミネーターとの間にウイルスｃＤＮＡを挿入するために、２つのＢｓｍＢＩ制限部位（下線で示す）を導入した。ＢｓｍＢＩによるベクターの消化により、スティッキーであるが、非相補的な付着末端を有するベクター断片が生成した。このベクターのデザインによって、ｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーター配列に関して、プラスセンス配向のウイルスｃＤＮＡの精密な融合が可能である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖のために、プラスミドは複製起点（ｏｒｉ）を有し、アンピシリン含有培地における選択のために、プラスミドはβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）を含んでいる。 感染性ＲＮＡウイルスの生成のための二重プロモーターシステムを示す図である。ＲＮＡウイルスは、細胞寄生生物として機能するので、その遺伝情報の発現のために宿主細胞を用いる戦略を最適化しなければならない。すべてのＲＮＡウイルスは、タンパク質に翻訳されることができるｍＲＮＡを合成しなければならない。一般的に、合成されたタンパク質は、複製、転写および新しい子孫ウイルス粒子の生成に必要である。ゲノムＲＮＡの効率のよい複製のために、正確な５’および３’末端を有するＲＮＡ転写物が生成されなければならない。本発明によるシステムは、外部および内部転写単位を含む。内部転写単位は、プロモーター（ｐ（＋ＲＮＡ）またはｐ（−ＲＮＡ））、好ましくはｐｏｌＩプロモーターを含む。ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡｓは、非コーディング領域（ＮＣＲ）が両端に隣接している１つまたは複数の開いたリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなっている。ウイルスｃＤＮＡとプロモーターとの間に介在する配列が存在しないことが好ましい。ゲノムｖＲＮＡの５’および３’末端は一般的に転写および複製に必要なウイルスタンパク質によって認識される配列を含んでいるので、介在配列がないことが極めて重要であり、追加の非ウイルス配列は、一般的にウイルスタンパク質によるｖＲＮＡの効率のよい認識と複製を妨げる。介在配列が欠けていることにより、転写された（−）鎖ＲＮＡ（Ａ）または（＋）鎖ＲＮＡ（Ｂ）がウイルスポリメラーゼタンパク質によって効率よく使用されることが可能となる。外部転写単位は、ｃＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を導くプロモーター（ｐ（ｍＲＮＡ））、好ましくはｐｏｌＩＩプロモーターを有する。ｍＲＮＡは、ウイルスタンパク質への翻訳開始とその産生に必要である５’配列（例えば、メチルＧキャップ）および３’配列（例えば、ポリ（Ａ）テイル）を含む。翻訳の過程は、外部転写単位のプロモーターとウイルスｃＤＮＡとの間の追加配列を許容することであるので、内部転写単位からの介在配列の存在は、ｍＲＮＡの翻訳を有意に妨げない。このシステムは、内部転写単位における異なるプロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ、Ｔ３、ＳＰ６、Ｔ７またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの他のプロモーター）および正確な５’および３’末端を有するウイルスＲＮＡの細胞内合成のための終結エレメントまたはリボザイムを用いることによって、インフルエンザウイルス以外のＲＮＡウイルス用に修正し、改良することができる（下で論じる）。ハンマーヘッドリボザイムまたはデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、正確な末端を有するウイルスＲＮＡの生成に用いることができる（シュネルら（Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４年、第１３巻、４１９５ページ；プレシュカら（Ｐｌｅｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、第７０巻、４１８８ページ；ヘロロルド ジェーら（Ｈｅｒｏｌｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００年、第７４巻（１４号）、６３９４−４００ページ）。外部転写単位は、ｐｏｌＩまたはＩＩＩプロモーター、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの他のプロモーターを含んでいてよい。外部転写単位における他のプロモーターがメチルＧキャップを欠く転写物の合成を導く場合、転写開始を促進するためにｃＤＮＡコーディング配列の５’末端に内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を付加してもよい（下で論じる）。ベクターｐＨＷ２０００がＣＭＶプロモーターと終結部位との間にＴ７プロモーターを有することは注目すべきである。ｐｏｌＩＩ転写物は核中で合成されるのに対して、Ｔ７転写物はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞の細胞質中で合成される。したがって、外部転写単位の複数のプロモーターから起始する転写物が生成され、異なるｍＲＮＡが生ずる可能性がある。したがって、ｐＨＷ２０００から得られる発現プラスミドは、ｐｏｌＩＩまたはＴ７プロモーターもしくは両方の組合せが、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を有するプラス鎖ウイルスのｍＲＮＡ合成に最適であるかどうかの迅速な評価を可能にする。 図７Ａのつづきである。 （＋）鎖ＲＮＡウイルスの生成のための二重プロモーターシステムを示す図である。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのようなプラス鎖の単分子ゲノムを含むウイルスを生成させるように適合させることもできる。この実施形態においては、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム（約９５００ヌクレオシド）を含むｃＤＮＡが、細胞内でのｃＤＮＡのｍＲＮＡおよび全長マイナスＲＮＡ（２方向アプローチ）またはｍＲＮＡおよび全長プラスＲＮＡ（１方向アプローチ）への効率のよい転写を可能にする構成物中に挿入されている。ｃＤＮＡは、非コーディング領域（ＮＣＲ）が両端に隣接している１つの開いたリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなっている。図に、２方向システムを含む発現ブラスミドを示す。全長ｃＤＮＡがｐｏｌＩ（ｐＩ）プロモーターと終結配列（ｔＩ）との間に挿入されていて、その結果、トランスフェクション後に全長（−）鎖ＲＮＡが合成される。内部転写単位に、ｍＲＮＡ合成を駆動するプロモーター（ｐ（ｍＲＮＡ））をもつ外部転写単位が隣接している。好ましくは、このプロモーターはｐｏｌＩＩプロモーターである。しかし、合成されるＲＮＡが内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を有する場合、ｐｏｌＩＩプロモーターは、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩＩ、ＳＰ６、Ｔ７またはＴ３で置き換えることができる（Ｔ７またはＴ３プロモーターを用いるには、ポリメラーゼをコードするプラスミドのコトランスフェクションにより、あるいはポリメラーゼを発現する安定な細胞株を用いることにより、Ｔ７またはＴ３ポリメラーゼタンパク質が発現する必要がある。）外側転写単位の３’末端において、ポリ（Ａ）シグナルまたは挿入されたポリ（Ａ）配列が、合成されるｍＲＮＡにポリ（Ａ）テイルを供給するのに用いられる。生成したｍＲＮＡは、翻訳時および翻訳後に開裂して個々の構造および非構造ウイルスタンパク質を生ずる、大きいポリタンパク質前駆体に翻訳される。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質である非構造タンパク質ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂは、内部転写単位によって合成された（−）ＲＮＡを鋳型として用いて、ウイルス複製／転写サイクルを開始する。それにより、タンパク質への翻訳に用いられる（＋）ＲＮＡ／ｍＲＮＡが生成する。最終的に、（＋）ＲＮＡとウイルス構造タンパク質を含む感染性ウイルスが発生する。 ヒトパラインフルエンザウイルスＩＩＩの生成用のｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムを示す図である。本発明は、マイナス鎖の単分子ＲＮＡゲノムを含むパラインフルエンザＩＩＩ型ウイルスを発生させるのに用いることができる。ウイルスｃＤＮＡは、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムにセンスまたはアンチセンス配向で挿入することができた。図には１方向システムを示す。ｐｏｌＩプロモーターはｃＲＮＡ合成を導き、ｐｏｌＩＩプロモーターはｍＲＮＡ合成を導く。この実施形態では、ｐｏｌＩＩプロモーターは、最初の開いたリーディングフレームがそれから効率よくヌクレオキャプシド（ＮＰ）タンパク質に翻訳される、ポリシストロン性ｍＲＮＡを生成させる。このタンパク質は、複製を必要とする。複製および転写にも必須である（しかし、ポリシストロン性ｍＲＮＡから効率よく翻訳されない）ＬおよびＰタンパク質をコードするプラスミドが調製され、別の発現プラスミド上でコトランスフェクトされる。（デュービン エーピーら（Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７年、第２３５巻２号、３２３−３３２ページ）によって開発された逆遺伝学システムと比較して、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムはいくつかの利点を有している。同じｃＤＮＡからＮＰを発現させることによって、この最小限のプラスミドに基づくシステムは、クローン化ｃＤＮＡからヒトパラインフルエンザウイルスＩＩＩを完全に発生させるのに、４プラスミドの代わりに、３プラスミドのみの構築とトランスフェクションを必要とするにすぎない。Ｔ７プロモーターからのｉｎ ｖｉｖｏ転写に基づく逆遺伝学システムと異なり、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムは、各細胞中に認められる真核ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって完全に駆動される。さらに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動するワクシニアウイルスの感染は、ワクシニアウイルスを許容するが、ヒトパラインフルエンザウイルスの成長に関して最適でない細胞（ＨｅＬａ細胞またはＨｅｐ−２細胞のような誘導体）を必要とするものであり、したがって、このことがこのアプローチを感染性ウイルスの発生に用いる際の制約となっている。ワクシニアウイルスの高度の細胞変性作用と感染病原体の使用に必要な安全上の予防処置は、このシステムの望ましくない特徴である。ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムを使用することにより、ウイルス感染に備えての要件がなくなり、ヒトパラインフルエンザウイルスＩＩＩのトランスフェクションと成長にＬＬＣ−ＭＫ２細胞の使用が可能となり、したがって、より簡単かつ安全な方法で弱毒化ウイルスを発生させる技術を提供することができる。 クローン化ｃＤＮＡからロタウイルスを発生させるためのプラスミドに基づくシステムを示す図である。このシステムは、セグメント化した２本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルス（例えば、ロタウイルス）を発生させるのに用いることができる。このシステムは、例えば、レオウイルス科（１０、１１、１２ｄｓＲＮＡセグメント）またはビルナウイルス科（２ｄｓＲＮＡセグメント）に属するウイルスに適用することができる。現在までのところ、レオウイルス科のウイルスについて逆遺伝学システムは利用可能ではない。この図には、１１ｄｓＲＮＡセグメントを有するロタウイルスを本発明を用いてどのようにして発生させることができるかを例示するが、同様のシステムをオルビウイルス（１０ｄｓＲＮＡセグメント）またはオルトレオウイルス（１２ｄｓＲＮＡセグメント）属のメンバーに対して用いることができる。以下の議論では、クローン化ｃＤＮＡからロタウイルスＡ／ＳＡ１１を完全に発生させることを例示する。サルロタウイルス２本鎖ＲＮＡゲノムの１１セグメントすべてを検討した。ゲノムにおけるｄｓＲＮＡは３３０２ｂｐ−６６３ｂｐの長さであり、完全なゲノムのサイズは１８，５５０ｂｐである。ゲノムセグメントは、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析により移動度が増加する順序で１−１１の番号を付けた。セグメントは、完全に塩基対であり、プラスセンス鎖は５’末端キャップ構造（ｍ７ＧｐｐｐＧｍＧＰｙ）を含むが、その３’末端の近くにポリアデニル化シグナルを有さない。すべてのゲノムセグメントは、短い保存５’および３’末端、すなわち５’末端における１０ヌクレオチド共通配列と３’末端における８ヌクレオチド共通配列を共有している。各遺伝子におけるこれらの末端領域のすぐ内側に、ゲノム特異的である少なくとも３０−４０ヌクレオチドの保存配列の第２の領域が存在する。５’非翻訳領域（ＮＴＲｓ）は、長さは異なるが、すべてが５０ヌクレオチドより短く、すべてのセグメントにおいてＮＴＲｓに続いて、最初のＡＵＧの後に少なくとも１つの長い開いたリーディングフレームが存在する。セグメント９および１１は、２つのタンパク質をコードする。３’ＮＴＲｓは長さが異なっていて、１７ｎｔｓ（セグメント１）から１８２ｎｔｓ（セグメント１０）までの範囲にわたっている。ロタウイルスのｃＤＮＡを二重プロモーターシステム、好ましくは、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステム中にクローン化する。得られたプラスミドの適切な宿主細胞へのトランスフェクションの後に、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質が産生され、感染性ロタウイルスが生成する。好ましくは、ロタウイルスの生成に１方向転写システムを用いる。このアプローチを用いることにより、５’末端に三リン酸を有するロタウイルスゲノムの１１（＋）ＲＮＡ分子の細胞内合成が起こる。ウイルス様ｍＲＮＡの発現によりウイルスタンパク質の発現がもたらされる。グアニルイルトランスフェラーゼおよびメチルトランスフェラーゼ活性を有するウイルスタンパク質ＶＰ３（キャップ）は、１１ロタウイルス（＋）ＲＮＡへの５’キャップ構造の付加を触媒する（チェン ディーら（Ｃｈｅｎ Ｄ．、ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９年、第２６５巻、１２０−１３０ページ）。実際、ブルータングウイルス（ＢＴＶ）のロタウイルスＶＰ３（キャップ）類似体である精製ＶＰ４（キャップ）は、ウイルス様（＋）ＲＮＡにｉｎ ｖｉｔｒｏでキャップ構造を付加することができることが以前に示された（ラマデビ エヌら（Ｒａｍａｄｅｖｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ米国、１９９８年、第９５巻２３号、１３５３７−４２ページ）。細胞内でのｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ転写およびＶＰ３（キャップ）タンパク質発現が、１１ロタウイルスゲノムセグメントすべてにおけるキャップ構造を有するＲＮＡの発生をもたらすと予想される。それらのｍＲＮＡがウイルスタンパク質に翻訳されるか、あるいはプレコアＲＩにパッケージングされる。ＶＰ６（Ｔ１３）−ＲＩ粒子の生成後、プラスセンスｍＲＮＡが（−）ＲＮＡの合成の鋳型として用いられる。最終的に、形態形成中のＶＰ４およびＶＰ７の付加により感染性子孫ビリオンが生成する。複製および形態形成の効率のよい開始は各ウイルスタンパク質の最適濃度に依存すると思われるので、ＲＮＡ合成およびタンパク質発現のために別個のプラスミドを発生させることが有利であると思われる。しかし、タンパク質発現のレベルは、宿主細胞中のプラスミドの量を変化させることにより、あるいはｍＲＮＡ合成のために種々のプロモーターを用いることにより、最適化することができるので、１つのセグメントに対して２つのプラスミドを用いることは、大部分の遺伝子について必要でない可能性がある。（＋）ＲＮＡは（−）ＲＮＡから合成されるので、（−）ＲＮＡおよびタンパク質の細胞内発現は、ウイルスｍＲＮＡを生成する複製能を有する単位の発生をもたらすと思われる。したがって、二重プロモーターシステムは、ＲＮＡおよびタンパク質発現プラスミドが別個のプラスミド上にある場合に必要である２２個よりも有意に少数のプラスミドを含む最少プラスミドシステムを確立することを可能にする。ロタウイルスの生成は、インフルエンザＡ型ウイルスの生成に用いたのと同様の方法で実施することができる。 ＲＮＡウイルスゲノムの複製およびｍＲＮＡの合成を示す図である。（Ａ）ｍＲＮＡは、（−）鎖ウイルスの感染時にウイルスポリメラーゼタンパク質によって合成される。この場合、セグメントＲＮＡウイルスでは１つまたは２つのｍＲＮＡが、単一分子ゲノムを有するウイルスでは複数のｍＲＮＡが合成される。抗終結機構により、（−）ゲノムＲＮＡにコピーすることができる全長（＋）鎖の合成がもたらされる。 （Ｂ）アンビセンスＲＮＡウイルスのセグメントゲノムがコピーされて、１つのｍＲＮＡを生成する。第２のＲＮＡが相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から合成される。 （Ｃ）２本鎖ＲＮＡウイルスに感染した細胞では、最初に合成されたｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるか、あるいは（−）鎖の合成の鋳型としての役割を果たし、その結果、２本鎖ゲノムＲＮＡが生成する。 （Ｄ）（＋）鎖ウイルスの場合、ゲノムＲＮＡがｍＲＮＡでもあり、（＋）ゲノムＲＮＡにコピーすることができる（−）鎖ＲＮＡにコピーされる。一部の（＋）ＲＮＡウイルスのｍＲＮＡはポリ（Ａ）テイルを含まない。一部のファミリーにおいて、１つまたは複数のサブゲノムＲＮＡが生成する。
すべてのＲＮＡウイルスの生活環は、ＲＮＡ合成と、タンパク質合成後のウイルス粒子のアセンブリーを含む。これらの機能は、クローン化ｃＤＮＡからＲＮＡウイルスを生成するのに用いられる本発明による逆遺伝学システムの概念の枠組みを提供する。本発明は、マイナス鎖セグメントウイルス（例えば、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、ブニヤウイルス）、非セグメントマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、パラミクソウイルス、モノネガウイルス）、２本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス、ビトラウイルス）、およびプラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、フラビウイルス、ピコナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス）の生成のための二重プロモーターシステムを確立することによって、現在利用可能な逆遺伝学システムを簡易化し、改良するものである。本発明によるシステムはタンパク質合成とゲノムＲＮＡ合成の両方に単一のウイルスｃＤＮＡを用いるので、このシステムではウイルス生成に必要なプラスミドの数が少なく、そのためワクチンの開発が迅速かつ安価に行うことができる。
セグメントＲＮＡゲノムを含むウイルスを本発明を用いて生成させる場合、標的ゲノムにおける各遺伝子に対応するウイルスｃＤＮＡを本発明による発現プラスミドに挿入する。本発明は、ウイルスｃＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）プロモーターとターミネーター配列との間に挿入されている２方向プラスミドに基づく発現システムおよび１方向プラスミドに基づく発現システム（内部転写単位）を含む。この全ＰｏｌＩ転写単位の両端には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターとポリアデニル化部位（外部転写単位）が隣接している。１方向システムにおいては、ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターがｃＤＮＡの上流側にあり、キャップ構造を有さないプラスセンスｃＲＮＡ（ｐｏｌＩプロモーターから）およびキャップ構造を有するプラスセンスｍＲＮＡ（ｐｏｌＩＩプロモーターから）を生成する。１方向システムにおけるｐｏｌＩプロモーター、ｐｏｌＩターミネーター配列、ｐｏｌＩＩプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、「上流から下流への配向」を含むと称することができる。２方向システムでは、ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターがｃＤＮＡの反対側にあり、上流ｐｏｌＩＩプロモーターがキャップ構造を有するプラスセンスｍＲＮＡを生成させ、下流ｐｏｌＩがキャップ構造を有さないマイナスセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を生成させる。これらのｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムは、おそらく核の異なるコンパートメント中でのそれら自体のプロモーターからの２種の細胞ＲＮＡポリメラーゼ酵素の転写の開始から始める。２方向システムにおけるｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩターミネーター配列は、「下流から上流への配向」を含むと称することができ、一方、２方向システムにおけるｐｏｌＩＩプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、「上流から下流への配向」を含むと称することができる。
もし標的ウイルスがプラス鎖セグメントＲＮＡゲノムを含んでいる場合、ｐｏｌＩプロモーターが内部転写単位におけるｃＤＮＡの上流にあることが好ましい（１方向システム）。この実施形態においては、プラス鎖ＲＮＡが生成して、新しいウイルスに直接組み込まれる。しかし、マイナス鎖セグメントＲＮＡゲノムを含む標的ウイルスを１方向システムを用いて生成させる実施形態は、本発明の適用範囲内にある。
もし標的ウイルスがマイナス鎖セグメントＲＮＡゲノムを含む場合、ｐｏｌＩプロモーターが内部転写単位におけるｃＤＮＡの下流にあることが好ましい（２方向システム）。この実施形態においては、マイナス鎖ＲＮＡが生成して、新しいウイルスに直接組み込まれる。プラス鎖セグメントＲＮＡゲノムを含む標的ウイルスを２方向システムを用いて生成させる実施形態は、本発明の適用範囲内にある。
本発明はまた、感染性または非感染性非セグメントＲＮＡゲノム（１本鎖または２本鎖）を含むウイルスを生成するのにも用いることができる。一般的に、宿主細胞に感染性ウイルスゲノムＲＮＡを単純に導入することにより、細胞内でのウイルスの生活環の開始と完全なウイルスの最終的な生成が十分にもたらされる。例えば、宿主細胞にピコナウイルスゲノムＲＮＡを単純に導入することにより、完全なピコナウイルスの発生が十分に起こる。非感染性ゲノムＲＮＡを含むウイルスの生活環の開始には、一般的に、ゲノムとともに通常ウイルス粒子内に運ばれる他のウイルスタンパク質の追加の導入を必要とする。例えば、パラインフルエンザＩＩＩ型ウイルスは、新たに感染した宿主細胞内でウイルスゲノムＲＮＡの複製とウイルスｍＲＮＡの転写の開始のためにその存在が必要であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを運ぶ。このポリメラーゼが存在しない場合、パラインフルエンザＩＩＩゲノムＲＮＡは感染性ではない。感染性の非セグメントゲノムＲＮＡを含むウイルスを発生させる本発明の実施形態において、ウイルスゲノムを含む核酸を運ぶ、本発明による二重発現プラスミドを適切な宿主細胞に単純に導入することによって、完全なウイルスの発生が十分にもたらされる。非感染性非セグメントゲノムＲＮＡを含むウイルスを発生させる実施形態において、追加の発現プラスミドもウイルスゲノムを運ぶ二重発現プラスミドとともに宿主細胞に導入しなければならない。追加のプラスミドは、感染時に宿主細胞に通常導入されるウイルスの生活環の開始に必要なタンパク質（例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）を発現するものでなけれならない。
感染性非セグメントＲＮＡゲノムを含むピコナウイルスを生成する実施形態において、完全なウイルスゲノムを含むｃＤＮＡを本発明による二重プロモーター発現プラスミドに挿入する。外部転写単位における上流プロモーター、好ましくは、ｐｏｌＩＩプロモーターが、完全なウイルスゲノムを含むプラス鎖ｍＲＮＡの生成を導く。そして、ｍＲＮＡからポリタンパク質が翻訳され、ポリタンパク質から個々のタンパク質に分解され、放出される（例えば、ポリタンパク質内のプロテアーゼにより）。ウイルスゲノムはプラス鎖ＲＮＡを含むので、内部転写単位（１方向システム）における第２の上流プロモーター、好ましくは、ｐｏｌＩプロモーターがゲノムのプラス鎖コピーの生成を導く。もしウイルスゲノムがマイナス鎖ＲＮＡを含んでいるならば、内部転写単位（２方向システム）における第２の下流プロモーター、好ましくは、ｐｏｌＩプロモーターがゲノムのマイナス鎖コピーの生成を導くであろう。マイナス鎖の非セグメントＲＮＡウイルスを１方向システムを用いて生成させる実施形態は、本発明の適用範囲内にある。同様に、プラス鎖の非セグメントＲＮＡウイルスを２方向システムを用いて生成させる実施形態は、本発明の適用範囲内にある。
ポリタンパク質が生成されない非感染性非セグメントＲＮＡゲノムを含むウイルスも、本発明により発生させることができる。例えば、このシステムは、生活環に通常、ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってマイナス鎖ゲノムＲＮＡから複数のモノシストロン性ｍＲＮＡが産生されることが含まれる、ラブドウイルス科ウイルスまたはパラミクソ科ウイルス、好ましくは、パラインフルエンザＩＩＩ型ウイルスを生成するのに用いることもできる。個別のタンパク質はモノシストロン性ｍＲＮＡから発現される。これらの実施形態において、プロモーター、好ましくはｐｏｌＩＩプロモーターを含む外部転写単位がウイルスゲノムのプラス鎖のポリシストロン性コピーの生成を導き、そのコピーから一般的に最初の遺伝子（ＮＰ）のみが翻訳される。さらに、プロモーター、好ましくはｐｏｌＩプロモーターを含む内部転写単位が、新たなウイルスに組み込むためのゲノムのＲＮＡコピーの発現を導く。パラインフルエンザＩＩＩ型ウイルスゲノムはマイナス鎖ＲＮＡを含むので、内部転写単位のプロモーターはｃＤＮＡの下流にあることが好ましい（２方向システム）。ウイルスゲノムがプラス鎖ＲＮＡを含む場合、内部転写単位のプロモーターはｃＤＮＡの上流にあることが好ましい（１方向システム）。プラス鎖ＲＮＡゲノムを含むウイルスを２方向システムを用いて生成させる実施形態およびマイナス鎖ＲＮＡゲノムを含むウイルスを１方向システムを用いて生成させる実施形態は、本発明の適用範囲内にある。追加のウイルスタンパク質（ポリシストロン性ｍＲＮＡから発現したタンパク質以外）がウイルス転写および複製に必要であり（ＬおよびＰ）、これらのタンパク質は別個の発現プラスミド上で個別に供給される。
本発明には、２本鎖のセグメントＲＮＡゲノムを含むウイルスを発生させる実施形態も含めることができる。これらの実施形態において、標的ウイルスゲノムにおける各遺伝子を含むプラスミドを本発明による二重プロモーター発現プラスミドに挿入する。プラスミドは１方向プラスミドでも２方向プラスミドでもよい。外部転写単位におけるプロモーター、好ましくはｐｏｌＩＩプロモーターは、コードされたタンパク質に翻訳される各遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現を導く。内部転写単位におけるプロモーター、好ましくはｐｏｌＩプロモーターは、プラス鎖（１方向システム）またはマイナス鎖（２方向システム）の転写を導く。その後、生成する最初の鎖が、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる相補鎖の生成のための鋳型として働く。得られる２本鎖ＲＮＡ産物が新たなウイルスに組み込まれる。
最少のプラスミドに基づくシステムからの２種のインフルエンザＡ型ウイルス、すなわちＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）が回収されたことにより、このシステムの有用性が確立された。不活性化インフルエンザＡ型ワクチンの生産の標準である表現型が区別できないＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株が回収されたことから、ワクチン開発に関するこのシステムの有用性が確立された。同時培養した２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞への８種の発現プラスミドのトランスフェクションの７２時間後のトランスフェクトされた細胞の上清中のウイルス収量は、２×１０５−２×１０７感染性ウイルス／ｍｌであった。この８プラスミドシステムは、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）とＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）との間の単一および４重（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）再構築ウイルスを発生させるため、およびタンデム配向システム（ｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを生成する）からＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスを発生させるためにも用いた。
ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムは、組換えおよび再構築インフルエンザＡ型ウイルスのデザインおよび回収を容易にすることから、クローン化ｃＤＮＡからの他のＲＮＡウイルスの完全な回収にも適用可能である。ｃＤＮＡは本発明において用いることが好ましいが、本発明の本質的な要素が保存されるならば、発現させることができるウイルス遺伝子をコードする他の種類の核酸を用いてもよい。例えば、ウイルス遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物または制限断片を用いてもよい。さらに、本発明のプラスミドに基づくシステムにおいて発現した遺伝子は、精製／検出標識（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ｍｙｃ標識およびＦＬＡＧ標識）などの他の遺伝子と融合させたり、あるいは、それらで標識することができる。本発明はまた、部分的遺伝子配列を本発明によるプラスミド中で用いる実施形態も予想している。
以下の表に、本発明を用いて生成させることができるマイナス鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な一覧を含める。
本発明は、さらに一部、ｖＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）プロモーターとウイルスｍＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターとが両端に隣接した、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、ＭまたはＮＳをコードするウイルスｃＤＮＡを含む２方向転写構成物の開発に基づいている。このアプローチの有用性は、ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプロモーター−ＰＢ１構成物をトランスフェクトした後のウイルスの発生ならびに残りの７セグメントに対するｖＲＮＡおよびタンパク質発現構成物によって立証されている。このアプローチは、ウイルス発生に必要なプラスミドの数を低減させるものであるため、クローニングに必要な作業も低減させ、ウイルスの発生の効率を高め、逆遺伝学システムの使用を１７プラスミドの効率のよいコトランスフェクションを達成することができない細胞株に拡大させる。また、ウイルスｃＤＮＡコーディング配列の上流に置かれたｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを含む１方向転写構成物も含まれている。両プロモーターは、遺伝子に対して共通の上流から下流への配向をなしている。２方向システムはより高い力価のインフルエンザＡ型ウイルスを生成するが、１方向システムは他の適用例（例えば、他のマイナス鎖ウイルス株の生成）において有用である。
プロモーター、ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルは、遺伝子の始めの部分（例えば最初のコドン）の近位にあり、遺伝子の終端（例えば終止コドン）の遠位にあるならば、「上流」である。遺伝子の終端の近位にあり、遺伝子の始めの部分の遠位にあるならば、プロモーター、ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルは「下流」である。
本明細書で用いているように、「発現プラスミド」は、「内部転写単位」および「外部転写単位」を含むＤＮＡベクターである。上述のように、発現プラスミドは、あらゆるタイプのＲＮＡウイルス、好ましくは、プラスまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルス、セグメントまたは非セグメントゲノムＲＮＡウイルスあるいは２本鎖ＲＮＡウイルスを発生させるのに用いることができる。外部転写単位は、ウイルスｃＤＮＡからの、翻訳可能であるｍＲＮＡの転写を導くプロモーター、好ましくはｐｏｌＩＩプロモーターを含む。外部転写単位は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、もしくは翻訳可能なＲＮＡ産物の発現を駆動することができるあらゆるプロモーターまたは遺伝要素の組合せを含んでいてよい。例えば、プラスミドから発現させることができるウイルスｃＤＮＡを、転写されたＲＮＡの３’末端にポリアデニル化シグナルを含むように遺伝子工学により改変するならば、外部転写単位はｐｏｌＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターを含んでいてよい。これは、停止コドンの直前のｃＤＮＡコーディング配列の３’末端にＡヌクレオチドのストリングを挿入することによって達成することができる。さらに、転写されたＲＮＡからの翻訳開始を促進するために、ｃＤＮＡの５’末端に内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）を含むようにウイルスｃＤＮＡを遺伝子工学により改変することができる。本発明による発現プラスミドにおける「内部転写単位」は、外部転写単位の内部に位置し、ウイルスの機構によって複製され、新たなウイルスに組み込まれるウイルスｃＤＮＡの転写を導くことができるプロモーター、好ましくはＰｏｌＩプロモーターを含む。内部転写単位におけるプロモーターは、好ましくはウイルスｃＤＮＡとｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーター配列との精密な融合によって、５’および３’末端に過剰の非ウイルス外来配列を含まないＲＮＡを転写することが好ましい。しかし、本発明は、内部転写単位が５’および３’の付加的非ウイルス配列を含むＲＮＡ転写物の生成を導くプロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む実施形態を含む。これらの実施形態において、付加的配列を、内部転写単位から生産されるＲＮＡが過剰の非ウイルス配列を含まないことを保証する発現プラスミド中に含めることができる。例えば、内部転写単位から生産される転写物の末端にリボザイム配列を含むように発現プラスミドを遺伝子工学により改変することができる。この場合、転写されたＲＮＡのリボザイム部分が、ＲＮＡの５’および３’末端の配列がウイルスＲＮＡで認められるようになるように、転写物を切断する。さらに、ウイルスｃＤＮＡコーディング配列の末端に転写終結をもたらすターミネーター配列を含ませ、それにより、転写されたＲＮＡの３’末端に過剰な非翻訳可能配列の組込みを防止できるように、発現プラスミドを遺伝子工学により改変することができる。「発現プラスミド」はｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムを用いるＤＮＡベクターであることが好ましい。したがって、そのようなプラスミドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に挿入されているＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）プロモーターおよびｐｏｌＩターミネーター配列を含む。２方向システムでは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、プロモーターとターミネーターとの間に「アンチセンス」配向で挿入されているｃＤＮＡのキャップ構造を有さないゲノムマイナスセンスＲＮＡ（本明細書では「ｖＲＮＡ」と称する）の発現を調節している。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、メッセンジャーＲＮＡの発現を調節している。ｐｏｌＩＩプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に「センス」配向で挿入されているウイルス遺伝子ｃＤＮＡセグメントがキャップ構造を有するプラスセンスウイルスｍＲＮＡの発現をもたらす。１方向システムでは、ウイルスｃＤＮＡがｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターの下流にセンス配向で挿入されている。ｐｏｌＩＩプロモーターはキャップ構造を有するプラスセンスウイルスｍＲＮＡの発現を駆動し、ｐｏｌＩプロモーターはキャップ構造を有さないプラスセンスウイルスｃＲＮＡの発現を駆動する。
プラスミドは、ベース（ｂａｓｅ）プラスミドのすべての遺伝子および機能的非コーディング領域が存在するならば、「本質的にすべての」他のベースプラスミドを含んでいてよい。例えば、ポリリンカーの単なる除去と外来遺伝子の挿入によって構築されているプラスミドは、本質的にすべてのベースプラスミドを含む。
「マイナス鎖ＲＮＡウイルス」は、ウイルスゲノムがマイナス鎖ＲＮＡを含むウイルスである。マイナス鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡと相補的であり、一般的に、タンパク質が翻訳されるためには相補的なプラス鎖ｍＲＮＡにコピーされなければならない。一般的に、これらのウイルスは、宿主細胞感染時のｍＲＮＡの産生のためのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをパッケージングしている。マイナス鎖ＲＮＡウイルスの科は、オルトミクソウイルス、アレナウイルスおよびブニアウルスを含むが、これらだけに限定されない。好ましくは、ウイルスゲノムは、オルトミクソウイルス科に属するウイルスのゲノムであって、セグメント化ゲノムが最適である。オルトミクソウイルス科ウイルスのメンバーは、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、トゴトウイルス、はしかウイルスおよびおたふくかぜウイルス（パラミクソウイルス）または狂犬病ウイルス（ラブドウイルス）を含むが、これらだけに限定されない。
「プラス鎖ＲＮＡウイルス」は、プラス鎖ＲＮＡゲノムを含むウイルスである。プラス鎖ＲＮＡウイルスの例として、ポリオウイルス（ピコナウイルス）、トガウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ）およびフラビウイルスがある。これらのゲノムＲＮＡウイルスは、ｍＲＮＡと同じセンスであり、ｍＲＮＡとして機能することができる。これらのウイルスは、セグメント化または非セグメント化ゲノムを含む。
「２本鎖ＲＮＡウイルス」は、２本鎖ＲＮＡゲノムを含む。レオウイルスは２本鎖ＲＮＡウイルスである。
ウイルスゲノムは、セグメント化または非セグメント化（単分子）していてもよい。セグメント化ゲノムは、それぞれが１つまたは複数のウイルス遺伝子をコードする２つまたは複数の核酸を含む。好ましくは、セグメントゲノムは各ウイルス遺伝子ごとに別個の核酸を含む。オルトミクソウイルス（インフルエンザＡ、インフルエンザＢまたはインフルエンザＣ）、ブニヤウルスおよびアレナウイルスは、セグメントＲＮＡゲノムを含む。非セグメントゲノムは、すべてのウイルスゲノムを含む単一核酸を含む。Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓウイルス、ラブドウイルス、フラビウイルス、ピコナウイルス、コロナウイルス、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅウイルスおよびパラミクソウイルスは、非セグメントＲＮＡゲノムを含む。
２本鎖ＲＮＡは「ｄｓＲＮＡ」と略記してよい。１本鎖ＲＮＡは「ｓｓＲＮＡ」と略記してよい。１本マイナス鎖ＲＮＡは「−ｓｓＲＮＡ」と略記してよい。１本プラス鎖ＲＮＡは「＋ｓｓＲＮＡ」と略記してよい。
「ウイルス遺伝子セグメント」は、好ましくは、ＲＮＡウイルスゲノムのゲノムＲＮＡ分子に対応するクローン化ｃＤＮＡである。この用語は、ＲＮＡウイルス由来の遺伝子を含む遺伝子または遺伝子セグメント（例えば、ＰＣＲ産物または制限断片）を含んでいてもよい。
「最少のプラスミドに基づくシステム」は、ＲＮＡウイルスの各自律性ウイルスゲノムセグメントを含む上で定義した発現プラスミドが存在するシステムである。したがって、ウイルスゲノム配列を含むプラスミドの総数は、原ＲＮＡウイルスの遺伝子セグメントの総数を超えない。本発明は、ウイルス配列を含まない他のプラスミドを任意選択で宿主細胞中にコトランスフェクトすることができる実施形態を含む。これは、宿主細胞中にシステムを確立するのに必要なプラスミドの総数を制限し、ヘルパーウイルスの必要をなくし、選択過程の必要をなくし、再構築ウイルスの効率のよい発生を可能にすることによって重要な利点を提供する。
本発明による最少のプラスミドに基づくシステムにおける一定のウイルス遺伝子は、ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）またはＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（株）のような細胞培養中で成長するようによく適応したウイルス株、もしくはＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）のようなまたはインフルエンザＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６０用の弱毒化株から得ることができる。好ましくは、この弱毒化株も細胞培養中での成長によく適応しているものである。特に、インフルエンザＡについては、このプラスミドに基づくシステムにおける好ましいウイルス遺伝子セグメントは、細胞培養中で成長するようによく適応した株または弱毒化株からの、もしくは両方からのウイルスポリメラーゼ複合タンパク質であるＭタンパク質および／またはＮＳタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、本明細書で「ウイルス内部タンパク質」またはウイルス「非糖タンパク質」と称する。
インフルエンザＡウイルスのゲノムは、一般的に次の１０種のタンパク質をコードする。すなわち、トランスクリプターゼであると考えられているＰＢ２、トランスクリプターゼであると考えられているＰＢ１、トランスクリプターゼであると考えられているＰＡ、赤血球凝集素であると考えられているＨＡ、ＲＮＡ結合核タンパク質であると考えられているＮＰ、ノイラミニダーゼであると考えられているＮＡ、それぞれマトリックスタンパク質および内在性膜タンパク質であると考えられているＭ１／Ｍ２、ならびにＲＮＡプロセッシングおよび輸送に影響を及ぼすと思われる非構造タンパク質であると考えられているＮＳ１／ＮＳ２。ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰおよびＰＡは、インフルエンザウイルス転写ポリメラーゼ複合体の一部であると考えられている。
本明細書で用いている「細胞培養」という用語は、好ましくは、ワクチン生産のためにウイルスを増殖させる商業上許容できる方法、例えば、ふ化卵、ならびに宿主細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養を指す（ファーミンガー（Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２４章、３２４−３３２ページを参照）。
同様に、プラスミドに基づくシステムは、防御免疫応答を引き起こすに必要な抗原に対する遺伝子セグメントを組み込むであろう。「防御免疫応答」は、免疫化（ワクチン接種）対象におけるビリオンおよび感染細胞を除去するのに有効な体液性（抗体）または細胞性成分もしくは両方を含む。したがって、防御免疫応答は、ＲＮＡウイルス、例えばインフルエンザウイルス感染を予防または消失させることができる。好ましくは、抗原は「表面抗原」、すなわちビリオンの表面または感染細胞の表面で発現している。さらに好ましくは、表面抗原は糖タンパク質である。インフルエンザの場合、一次糖タンパク質抗原は赤血球凝集素（ＨＡまたはＨ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡまたはＮ）である。
本明細書で用いられているように、「免疫原性」という用語は、ポリペプチドが体液性または細胞性免疫応答、および好ましくは両方を誘発することができることを意味する。免疫原性存在物は、抗原性でもある。免疫原性組成物は、動物に投与したとき、体液性または細胞性免疫応答、もしくは両方を誘発する組成物である。免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できるとき、分子は「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５アミノ酸、また好ましくは少なくとも約１０アミノ酸のエピトープを含む。本明細書でエピトープとも呼ばれているポリペプチドの抗原性部分は、抗体またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である部分であることができ、あるいは、抗原部分を免疫化のための担体ペプチドに結合させることによって分子に対する抗体を生成させるのに用いられる部分であることができる。抗原性である分子は、それ自体免疫原性、すなわち担体なしに免疫応答を誘発することができる必要はない。
「病原性ウイルス株」という用語は、本明細書では疾患を引き起こすことができるウイルス株を呼ぶために用いる。好ましくは、ウイルスは、現行の世界保健機構（ＷＨＯ）、疾病対策センター（ＣＤＣ）または他の公衆衛生当局の予想循環ウイルス（ｌｉｋｅｌｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ）の一覧に収載されているものである。そのようなウイルスとして、肝炎ウイルスの科、レオウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、コロナウイルス科、ポリオウイルス科またはラブドウイルス科を含めることができる。本発明は有利には、そのような株からの一次抗原に対する遺伝子をプラスミドに基づくシステムに挿入すること、残りのウイルス遺伝子が所望の培養および／または弱毒化特性を有することの手だてとなり、それにより、ワクチン生産に適切な抗原性バックグラウンドの大量のウイルスの生産の手だてとなる。例えば、パラミクソウイルスであるヒトパラインフルエンザウイルス３の遺伝子（ヌクレオキャプシド遺伝子、リンタンパク質遺伝子、マトリックス遺伝子、融合遺伝子、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質遺伝子および大遺伝子）を、ヒトパラインフルエンザウイルス３ビリオンの生産のために本発明によるプラスミドに適宜入れることができる。
したがって、本発明による好ましい「再構築」ウイルスは、病原性ウイルス株の抗原性タンパク質をコードする遺伝子セグメントが培養中での成長に適応したウイルス（または弱毒化ウイルス）のウイルスポリメラーゼ複合体または他の同様な遺伝子（例えば、Ｍ遺伝子およびＮＳ遺伝子を含む非糖タンパク質）をコードする遺伝子セグメントと組み合わされているウイルスである。したがって、再構築ウイルスは、上述のような宿主細胞中で効率のよい生成を可能にするバックグラウンドにある所望の抗原性特性を運ぶ。そのような再構築ウイルスは、ワクチンを生産するためのビリオンの生産のための望ましい「ウイルス種」である（上記のＦｕｒｍｉｎｇｅｒを参照）。
「宿主細胞」という用語は、細胞による組換えＲＮＡビリオン、好ましくはマイナス鎖セグメントＲＮＡビリオンの生成のために、あらゆる方法で選択され、改良され、形質転換され、増殖され、もしくは使用され、または操作されたあらゆる生物のあらゆる細胞を意味する。具体例としての宿主細胞は、例えば、また限定のつもりではないが、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ベロ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞ならびにＢＨＫ−１細胞を含むが、これらだけに限定されない。特定の実施形態において、ビリオンを生成するために一時的同時培養が好ましい。同時培養は、２９３Ｔ細胞のような受容細胞の効率のよいトランスフェクションと、その後のＭＤＣＫ細胞のようなウイルスの成長のための許容細胞の感染を可能にする。
「ＲＮＡウイルスビリオン」という用語は、本発明によるプラスミドに基づくシステムによりトランスフェクトまたはコトランスフェクトされた宿主細胞から最初に生成されたとき、十分に感染性であるウイルス粒子を指す。そのようなシステムは、ｖＲＮＡおよびウイルスタンパク質（ウイルスｍＲＮＡ翻訳による）を生成し、感染性ウイルス粒子（ビリオン）のアセンブリーをもたらす。
本明細書で用いているように、「ＲＮＡウイルス特異的ワクチン」は、対象に投与したとき、ＲＮＡウイルスに対する防御免疫を誘発することができる組成物である。「ワクチン」という用語は、受容者における防御免疫を誘発するために用いることができるウイルス、不活性化ウイルス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルスまたはウイルスタンパク質、すなわち表面抗原を含む組成物を指す（上記のＦｕｒｍｉｎｇｅｒを参照）。有効であるためには、一部の人は強いまたは防御免疫応答あるいは場合によってあらゆる免疫応答を起こさないことがあるので、本発明によるワクチンは集団の一部における免疫を誘発することができることを注意すべきである。この無能力は、個人の遺伝的バックグラウンドによって生ずるか、免疫不全（後天性または先天性）または免疫抑制（例えば、臓器拒絶を予防するため、あるいは自己免疫状態を抑制するために免疫抑制薬の投与）のためである。有効性は動物モデルで確認することができる。
ワクチンの「防御用量」は、単独またはアジュバントと併用したとき受容者における防御免疫応答を誘発するのに有効な量である。防御は、投与経路、例えば、筋肉内（不活性化ワクチンについて好ましい）または鼻腔内（弱毒化ワクチンについて好ましい）にも依存することがある。
本明細書で用いている「対象」という用語は、水鳥、ニワトリ、ブタおよびヒトを含むが、これらだけに限定されない、ＲＮＡウイルス感染を支持する動物を指す。特に、この用語はヒトを指す。
「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を増強する分子または組成物である。アジュバントは、以下で定義するように、製薬上許容できるとき、「ヒトにおける使用が許容できる」。アジュバントの例を以下に記載する。
本明細書で用いているように、「分離された」という用語は、言及している物質がその自然環境、例えば、細胞から除去されることを意味する。したがって、分離された生物学的材料は、一部またはすべての細胞成分、すなわち天然材料が自然に存在している細胞の成分（例えば、細胞質や膜成分）がないことであり得る。材料は、細胞抽出物または上清中に存在している場合、分離されているとみなされる。核酸分子の場合、分離された核酸分子は、ＰＣＲ生成物、分離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは制限断片を含む。他の実施形態において、分離された核酸分子は、好ましくは、それが認められた染色体から切除されているものであり、さらに好ましくは、染色体中に認められたとき分離された核酸分子が含んでいた遺伝子の上流または下流にあった非コーディング領域（しかし、天然調節領域またはその一部と結合していてもよい）または他の遺伝子にもはや結合していないか、または隣接していない。さらに他の実施形態において、分離された核酸分子は１つまたは複数のイントロンを欠いている。分離された核酸分子は、プラスミドに挿入されている配列、コスミド、人工染色体および同様のもの（すなわち、キメラ組換え核酸分子構成物の一部をなしているとき）を含む。したがって、特定の実施態様において、組換え核酸分子は分離された核酸分子である。分離されたタンパク質は、他のタンパク質または核酸もしくは両方と、それが細胞中で結合していたものと、あるいは、それが膜結合タンパク質の場合、細胞膜と結合していてよい。分離されたオルガネラ、細胞または組織は、それが生物において認められるときの解剖学的部位から除去されている。分離された材料は、精製されていてよいが、精製されている必要はない。
本明細書で用いている「精製された」という用語は、無関係の材料、すなわち、当材料が得られたもとの天然材料を含む混在物の存在を減少させるまたは除去する条件下で分離された材料を指す。例えば、試製されたビリオンは、好ましくは、組織培養または卵タンパク質、非特定病原体および同様のものを含む宿主細胞または培養成分を実質的に含まない。本明細書で用いているように、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析試験の状況において操作上用いられている。好ましくは、混在物を実質的に含まない精製された材料は少なくとも５０％の純度であり、さらに好ましくは、少なくとも９０％の純度であり、さらに好ましくは、少なくとも９９％の純度である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫検定、組成分析、生物学的定量法および当技術分野で知られている他の方法によって評価することができる。
精製の方法は、当技術分野でよく知られている。ウイルス粒子は、限外ろ過または超遠心、好ましくは連続遠心によって精製することができる（上記のＦｕｒｍｉｎｇｅｒを参照）。他の精製方法が可能であり、本明細書で予想されている。精製された材料は、細胞成分、培地、タンパク質、あるいはそれが最初に結合していた他の望ましくない成分または不純物（状況上必要に応じて）の約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは約９０％未満含んでいてよい。「実質上純粋」という用語は、当技術分野で知られている通常の精製技術を用いて達成することができる最高の純度を示している。
特定の実施形態において、「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内であることを意味する。あるいは、生物学で用いられる対数については、「約」は、所与の値の桁以内、好ましくはその値の桁の半分以内を意味する。
プラスミドに基づくシステムの遺伝子工学
本発明に従って、通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を当技術分野の熟練の範囲内で用いることができる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、サンブルック、フリッシュおよびマニアチス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書では「サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ）、１９８９年」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（ディーエヌ グローバー（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（エムジェー ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［ビーディー ハメス、エスジェー ヒギンス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［アールアイ フレシュネイ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｒｙ）編（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）］；ビー パーバル（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；エフエム オースベルら（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４年）を参照のこと。
これらの常用の技術は、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩプラスミドシステムの調製、ウイルス遺伝子セグメントｃＤＮＡクローンの分離、そのようなＤＮＡのプラスミドへの挿入および本発明によるプラスミドまたはプラスミドに基づくシステムによる細胞のトランスフェクションに適用される。特に、位置特異的突然変異導入法または遺伝子修飾の常用の技術は、下に記載する弱毒化ウイルス、もしくは新規のエピトープを、例えば、ノイラミニダーゼストークに組み込むウイルスタンパク質を開発するための、もしくは欠陥ウイルスを作るためのＲＮＡウイルス、好ましくはマイナス鎖セグメントＲＮＡウイルス遺伝子の修飾を可能にする。
本明細書で用いているＤＮＡの「増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の量を増加させることを意味する。ＰＣＲの説明については、サイキら（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、第２３９巻、４８７ページを参照のこと。
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；ＤＮＡ分子）のリン酸エステル重合体、もしくは、１本鎖または２本鎖らせんの形態のホスホロチオエートおよびチオエステルのようなそのリン酸エステル類似体を指す。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおける一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれている）であり、２つまたは複数のヌクレオチドの鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、一般的に、タンパク質を作るために細胞機構により使用される情報を含む遺伝情報を運ぶ。
本明細書におけるポリヌクレオチドの両端には、プロモーター、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ；ガッタスら（Ｇｈａｔｔａｓ、ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１１巻、５８４８−５８５９ページ、１９９１年）を含む異種配列ならびに他のボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’および３’非コーディング領域および同様のものが隣接している。核酸は、当技術分野で知られている多くの手段によって修飾することもできる。そのような修飾の非限定的例として、メチル化、５’−７−メチル−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎキャップなどの「キャップ」、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換およびヌクレオチド間の修飾がある。ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリシン等）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属等）およびアルキル化剤のような１つまたは複数の追加の共有結合部分を含んでいてよい。ポリヌクレオチドは、メチルまたはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホラミデート結合の形成によって誘導体化されていてよい。さらに、本明細書におけるポリヌクレオチドは、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾されていてもよい。具体例としての標識として、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン等がある。
「コーディング配列」またはポリペプチドのような発現産物を「コードする」配列は、発現したとき、そのポリペプチドの産生をもたらすヌクレオチド配列である。すなわち、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコーディング配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）および停止コドンを含んでいてよい。
「構造遺伝子」とも呼ばれている「遺伝子」とうい用語は、１つまたは複数のポリペプチドのすべてまたは一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードする、またはそれに対応するＤＮＡ配列であって、例えば、遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列のような調節ＤＮＡ配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。
さらに、本発明は、次のすべての変異体が必要とする免疫防御作用を保持するならば、ＲＮＡウイルス遺伝子セグメント、好ましくはマイナス鎖ＲＮＡウイルス遺伝子セグメントの様々な突然変異体、配列保存変異体および機能保存変異体の使用を許容するものである。実際、本発明は、有利なことに弱毒化ウイルス株を系統的に開発するために突然変異誘発を許容している。
「突然変異体」および「突然変異」という用語は、遺伝物質、例えばＤＮＡ、または過程、機構の検出可能な変化、あるいはそのような変化の結果を意味する。これは、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が変化する遺伝子突然変異、突然変異過程により生ずる遺伝子またはＤＮＡ、および修飾遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現された発現産物（例えば、タンパク質）を含む。「変異体」という用語は、修飾された、または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞等、すなわち、あらゆる種類の突然変異体を示すのにも用いられる。突然変異は、ランダム突然変異誘発法またはＰＣＲによる配列修飾を含む位置特異的突然変異導入法に導入することができる。上記のように、また以下で詳細に論じるように、ＲＮＡウイルス（例えば、マイナス鎖セグメントＲＮＡウイルス）の１つまたは複数の個々の遺伝子セグメントの突然変異誘発によって、弱毒化ウイルスの開発とアテニュエーション機構の解明が可能となる。さらに、本発明によるプラスミドに基づくシステムは、効率のよい選択システムの制限のような、突然変異誘発によって弱毒化ウイルスを開発する以前の努力の欠点を克服するものである（ビルセルおよびカワオカ （Ｂｉｌｓｅｌ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ）著、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｍａｙ編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第３２章、４２２−４３４ページ、特に４２３−４２５ページを参照）。
ポリヌクレオチド配列の「配列保存変異体」は、所与のコドン位置における１つまたは複数のヌクレオチドの変化がその位置でコードされるアミノ酸の変化をもたらさないものである。アレル変異体は、配列保存変異体であり得る。
「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体的なコンホメーションおよび機能が変化せずに、タンパク質または酵素における所与のアミノ酸残基が変化したものであり、その変化は、１つのアミノ酸の同様な特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族等）を有するアミノ酸との置換を含むが、これだけに限定されない。一部のアレリック変異では、アミノ酸置換がタンパク質の機能に劇的な影響を及ぼさないような機能保存変異体が生ずる。同様に、相同タンパク質は機能保存変異体であり得る。類似の性質を有するアミノ酸は当技術分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンは、親水性の塩基性アミノ酸で、相互交換可能である。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換できる。そのような変化は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量や等電点にほとんど、または全く影響を及ぼさないと予想される。保存配列であると示されている以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素が異なっており、そのため、類似の機能の２つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性の割合が異なっている可能性があり、例えば、クラスター法のような方法によるアラインメントスキームに従って測定したとき、７０％−９９％であると思われる。この場合、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいている。「機能保存変異体」は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定したとき、少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素も含む。この場合、パラメーターは、参照配列の全長にわたって試験した配列間で、好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは少なくとも８５％、なおも好ましくは少なくとも９０％最大の一致が得られるように選択した。そしてそれは、それと比較した天然または親タンパク質または酵素と同じ、または実質的に同様の性質または機能を有している。
本明細書で用いているように、「相同」という用語は、そのすべての文法上の形態および綴りの変形体において、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）のタンパク質および異なる動物種の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖等）を含む「共通の進化上の起源」を有するタンパク質の間の関係を指す（リークら（Ｒｅｅｃｋ、ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ第５０巻、６６７ページ、１９８７年）。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、類似性の割合あるいは特定の残基またはモチフの存在の点での配列の類似性を反映する配列相同を有する。
したがって、すべての文法上の形態の「配列類似性」という用語は、共通の進化上の起源を共有する、あるいは共有しないタンパク質の核酸またはアミノ酸配列の間の一致または類似の程度を指す（Ｒｅｅｃｋ、ｅｔ ａｌ．を参照）。しかし、共通の用法および即時の適用例において、「相同」という用語は、「高度に」のような副詞で修飾したとき、配列類似性を指し、共通の進化上の起源に関連するか、または関連しない。
特定の実施形態において、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒおよびその他の配列比較アルゴリズムによって決定したとき、配列を他の配列と区別するために定められた長さのＤＮＡ配列にわたって十分の数のヌクレオチドが一致したとき、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。この場合、パラメーターは、参照配列の全長にわたって試験した配列間で最大の一致が得られるように選択した。実質的に相同である配列は、配列データバンク、もしくは特定のシステムについて定められた、例えば、緊縮条件下でのサザンハイブリッド形成実験で、利用可能な標準ソフトウエアを用いて、配列を比較することによって確認することができる。そのような緊縮条件は、当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１−６．３．６に見いだすことができる。緊縮ハイブリッド形成条件の非限定的例は、約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリッド形成、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、５０℃、好ましくは５５℃、さらに好ましくは６０℃または６５℃で１回または複数回洗浄する。
同様に、特定の実施形態において、配列を他の配列と区別するために定められた長さにわたって十分なアミノ酸が同一または同様（機能的に同じ）であるとき、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムまたは上述のいずれかのプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を用いたアライメントに よって確認する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する次の参考文献を参照により本明細書に組み込む。ＢＬＡＳＴアルゴリズム：アルチュール エスエフ、ギシュ ダブリュ、ミラー ダブリュ、マイヤーズ イーダブリュおよびリップマン ディージェー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻、４０３−４１０ページ、１９９０年；ギシュ ダブリュおよびステーツ ディージェー（Ｇｉｓｈ，Ｗ． ＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．第３巻、２６６−２７２ページ、１９９３年；マデッン ティーエル、タツソフ アールエルおよびツアン ジェー（Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、Ｔａｔｕｓｏｖ，Ｒ．Ｌ． ＆ Ｚｈａｎｇ，Ｊ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２６６巻、１３１−１４１ページ、１９９６年；アルチュール エスエフ、マデッン ティーエル、シェフェル エーエー、ツアン ジェー、ツアン ゼット、ミラー ダブリュおよびリップマン ディージェー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、 Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２５巻、３３８９−３４０２ページ、１９９７年；ツアン ジェーおよびマデッン ティーエル（Ｚｈａｎｇ，Ｊ． ＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．第７巻、６４９−６５６ページ、１９９７年；ウートン ジェーシーおよびフェダーヘン エス（Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ． ＆ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｓ．）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．第１７巻、１４９−１６３ページ、１９９３年；ハンコック ジェーエムおよびアームストロング ジェーエス（Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ． ＆ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．第１０巻、６７−７０ページ、１９９４年；アラインメントスコアリングシステ ム：ダイホッフ エムオー、シュワルツ アールエムおよびオーカット ビーシー（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ． ＆ Ｏｒｃｕｔｔ，Ｂ．Ｃ．）（１９７８年）「Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｉｎ「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」第５巻、増刊第３号、エムオー デイホッフ（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ）編、３４５−３５２ページ、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；シュワル ツ アールエムおよびデイホッフ エムオー（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ． ＆ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．）（１９７８年）「Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」Ｉｎ「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、第５巻、増刊第３号、エムオー デイホッフ（Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ）編、３５３−３５８ページ、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；アル チュール エスエフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１９巻、５５５−５６５ページ、１９９１年；ステーツ ディージェー、ギシュ ダブリュ、アルチュール エスエフ（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ第３巻、６６−７０ページ、１９９１年；ヘニコッフ エスおよびヘニコッフ ジェージー（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ． ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国第８９巻、１０９１５−１０９１９ページ、１９９２年；アルチュール エスエフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．第３６巻、２９０−３００ページ、１９９３年；アラインメント統計学：カーリン エスおよびアルチュール エスエフ（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． ＆ Ａｌｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国第８７巻、２２６４−２２６８ページ、１９９０年；カーリン エスおよびアルチュール エスエフ（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． ＆ Ａｌｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国第９０巻、５８７３−５８７７ページ、１９９３年；デムボ エー、カーリン エスおよびゼイトウニ オー（Ｄｅｍｂｏ，Ａ．、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． ＆ Ｚｅｉｔｏｕｎｉ，Ｏ．）、Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．第２２巻、２０２２−２０３９ページ、１９９４年およびアルチュール エスエフ（Ａｌｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）（１９９７年）「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」Ｉｎ「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．」（エス スハイ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ）編）、１−１４ページ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼを結合することができるＤＮＡ調節領域であり、配列の転写を開始する。本発明を定義する目的のために、ｃＤＮＡの上流にあるプロモーター配列は転写開始部位によってその３’末端で結合されていて、バックグラウンドより上の検出可能なレベルの転写を開始するに必要な最小限の数の塩基または要素を含めるために上流側（５’方向）に伸びている。ｃＤＮＡの下流にあるプロモーター配列（（−）ＲＮＡを発現する）は転写開始部位によってその５’末端で結合されていて、バックグラウンドより上の検出可能なレベルの転写を開始するに必要な最小限の数の塩基または要素を含めるために下流側（３’方向）に伸びている。本発明による２方向システムは、上流および下流プロモーターを含み、１方向システムは上流プロモーターのみを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって適宜定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担っているタンパク質結合ドメイン（共通配列）が見いだされる。
本発明の本質的な要素が保存される限り、あらゆる既知のプロモーターを本発明で用いてもよい。例えば、遺伝子発現を調節するのに用いられるｐｏｌＩＩプロモーターは、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ベノイストおよびチャムボウ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｕ）、Ｎａｔｕｒｅ第２９０巻、３０４−３１０ページ、１９８１年）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれているプロモーター（ヤマモトら（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ ２２巻、７８７−７９７ページ、１９８０年）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ワグナーら（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国．７８巻、１４４１−１４４５ページ、１９８１年）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（ブリンスターら（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔｕｒｅ第２９６巻、３９−４２ページ、１９８２年）；Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび問題の宿主細胞中で有効な他のプロモーターを含むが、これらだけに限定されない。キャップ構造を有さないＲＮＡの発現のためのｐｏｌＩプロモーターは、すべての真核生物に遍在しており、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩに含まれている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ダーネルら（Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）編、１９８６年、３１１ページ、３６５−６ページを参照）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターも本発明に用いることができる。
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｖＲＮＡ）に転写するとき、細胞中で転写および翻訳調節配列（例えば、ｐｏｌＩまたはｐｏｌＩＩプロモーター）「の制御下にあり」、「と機能的に関連し」または「と効果的に関連し」ている。
「発現する」または「発現」という用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報が顕在化することを可能にする、またはそれを顕在化させることを意味し、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってＲＮＡ（ｃＲＮＡ、ｖＲＮＡおよびウイルスｍＲＮＡを含む）またはタンパク質を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞によって、または細胞内に発現して、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、生ずるタンパク質も、細胞によって「発現された」と言われることがある。
「トランスフェクション」という用語は、細胞中に外来核酸を導入し、その結果、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、導入された遺伝子または配列によってコードされた所望のポリペプチドを産生することを意味する。導入された遺伝子または配列は、「クローン化」または「外来」遺伝子または配列とも呼ばれることがあり、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌または細胞の遺伝機構によって使用される他の配列のような調節または制御配列を含んでいてよい。遺伝子または配列は、非機能配列または既知の機能を有さない配列を含んでいてよい。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受け、発現している宿主細胞は、「形質転換」されており、「形質転換細胞」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または種の細胞、もしくは異なる属または種の細胞を含むあらゆる源からのものであってよい。
「ベクター」「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる伝達体を意味する。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。
ベクターは一般的に、外来ＤＮＡが挿入される伝達性病原体（ａｇｅｎｔ）のＤＮＡを含む。１つのＤＮＡのセグメントを他のＤＮＡのセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特異的部位（ヌクレオチドの特定の基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を必要とする。「カセット」は、定義された制限部位においてベクターに挿入することができる発現産物をコードするＤＮＡコーディング配列またはＤＮＡのセグメントを指す。カセット制限部位は、適切なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を保証するようにデザインされている。一般的に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位において挿入され、次いで、ベクターによって、伝達性ベクターＤＮＡとともに宿主細胞に運ばれる。発現ベクターのような挿入された、もしくは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構成物」とも呼ばれている。ベクターの一般的なタイプは「プラスミド」であり、これは、一般的に、付加的（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、適切な宿主細胞に容易に導入することができる、通常細菌由来の２本鎖ＤＮＡの自己充足分子である。プラスミドベクターは、コーディングＤＮＡとプロモーターＤＮＡを含むことが多く、外来ＤＮＡの挿入に適した１つまたは複数の制限部位をもっている。コーディングＤＮＡは、特定のタンパク質または酵素の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始させ、調節し、または別の方法で媒介し、あるいは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコーディングＤＮＡは、同じ遺伝子由来のものでも異なる遺伝子由来のものでもよく、同じ、または異なる生物由来のものでもよい。組換えクローニングベクターはしばしば、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製システム、宿主における選択、例えば抗生物質耐性の１つまたは複数のマーカー、および１つまたは複数の発現カセットを含む。
「発現システム」という用語は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされたタンパク質の発現に適した条件下の宿主細胞および適合ベクターを意味する。
「異種」という用語は、天然に存在しない要素の組合せを指す。例えば、異種ＤＮＡは、細胞中または細胞の染色体部位に天然にはないＤＮＡを指す。好ましくは、異種ＤＮＡは、細胞にとって異質の遺伝子を含む。異種発現調節要素は、天然で効果的に結合している遺伝子よりも異なる遺伝子と効果的に結合した要素である。本発明と関連して、配列のライブラリーからの配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子は、クローニングまたは発現のためにそれが挿入されているベクターＤＮＡに対して異種であり、それが発現するそのようなベクターを含む宿主細胞に対して異種である。
上記のように、本発明は、異種ウイルス遺伝子を用いて再構築ウイルスを発生させることを可能にする。培養中でよく成長するように適応させたウイルス株の遺伝的バックグラウンドにおけるウイルス抗原に対する遺伝子を組み込むことに加えて、本発明は、交差種再構築、例えば、インフルエンザＡバックグラウンドにおけるインフルエンザＢ抗原を作ることを可能にする。
ワクチン
上記のように、本発明はＲＮＡウイルス感染、好ましくはマイナス鎖ＲＮＡウイルス感染を治療または予防するためのワクチンの生産の効率のよい、経済的な戦略を提供する。本発明による最少のプラスミドに基づくシステムは、選択の必要性をなくし、再構築ウイルスの精密なコントロールを提供する。不活性化インフルエンザワクチンの生産のために、高収量株（例えば、ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））の非糖タンパク質セグメント（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＭおよびＮＳ）を含む６つのプラスミドを推奨ワクチンサブタイプのＨＡおよびＮＡｃＤＮＡを含む２つの発現プラスミドとともにコトランスフェクトすることができる。ヘルパーウイルスは必要でないので、発生したウイルスは、所望の遺伝子配列を有するインフルエンザウイルスである。同様のアプローチを用いて、ワクチン用の不活性化再構築ＲＮＡウイルスの変種を生産することができる。標的ウイルスのウイルス遺伝子セグメント（例えば、非糖タンパク質セグメント）を含む発現プラスミドを、所与の感染性ウイルスサブタイプ（例えば、現在集団において循環しているウイルスサブタイプ）に対応するタンパク質をコードする他の発現プラスミドとともにコトランスフェクトすることができる。本発明によって生成させたウイルスは、ワクチン接種に対する伝統的または新規のアプローチ（ビルセルおよびカワオカ（Ｂｉｌｓｅｌ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第３２章、４２２−４３４ページを参照）、特に、弱毒化生ワクチン（以下で詳細に論じる）の開発に用いることができる。特に、本発明は、宿主の範囲が限られていることや、弱毒化が予測できないなどの、再構築ウイルスの開発に関する現在の技術の欠点を克服するものである（ｉｄ）。
インフルエンザワクチンの開発には多くの努力が払われた（ウッドおよびウイリアムス（Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２３章、３１７−３２３ページを参照）。このセクションの多くはインフルエンザワクチンに関連しているが、本発明の適用範囲は、すべてのＲＮＡウイルスワクチン、好ましくは、マイナス鎖セグメントＲＮＡウイルスワクチンおよび特にオルトミクソウイルスワクチンに及んでいる。
次の３つのタイプの不活性化インフルエンザワクチンが現在入手可能である：全ウイルス、スプリット産物および表面抗原ワクチン（ウッド（Ｗｏｏｄ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２５章、３３３−３４５ページを参照）。本発明は、培養中での許容できる成長特性を有する所望の再構築ウイルスの迅速な開発を可能にするので、ワクチン製造業者が公衆衛生上の必要を満たし、標準化を保証する十分な量のワクチンを有利に製造することを可能にする。このことは、通常８−９ヶ月間にわたる臨床量のワクチンを製造する必要によって現在軽減されている重要な要件である（ウッド（Ｗｏｏｄ）、上記３３３ページ）。
ワクチンの安全性も問題である（ウィセルカ（Ｗｉｓｅｌｋａ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２６章、３４６−３５７ページを参照）。本発明によるワクチンは定義された細胞培養システム中での生産が可能であるため、ふ化卵中で調製されている市販のワクチンに存在する可能性がある非特異的病原体、細菌およびアレルゲン性タンパク質を避けることができる。
アジュバントはワクチン（例えば、インフルエンザワクチン）とともに用いられてきた（ウッドおよびウイリアムス（Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、上記）。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増大させる化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原を徐々に放出させる組織貯蔵庫として、また免疫応答を非特異的に増大させるリンパ様システムアクチベーターとしても役割を果たすことができる（フードら（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、１９８４年、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、３８４ページ）。しばしば、アジュバントの非存在下での抗原のみによる一次惹起で、体液性または細胞性免疫応答が誘発されないことがある。アジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾルシンのような界面活性剤、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素乳濁液、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらだけに限定されない。好ましい合成アジュバントの例は、ＱＳ−２１である。あるいは、もしくはさらに、下記のような免疫促進性タンパク質は、アジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を増大させるために提供することができる。好ましくは、アジュバントは製薬上許容できるものである。
「製薬上許容できる」という句は、ヒトに投与したとき、生理的に耐えることができ、一般的に、アレルギーや、胃の不調、めまい等の同様な有害な反応を引き起こさない分子または組成物を指す。好ましくは、本明細書で用いているように、「製薬上許容できる」という用語は、連邦または州政府の規制当局により承認されている、もしくは、米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に、動物用および、より具体的にヒト用として収載されていることを意味している。「担体」という用語は、化合物を一緒に投与する希釈剤、補助薬、賦形剤または溶媒を指す。滅菌水または水溶液、食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射溶液に対する担体として用いることが好ましい。適切な医薬品担体は、イーダブリュ マーチン（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）著のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
ワクチン接種の有効性は、免疫促進性、免疫増強性、プロ炎症性サイトカイン、リンホカインまたはケモカインなどの免疫促進性分子（サルガラーおよびロッジ（Ｓａｌｇａｌｌｅｒ ａｎｄ Ｌｏｄｇｅ）、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１９９８年、第６８巻、１２２ページ）とワクチン、具体的には、ベクターワクチンとの併用投与によって増大させることができる。例えば、インターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３のようなサイトカインまたはサイトカイン遺伝子、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド（ライマン（Ｌｙｍａｎ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、第５巻、１９２ページ、１９９８年）ならびにいくつかの重要なｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分子またはそれらの遺伝子（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２）を用いることができる。これらの免疫促進性分子は、タンパク質として、あるいは分子の発現をコードするベクターの発現により全身的または局所的に送達することができる。
樹状細胞標的：ワクチン接種は、樹状細胞を標的とすることによって達成される（スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．第１２８巻、５３１ページ、１９９６年；スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第２４巻、８５９ページ、１９９６年；テイトら（Ｔａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．）、ｌｅｕｋｅｍｉａ第１３巻、６５３ページ、１９９９年；アビガン（Ａｖｉｇａｎ）、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．第１３巻、５１ページ、１９９９年；ディニコラら（ＤｉＮｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．第４巻、２６５ページ、１９９８年）。樹状細胞は、Ｔ細胞依存性免疫の活性化に非常に重要な役割を果たしている。増殖性樹状細胞を用いて、ｉｎ ｓｉｔｕで免疫原性の形態にあるタンパク質抗原を捕捉し、Ｔ細胞によって認識され、Ｔ細胞を刺激できる形態のこれらの抗原を提示するのに用いることができる（例えば、スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第２４巻、８５９−８６２ページ、１９９６年；イナバら（Ｉｎａｂａ ｅｔａｌ．）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８８巻、２１６３−７３ページ、１９９８年；米国特許第５，８５１，７５６を参照）。ｅｘ ｖｉｖｏ刺激の場合、樹状細胞を培養皿に入れ、十分な量にビリオンに、ウイルス抗原が樹状細胞に結合させるに十分な時間にわたり暴露させる（ビリオンでパルスする）。パルスした細胞を治療を受ける対象に、例えば静脈内注射により戻し移植することができる。好ましくは、自己由来樹状細胞、すなわち治療を受ける対象から得られた樹状細胞を用いる。ただし、型一致ドナーから、もしくは樹状細胞を所望のＭＨＣ分子を発現する（および好ましくは、望ましくないＭＨＣ分子の発現を抑制する）ように遺伝子工学により処理することによって得られるＮＨＣクラスＩＩ適合樹状細胞を用いることも可能である。
好ましくは、樹状細胞はｉｎ ｖｉｖｏでウイルスまたはウイルスサブユニットを取り込むように特異的に標的とする。ＤＥＣ−２０５のような抗原提示を媒介する受容体（スウィッガードら（Ｓｗｉｇｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６５巻、３０２−１１ページ、１９９５年；スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第２４巻、８５９ページ、１９９６年）およびＦｃ受容体を利用することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで樹状細胞を標的とする様々な戦略が利用可能である。
不活性化ワクチン
不活性化ウイルスワクチンは、ＲＮＡウイルス感染（例えば、インフルエンザ）を予防するためのワクチン接種についてよく確立されている（ニコルソン（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２７章、３５８−３７２ページを参照）。不活性化ウイルスを調製するために、トランスフェクトしたウイルスを細胞培養またはふ化卵中で成長させる。ウイルスは、ホルムアルデヒド、ベータプロピオラクトン、エーテル、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−８０など）を含むエーテル、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）およびＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウムおよびリン酸トリ（ｎ−ブチル）で処理して不活性することができる（ファーミンガー（Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ）、上記；ウッドおよびウイリアムス（Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、上記）。不活性は、尿膜液（卵中で生産されたウイルスからの）の清澄化の後、または前に行うことができる。遠心によりビリオンを分離し、精製する（ファーミンガー（Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ）、上記、３２６ページを参照）。ワクチンの効力を評価するために、単一放射免疫核酸（ＳＲＤ）試験を用いた（シルドら（Ｓｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．１９７５年、第５２巻、４３−５０ページおよび２２３−３１ページ；モストウら（Ｍｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７５年、第２巻、５３１ページ）。十分な免疫応答に必要な用量は、標準化されており、１５μｇＨＡ／株／投与である。不活性化ワクチンは、注射により筋肉内に投与することができる。
弱毒化生インフルエンザワクチン
弱毒化低温適応生ＲＮＡウイルスワクチン（インフルエンザワクチン）が開発された（ケイテルおよびピードラ（Ｋｅｉｔｅｌ ａｎｄ Ｐｉｅｄｒａ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２８章、３７３−３９０ページ；ゲンドン（Ｇｈｅｎｄｏｎ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、 Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、第２９章、３９１−３９９ページを参照）。８プラスミドから完全にインフルエンザウイルスを発生させることができることから、ワクチン株の弱毒化の調節が可能であり、標的集団に最適のワクチン株の開発が可能である（ビルセルおよびカワオカ（Ｂｉｌｓｅｌ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ）、上記を参照）。現在、インフルエンザ株Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）またはインフルエンザＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６の株が弱毒化生ワクチンの調製に用いられているので、インフルエンザの内部遺伝子（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ）の６つのｃＤＮＡｓのそれぞれをｐＨＷ２０００のようなプラスミドに挿入するであろう。関連するインフルエンザ株の糖タンパク質ＨＡおよびＮＡを含む２つのプラスミドを構築し、非グリコシル化インフルエンザタンパク質をコードする６つのマスタープラスミドとともにコトランスフェクトするであろう。
内部遺伝子のコーディングまたは非コーディング領域の遺伝的修飾は、弱毒化ウイルスの開発を可能にすることに加えて、ワクチンの安全性、感染力、免疫原性および防御効力を改善すると期待される。
ＨＡ遺伝子の操作によってもワクチン株の安全性を増大させることができる。例えば、高度に病原性の鳥類インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５またはＨ７糖タンパク質の結合ペプチドに認められる塩基性アミノ酸の除去によって、このワクチンの安全性を高めることができる。
粘膜ワクチン接種感染はしばしば粘膜を介して起こるので、粘膜ワクチン戦略は多くの病原性ウイルスに対して特に有効である。粘膜は、ＥＢＮＡ−１ワクチンおよび免疫療法の重要な標的である樹状細胞を含んでいる。したがって、不活性化および弱毒化ウイルスワクチンに関する粘膜ワクチン戦略を企図する。ワクチンの局所送達によって粘膜を標的にすることができるが、免疫原性タンパク質を粘膜に送達するために様々な戦略が用いられた。
特定の実施形態において、ワクチンは、コレラトキシンＢまたはコレラトキシンＡ／Ｂキメラのようなコレラトキシンとの混合物、もしくは複合またはキメラ融合タンパク質として投与することができる（ハジシェンガリス（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５４巻、４３２２−３２ページ、１９９５年；ジョブリングおよびホルメス（Ｊｏｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．第６０巻、４９１５−２４ページ、１９９２年）。コレラトキシンＢサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンが記載された（レーベンスおよびホルムグレン（Ｌｅｂｅｎｓ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ、第８２巻、２１５−２７ページ、１９９４年）。他の実施形態において、熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）との混合物を粘膜ワクチン接種用に調製することができる。
他の粘膜免疫化戦略は、ウイルスをマイクロカプセルに封入すること（米国特許第５，０７５，１０９号、第５，８２０，８８３号および第５，８５３，７６３号）および免疫増強膜性担体を用いること（国際公開第９８／０５５８号）を含む。経口投与した免疫原の免疫原性は、赤血球（ｒｂｃ）またはｒｂｃゴースト（米国特許第５，６４３，５７７号）を用いることにより、あるいはブルータング抗原（米国特許第５，６９０，９３８号）を用いることにより増大させることができる。
本発明は、限定することなく本発明を例示する以下の実施例を参照することによってよりよく理解されるであろう。
実施例１：インフルエンザＡ型ウイルスの発生のためのアンビセンス（Ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）アプローチ：１つの鋳型からのｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ合成
プラスミドの数を少なくする最初の段階として、この実施例は、同じプラスミド上にｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを含むプラスミドの構築とトランスフェクションを報告し、このシステムが１つの鋳型からのｖＲＮＡとタンパク質の発現を可能にするという証拠を提示する。この実施例は公表された（ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０００年、第２６７号、３１０ページ）。
材料および方法
プラスミドのクローニング
すべてのクローニングおよびＰＣＲ反応は、標準プロトコールに従って実施した。簡単に述べると、Ａ／ＷＳＮ／３３のポリメラーゼ複合遺伝子の発現プラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時型プロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードする遺伝子のポリＡ部位を含むｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られた。ウイルスｃＤＮＡは、発現構成物ｐＨＷ２５−ＮＰ、ｐＨＷ２３−ＰＡ、ｐＨＷ２１−ＰＢ２、ｐＨＷ２２−ＰＢ１を得るために、プラスミドｐＷＮＰ１４３、ｐＷＳＮＰＡ３、ｐＷＳＮＰＢ２−１４、ｐＧＷ−ＰＢ１から得た。ｐＨＷ１２は、ヒトｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーター配列をｐｏｌＩＩプロモーターとポリＡ部位との間に挿入して得た。プラスミドｐＨＷ５２は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位により延長されたＰＢ１の非コーディング領域を含むオリゴヌクレオチドを最初に挿入し、次に、ｐＨＷ２２−ＰＢ１のＰＢ１コーディング領域をこれらの部位に挿入して、ｐＨＷ１２から得た。プラスミドｐＨＷ８２−ＰＢ１は、ＣＭＶプロモーター配列の削除によりｐＨＷ５２−ＰＢ１から得た。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行ない、ＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩ消化後にｃＤＮＡをヒトｐｏｌＩプロモーターおよびマウスターミネーターならびにＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩ部位により分離されたＭセグメントの非コーディング領域を含むプラスミドｐＨＷ７２に挿入した後にリポーター構成物ｐＨＷ７２−ＥＧＦＰにおける増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のコーディング領域を得た。ｐＨＷ１２７−ＭおよびｐＨＷ１２８−ＮＳは、セグメント特異的配列およびＢｓｍＢＩ部位を含むプライマーを用いてウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅し、ＢｓｍＢＩ消化ベクターｐＨＨ２１に挿入して、構築した（イー ホフマン（Ｅ Ｈｏｆｆｍａｎｎ）、Ｐｈ．Ｄ．学位論文１９９７年、Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｉｅｓｓｅｎ、ドイツ；ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３４５ページ）。プラスミドｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１、 ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ、 ｐＥＷＳＮ−ＨＡおよびｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５は、他の論文（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、上記）に記載された。
細胞培養およびトランスフェクション
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）中で維持し、２９３Ｔヒト胚腎臓細胞を１０％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。製造業者の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて１×１０６個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。種々の量のプラスミド（表１）をＴｒａｎｓＩＴＬＴ−１（２μｌＴｒａｎｓＩＴＬＴ−１／１μｇ ＤＮＡ）と混合し、室温で４５分間インキュベートし、細胞に加えた。６時間後に、ＤＮＡ−トランスフェクション混合物を０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）で置換した。トランスフェクションの４８時間後に、ウイルスを含む上清をＭＤＣＫ細胞で力価測定した。
ＲＮＡ分離およびＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ウイルスＲＮＡをウイルス粒子から分離した。組換えインフルエンザの特性を検討するために、供給されたプロトコールに従ってＡｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ実験に次のプライマーを用いた。 Ｓｅｑ−ＰＢＩ＃１：５’−ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＧ Ｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；Ｓｅｑ−ＰＢ１＃２：５’−ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；Ｂｍ−ＰＢ１−１：５’−ＴＡＴ ＴＣＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＣＧ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＧＣ Ａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；Ｂｍ−ＰＢ１−２３４１Ｒ：５’−ＡＴＡ ＴＣＧ ＴＣＴ ＣＧＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＰＣＴ−２００ ＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて実施した。増幅プログラムは、４８℃で４５分間（第１鎖ｃＤＮＡ合成）の１サイクルおよび９４℃で２分間（ＡＭＶ逆転写酵素の不活性化およびｃＤＮＡ変性）の１サイクルから開始した。これらのサイクルに続いて、９４℃で２０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の４０サイクル（ＰＣＲ増幅）を行った。プログラムは７２℃で５分間の１サイクルで終了した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で分析し、プライマーＳｅｑ−ＰＢ１＃１またはＳｅｑ−ＰＢ１＃２を用いて配列決定した。
フローサイトメトリー
トランスフェクションの４８時間後に、２９３Ｔ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ペレットとし、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳに再懸濁した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施し、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアパッケージを用いて解析した。ＥＧＦＰ発現分析には、ＥＧＦＰ媒介蛍光検出の高い感度を達成するために５３０ｎｍの発光波長（ＦＬ１）を用いた。
結果および考察
２種の真核プロモーターを含むクローニングベクターｐＨＷ１２の設計および特徴
インフルエンザＡ型ウイルスは、マイナスセンス極性を有するＲＮＡ分子を含むセグメントウイルスである。複製サイクル中、リボ核タンパク質複合タンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ）による８ｖＲＮＡセグメントの５’および３’構造の認識は、インフルエンザウイルス遺伝子の複製と転写をもたらす。末端配列要素が高度に保存されているということから、転写された人工ＲＮＡが５’および３’末端の配列と同じ配列を有していることがわかる（ルオら（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９１年、第６５巻、２８６１ページ；フリックら（Ｆｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．）、ＲＮＡ １９９６年、第２巻、１０４６ページ）。クローニングベクターｐＨＷ１２が構築され、制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩを用いてｐｏｌＩプロモーターとターミネータとの間に問題の配列の挿入がなされた。ｐｏｌＩ転写単位の両端に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのｐｏｌＩＩプロモーターと、ウシ成長ホルモンをコードする遺伝子のポリアデニル化シグナルが隣接している。ＣＭＶプロモーター、ポリＡ部位およびプラスミドのバックボーンは、クローニングベクターｐｃＤＮＡ３由来である。
ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩ２方向転写システムにおけるＰＢ１タンパク質発現
ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩ１プラスミド転写システムを試験するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスのＰＢ１遺伝子のｃＤＮＡをクローニングベクターｐＨＷ１２に挿入したところ、プラスミドｐＨＷ５２−ＰＢ１が得られた。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位をこの遺伝子の５’および３’非コーディング領域に挿入した。発生した組換えウイルスがＲＴ−ＰＣＲによって同定できるようにするために、これらの遺伝標識を含めた。本願発明者らは、このプラスミドでトランスフェクトされたヒト細胞が２種のＲＮＡ、すなわち、細胞ｐｏｌＩによって合成されるＰＢ１−ｖＲＮＡおよびｐｏｌＩＩによって合成される５’キャップ構造を有するｍＲＮＡを生成することを予想した。ｍＲＮＡの翻訳によりＰＢ１−タンパク質が合成される。
この構成物からＰＢ１タンパク質が生産されるかどうかを検討するために、本願発明者らは、ＣＭＶプロモーターの制御下にＡ／ＷＳＮ／３３のＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質をコードするｃＤＮＡｓを含む発現プラスミドｐＨＷ２１−ＰＢ２、ｐＨＷ２３−ＰＡおよびｐＨＷ２５−ＮＰを構築することによって人工ｖＲＮＡの複製と転写を試験した。人工ｖＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ合成のために、本願発明者らはＭセグメントの非コーディング領域およびヒトｐｏｌＩプロモーターとマウスターミネーター配列が両端に隣接したＥＧＦＰ ｃＤＮＡを含むリポータープラスミドｐＨＷ７２−ＥＧＦＰを構築した。５つのプラスミド（２μｇ ｐＨＷ２１−ＰＢ２、２μｇ ｐＨＷ５２−ＰＢ１（ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプロモーター構成物）、２μｇ ｐＨＷ２３−ＰＡ、２μｇ ｐＨＷ２５−ＮＰおよび１μｇ ｐＨＷ７２−ＥＧＦＰ）を２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４および４８時間後に、細胞を蛍光顕微鏡検査法により分析した。２４時間後に蛍光細胞が認められた。この結果は、２４時間以内にポリメラーゼタンパク質が、ＥＧＦＰ−ｖＲＮＡのインフルエンザウイルス特異的末端の認識を可能にするに十分な濃度で合成されることを示すものである。これらのタンパク質は、ＥＧＦＰに翻訳されるｍＲＮＡを合成する。
このシステムの効率を評価するために、本願発明者らはフローサイトメトリー分析を実施して、蛍光細胞の数を計数した。５プラスミドのトランスフェクションの４８時間後に、細胞集団の１８．７２％が蛍光を示した。ｐＨＷ５２−ＰＢ１プラスミドを加えなかったとき、バックグラウンドレベルの蛍光細胞（０．０６％）が認められたにすぎなかった。この所見は、ｖＲＮＡの増幅には４種のＲＮＰ複合タンパク質のすべてが必要であることを示す以前の試験（ファンら（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９０年、第６４巻、５６６９ページ）の所見と一致している。結果から、ＰＢ１−ｃＤＮＡ転写とＰＢ１タンパク質ならびに他のＲＮＰ複合タンパク質の得られた濃度はウイルス転写／複製過程を開始するに十分なものであることがわかる。
組換えインフルエンザＡ型ウイルスの発生
感染性インフルエンザＡ型ウイルスの発生のためには、プラスミドｐＨＷ５２−ＰＢ１が、ＰＢ１ｍＲＮＡおよびタンパク質だけでなく、子孫ウイルスにパッケージングすることができる十分な量のＰＢ１−ｖＲＮＡも供給することが必要である。残りの７種のｖＲＮＡについては、本願発明者らは、ヒトｐｏｌＩプロモーターとマウスターミネーターが両端に隣接した、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスの全長ＲＮＡのｃＤＮＡｓを含むプラスミドを用いた。これらのプラスミドのトランスフェクションにより、新たなｖＲＮＡを生成するポリメラーゼタンパク質によって複製され、転写される８種のウイルスＲＮＡのすべての合成がもたらされるはずである。構造タンパク質の合成の後に、ＲＮＰｓが新しいウイルス粒子にパッケージングされるであろう。
本願発明者らは、種々の量のｐＨＷ５２−ＰＢ１プラスミド（０、２、４μｇ）ならびにプラスミドｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ、ｐＨＷ１２７−Ｍ、ｐＨＷ１２８−ＮＳ（各１μｇ）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。タンパク質発現プラスミドｐＨＷ２１−ＰＢ２（１μｇ）、ｐＨＷ２３−ＰＡ（０．１μｇ）、ｐＨＷ２５−ＮＰ（１μｇ）、ｐＥＷＳＮ−ＨＡ（１μｇ）およびｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５（１μｇ）をコトランスフェクトした。赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対する発現プラスミドを含めたところ、トランスフェクタントウイルスの収量が増加した。
トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクトされた初代２９３Ｔ細胞の上清をＭＤＣＫ細胞に移した。ｐＨＷ５２−ＰＢ１プラスミドを加えたすべてのトランスフェクション実験において、継代培養の２４時間後にウイルス誘発性の細胞変性効果を認めた。ＰＢ１発現プラスミドをトランスフェクション反応に含めなかった場合、細胞変性効果は見られなかった。ＭＤＣＫ細胞上のトランスフェクトされた細胞の上清の力価測定により、ウイルス力価を測定した。上清は２×１０４−２×１０５ｐｆｕ／ｍｌを含むことがわかった。この所見から、ＰＢ１−ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプロモータープラスミド（発現プラスミドとともに）のトランスフェクションの後にＰＢ１ ｖＲＮＡおよびＰＢ１タンパク質がヒト細胞株２９３Ｔ中で感染性インフルエンザＡ型ウイルスの発生に十分なレベルで合成されることがわかる。２プラスミド（ｐＨＷ８２−ＰＢ１およびｐＨＷ２２−ＰＢ１）上の分離されたＰＢ１−ｃＤＮＡを含むプラスミドを用いたコトランスフェクション実験で、２×１０４ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価が認められた。野生型ＰＢ１配列を含むプラスミドを用いた同様な実験で、３×１０６ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価が得られた。
以前の試験（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３４５ページ）で使用されたｐｏｌＩＩプロモーターを含む発現構成物と異なり、本願発明者らはＣＭＶプロモーターとポリアデニル化部位との間に挿入されているｐｏｌＩ転写単位から得られる配列を含むプラスミドｐＨＷ５２−ＰＢ１を用いた。ＥＧＦＰリポーター遺伝子の発現は、このシステムにおけるＰＢ１タンパク質の全体的な発現がＥＧＦＰ−ＲＮＰ複合体の生成に十分なものであることを示している。ｐｏｌＩプロモーター／ターミネーター領域はｐｏｌＩ特異的転写および終結因子に対する認識配列を含んでいる（ベックマンら（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５年、第２７０巻、１５０６ページ；ベルら（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８年、第２４１巻、１１９２ページ；クーンら（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４年、第１３巻、４１６ページ）が、これらのＤＮＡ結合タンパク質はｐｏｌＩＩ媒介転写を阻害しないように思われる。これらの所見は、ｐｏｌＩ特異的ＤＮＡ結合タンパク質は細胞ｒＤＮＡ転写が起こるコンパートメントである核により豊富に存在するという所見（エバースら（Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９５年、第１４巻、１２４８ページ）と一致している。これらの結果から、ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプロモーター構成物の細胞中へのトランスフェクションの後に、一部のプラスミドが核に送達され、そこでｐｏｌＩ媒介の転写が起こり、一部が核に保持され、そこでそれらがＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されることがわかる。
リポーターｐＨＷ５２−ＰＢ１構成物は開始コドンの前および停止コドンの後の非コーディング領域における付加的非インフルエンザウイルス配列（制限部位）を含んでいるので、本願発明者らは、これらの配列がウイルスＰＢ１ ＲＮＡセグメントに安定に維持されていたかどうかに興味をもった。したがって、本願発明者らはＭＤＣＫ細胞上でのトランスフェクタントウイルスの第２継代培養の後に、ｖＲＮＡを分離し、逆転写ＰＣＲ分析を実施した。ＰＢ１特異的プライマーを用いたｖＲＮＡの増幅により、予想されたサイズのｃＤＮＡ断片の発生がもたらされた。同じウイルスＲＮＡおよびプライマーを用いたが、逆転写酵素を加えなかった場合、増幅生成物は得られなかったことから、ウイルスＲＮＡを起源とし、プラスミドＤＮＡを起源としないｃＤＮＡがトランスフェクトされた細胞の上清から持ち越されたことがわかった。
ＰＣＲ生成物の配列決定により、両制限部位配列がＲＮＡ分子中に存在していたことが示された。結果から、ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩ転写システムは感染性組換えウイルスの回収を可能とするものであり、ＰＢ１遺伝子の非コーディング領域に外来配列を有するウイルスが生存可能であることがわかる。この修飾ＰＢ１セグメントは依然として複製され、転写され、ウイルス粒子にパッケージングされている。以前に、ＲＮＰトランスフェクションシステムを用いて、インフルエンザＡウイルスセグメントの非コーディング領域を変更した。ＮＡ遺伝子の非コーディング領域をインフルエンザＢのＮＳセグメントの対応する配列で置換することにより、トランスファクタントインフルエンザウイルスが得られた（ムスターら（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９１年、第８８巻、５１７７ページ；バーグマンおよびムスター（Ｂｅｒｇｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｓｔｅｒ）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５年、第７６巻、３２１１ページ）。キメラＮＡセグメントを有するこの種のウイルスは、マウスおよび野生型インフルエンザウイルス感染の予防のために非致死用量で接種したマウスにおいて弱毒化表現型を示した。これらの結果は、ＲＮＡセグメントの非コーディング領域の遺伝的改変がトランスファクタントウイルスの生物学的性質を変化させ得ることを示している。ここに、本願発明者らは、非インフルエンザウイルス配列さえもＰＢ１セグメントの非コーディング領域に挿入できることを最初に報告する。
ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩ転写システムにより、ＰＢ１セグメントの非コーディング領域におけるこれらの配列要素を系統的に修飾し、これらの遺伝子操作が組換えウイルスの生物学的性質の変化をもたらすかどうかを評価することが今や可能である。実際、突然変異したＰＢ１セグメントを有するウイルスの収量が野生型ウイルスと比較して低いことから、挿入された配列がウイルスの成長に負の影響を及ぼしていることがわかる。
最近開発されたプラスミドに基づくシステム（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、上記）はインフルエンザウイルスを発生させる点については非常に効率がよいが、１４−１７のクローニングプラスミドを必要とする。この試験では、本願発明者らは、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルス株の効率のよい回収に必要なプラスミドの数を１３に減らした。このアプローチによって達成されたプラスミドの数の低減は、２９３Ｔ細胞以外の細胞株のトランスフェクションの効率の増大を約束するものであり、したがって、１４個のプラスミドの効率のよい送達を達成するのが困難である細胞株への遺伝子の送達を可能にするものである。フォドーら（Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年、第７３巻、９６７９ページ）は、１２プラスミドをトランスフェクトした後にインフルエンザウイルスを救出することができたが、その試験におけるウイルス収量は、トランスフェクトされた１０６個のベロ細胞当たり１−２個の感染性ウイルスにすぎなかった。
実施例２：最少のプラスミドに基づくシステムによる組換えインフルエンザＡ型ウイルスの構築
この実施例では、クローン化ｃＤＮＡからインフルエンザＡ型ウイルスを完全に救出するためのプラスミドに基づくトランスフェクションシステムの使用を記載する。確立されたプラスミドに基づくシステムと異なり、インフルエンザＡ型ウイルスの発生のためのこのシステムでは、それぞれがウイルス遺伝子セグメントに対応する異なるウイルスｃＤＮＡの１つのコピーを含む８つの発現プラスミドのみの構築とトランスフェクションを用いる。この逆遺伝学システムは、インフルエンザＡ型ウイルスの回収に必要なプラスミドの数を低減させ、再構築ウイルスの予測可能かつ効率的な発生を可能にするものである。
材料および方法
プラスミドのクローニング
プラスミドｐＨＷ２０００（図３Ａ）をｐＨＷ１２から得た（実施例１）。ｐＨＷ２０００クローニングベクターは、２つのＢｓｍＢＩ部位で隔てられた２２５ｂｐのヒトｐｏｌＩプロモーターと３３ｂｐのマウスターミネーター配列を含む。ｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーター要素の両端には、ヒトサイトメガロウイルスのｔｒｕｎｃａｔｅｄ即時型プロモーター（ｐｃＤＮＡ３［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｎｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ］に認められるように転写部位の約３５０ｂｐ上流で始まる）とウシ成長ホルモンをコードする遺伝子のポリアデニル化シグナルが隣接している。ウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）のｃＤＮＡを含む８つのプラスミド（ｐＨＷ１８１−ＰＢ２、ｐＨＷ１８１−ＰＢ１、ｐＨＷ１８３−ＰＡ、ｐＨＷ１８４−ＨＡ、ｐＨＷ１８５−ＮＰ、ｐＨＷ１８６−ＮＡ、ｐＨＷ１８７−ＭおよびｐＨＷ１８８−ＮＳ）は、プラスミドｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３４５ページ）、ｐＨＷ１２７−ＭおよびｐＨＷ１２８−ＮＳ（実施例１）のＡｐａＩ−ＳａｌＩ断片（ウイルスｃＤＮＡならびにｐｏｌＩプロモーターおよびターミネーター配列を含む）をｐＨＷ２０００のＡｐａＩ−ＳａｌＩベクター断片に挿入して構築した。Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のｃＤＮＡを含む８つのプラスミド（ｐＨＷ２４１−ＰＢ２、ｐＨＷ２４２−ＰＢ１、ｐＨＷ２４３−ＰＡ、ｐＨＷ２４４−ＨＡ、ｐＨＷ２４５−ＮＰ、ｐＨＷ２４６−ＮＡ、ｐＨＷ２４７−ＭおよびｐＨＷ２４８−ＮＳ）は、ウイルスＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅によって構築した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、それらの３’末端のセグメント特異的配列およびそれらの５’末端のＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩ制限部位配列を含んでいた。ＰＣＲ生成物をＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩで消化させた後、断片をベクターｐＨＷ２０００中でクローンした（図３Ａ）。Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のゲノムの増幅に用いたプライマーの配列は以下の通りである。プライマーは５’および３’末端に対応して左から右に示す。インフルエンザＡ特異的ヌクレオチドは下線で示す。
（注：ＨＡおよびＮＳセグメントは、非コーディング領域のこの部分では同じ配列を有している）
プライマー５’−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を用いてＲＴ反応を実施した。発現プラスミド中でＲＴ−ＰＣＲ増殖により得られたウイルスｃＤＮＡが好ましくない突然変異を有していなかったことを保証するために、挿入されたｃＤＮＡｓの配列決定を行った。
ウイルスおよび細胞培養
インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）を１０日齢卵中で増殖させた。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を１０％ＦＢＳを含む修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）中で維持した。２９３Ｔヒト胚腎臓細胞を５％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で培養した。トランスフェクション実験には６ウエル組織培養プレートを用いた。トランスフェクションの前日に、７５ｃｍ２フラスコ中の集密的２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞をトリプシン処理し、各細胞株の１０％を１８ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ中で混合した。この細胞懸濁液の３ｍｌを６ウエルプレートの１ウエルに播種した。同時培養したＭＤＣＫおよび２９３Ｔ細胞（ウエル当たり各０．２−１×１０６細胞）をトランスフェクション実験に用いた。製造業者の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、ＤＮＡ１μｇ当たり２μｌのＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１を混合し、室温で４５分間インキュベートし、細胞に加えた。６時間後にＤＮＡ−トランスフェクション混合物をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉで置換した。トランスフェクションの３０時間後に、ＴＰＣＫ−トリプシンを含む１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉを細胞に加えた。この添加で、ＴＰＣＫ−トリプシンの最終濃度は、細胞上清中０．５μｇ／ｍｌとなった。細胞上清のウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞上の上清の力価測定により測定した。
ＲＮＡ分離およびＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙキット （Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ウイルスＲＮＡをウイルス粒子から分離した。組換えインフルエンザウイルスの特性を検討するために、供給されたプロトコールに従ってＡｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ実験では次のプライマーを使用した。Ｂｍ−ＮＳ＃１（５’−ＴＡＴ ＴＣＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＣＡ ＡＡＡ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＧ−３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびＢｍ−ＮＳ＃２（５’−ＡＴＡ ＴＣＧ ＴＣＴ ＣＧＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＴ−３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。ＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＰＣＴ−２００ ＤＮＡエンジン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて実施した。増幅プログラムは、４８℃で４５分間の１サイクルおよび９４℃で２分間の１サイクルから開始した。これらのサイクルに続いて、９４℃で２０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で４０秒間の４０サイクル（ＰＣＲ増幅）を行った。プログラムは７２℃で５分間の１サイクルで終了した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で分析し、プライマーＢｍ−ＮＳ＃１を用いて配列決定した。Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの生物工学センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が鋳型ＤＮＡの配列を、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．［ＰＥ／ＡＢ］、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および合成オリゴヌクレオチドを用いるローダミンまたはｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ色素ターミネーターサイクル配列決定即時反応キット（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｏｒ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ）を用いて決定した。試料を電気泳動、検出およびＰＥ／ＡＢＩモデル３７３、モデル３７３ Ｓｔｒｅｔｃｈまたはモデル３７７ ＤＮＡシークエンサーを用いた分析に供した。
結果
Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）の発生用のｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムの確立
インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムは８つのセグメントを含んでいるので、ｐｏｌＩプロモーターとｐｏｌＩＩプロモーターとの間への８つのインフルエンザＡ ｃＤＮＡすべての挿入が、８つのｖＲＮＡ、すべてのウイルスＲＮＡの転写、ならびに１０種すべてのウイルスタンパク質の合成をもたらすと推論した（図１）。構造タンパク質によるすべてのウイルスリボ核タンパク質のアセンブリーの後に、感染性インフルエンザＡ型ウイルスが生成するはずである（図２）。
このｃＤＮＡ２方向転写システムによってインフルエンザＡ型ウイルスを救出することができるかどうかを試験するために、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）の８つのｃＤＮＡｓを含む８つの発現プラスミド（ｐＨＷ１８１−ＰＢ２、ｐＨＷ１８１−ＰＢ１、ｐＨＷ１８３−ＰＡ、ｐＨＷ１８４−ＨＡ、ｐＨＷ１８５−ＮＰ、ｐＨＷ１８６−ＮＡ、ｐＨＷ１８７−ＭおよびｐＨＷ１８８−ＮＳ）を構築した。８つのプラスミド（各プラスミド１μｇ）（表２）を一時的に同時培養した２９３Ｔ−ＭＤＣＫ細胞中にコトランスフェクトした。高いＤＮＡトランスフェクション効率（２９３Ｔ細胞）およびインフルエンザＡ型ウイルスの高い複製効率（ＭＤＣＫ細胞）の条件を確保するために、トランスフェクションの前日に１つの細胞培養ウエル中で両細胞株を同時培養した。４８および７２時間後に、ＭＤＣＫ細胞はウイルス誘発性の細胞変性効果を示したが、ＰＢ１発現構成物を含まない７つのプラスミド（表２）のトランスフェクションの後には細胞変性効果は認められなかった。トランスフェクション後の種々の時点にＭＤＣＫ細胞についての力価測定により、上清のウイルス力価を測定した。トランスフェクションの２４時間後に細胞上清は１×１０３ウイルス／ｍｌを含んでいた。トランスフェクションの７２時間後に２×１０７個／ｍｌの感染性ウイルスが発生した（表２）。回収されたウイルスは、ＭＤＣＫ細胞上で２回継代培養した。発生したウイルスが設計されたＡ／ＷＳＮウイルスであったことを立証するために、ＮＳ遺伝子に対するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより生成させた（図４Ａ、レーン８）。制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩによる消化後の２つの断片の生成（図４Ｂ、レーン８）と増幅断片の配列分析とから、回収されたウイルスが実際に設計されたＡ／ＷＳＮウイルスであったことが確認された。これらの所見は、ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩ駆動による８つの鋳型からのｖＲＮＡおよびｍＲＮＡの合成が感染性インフルエンザＡ型ウイルスの発生をもたらすことを示している。
８プラスミドのコトランスフェクションによるＡ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）の回収
１９１８年からのヒトインフルエンザ汎流行株から最初に得られたインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ゴトーおよびカワオカ（Ｇｏｔｏ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ）、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９８年、９５巻、１０２２４ページ；レイドら（Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、９６巻、１６５１ページ）は、マウス脳で継代培養されており、細胞培養における成長によく適応している。細胞培養における成長に適応していないクローン化ｃＤＮＡからのウイルスの発生に関する８プラスミドシステムの効率を評価するために、クローン化ｃＤＮＡのみからのウイルスＡ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）の発生を試みた。このＨ６Ｎ１ウイルスは、１９９７年の香港におけるＨ５Ｎ１の突発時に死亡したコガモから分離された。このウイルスの遺伝分析から、このウイルスは７つのセグメントを有し、病原性Ｈ５Ｎ１ウイルス株と９７％以上のヌクレオチド相同性を有することが示された。ＲＮＡを感染尿膜液から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡｓをｐＨＷ２０００に挿入した。この挿入によって８つの発現プラスミドが得られた（図３）。同時培養した２９３Ｔ−ＭＤＣＫ細胞へのｐＨＷ２４１−ＰＢ２、ｐＨＷ２４２−ＰＢ１、ｐＨＷ２４３−ＰＡ、ｐＨＷ２４４−ＨＡ、ｐＨＷ２４５−ＮＰ、ｐＨＷ２４６−ＮＡ、ｐＨＷ２４７−ＭおよびｐＨＷ２４８−ＮＳ（各１μｇ）のトランスフェクションの７２時間後に、ウイルス誘発性の細胞変性効果がＭＤＣＫ細胞に認められた（表２）。ウイルス収量は、トランスフェクトされた細胞の上清１ｍｌ当たり２×１０５感染性ウイルスであった。図４（ＡおよびＢ、レーン２）に示すように、ＮＳセグメントの特性の確認によって回収されたウイルスの同一性が立証された。これらの結果から、このプラスミドシステムは１つのプラスミドベクターへの８つのｃＤＮＡのみのクローニングを必要とするものであり、８つの発現プラスミドのトランスフェクションによって、哺乳動物細胞中での成長に適応していないウイルスの抗原性を有するインフルエンザＡ型ウイルスの回収が可能であることがわかる。
再構築インフルエンザＡ型ウイルスの救出
再構築ウイルスの発生に関する８プラスミドシステムの有用性を試験した。このＤＮＡトランスフェクションシステムは選択システムを必要としないので、再構築ウイルスの回収は、トランスフェクション反応における発現プラスミドの適切な組合せによって達成できるはずである。Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のｃＤＮＡを含む７つの発現プラスミドをＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）のｃＤＮＡを含む１つの発現プラスミドとともにコトランスフェクトした（表３）。コガモウイルスの７セグメントとＷＳＮウイルスのＭセグメントまたはＮＳセグメントを含む再構築ウイルスについて、高いウイルス収量が得られた。ＮＡおよびＨＡ再構築ウイルスについては、より低いウイルス収量が得られた（表３）。単一の再構築ウイルスが８プラスミドシステムにより救出されたので、次の段階では、ウイルスが１つのウイルス由来の多セグメントにより救出できるかどうかを検討することとした。したがって、Ｈ６Ｎ１ウイルスＲＮＰ複合体遺伝子のｃＤＮＡを含む４つの発現プラスミド（ｐＨＷ２４１−ＰＢ２、ｐＨＷ２４２−ＰＢ１、ｐＨＷ２４３−ＰＡおよびｐＨＷ２４５−ＮＰ）をＷＳＮウイルスのｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＨＷ１８４−ＨＡ、ｐＨＷ１８６−ＮＡ、ｐＨＷ１８７−ＭおよびｐＨＷ１８８−ＮＳ）とともにトランスフェクトした（表３）。細胞上清１ｍｌ当たり２×１０６個のウイルスが回収された。図４（レーン１０）に示すように、４重（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）再構築ウイルスの増幅ＮＳセグメントがＮｃｏＩにより切断された。したがって、ＮＳセグメントはＷＳＮウイルス由来である。これらの結果から、８プラスミドトランスフェクトシステムは単一および４重再構築ウイルスの回収を可能にすることがわかる。
考察
Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）またはＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）のｃＤＮＡを含む８つの発現プラスミドのトランスフェクションの後のインフルエンザＡ型ウイルスを救出する能力があることは、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムが感染性インフルエンザＡ型ウイルスの生成に十分な量のｖＲＮＡとウイルスタンパク質を提供することを立証している。コーディング領域が異なる２つのタイプのｍＲＮＡが合成される（図１）。すべてのウイルスタンパク質をコードするタイプのｍＲＮＡは、ｐｏｌＩＩによって直接に転写される。これらのｍＲＮＡは、非コーディング領域（ＮＣＲ）のインフルエンザウイルス配列に加えて、ｐｏｌＩプロモーターおよびマウスターミネーター領域の配列を含む。重要なことに、開発されたｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ発現システムは、３３ｂｐのマウスターミネーター配列のみを含む。リポーター遺伝子クロルアンフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いた以前の試験で、１７４ｂｐのターミネーター領域の配列がタンパク質のｐｏｌＩＩによる発現を低減させることが示された（ホフマン イー（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｅ．）Ｐｈ．Ｄ．学位論文１９９７年、Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｉｅｓｓｅｎ、ドイツ）。第２のタイプのｍＲＮＡは、ウイルス複製および転写過程の開始後に生成される（図２）。このｍＲＮＡは、ウイルスのポリメラーゼタンパク質によって合成され、インフルエンザウイルス非コーディング配列に先立つキャップ引き抜き（ｓｎａｔｃｈｉｎｇ）により細胞ＲＮＡから得られた５キャップ構造を含む。両ｍＲＮＡから翻訳された構造タンパク質はＲＮＰ複合体と結合して、新たなウイルス粒子を生成する。トランスフェクタントウイルスの出芽後に、発生したウイルス粒子は、２９３Ｔ細胞中および同時培養されたＭＤＣＫ細胞中で複製することができる。
上記の発明の背景において論じたアプローチと異なり、本発明の方法は２２５ｂｐのｐｏｌＩプロモーター配列と３３ｂｐのターミネーター配列を含む８つのプラスミドに８つのｃＤＮＡｓを配置する。ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムにおいては、１０種のウイルスタンパク質すべてがヒトサイトメガロウイルスのｔｒｎｃａｔｅｄ即時型プロモーターから発現している。１７プラスミドシステム（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３４５ページ）および８プラスミドシステム（本試験）によるすべての構造タンパク質の発現が、ＲＮＰ複合タンパク質を発現するプラスミドのコトランスフェクションによる方法よりも高い効率のウイルス回収がもたらされたということ（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、上記；フォドーら（Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年、第７３巻、９６７９ページ）は、感染性インフルエンザＡ型ウイルスの発生がトランスフェクション後早期にＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２タンパク質を供給することによって増大するという考え方を支持するものである。
ウイルス複製サイクルはウイルスタンパク質同士間および細胞因子との間の複雑な相互作用を伴う（ルドウィグら（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９年、第１２巻、１７５ページ）。したがって、感染性ウイルスの発生のための、ウイルス分子のプラスミド駆動合成が、複製サイクルの開始およびウイルス様粒子の生成に最適な濃度のウイルスタンパク質を供給するはずである。８プラスミドシステムは効率がよいことが証明されたが、ウイルスの生産をさらに増大させることは可能であろう。ＲＮＰ複合タンパク質を発現するトランスフェクト済みプラスミドとＭ１タンパク質の発現との比が転写酵素活性に影響を及ぼすことが示された（プレシュカら（Ｐｌｅｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、第７０巻、４１８８ページ；ペレズおよびドニス（Ｐｅｒｅｚ ａｎｄ Ｄｏｎｉｓ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８年、第２４９巻、５２ページ）。ウイルス様粒子の生成の効率も構造ウイルスタンパク質の濃度に依存する（メナら（Ｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、第７０巻、５０１６ページ；ゴメス−ピュータスら（Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年、第８０巻、１６３５ページ；ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００年、第７４巻、５４７ページ）。したがって、ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムによる感染性ウイルスの発生の効率は、トランスフェクション反応に用いるプラスミド濃度を変化させることにより、あるいは異なるｐｏｌＩＩプロモーターを含む発現プラスミドを用いることにより、さらに増加させることができると思われる。細胞因子によって媒介されるスプライシング効率がインフルエンザＡ型ウイルスが複製する能力に影響する（ラウおよびショルティセック（Ｌａｕ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５年、第２１２巻、２２５ページ）ので、２９３Ｔ以外の細胞株を用いることによって、ある種のインフルエンザＡ型ウイルス株のウイルス収量が増加する可能性がある。４重再構築でのウイルス収量が高い（表３）ことは、培養細胞中のＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）の速やかな複製がＨＡ、ＮＡおよびＭセグメントによって媒介されているという所見と一致している（ゴ
トウおよびカワオカ（Ｇｏｔｏ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９８年、第９５巻、１０２２４ページ；シュルマンおよびパレセ（Ｓｃｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９７７年、第２４巻、１７０ページ；ヤスダら（Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４年、第６８巻、８１４１ページ）。
鳥類Ｈ６Ｎ１ウイルスとヒトＨ１Ｎ１ウイルスの間の生存可能な再構築体が発生したこと（表３）は、このＨ６Ｎ１ウイルスが関係が遠いウイルスから遺伝子セグメントを獲得できることがわかる。遺伝子分析から、病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスが再構築によって発生したことが示唆された（スーら（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９年、第２６１巻、１５ページ）。Ｈ５Ｎ１様遺伝子セグメントがＨ６Ｎ１およびＨ９Ｎ２サブタイプに認められており（グアンら（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３６３ページ）、この所見はこれらのウイルスが病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスの前駆体であった可能性があることを示している。新たな病原性ウイルスを生じさせるような再構築事象が将来起こる可能性がある。しかし、本試験で開発された簡略化された方法によってこれらのウイルスを発生させ、操作することができたことは、研究者がこれらの新しいウイルスの生物学的性質をよりよく理解し、それらから集団を保護する効果的なワクチンを開発するうえでの助けとなるであろう。新しい病原性株の発生とワクチンの調製との間の期間は、ワクチン接種プログラムの有効性における非常に重要な変数である。８つのプラスミドのみをクローニングすることによってウイルスを発生させることができることは、ワクチンの候補を製造するに必要な時間を短縮でき、ウイルスの生成を単純化することにより既存の逆遺伝学システムを改良することができ、ワクチンの生産の総費用を削減できることにつながることである。
ウイルスの回収のためにｐｏｌＩプロモーターとｐｏｌＩＩプロモーターとの間に挿入したｃＤＮＡを真核細胞に導入するという概念は、オルトミクソウイルス科の他のメンバーの発生にも適用できる。インフルエンザＢ型ウイルスの場合、この戦略では８つのプラスミドの構築とコトランスフェクションが必要であろう。また、インフルエンザＣの場合は７つ、トゴトウイルスの場合は６つ必要であろう。同じｃＤＮＡ鋳型から５’キャップ構造を有するｍＲＮＡならびにｖＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで転写することは、他のＲＮＡウイルスに対して用いるプラスミドに基づくシステムも単純化することができ、あるいは、他の科（例えば、アレナウイルス、ブニヤウイルス）のウイルスに対するｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムの確立も容易となる。
実施例３：クローン化ｃＤＮＡからインフルエンザＢ型ウイルスを完全に発生させるためのＲＮＡ ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩシステム
インフルエンザＡおよびＢ型ウイルスは、各々極性が負の１本鎖ＲＮＳＡの８セグメントを含んでいる（総説については、ラムおよびクルグ（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｋｒｕｇ）著、「Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、フィールド（Ｆｉｅｌｄｓ）編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１３５３−１３９５ページを参照のこと）。インフルエンザＡと異なり、インフルエンザＢの８セグメントは１１タンパク質をコードする。３つの最大遺伝子はＲＮＡポリメラーゼの成分であるＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡをコードする。セグメント４は赤血球凝集素をコードする。セグメント５は、ウイルスＲＮＡに結合している主要な構造成分である核タンパク質をコードし、セグメント６はノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびＮＢタンパク質をコードする。両タンパク質ＮＢおよびＮＡは、ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｍＲＮＡの重複リーディングフレームから翻訳される。インフルエンザＢのセグメント７も２つのタンパク質、ＢＭ１およびＢＭ２をコードする。最小のセグメントは２つの産物をコードし、ＮＳ１は全長ＲＮＡから翻訳され、一方、ＮＳ２はスプライスされたｍＲＮＡから翻訳される。
インフルエンザＢのｃＤＮＡを含む発現プラスミドの構築は、インフルエンザＡ型ウイルスＡ／ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）の発生について記載したのと同じ戦略を必要とする。最初に、感染した尿膜液、例えば、Ｂ／Ｌｅｅ／４０から得られたウイルス粒子からＲＮＡを分離する。非コーディング領域の保存配列に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーを調製し、ｃＤＮＡの合成に用いる。５’末端では、それらのプライマーは制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩの配列を含む。ＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩによるＰＣＲ生成物の消化により、ＢｓｍＢＩで線状化されたクローニングベクターｐＨＷ２０００（またはｐＨＷ１１）への挿入が可能となる。プラスミド中のｃＤＮＡｓが、ＰＣＲ中にポリメラーゼによって行われる誤りに起因した好ましくない突然変異を有さないことを保証するために、構成物の配列決定を行わなければならない。
同時培養した２９３Ｔ−ＭＤＣＫ細胞（またはＣＯＳ−１−ＭＤＣＫ細胞）のコトランスフェクションとトリプシンの添加により、感染性インフルエンザＢ型ウイルスの発生がもたらされる。トランスフェクトされた細胞の上清を新しいＭＤＣＫ細胞上で継代培養する。得られたウイルスの力価は、標準的な方法、例えば、ＨＡ検定およびプラーク検定により測定することができる。各遺伝子セグメントに対して特異的なプライマーを用いて実施したＲＴ−ＰＣＲにより、組換えインフルエンザＢ型ウイルスのＲＮＡが増幅される。生成物の配列決定により、発生したウイルスが実際に所望のインフルエンザＢ型ウイルスであることが確認される。
実施例４：インフルエンザＡ型ウイルスマスター株の８プラスミド救出システム
ワクチン生産のためのこのプラスミドに基づくシステムの商業上の有用性を検討するために、本願発明者らは、不活性化ワクチンの生産に現在用いられているマスター株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を実施例２で記載したようにクローン化ｃＤＮＡから完全に発生させた。組換えウイルスの卵中での継代培養の後にＨＡ検定により測定したウイルス収量は、親野生型ウイルスのウイルス収量と同様に高かった。これらの結果から、組換えウイルスは卵成長親ウイルスと同じ成長特性を有することが立証され、８プラスミドトランスフェクション法は現在用いられているワクチンウイルスの生産方法を改良する可能性をもっていることがわかる。
材料および方法
ウイルスおよびトランスフェクション
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌのレポジトリから入手し、１０日齢ふ化卵中で増殖させた。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ中で維持した。２９３Ｔヒト胚腎臓細胞およびベロ細胞を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で培養した。トランスフェクション実験には、６ウエル組織培養プレートを用いた。同時培養したＭＤＣＫおよび２９３Ｔ細胞（ウエル当たり各０．２１×１０６細胞）をトランスフェクション実験に用いた。製造業者の指示に従って、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて細胞をトランスフェクトした。簡単に述べると、ＤＮＡ１μｇ当たり２μｌのＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ−１を混合し、室温で４５分間インキュベートし、細胞に加えた。６時間後にＤＮＡ−トランスフェクション混合物をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉで置換した。トランスフェクションの２４時間後に、ＴＰＣＫ−トリプシンを含む１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉを細胞に加えた。この添加で、ＴＰＣＫ−トリプシンの最終濃度は、細胞上清中０．５μｇ／ｍｌとなった。ウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞上での細胞上清を継代培養して、プラーク検定により測定した。
ＲＴ−ＰＣＲおよびプラスミドの構築
ウイルスＲＮＡは、２００μｌのウイルスを含むふ化卵の尿膜液からＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔを用いて抽出した。２段階ＲＴ−ＰＣＲを用いて各ウイルス遺伝子セグメントを増幅した。簡単に述べると、提供されたプロトコールに従って、ＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を用いてｃＤＮＡに転写し、次いで、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を用いてｃＤＮＡを増幅した。増幅プログラムは９４℃で２分間の１サイクルから開始し、続いて、９４℃で２０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で３分間の３０サイクルを行った。プログラムは７２℃で５分間の１サイクルで終了した。クローニングベクターｐＨＷ２０００への消化されたＰＣＲ断片の精密な挿入ができるように、用いたプライマーにはＢｓａＩまたはＢｓｍＢＩの配列を含めた（実施例２を参照）。
ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、ＮＳ遺伝子のクローニングのために、ＰＣＲ断片をＢｓｍＢＩまたはＢｓａＩで消化し、クローニングベクターｐＨＷ２０００に結合させた。Ｐ遺伝子のクローニングのために、２（ＰＢ２、ＰＡ）または３（ＰＢ１）断片を分離し、消化し、ｐＨＷ２０００−ＢｓｍＢＩに結合させた。遺伝子が好ましくない突然変異を含まないことを保証するために、ＰＣＲによって得られた断片の配列決定を行った。Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の全長ｃＤＮＡを含む８つのプラスミドをｐＨＷ１９１−ＰＢ２、ｐＨＷ１９２−ＰＢ１、ｐＨＷ１９３−ＰＡ、ｐＨＷ１９４−ＨＡ、ｐＨＷ１９５−ＮＰ、ｐＨＷ１９６−ＮＡ、ｐＨＷ１９７−ＭおよびｐＨＷ１９８−ＮＳと称した。Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの生物工学センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が鋳型ＤＮＡの配列を、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．［ＰＥ／ＡＢ］、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および合成オリゴヌクレオチドを用いるローダミンまたはｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ色素ターミネーターサイクル配列決定即時反応キット（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｏｒ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ）を用いて決定した。試料を電気泳動、検出およびＰＥ／ＡＢＩモデル３７３、モデル３７３ Ｓｔｒｅｔｃｈまたはモデル３７７ ＤＮＡシークエンサーを用いた分析に供した。
結果
ウイルス様ｖＲＮＡＳｓおよびｍＲＮＡの細胞内合成を可能にするために、本願発明者らはＲＮＡ ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ発現システムを確立した（実施例２）。このシステムでは、ｃＤＮＡがヒトＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）プロモーターとターミネーター配列との間に挿入されている。この完全なｐｏｌＩ転写単位の両端には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）プロモーターとポリ（Ａ）部位が隣接している。２つの転写単位の配向は、１つのウイルスｃＤＮＡ鋳型からマイナスセンスウイルスＲＮＡとプラスセンスｍＲＮＡとが合成されることを可能にしている。ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩシステムは、２つの細胞ＲＮＡポリメラーゼ酵素の、おそらく分子の異なるコンパートメントにおけるそれら自体のプロモーターからの転写の開始から始まる（図１参照）。２９３Ｔ細胞への８プラスミドのトランスフェクションにより、細胞およびウイルス転写および翻訳機構により得られるすべての分子の相互作用がもたらされ、最終的に感染性インフルエンザＡ型ウイルスが発生する。このシステムは、インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）の生成に非常に有効であることが証明された（実施例２）。
不活性化インフルエンザワクチンの生産のための現在のマスター株はＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）であるので、本願発明者らはこのウイルスをクローン化ｃＤＮＡから完全に発生させることを試みた。８つのＲＮＡセグメントを表わすｃＤＮＡをベクターｐＨＷ２０００に挿入した。得られたプラスミド（ｐＨＷ１９１−ＰＢ２、ｐＨＷ１９２−ＰＢ１、ｐＨＷ１９３−ＰＡ、ｐＨＷ１９４−ＨＡ、ｐＨＷ１９５−ＮＰ、ｐＨＷ１９６−ＮＡ、ｐＨＷ１９７−ＭおよびｐＨＷ１９８−ＮＳ）を同時培養した２９３Ｔ−ＭＤＣＫまたはベロ−ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に、ＭＤＣＫ細胞における力価測定によりウイルス力価を測定した。同時培養したベロ−ＭＤＣＫ細胞の上清は１×１０４ｐｆｕ／ｍｌを含み、同時培養した２９３Ｔ−ＭＤＣＫ細胞の上清は２×１０６ｐｆｕ／ｍｌを含んでいた。２９３Ｔ−ＭＤＣＫ細胞における収量がより高いことは、２９３Ｔ細胞のトランスフェクション効率がベロ細胞と比較して高いことに起因していると思われる。これらの結果から、８プラスミドシステムはクローン化ｃＤＮＡからＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を発生させることが可能であることがわかる。
野生型ウイルスと発生した組換えウイルスの成長を比較するために、ふ化鶏卵に野生型ウイルスと組換えウイルスを接種した。感染４８時間後に尿膜液を回収した。ＨＡ検定によりウイルス収量を測定した。ＨＡ力価は個々の卵で異なっていたが、本発明者らは両ウイルスが５１２０−１０２４０赤血球凝集素単位のＨＡ力価を示したことを認めた。このことから、両ウイルスは高収量分離株であることがわかる。したがって、ＤＮＡトランスフェクションによって生成した組換えウイルスは、親分離株と同じ頑強な培養表現型を有している。
考察
本発明による８プラスミドシステムは、タンパク質の発現のための別のプラスミドの使用（発明の背景を参照）を避けることができ、したがって、クローン化ｃＤＮＡから完全にインフルエンザＡ型ウイルスを発生させる方法を簡略化することができる。ワクチンの生産は、卵または細胞培養中でのワクチンウイルスの生産のためのウイルス種子として用いるウイルスの発生を必要とする。ワクチン接種の有効性は、ワクチン接種集団における高い特異抗体力価を刺激し、有効な防御をもたらすために循環病原性株に厳密に適合するサブタイプを選択することに依存する。内部インフルエンザＡ遺伝子をコードする６種のＡ／ＰＲ／８／３４マスタープラスミド（ｐＨＷ１９１−ＰＢ２、ｐＨＷ１９２−ＰＢ１、ｐＨＷ１９３−ＰＡ、ｐＨＷ１９５−ＮＰ、ｐＨＷ１９７−ＭおよびｐＨＷ１９８−ＮＳ）を、現在循環している株の糖タンパク質ＨＡおよびＮＡをコードするプラスミドとコトランスフェクションするのに今や用いることができる。各遺伝子セグメントを操作できることは、卵または細胞培養中での再構築ウイルスの高収量をもたらす成長を確保するのにどの遺伝子セグメントが重要であるかを評価することが可能となる。
本願発明者らが８種のプラスミドのみをコトランスフェクトすることによって２種の実験室インフルエンザウイルス株（Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））と野外分離株（Ａ／Ｔｅａｌ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７）（Ｈ６Ｎ１）を発生させることができたことから、このシステムが弱毒化生インフルエンザワクチンの開発に適用できることが示唆される。鼻腔内投与した弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンは、粘膜における局所的な細胞性および体液性免疫を誘発する。
弱毒化生インフルエンザＡ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）の６つの内部遺伝子ならびに同時に発生する野生型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む低温適応（ｃａ）再構築（ＣＲ）ウイルスは、確実に弱毒化されるように思われる。このワクチンは小児および若齢成人において有効であることが示された（ケイテルおよびピードラ（Ｋｅｉｔｅｌ ａｎｄ Ｐｉｅｄｒａ）著、ニコルソン、ウェブスターおよびメイ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｗｅｂｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｙ）編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、１９９８年、３７３−３９０ページ）。しかし、米国においてインフルエンザ感染により毎年死亡する２０，０００−４０，０００人の主な集団である高齢者における理想的免疫応答を刺激するには弱毒化されすぎている可能性がある。弱毒化された表現型に対する各セグメントの寄与はまだ十分に定義されていない（ケイテルおよびピードラ（Ｋｅｉｔｅｌ ａｎｄ Ｐｉｅｄｒａ）、上記）。この情報は、ウイルスに特定の定義された突然変異を逐次的に導入することによってのみ得ることができる。非常に多数の操作を加えたウイルスの試験には詳細な分析が必要であるので、８プラスミドのみを構築し、トランスフェクションすることは、この課題を単純にし、この目標の達成に要する時間と費用を低減させるものである。
実施例５：８プラスミドからのインフルエンザＡ型ウイルスの発生のための１方向ＲＮＡポリメラーゼＩ−ポリメラーゼＩＩ転写システム
先の実施例では、マイナスセンスｖＲＮＡとプラスセンスｍＲＮＡが発現する、８プラスミドのみをトランスフェクトすることによるインフルエンザＡ型ウイルスの発生のためのシステムを記載している（この試験は後に公表された；ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、第９７巻、６１０８−６１１３ページ）。この実施例では、１つの鋳型からのキャップ構造のないプラスセンスｃＲＮＡと５’キャップ構造のあるｍＲＮＡの合成を可能にするウイルス様ＲＮＡの発現のための異なる転写システムの確立を記載する。Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）のｃＤＮＡを含む８つのＲＮＡ ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩタンデムプロモータープラスミドのコトランスフェクションによって、２方向システムよりもウイルス収量は低かったが、感染性インフルエンザＡ型ウイルスの発生がもたらされた。最小限のセットのプラスミドから細胞内でｖＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを生成させる本願発明者らのアプローチは、他のＲＮＡウイルスの逆遺伝学システムの確立と最適化に有用である。
この実施例に報告されている結果は公表された（ホフマンおよびウェブスター（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２０００年、第８１巻、２８４３ページ）。
マイナスセンスＲＮＡウイルスの発生のために、マイナスセンスｖＲＮＡまたはプラスセンスｃＲＮＡを鋳型とすることができる。ウイルスの回収に必要なプラスミドの数を減らすために、本願発明者らは細胞ＲＮＡｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩが１つの鋳型からｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを合成することが可能であると推論した。したがって、本願発明者らは１方向ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムを開発した（図５）。ウイルスｃＤＮＡをプラスセンス配向でＲＮＡｐｏｌＩプロモーターとターミネーター配列との間に挿入した。この全ｐｏｌＩ転写単位をプラスセンス配向でＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーターとポルアデニル化部位との間に挿入した（図５）。本願発明者らの２方向転写システムではマイナスセンスｖＤＮＡとプラスセンスｍＲＮＡが発生した（図１）のとは異なり、２つのタイプのプラスセンスＲＮＡが合成されると予想された。ｐｏｌＩＩプロモーターから、５’キャップ構造をもったｍＲＮＡが核質内で転写されるはずである。この転写物はタンパク質に翻訳される。仁中で、細胞ｐｏｌＩは、５’末端に三リン酸基を有する全長のプラスセンスインフルエンザウイルスｃＲＮＡを合成すると予想される（図５）。任意のｃＤＮＡ断片の挿入に用いることができるクローニングベクターｐＨＷ１１を構築した（図６）。このプラスミドは、ｐｏｌＩＩプロモーター（ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーター）と、ｐｏｌＩターミネーター配列およびポリ（Ａ）部位の上流にあるヒトｐｏｌＩプロモーターを含んでいる。
１つの鋳型からｃＲＮＡとｍＲＮＡを合成することによって感染性インフルエンザＡ型ウイルスを発生させることができるかどうかを試験するために、本願発明者らは８種のプラスミドを構築した。プラスミドｐＨＷ１７１−ＰＢ２、ｐＨＷ１７２−ＰＢ１、ｐＨＷ１７３−ＰＡ、ｐＨＷ１７４−ＨＡ、ｐＨＷ１７５−ＮＰ、ｐＨＷ１７６−ＮＡ、ｐＨＷ１７７−ＭおよびｐＨＷ１７８−ＮＳ）は、インフルエンザＡ株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）の８つの遺伝子セグメントを表わすｃＤＮＡｓを含んでいる。これらのｃＤＮＡｓのすべてがｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターに対してプラスセンス配向であった。８プラスミド（各プラスミドが１μｇ）を、実施例２に記載したＭＤＣＫ細胞と同時培養を行った、あるいは行わなかった２９３ＴまたはＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクトされた細胞の上清中の種々の時点のウイルス収量を、ＭＤＣＫ細胞上での継代培養の後にプラーク検定により測定した。トランスフェクションの４８時間後に２−５×１０３個の感染性ビリオンが生成した（表４）。トランスフェクションの７２時間後に上清は、２３９Ｔへのトランスフェクションの後に４×１０４ｐｆｕ／ｍｌを、ＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクションの後に２×１０４ｐｆｕ／ｍｌを含んでいた。７２時間後のウイルス収量は、２３９Ｔ細胞またはＣＯＳ−１細胞をＭＤＣＫ細胞と同時培養することによって増加させることができた（表４）。
ウイルスが発生したことから、８プラスミドのトランスフェクションの後にＲＮＡｐｏｌＩはキャップ構造をもたない８つのプラスセンスｃＲＮＡを合成したことが証明される。細胞ＲＮＡｐｏｌＩＩ合成転写物から翻訳された４種のウイルスポリメラーゼタンパク質が裸のウイルス様ｃＲＮＡに結合して、ｃＲＮＰｓを生成した。ポリメラーゼサブユニットＰＢ１は、ウイルス様ｃＲＮＡの末端構造および結合の認識に重要である（ゴンザレスおよびオーチン（Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｏｒｔｉｎ）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９年、第１８巻、３７６７ページ；ゴンザレスおよびオーチン（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＆ Ｏｒｔｉｎ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年、７３巻、６３１ページ；および１９９９年ｂ；リーら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８年、第１７巻、５８４４ページ）。他のポリメラーゼタンパク質との相互作用が複製−転写サイクルを開始させ、その結果、ｖＲＮＡおよびウイルスｍＲＮＡの合成がもたらされる（トヨダら（Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年、第７７巻、２１４９ページ；ゴンザレスら（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６年、第２９巻、４４５６ページ）。ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムでは、２つの異なるタイプのｍＲＮＡが合成された。１つは、プラスミドＤＮＡからＲＮＡｐｏｌＩＩによって直接転写され、５’末端における２２５−ｎｔｐｏｌＩプロモーター配列と３’末端におけるｐｏｌＩターミネーター配列を含んでいる。他のｍＲＮＡは、ｖＲＮＡを鋳型として用いるウイルスポリメラーゼ複合タンパク質によって合成される。このｍＲＮＡの５’キャップ構造は、ポリメラーゼが細胞ＲＮＡからキャップを取るＰＢ２を提出する、キャップ引き抜き機構によって獲得される（ウルマネンら（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９８１年、第２１巻、３６０７ページ）。両タイプのｍＲＮＡは、５’および３’非コーディング領域が異なっているが、すべのウイルスタンパク質に対する同じ開いたリーディングフレームを含んでいる。構造タンパク質はｖＲＮＡとともに集合して感染性インフルエンザＡ型ウイルスを生成する。
８つのタンデムプロモータープラスミドでトランスフェクトした細胞からのＷＳＮウイルスの発生は非常に信頼できることが証明されたが、このｃＲＮＡ−ｍＲＮＡアプローチによるウイルス収量は、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ転写物を生成する２方向システムのウイルス収量よりも低かった（表４）。２９３ＴまたはＣＯＳ−１細胞を２方向ｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムを含む８プラスミド（図１；実施例２；ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、２０００年、第９７巻、６１０８ページを参照；ｐＨＷ１８１−ＰＢ２、ｐＨＷ１８２−ＰＢ１、ｐＨＷ１８３−ＰＡ、ｐＨＷ１８４−ＨＡ、ｐＨＷ１８５−ＮＰ、ｐＨＷ１８６−ＮＡ、ｐＨＷ１８７−ＭおよびｐＨＷ１８８−ＮＳ）でトランスフェクトさせてから７２時間後に、ウイルス力価は１×１０３ｐｆｕ／ｍｌであった（表３）。ＣＯＳ−１または２９３Ｔ細胞のトランスフェクションの２４時間後に０．４−１×１０３ｐｆｕ／ｍｌが上清中に認められた。これらのデータから、８プラスミド２方向システムは、１２または１７プラスミドのコトランスフェクションを必要とするより複雑で扱いにくい多プラスミドシステム（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９９年、第９６巻、９３４５ページ）と、同様な動力学によるウイルスの発生について同じ有効性を有することがわかる。
８タンデムプロモータープラスミドによるトランスフェクションの２４時間後に感染性ウイルスは認められなかった（表４）。これらの結果は、ｖＲＮＡ−ｍＲＮＡアプローチとｃＲＮＡ−ｍＲＮＡアプローチとの間に見られるウイルス力価の差は、一次ｐｏｌＩ転写物の極性が異なることに起因していることを示唆している。２方向システムは、ｖＲＮＰｓが核に輸送され、ｖＲＮＡがｍＲＮＡおよびｃＲＮＡ合成の鋳型としての役割を果たしている天然インフルエンザＡ型感染と類似した状況であるｖＲＮＡの細胞内合成から始まっている。１方向システムでは、ｃＲＮＰｓが生成する最初の複製適格単位である。ｍＲＮＡを生成させるためには、ｃＲＮＡがｖＲＮＡに複製されなければならず、またｖＲＮＰｓが最終的に子孫ウイルス粒子にパッケージングされる（シューら（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９８７年、７７巻、２５７５ページ）。ｃＲＮＰｓからｖＲＮＡの発生には追加の反応が必要であるため、１方向システムにおけるウイルスの生成は、２方向システムによるウイルス生成よりも遅い時点に起こる。
２つのシステムのウイルス収量の差についての他の考えられる理由は、ｃＤＮＡにおける配列要素が転写を終結させることにより転写の効率を低くしている。あるいは、ＲＮＡ転写物における配列がｐｏｌＩまたはｐｏｌＩＩ転写物の定常状態レベルを低くしていることである。８つのウイルス様ｃＲＮＡまたはｍＲＮＡのうちの１つだけが低濃度であるために、このシステムの全体の効率が低くなっている。その理由は、すべてのｖＲＮＰｓおよび構造タンパク質が、ウイルス複製とウイルスアセンブリーに最適の濃度で合成されなければならないからである。
インフルエンザＡ型ウイルスの発生について８プラスミドシステムが高い効率を有していることは、このシステムが他のオルトミクソウイルス、例えば、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルスおよびトゴトウイルスに適用できることを意味している。この試験における結果は、ｖＲＮＡ−ｍＲＮＡシステムがこれらのウイルスをプラスミドから完全に発生させる最も効率の高い方法であることを示唆している。本発明は、オルトミクソウイルス科のメンバー以外のＲＮＡウイルス、例えば、パラミクソウイルス、アレナウイルスあるいはブニヤウイルスのメンバーの発生のためのｐｏｌＩに基づくシステムの確立を可能にするものである（ロバーツ エーおよびローズ ジェーケー（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．＆ Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｋ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８年、第２４７巻、１−６ページ；ブリッジェンおよびエリオット（Ｂｒｉｄｇｅｎ ＆ Ｅｌｌｉｏｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国１９９６年、第９３巻、１５４００ページ；リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００年、第７４巻、３４７０ページ）。オルトミクソウイルスと異なり、ほとんどのＲＮＡウイルスは感染細胞の細胞質中で複製する。それらの発生中に、これらのウイルスのＲＮＡは、核に認められた選択圧力、例えば、スプライシングを受けなかった。一般的に、非セグメントのマイナス鎖ＲＮＡウイルスに関する逆遺伝学システムは、狂犬病ウイルスの救出のためにコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）と共同研究者らによって開拓されたＴ７プロモーターからの細胞内転写に基づいている（（シュネルら（Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４年、第１３巻、４１９５ページ）。ウイルス様ＲＮＡの発現は、組換えワクシニアウイルスの感染により、あるいは本質的にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞株を用いることにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって駆動される。核内で起こるｐｏｌＩ転写と異なり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写は細胞質内で起こる。細胞質ＲＮＡウイルスに対してｐｏｌＩ転写システムを用いるには、ＲＮＡ転写物が核外に輸送される必要がある。実際にｐｏｌＩ転写物が核外に輸送されるということは、５’非コーディング領域に挿入された内部リボソーム入口部位を有していたｐｏｌＩ転写物を含む細胞中でのタンパク質の産生が検出されたことによって裏づけられている（パルマーら（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９３年、第２１巻、３４５１ページ）。ｐｏｌＩ転写物の輸出または保持に重要な役割をもつ配列に関する情報は不足しているため、マイナスセンスＲＮＡが合成される場合とプラスセンスＲＮＡが合成される場合とで、核輸出の効率が異なる可能性がある。さらに、ｐｏｌＩＩによって生成された大きいコロナウイルス様転写物（３０，０００ｎｔｓより大きい）の核からの輸出が見られた（アルマザンら（Ａｌｍａｚａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、２０００年、第９７巻、５５１６ページ）ことから、転写物の長さよりも特異的配列が輸出に極めて重要であることがわかる。本願発明者らが開発したｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩクローニングベクターとタイプＩＩｓ制限エンドヌクレアーゼの使用に基づく効率のよいクローニング法によって、妥当な費用と妥当な時間内での細胞質ＲＮＡウイルスの発生のためのプラスまたはマイナスセンスＲＮＡの合成が可能であろう。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって適用範囲が限定されるものでない。実際に本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更形態が、前述の説明および添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付した特許請求の範囲の適用範囲に入ることを意図されている。
さらにすべての値は近似値であり、説明のために記載されていることを理解すべきである。
本明細書に引用されているすべての特許、特許出願、刊行物およびその他の資料は、それらの全部、参照により本明細書に組み込む。
［配列表］

Claims (6)

  1. クローン化ウイルスｃＤＮＡから感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスを生成する際に使用するための一組のプラスミドを含む組成物であって、
    前記一組のプラスミドが、前記ＲＮＡウイルス由来の全てのウイルスゲノムセグメントに相当するウイルスｃＤＮＡを含み、かつ前記一組のプラスミド中のプラスミドの総数が、ウイルスゲノムセグメントの総数を超えず、
    前記一組のプラスミド中の各プラスミドが、一つのウイルスゲノムセグメントに相当するウイルスｃＤＮＡを含み、
    前記ウイルスゲノムセグメントに相当するウイルスｃＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）プロモーターとターミネーター配列との間に挿入され、それによってｖＲＮＡの発現が生じ、次に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターとポリアデニル化シグナルとの間に挿入され、それによってウイルスｍＲＮＡの発現を生じさせ、
    ベロ細胞およびＣＯＳ−１細胞からなる群から選択される宿主細胞中に感染した場合に感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスを生成することができる組成物。
  2. 前記ｐｏｌＩプロモーターが前記ポリアデニル化シグナルに隣接していて、前記ターミネーター配列が前記ｐｏｌＩＩプロモーターに隣接している、請求項１に記載の組成物。
  3. 請求項１または２に記載の組成物を含む、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ベロ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＢＨＫ−１細胞からなる群から選択される宿主細胞。
  4. 感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスビリオンを生成する方法であって、ウイルスタンパク質およびｖＲＮＡの産生を可能にする条件下で請求項３に記載の宿主細胞を培養し、それにより感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスを生成することを含む方法。
  5. 弱毒化マイナス鎖ＲＮＡウイルスを発生させる方法であって、
    （ａ）請求項１または２に記載の組成物中の１つまたは複数のウイルス遺伝子を突然変異させること、および
    （ｂ）適切な宿主細胞に導入した組成物によって生成された感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスが弱毒化されるかどうかを判定することを含む方法。
  6. ワクチン用の感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスを生成する方法であって、
    （ａ）前記ウイルスを発生させるために、請求項１または２に記載の組成物を含み、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ベロ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、およびＢＨＫ−１細胞からなる群から選択される宿主細胞を培養すること、および
    （ｂ）前記宿主細胞によって生成した前記ウイルスを精製することを含む方法。
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