PT1194580E - Recostituição in victro de vírus de rna de cadeia negativa segmentados - Google Patents

Description

ΡΕ1194580 1 DESCRIÇÃO "RECONSTITUIÇÃO IN VITRO DE VÍRUS DE RNA DE CADEIA NEGATIVA SEGMENTADOS" O presente invento está relacionado com a reconstituição (recuperação) de vírus de RNA de cadeia negativa segmentados, em culturas celulares, a partir de DNAs recom-binantes. Mais particularmente, por exemplo, está relacionado com a recuperação de tais vírus tendo mais de 3 segmentos de vRNA genómico, especialmente, por exemplo, vírus da gripe tendo de um modo geral 8 segmentos de vRNA genómico, através de um sistema totalmente dirigido por um vector, o que evita a necessidade de um vírus auxiliar.

Os últimos cinco anos testemunharam a recuperação da maioria dos vírus de RNA de cadeia negativa não segmentados importantes a partir de DNA recombinante. Primeiro, Schnell et al. conseguiram a recuperação de vírus da raiva a partir de DNA recombinante (EMBO J. (1994) 13, 4159-4203). Pouco depois, foram desenvolvidos sistemas de recuperação baseados em plasmídeos para os vírus da estomatite vesicular (Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1995) 92_, 4477-4481; Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1995) 92_, 8388-8392), vírus dos sincícios respiratórios (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1995) 92, 11563-11567; Jin et al., Virology (1998) 251 2 ΡΕ1194580 206-214), vírus do sarampo (Radecke et al., EMBO J. (1995) 14, 5773-5784) e vírus Sendai (Garcin et al., EMBO J. (1995) 14, 6087-6094; Kato et al., Gene Cells (1996) 1, 569-579). Mais recentemente, foram desenvolvidos sistemas de recuperação baseados em plasmídeos para o vírus parainfluenza humano tipo 3 (Durbin et al., Virology (1997) 235, 323-332; Hoffman and Banerjee, J. Virol. (1997) 71, 4272-4277), vírus da peste bovina (Baron and Barrett, J. Virol. (1997) 7_1^ 1265-1271), vírus símio 5 (He et al., Virology (1997) 237, 249-260), vírus dos sincícios respiratórios bovinos (Buchholz et al., J. Virol. (1999) 73, 251-259) e vírus da doença de Newcastle (Peeters et al., J. Virol. (1999) 73, 5001-5009).

Bridgen and Elliott (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) R4, 15400-15404) descreveram a recuperação, sem vírus auxiliar, de um buniavírus tendo apenas 3 segmentos de vRNA genómico a partir de cDNA, através da expressão de RNAs anti-genómicos e proteínas virais sob o controlo de um promotor do bacteriófago 7. No entanto, até agora desconhecia-se se poderia ter êxito a aplicação de uma estratégia totalmente baseada em plasmídeo para a recuperação de vírus de RNA de cadeia negativa segmentados com um maior número de segmentos de vRNA, tais como virus da gripe, sem a ajuda de um virus auxiliar. A gripe mantém-se como uma ameaça constante para a saúde humana a nível mundial e portanto existe uma necessidade particular de um método fácil de gerar vírus da 3 ΡΕ1194580 gripe modificados com mutações conhecidas em qualquer um dos segmentos de vRNA genómico. A manipulação de segmentos de vRNA da gripe para a expressão de sequência heterólogas é também de grande interesse, por exemplo, no desenvolvimento de novas vacinas eficazes contra o virus da gripe e contra um segundo agente patogénico. Conhecem-se três tipos de virus da gripe designados como tipos A, B e C. Até agora, o virus da gripe A tem sido o principal foco de atenção relativamente a manipulação genética. 0 genoma de um virus da gripe A selvagem consiste em 8 segmentos de RNA de cadeia negativa simples, que codificam 10 polipeptideos: As proteinas da RNA polimerase RNA dependente (PB 1, PB 2 e PA), a nucleoproteina (NP), as proteinas da matriz (Ml, M2), duas glicoproteinas de superfície que se projectam a partir do invólucro lipoproteico (hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA)) e as proteinas não estruturais NS1 e NS2. As proteinas HA, NA, NP e as proteinas da polimerase são codificadas por segmentos genómicos monicistrónicos.

Tal como para outros virus de RNA de cadeia negativa segmentados ;, durante o ciclo replicativo de um virus da gripe, o genoma virai é transcrito em mRNA e replicado em RNA complementar (CRNA) Para isto, os segmentos de vRNA genómico necessitam de ser complexados com a nucleoproteina e a RNA polimerase dependente de RNA em complexos ribonucleoproteicos (RNP) (Huang et al., J. Virol. (1990) 64, 5669-5673; Garcia-Sastre, Trends In Biotechnology (1998) 16_, 230-235) . Inicialmente, para manipular o genoma de um virus da gripe, RNPs foram recons- 4 ΡΕ1194580 tituídas in vitro a partir de RNA transcrito a partir DNA de plasmideo na presença das proteínas polimerases PBl, PB2 e PA e da nucleoproteína isolada a partir do vírus da gripe purificado (Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87, 3802-3805; Enami and Palese, J. Virol. (1991) 65, 2711-2713; Muster and Garcia-Sastre, Genetic manipulation of influenza viruses in Texbook of influenza (1998), cap. 9, eds. Nicholson et al.) . As RNPs reconstituídas in vitro foram transfectadas em células infectadas com um vírus da gripe auxiliar, o qual proporciona as restantes proteínas necessárias e os segmentos de RNA, resultando na geração de vírus transfectantes. Esta técnica tem sido extremamente útil no avanço da compreensão da biologia molecular e patogenicidade dos vírus da gripe. No entanto, baseia-se em métodos de selecção altamente especializados para isolar os vírus transfectantes a partir de vírus auxiliares, o que restringe o seu uso a determinados segmentos de RNA de um número limitado de estirpes virais.

Mais recentemente, a reconstituição intracelular de um complexo RNP derivado de um segmento de vRNA transcrito intracelularmente mostrou-se ser possível usando proteínas NP e polimerases expressas em plasmídeos (Neumann et ai., Virlogy (1994) 202, 477-479; Zhang and Air, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200, 95-101; Plescka et al., J. Virol. (1996) J0_, 4188-4192). Por exemplo, Pleschka et al. mostrou que PBl, PB2, PA e NP da gripe A expressas a partir de plasmídeos podem encapsidar, transcrever e replicar um RNA tipo vRNA do vírus da gripe, 5 ΡΕ1194580 contendo um gene repórter da cloranfenicol acetiltrans-ferase (CAT), em células 293 humanas transfectadas. Este gene repórter tipo vRNA foi introduzido nas células hospedeiras escolhidas por transfecção de um DNA de plasmídeo (pPOLI-CAT-RT) tendo um promotor de RNA polimerase I humana truncado (nucleótidos -250 a -1) posicionado a montante da região codificadora do vRNA. A sequência da ribozima genómica do vírus da hepatite delta foi posicionada a jusante da região codificadora do vRNA, de forma a assegurar o processamento do RNA para dar o extremo 3' correcto do vRNA transcrito. Foi igualmente descrito pelo mesmo grupo que, através da substituição do plasmídeo codificador do gene repórter CAT com um plasmídeo codificador de um segmento de vRNA autêntico da gripe A, podiam ser recuperados complexos RNP reconstituídos intracelularmente em vírus transfectantes, quando da infecção das células transfectadas com um vírus auxiliar da gripe. Tal sistema de recuperação baseado em vírus auxiliar foi investigado por Pleschka et al. empregando segmentos de vRNA de NA mutante do vírus da gripe A transcritos intracelularmente. A mudança para um sistema de recuperação totalmente baseado em plasmídeo para os vírus da gripe levanta, no entanto, novas considerações em termos de obtenção de expressão adequada da totalidade das sequências necessárias e da cooperação correcta daquelas sequências para montar um vírus completo.

Bridgen e Elliott foram incapazes de recuperar o buniavírus Bunyamvera usando plasmídeos que dirigem a 6 ΡΕ1194580 expressão de segmentos de vRNA genómico em vez de RN As anti-genómicos. Encontrou-se agora, no entanto, que a recuperação sem vírus auxiliar de um vírus da gripe A em culturas celulares é possível através da cotransfecção de culturas celulares de 12 plasmídeos capazes de coexpressão de 8 segmentos de vRNA e das proteínas NP e 3 RNA polimerases, necessárias para a formação de complexos RNP. Esta mesma estratégia pode ser extrapolada para uma variedade de outros vírus de RNA de cadeia negativa segmentados tendo um grande número de segmentos de vRNA genómico, por exemplo 6 ou mais, incluindo, por exemplo, vírus da gripe de outros tipos e outros membros da família Orthomyxoviridae, tais como os togotovírus contendo 6 segmentos de vRNA. Enquanto os vírus da gripe A e da gripe B possuem 8 segmentos de vRNA, foram descritos vírus da gripe A modificados contendo um segmento de vRNA adicional (Enami et al., Virology (1993) 185, 765-90) e vírus da gripe C tendo um segmento de vRNA a menos.

Sumário do invento O presente invento proporciona assim um método para a geração de partículas virais infecciosas de um vírus de RNA de cadeia negativa segmentado, tendo mais de 3 segmentos de vRNA genómicos, o referido método compreendendo : introdução nas culturas celulares de vectores de expressão que expressam nas referidas células os segmen- 7 ΡΕ1194580 tos de vR-NA genómicos completos ou os correspondentes cRNAs completos do referido vírus, as referidas células também proporcionando uma nucleoproteína e uma RNA polimerase dependente de RNA ,pelo que os complexos RNP contendo os segmentos de vRNA genómico do referido vírus são formados e as referidas partículas virais infecciosas são produzidas pelas referidas células, na ausência de um vírus auxiliar, e em que as referidas células não produzem interferão.

As células hospedeiras escolhidas podem, por exemplo, ainda ter introduzidos um ou mais vectores de expressão capazes de dirigir a expressão nas células de uma ou mais proteínas virais necessárias. Por exemplo, uma segunda série de vectores de expressão pode ser empregue para expressar nas células hospedeiras a nucleoproteína e todas as subunidades da polimerase dependente de RNA. Por conveniência, por exemplo, pode ser empregue um vector de expressão separado para cada uma das proteínas. As células hospedeiras escolhidas podem, por exemplo, como alternativa ser manipuladas para expressar uma ou mais das nucleo-proteínas e subunidades de RNA polimerase dependentes de RNA. Caso sejam proporcionadas todas as proteínas essenciais para a encapsidação, transcrição e replicação dos vRNAs pelas células hospedeiras de partida, então será óbvio que apenas a primeira série de vectores de expressão é necessária. Ainda, as células hospedeiras de partida escolhidas podem ser células manipuladas de forma a expressarem um ou mais segmentos de vRNAs genómicos do ΡΕ1194580 vírus pretendido. Através de um método do invento, será entendido que a recuperação de um vírus de RNA de cadeia negativa segmentado pode ser conseguida sem qualquer ajuda de vírus, e.g., através de um método totalmente baseado em plasmídeo.

Num outro aspecto, o invento proporciona um método para a produção em culturas celulares de partículas infecciosas de um vírus de cadeia negativa segmentado, o referido método compreendendo: obtenção de uma primeira população de células que são capazes de suportar a replicação do referido vírus e que foram modificadas para proporcionar (a) os vRNAs genómicos do referido vírus e (b) uma nucleoproteína e RNA polimerase dependente de RNA, pelo que os complexos RNP contendo os referidos vRNAs genómicos são formados e as referidas partículas virais infecciosas são montadas, os referidos vRNAs genómicos sendo directamente expressos nas referidas células sob o controlo de um promotor Pol I de mamífero ou de um seu derivado funcional na ausência de um vírus auxiliar e em que as referidas células não produzem interferão.

Será entendido que as células hospedeiras modificadas para recuperação virai, como atrás descrito, constituem um outro aspecto do invento. As partículas virais produzidas pela referida primeira população de células podem ser amplificadas através de um ou mais de outros 9 ΡΕ1194580 passos de infecção das células, por exemplo, empregando as mesmas culturas celulares da referida primeira população de células ou outras diferentes. Para usar, as partículas virais assim produzidas podem ser isoladas.

Sempre que as partículas virais inicialmente produzidas pelas células hospedeiras não sejam atenuadas, um passo de atenuação convencional ou de inactivação do vírus pode ser subsequentemente realizado, por exemplo, antes da formulação para usar numa vacina. As partículas virais geradas de acordo com o invento podem ser partículas virais recombinantes capazes de expressar uma sequência heteróloga. Tais partículas, se necessário após atenuação ou inactivação conforme adequado, podem também ser formuladas para usar como vacina ou para outro fim terapêutico.

Ao contrário das técnicas de recuperação iniciais, baseadas num vírus auxiliar, para o vírus da gripe, os métodos do invento podem ser facilmente usados para a geração de vírus da gripe infecciosos de qualquer um dos tipos A, B e C contendo múltiplas mutações em vários genes diferentes ao mesmo tempo. Tal método também permite a produção mais fácil e mais directa de redistribuição de segmentos genómicos em vírus de cadeia negativa segmentados contendo segmentos de vRNA derivados de mais de um vírus parental. Convencionalmente, os vírus com redistribuição são obtidos por rastreio de partículas virais através da infecção de células com uma população mista de vírus. Um método do invento é particularmente vantajoso para a 10 ΡΕ1194580 produção de vírus de cadeia negativa segmentado que sofreu redistribuição, os quais são difíceis de isolar por métodos clássicos.

Breve descrição da figura A Figura 1 é uma representação esquemática de uma realização do invento, como ainda descrito nos Exemplos 1 a 3, em que 12 plasmideos, para expressão directa dos segmentos de vRNA do vírus da gripe A e expressão da nucleoproteína e subunidades da RNA polimerase dependente de RNA do vírus da gripe A, são cotransfectados em células Vero em cultura (células de rim de macaco verde) . Nesta realização, são empregues células MDBK (rim bovino Madin-Darby) para o ensaio de placas e amplificação de partículas virais recuperadas. No entanto, será evidente que outras células que suportam o crescimento do vírus da gripe A podem ser igualmente empregues para o ensaio de placas e amplificação, incluindo células Vero e células MDCK (rim canino Madin-Darby). Na Figura 1, POL I = promotor truncado da RNA polimerase humana I, R = ribozima genómica do vírus da hepatite, MLP = principal promotor tardio do adenovírus tipo 2 ligado a uma sequência sintética compreendendo a sequência líder tripartida processada do adenovírus humano tipo 2 e pA = sequência de poliadenilação do SV40.

Descrição detalhada do invento

Prefere-se empregar vectores de expressão para 11 ΡΕ1194580 expressarem directamente segmentos de vRNA genómicos do vírus pretendido. Estes podem ser segmentos de vRNA totalmente selvagens ou podem incluir pelo menos um segmento de vRNA não selvagem, e.g., um segmento de vRNA mutante tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções nucleo-tídicas.

Por exemplo, pelo menos um segmento de vRNA proporcionado pelas células hospedeiras pode ser um segmento de vRNA guimérico capaz de expressar uma sequência heteróloga relativamente ao genoma virai em células alvo infectadas pelo vírus recuperado. Tal sequência heteróloga pode codificar um peptídeo ou um polipeptídeo. Pode em alternativa codificar um ácido nucleico, como seja uma ribozima ou ácido nucleico complementar da cadeia codificadora. A sequência heteróloga pode ser proporcionada num segmento de vRNA codificando ainda uma proteína virai nativa completa, conforme ilustrado pelo segmento de vRNA quimérico descrito no Exemplo 8, ou pode ser inserido na sequência codificadora de uma proteína virai. Por exemplo, é conhecido que a proteína HA da gripe A pode tolerar o enxerto de epitopos no local antigénico B. Métodos para a construção de tais segmentos de vRNA quiméricos estão revistos, por exemplo, em Muster and Garcia-Sastre, Ch. 9, Textbook of Influenza (1998) e Palese et al., Proc., Ntal. Acad. Sei. USA (1996) 93_, 11354-11358. Estratégias para a construção de segmentos de vRNA de virus da gripe quiméricos foram também anteriormente descritos no Pedido de Patente Internacional Publicado WO 91/03552. 12 ΡΕ1194580

Os segmentos de vRNA proporcionados nas células hospedeiras podem ainda, ou em alternativa, incorporar uma ou mais mutações atenuadas. Por exemplo, os segmentos de vRNA podem ser os segmentos de vRNA de um virus da gripe A tendo a substituição de um par de bases atenuante numa região de cadeia dupla da estrutura em cabo de frigideira do promotor, em particular, por exemplo, a conhecida substituição atenuante do par de bases A para C e U para G na posição 11-12' na região do duplex do vRNA especifico de NA (Fodor et al., J. Virol. (1998) 6283-6290). Ao usar-se o sistema de recuperação do invento, podem ser identificadas novas mutações atenuantes. Conforme indicado atrás, quando partículas virais não atenuadas são inicialmente produzidas por um método do invento, a atenuação ou inactivação das partículas virais pode, no entanto, ser subsequentemente conseguida, por exemplo, por métodos clássicos.

Virus atenuados ou inactivados produzidos de acordo com o invento podem, subsequentemente, ser incluídos numa composição de vacina de forma convencional. Quando tal vírus possuir um segmento de vRNA quimérico como discutido atrás, o qual codifica um antigénio estranho, pode ser formulado para se conseguir vacinação contra mais de um agente patogénico em simultâneo. Os vírus recombinantes atenuados produzidos de acordo com o invento, que possuem um segmento de vRNA quimérico, podem também ser projectados para outros usos terapêuticos, e.g., um agente anti-tumoral ou instrumento de terapia génica, neste caso a produção do 13 ΡΕ1194580 vírus será seguida pela sua incorporação numa composição farmacêutica adequada juntamente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Conforme indicado atrás, a recuperação sem virus auxiliar de acordo com o invento é particularmente favorecida para a geração de vírus com redistribuição, especialmente vírus da gripe com redistribuição destinados a serem usados como vacina. Por exemplo, por meio de recuperação de vírus de acordo com o invento, os segmentos de vRNA de HA e NA de um vírus da gripe, e.g. gripe A/PR8/34 que é reconhecida como adequada para administração humana, podem ser facilmente substituídos com os segmentos de vRNA HA e NA de uma estirpe da gripe associada a uma infecção epidémica pelo vírus da gripe. Tais vírus da gripe com resdistribuição podem, por exemplo, ser usados para a produção de uma vacina da gripe inactivada de forma convencional (ver Exemplos 4 e 6).

Os vectores de expressão empregues podem preferencialmente ser plasmídeos capazes de se replicarem nas células hospedeiras escolhidas. Um vector de expressão separado pode ser proporcionado para expressão directa de cada segmento de vRNA necessário ou o correspondente cRNA. Como já referido atrás, uma segunda série de vectores de expressão pode ser igualmente proporcionada para cada uma das nucleoproteínas e subunidades de RNA polimerase dependentes de RNA individuais, e.g., as subunidades PBl, PB2 e PA de uma RNA polimerase dependente de RNA do vírus da 14 ΡΕ1194580 gripe. No entanto, como também indicado atrás, alternativamente, pode ser empregue uma linha celular que seja capaz de expressar uma ou mais destas proteinas situação em que a segunda série de vectores de expressão pode ser reduzida ou mesmo eliminada. O exemplo 7 ilustra tal método para recuperação, sem um vírus auxiliar, de um vírus da gripe A empregando uma linha celular que expressa estavelmente a nucleoproteína.

Todos os vectores de expressão necessários podem, preferencialmente, ser introduzidos nas células hospedeiras escolhidas num único passo de cotransfecção ou cotrans-dução. Para este fim, a transfecção lipossomal pode ser preferencialmente empregue, por exemplo usando o reagente de transfecção lipossomal DOTAP (Boehringer Mannheim) ou LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL).

No entanto, será entendido que pode ser feito mais de um passo de transferência de vector e que podem ser empregues outros meios conhecidos para introdução de vectores em células de mamífero, por exemplo, electropo-ração, transfecção com DEAE-dextrano, bombardeamento com micropartículas e transdução virai, e.g. utilização de retrovirus defectivos para a replicação. A precipitação com fosfato de cálcio é também particularmente preferida (ver Exemplo 5) . Podem ser escolhidos, por exemplo, para introduzir nas células hospedeiras vectores de expressão para a expressão das proteínas NP e polimerases antes dos vectores de expressão para a expressão dos segmentos de 15 ΡΕ1194580 vRNA. As células hospedeiras nas quais os vectores necessários são introduzidos podem estar numa placa de cultura ou cultivadas noutras formas adequadas para a transfecção ou transdução do vector. A expressão dos segmentos de vRNA ou correspondentes cRNAs estará, de preferência, sob o controlo de uma sequência de promotor derivada de um promotor de RNA Pol I de mamifero. É particularmente preferida para este fim o promotor truncado da RNA Pol I humana consistindo nos nucleótidos -250 a -1 do correspondente promotor nativo ou um seu derivado funcional (Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 8_5, 669-673). Outros promotores podem, no entanto, ser empregues em alternativa, incluindo, por exemplo, um promotor da RNA polimerase de T7. Para assegurar o extremo 3' correcto de cada vRNA ou cRNA expresso, cada vector de vRNA ou cRNA incorporará uma sequência de ribozima ou sequência terminadora adequada a jusante da sequência codificadora de RNA. Isto pode ser, por exemplo, a sequência de ribozima genómica do vírus da hepatite delta ou um seu derivado funcional. Como alternativa, por exemplo, pode ser empregue um terminador da Pol I (Neumann et al., Virology (1994) 202, 477-479). Os vectores de expressão de RNA podem ser construídos na mesma forma que os vectores de expressão de vRNA descritos em Pleschka et al., J. Virol. (1996) 70, 4188-4192.

Quando um ou mais vectores de expressão proteica são necessários para expressar proteínas virais para a 16 ΡΕ1194580 formação do complexo RNP, estes expressarão preferencialmente homólogos das proteínas virais necessárias para o vírus pretendido. A expressão da nucleoproteína e das subunidades de polimerase dependente de RNA pode preferencialmente, por exemplo, estar sob o controlo de uma sequência reguladora compreendendo o principal promotor tardio de adenovírus tipo 2 ligado à sequência do líder tripartido processado do adenovírus humano tipo 2, como descrito por Berg et al., Bio Techniques, 14, 972-978, ou um derivado funcional da referida sequência reguladora. No entanto, sequências de promotor alternativas, operativas em células de mamífero, podem possivelmente ser substituídas como seja, por exemplo, por um outro promotor virai, por exemplo o promotor precoce imediato de citomegalovírus humano (CMV) ou um promotor da polimerase de T7. Plasmídeos adequados para expressão da NP e subunidades da polimerase podem ser construídos, por exemplo, partindo do plasmídeo pGT-h como também descrito no artigo atrás mencionado de Berg et al. 0 invento será ainda descrito abaixo com referência específica à recuperação de vírus da gripe A. Com o objectivo de recuperar vírus da gripe A através da estratégia do invento utilizando plasmídeos que directamente expressam os vRNAs necessários, encontrou-se ser favorável, por exemplo, usar células Vero (rim de macaco verde africano), se bem que outras células que suportam a replicação dos vírus da gripe possam ser empregues, por exemplo, de preferência células de rim embrionário humano 17 ΡΕ1194580 293Τ. Tais células podem ser transfectadas de preferência na superfície de uma placa de cultura adequada. É conhecido que as células Vero são deficientes na expressão de interferão (Diaz et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA (1998) R5, 5259-5263), o que deverá ser um factor para se conseguir uma boa recuperação virai. Assim, é extrapolado que as células Vero e outras células deficientes na actividade ou resposta ao interferão que suportarão a replicação de vírus de RNA de cadeia negativa segmentados são úteis na realização do invento.

Quantidades e proporções adequadas de vectores para a realização de um método do invento podem ser determinadas através de experimentação de rotina. Como orientação, no caso de transfecção com lipossomas ou precipitação com cálcio dos plasmídeos nas células hospedeiras, pretende-se que cada plasmídeo seja empregue em pg, e.g. 1 a 10 pg, por exemplo diluído para uma concentração final de DNA total de aproximadamente 0,1 pg/ml, antes da mistura com o reagente de transfecção de forma convencional. Pode ser preferido usar vectores que expressam NP e/ou subunidades de RNA polimerase dependente de RNA numa concentração mais elevada do que as que expressam segmentos de vRNA.

De acordo com determinados aspectos, a presente especificação também proporciona um método para a geração de partículas virais infecciosas em culturas celulares de 18 ΡΕ1194580 um vírus de RNA de cadeia negativa segmentada, método que compreende: i) obtenção de uma população de células que sejam capazes de suportar o crescimento dos referidos vírus e que são modificadas de forma a serem capazes de proporcionar (a) os vRNAs genómicos do referido vírus na ausência de um vírus auxiliar e (b) uma nucleoproteina e RNA polimerase dependente de RNA pelo que o ou os complexos RNP contendo os referidos vRNAs genómicos podem ser formados e as referidas partículas virais podem ser montadas, os referidos RNAs sendo directa-mente expressos nas referidas células sob o controlo de um promotor Pol I de mamífero ou um seu derivado funcional, e.g., o promotor truncado de Poli humana como anteriormente observado e (ii) cultura das referidas células pelo que as referidas partículas virais são produzidas.

Tais células produtoras de vírus podem, por exemplo, serem de preferência células Vero ou outras células deficientes em actividade ou resposta ao interferão que suportarão o crescimento de vírus de RNA de cadeia negativa segmentados. A totalidade ou algumas das sequências codificadoras dos referidos vRNAs genómicos, nucleoproteina e RNA polimerase RNA dependente podem ser proporcionadas nas células hospedeiras escolhidas através da introdução de vectores de expressão nas células. 19 ΡΕ1194580

Os exemplos que se seguem ilustram o invento com referência a recuperação sem virus auxiliar de um virus da gripe A. No entanto, como previamente indicado atrás, o invento não está confinado a tais virus mas pode ser aplicado a outros virus de RNA de cadeia negativa segmentado, especialmente, por exemplo, virus da gripe de outros tipos.

Exemplos

Exemplo 1

Preparação de plasmídeos codificadores de segmentos de vRNA de um vírus da gripe A

Foram usados oito plasmideos, cada um deles expressando um segmento diferente de VRNA da gripe A/WSN/33 (pP0Ll-PB2-RT, pPOLl-PBl-RT, pPOLl-PA-RT, pPOLl-HA-RT, pPOLl-NP-RT, pPOLl-NA-RT, pPOLl-M-RT e pPOLl-ns-RT). Estes são plasmideos baseados em pUC19 ou pUC18, análogos em estrutura ao plasmideo modelo codificador de segmentos de vRNA, pPOLl-CAT-RT, descrito em Pleschka et ai. (1996) J. Virol. 70/ 4183-4192, excepto a substituição do cDNA codificador do segmento do gene repórter CAT do vRNA (uma grelha de leitura aberta para a cloranfenicol acetil-transferase de polaridade negativa flanqueada pelas regiões não codificadoras do segmento de vRNA codificador de NS do virus da gripe A/WSN/33) por uma cDNA codificador de um segmento de vRNA nativo do virus da gripe A/WSN/33. Em cada um destes plasmideos, um promotor truncado da RNA Poli 20 ΡΕ1194580 humana (posições -250 a -1) foi fundido com o extremo do segmento de vRNA codificador de cDNA para assegurar que o extremo 5' correcto do vRNA transcrito. É também proporcionado em cada um dos segmentos de vRNA a sequência da ribozima genómica do virus da hepatite delta para também assegurar o extremo 3' correcto do vRNA transcrito.

As amostras de virus da gripe A/WSN/33 para a preparação dos insertos de cDNA dos plasmideos atrás descrito são obtidas, por exemplo, a partir da W.H.O. Collabo-rating Centre, Division of Virology, National Institute for Medicai Research, London, UK).

Exemplo 2

Preparação de plasmideos para a expressão das proteínas PBl, PB2, PA e NP do vírus da gripe A/WSN/33. 4 plasmideos de expressão (pGT-h-PBl, pGT-h-PB2, pGT-h-PA e g-GT-h-NP) foram ainda preparados, cada um capaz de expressar uma proteína diferente seleccionada entre as proteínas necessárias PBl, PB2, PA e NP, sob o controlo do principal promotor tardio de adenovírus 2 ligado a uma sequência sintética compreendendo a sequência líder tripartida processada de adenovírus tipo 2 humano. Este promotor foi anteriormente descrito como conferindo níveis elevados de expressão de proteínas em células adaptadas a cultura em suspensão sem soro (Berg et al. (1993) BioTechniques, 14, 972-978) . A série pGT-h de plasmideos de 21 ΡΕ1194580 expressão proteica foi construída através da inserção de grelhas de leitura abertas para as proteínas PBl, PB2, PA e NP no local de clonagem Bell do plasmideo pGT-h (Berg et al. (1993), ibid.)

Os plasmideos de expressão codificadores da nucleoproteina e das 3 subunidades proteicas virais da RNA polimerase dependente de RNA foram contransfectados em células 293 humanas ou células Vero com o plasmideo de expressão pPOLl-CAT-RT. Tanto em células humanas 293 como em células Vero transfectadas, a actividade CAT foi detectada. As células Vero foram escolhidas para a geração de virus da gripe A/WSN/33 sem virus auxiliar a partir de segmentos de vRNA transfectados como ainda descrito abaixo, uma vez que suportam melhor o crescimento do vírus da gripe a/wsn/33 do que as células 293 humanas (cerca de um log de diferença no título virai máximo).

Exemplo 3

Recuperação de vírus da gripe A/WSN/33 sem vírus auxiliar

Para a recuperação virai, células Vero perto da confluência em placas de 8,5 cm de diâmetro (cerca de 107 células cobrindo cerca de 90% da placa) foram contrans-fectadas com os quatro plasmideos de expressão proteica e os oito plasmideos de transcrição de vRNA descritos atrás. Para este passo de cotransfecção, 5 μρ de cada um dos 22 ΡΕ1194580 plasmídeos de expressão da polimerase, 10 μς do plasmídeo de expressão de NP e 3 μς de cada um dos 8 plasmídeos codificadores de vRNA foram diluídos para uma concentração de 0,1 μς/μΐ em tampão Hepes 20 mM (pH 7,5). A solução de DNA foi adicionada ao reagente de transfecção lipossomal DOTAP (Boehringer Mannheim) diluído contendo 240 μΐ de DOTAP e 720 μΐ de tampão Hepes 20 mM (pH 7,5). A mistura de transfecção foi incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois misturada com 6,5 ml de Meio Mínimo Essencial (MEM) contendo 0,5% de soro fetal de vitela (FCS), 0,3% de albumina sérica bovina (BSA), penicilina e estreptomicina. Esta mistura foi adicionada a células Vero lavadas com PBS. Após 24 horas, o meio de transfecção foi removido das células e substituído com 8 ml de meio fresco (MEM) contendo 0,5% FCS, 0,3% BSA, penicilina e estreptomicina. As células Vero transfectadas foram cultivadas durante pelo menos 4 dias após transfecção. Todos os dias, o meio das células transfectadas foi colhido e testado relativamente à presença de vírus da gripe semeando uma alíquota de 0,5 ml em células mdbk de forma convencional. O resto do meio foi transferido para frascos de 75 cm2 de células MDBK subconfluentes para amplificação de qualquer virus recuperado. As células transfectadas originais foram ainda incubadas após adição de 8 ml de meio fresco.

Este processo resultou na recuperação de vírus da gripe infeccioso no dia 4 pós-transfecção. Cerca de 10 a 20 partículas virais formadoras de placas foram obtidas a 23 ΡΕ1194580 partir de uma placa de 8,5 cm contendo 107 células. O vírus recuperado mostrou uma propriedade específica caracterís-tica do vírus da gripe A/WSN/33, í.e. formou placas em células MDBK na ausência de tripsina. As placas formadas por recuperação de vírus foram comparáveis em tamanho às formadas por uma amostra controlo autêntica de vírus A/WSN/33 nas mesmas células MDBK.

Para confirmar que as placas virais observadas nas células MDBK tratadas com vírus colhido a partir do meio de cultura de células transfectadas derivavam dos clones de cDNA, marcas genéticas foram introduzidas em dois cDNAs dos 8 segmentos de vRNA. Foi construído um cDNA codificador de um segmento de vRNA HA com uma mutação de 6 nucleótidos perto do extremo 3' do segmento. Os nucleótidos 31 a 35 do extremo 3' (3'-UUUUG-5') foram substituídos com 3'-AAAAC-5' resultando em substituição de aminoácidos no aminoácido 4(K—»F) e no aminoácido 5 (L—»V) perto do extremo N de HA dentro do peptídeo sinal. Ainda, uma mutação silenciosa C—>U foi criada no nucleótido 40. Estas alterações introduziram vários locais de restrição novos, incluindo um local Spel único. O cDNA codificador do segmento NA foi mutado para codificar um segmento NA contendo duas mutações silenciosas nos nucleótidos 1358 e 1360 de forma a introduzir um local de restrição único Saci (Pleschka et al., J. Virol. (1996) 70, 4188-4192). O meio das células MDBK infectadas com o vírus 24 ΡΕ1194580 transfectante recuperado foi usado para isolar vRNA. 100 μΐ do meio foi tratado com 5 u de DNase sem RNase para remover qualquer contaminação com DNA plasmidico residual. Após 15 mins a 37°C, o vRNA foi isolado usando Rneasy Mini kit (Qiagen). Pequenas regiões dos vRNAs HA e NA, que se espera conterem as marcas genéticas, foram amplificadas por RT-PCR e depois analisados por digestão com as enzimas de restrição Spel e Saci, respectivamente. Como testemunha, as mesmas regiões dos segmentos HA e NA foram amplificadas a partir do vRNA isolado a partir de virus autêntico da gripe a/wsn/33 usando as mesmas sequências iniciadoras de RT-PCR.

Os produtos de PCR obtidos a partir do virus recuperado e do vírus controlo eram do mesmo tamanho. Os derivados dos segmentos de HA e NA do vírus recuperado foram digeridos com Spel e Saci respectivamente. No entanto, os produtos de PCR correspondendo ao vírus controlo foram, como esperado, não digeridos pelas mesmas enzimas. A omissão da transcriptase reversa nas reacções de RT-PCR controlo resultou em produtos de PCR não visíveis.

Comentários

Os estudos descritos atrás mostram que é possível recuperar um vírus da gripe A através da cotransfecção de 8 plasmídeos de transcrição para os segmentos de vRNA individuais e de 4 plasmídeos de expressão codificadores das proteínas NP, PBl, PB2 e PA em células Vero na ausência de qualquer vírus auxiliar. 25 ΡΕ1194580 É sublinhado que nos estudos atrás referidos, o vírus da gripe foi gerado através da expressão de segmentos de vRNA de sentido negativo. Isto parece contradizer alguns estudos iniciais que evidenciavam a importância da utilização de RNA de cadeia positiva para a recuperação de vírus de RNA de cadeia negativa, incluindo vírus Bunyamvera cujo genoma consiste em 3 segmentos (Schnell et al. (1994) EMBO J., _13, 4195-4203; Roberts and Rose (1998) Virology 247, 1-6; Bridgen and Elliot (1996) 9^3, 14500-15404) . No entanto, foram descritas recuperações bem sucedidas mais recentes de vírus de cadeia negativa não segmentados a partir de RNA de cadeia negativa (Kato et al. (1996) Genes Cells 1, 569-579; Durbin et al. (1997) Virology 235:323-332) .

Num protocolo do invento como ilustrado atrás, nas fases iniciais pós-transfecção, mRNA de sentido positivo derivado dos 4 plasmídeos de expressão proteica coexistem com vRNA genómico nu de sentido negativo transcrito a partir dos plasmídeos de transcrição. Assim, pode-se formar RNA de cadeia dupla. A formação de tal RNA de cadeia dupla em células humanas pode possivelmente conduzir à indução de respostas antivirais mediadas por interferão e consequentemente à supressão do crescimento de qualquer vírus recuperado. No entanto, tal indução de interferão é ultrapassada em células Vero, uma vez que estas células são deficientes na expressão de interferão. 26 ΡΕ1194580

Exemplo 4

Recuperação de vírus da gripe A/PR/8/34 (variante Cambridge) sem vírus auxiliar

De forma a recuperar A/PR/8/34 totalmente a partir de DNA recombinante, foram gerados 12 plasmídeos. Os 12 plasmídeos são análogos aos descritos para a recuperação de vírus A/WSN/33 (ver Exemplos 1 e 2 atrás), com algumas modificações. Os 8 plasmídeos necessários para a síntese dos 8 segmentos de vRNA, pela RNA polimerase I celular, possuem uma sequência terminadora de rRNA murino (GenBank, número de acesso M12074) em vez da ribozima do vírus da hepatite delta para gerar o extremo exacto 3' dos segmentos de vRNA. Os 4 plasmídeos de expressão proteica para as subunidades da polimerase A/PR/8/34 (PBl, PB2, PA) e nucleoproteína (NP) são baseados no pcDNA3 comercializado (Invitrogen, Catalogue N° V790-20), que tem um promotor de citomegalovírus (CMV) e o local poli(A) da hormona de crescimento bovina (BGH).

Construção do plasmídeo pPolISapIT

De forma a permitir a clonagem fácil dos 8 segmentos de vRNA, foi construído um novo vector de clonagem básico, pPolISapIT. Nesta construção, a sequência terminadora de rDNA murino (posições +520 a +715) é posicionada a jusante do promotor Poli. O promotor Poli e as sequências terminadoras estão separadas por uma 27 ΡΕ1194580 sequência adaptadora de 24 pb (5'-AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3'), contendo os locais de restrição Sapl. O plasmideo pPollSaplT foi obtido a partir de pPolI-CAT-RT (originalmente descrito em Pleschka et al., J. Virol. 70/ 4188-4192, 1996). Um fragmento de DNA contendo uma região da sequência terminadora de rDNA murino (posições +335 a +715, GenBank número de acesso M12074) foi inserido no local Sall de pPolI-CAT-RT para gerar pPolI-CAT-T. Subsequentemente, usando uma técnica de PCR inverso, o gene CAT, a ribozima e parte da sequência terminadora de rDNA murino (posições +335 a +571) foram eliminadas de pPolI-CAT-T. Ao mesmo tempo, a sequência adaptadora de 24 pb como descrita atrás foi introduzida através de sequências iniciadoras para PCR entre o promotor Poli e a sequência terminadora de rDNA murino.

Construção dos vectores de expressão de vRNA CDNA foi gerado por RT-PCR a partir de vRNA isolado de vírus da gripe A/PR/8/34 (variante Cambridge) usando sequências iniciadoras de PCR com extremos salientes Sapl. Após digestão com Sapl, os produtos de PCR foram clonados em pPolUSapIT digerido com Sapl.

Recuperação de vírus A contransfecção dos 12 plasmídeos em células Vero, usando o reagente de transfecção DOTAP e seguindo o 28 ΡΕ1194580 protocolo dado no Exemplo 3 (ver também Fodor et al., J. Virol. (Novembro 1999) T3_, 9679-9682), resultou na recuperação de partículas infecciosas da gripe A/PR/8/34 no 4o dias pós-transfecção. Os ensaios de placas e a amplificação virai foram realizados em células MDCK na presença de 0,5 μς/ιηΐ de tripsina.

Comentários

Estes resultados demonstram que o vírus da gripe A/PR/8/34 pode ser recuperado com êxito pelo método sem vírus auxiliar do invento. Isto é de particular interesse uma vez que o vírus da gripe A/PR8/34 é avirulento para o Homem (Beare et al., (1975) Trials in man with live recombinants made from A/PR8/34 (HON1) e vírus da gripe selvagem H3N2, Lancet (ii) 729-732) enquanto que o vírus da gripe A/WSN/33 é considerado inadequado para administração a seres humanos devido ao seu conhecido neurotropismo em ratinhos. É, assim, proposto que o vírus da gripe A/PR8/34, numa forma adequadamente atenuada, seja adequado como vírus parental para o desenvolvimento de vacina viva. Por exemplo, a recuperação de vírus sem um vírus auxiliar de acordo com o invento poderá ser usada para gerar um vírus atenuado resultante de redistribuição com vectores de expressão para os vRNAs do vírus da gripe A/PR8/34 exceptuan-do a substituição dos segmentos genómicos HA e NA do vírus A/PR8/34 com os segmentos genómicos HA e NA de uma estirpe de vírus da gripe associado a uma infecção epidémica pelo vírus da gripe. Mais exemplificação do uso de recuperação 29 ΡΕ1194580 de vírus sem vírus auxiliar de acordo com o invento para gerar vírus da gripe resultante de redistribuição está apresentada no Exemplo 6 abaixo.

Exemplo 5

Protocolos optimizados para a recuperação de vírus da gripe a/WSN/33 sem vírus auxiliar

Os 4 plasmídeos de expressão proteica especificados no Exemplo 2 foram substituídos com os plasmídeos de expressão proteica especificados no Exemplo 4 derivados de pcDNA3. Usando estes quatro plasmídeos de expressão proteica juntamente com os oito plasmídeos de transcrição de vRNA especificados no Exemplo 1 (ver também Fodor et al., J. Virol. (1990) 73/ 9679-9682) nos 3 protocolos descritos abaixo, entre 100-10000 partículas virais formadoras de placas a partir de 106 células foram obtidas no dia 2 pós-transfecção. Isto é pelo menos 100 vezes mais vírus do que o obtido pelos estudos de transfecção descritos no Exemplo 3.

Protocolo (a) : Transfecção de células 293T usando o reagente de transfecção "LipofectAMlNE 2000" 1 pg de cada um dos 12 plasmídeos foram combinados e o volume ajustado a 50 μΐ pela adição de meio OPTIMEM (Gibco BRL) . Num tubo de polistireno, 12 μΐ de Lipo-fectAMINE 2000 (Gibco BRL, Cat. N° 11 688-027) e 238 μΐ de 30 ΡΕ1194580 meio OPTIMEM foram combinados e a mistura incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente. A mistura de DNA foi então adicionada gota a gota ao reagente de transfecção LipofectAMlNE 2000 diluido. Após incubação da mistura de DNA-Lipofectamine à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos, a mistura foi adicionada gota a gota a uma suspensão de células 293T (cerca de 106 células em 1 ml de DMEM contendo 10% FCS sem antibióticos). Cerca de 16-24 horas pós-infecção, a mistura de transfecção foi removida e substituída com 1 ml de DMEM contendo 0,5% FCS, 0,3% BSA, penicilina e estreptomicina. 24-48 horas mais tarde, o vírus recuperado foi testado por plaqueamento de 100 μΐ do meio de células 293 T transf ectadas em células MDBK e passando o resto do meio para um frasco de MDBK semi-confluente de 25 cm2. 1 ml de DMEM contendo 0,5% FCS, 0,3% BSA penicilina e estreptomicina foi adicionado às células 293T transfectantes e a incubação continuou durante mais 2 a 3 dias antes de repetir o plaqueamento e amplificação em células MDBK.

Protocolo (b): Transfecção de células 293T usando precipitação com fosfato de cálcio

Para a transfecção usando precipitação com fosfato de cálcio, 1 μρ de cada um dos 12 plasmídeos foram combinados e a mistura de plasmídeos adicionada a 250 μΐ de tampão HEBS 2x (Hepes 40 mM, NaCl 280 mM, KC1 10 mM, Na2HP04 2 mM, glucose 10 mM, pH 7,05). Em seguida 250 μΐ de CaCl2 250 mM foi adicionado e o conteúdo do tubo misturado 31 ΡΕ1194580 fortemente. Após 20-30 mins à temperatura ambiente, o precipitado foi misturado com 1 ml de DMEM contendo 10% de FCS, penicilina e estreptomicina e adicionado a uma suspensão de células 293T (cerca de 106 células em 1 ml de DMEM contendo 10% FCS sem antibióticos) . Cerca de 16-24 horas pós-transfecção, a mistura de transfecção foi removida e substituída com 1 ml de DMEM contendo 0,5% de FCS, 0,3% BSA, penicilina e estreptomicina. 24-48 horas mais tarde, o vírus recuperado foi testado como no protocolo (a) atrás.

Protocolo (C): Transfecção de células Vero usando o reagente de transfecção DOTAP 1 μg de cada um dos 12 plasmídeos foi combinado e o volume ajustado a 120 μΐ através da adição de hepes 20 mM (pH 7,5) para dar uma concentração de DNA de aproxima-damente 0,1 μ9/μ1. A solução de DNA foi então adicionada ao reagente de transfecção DOTAP (Boehringer) diluído contendo 60 μΐ de DOTAP e 200 μΐ de Hepes 20 mM (pH 7,5) num tubo de polistireno. Após incubação da mistura DNA-DOTAP à temperatura ambiente durante cerca de 15- 20 minutos, a mistura foi adicionada gota a gota a uma suspensão de células Vero (cerca de 106 células em 1 ml de MEM contendo 10% de FCS, penicilina e estreptomicina). A cerca de 16-24 horas pós-transfecção, a mistura de transfecção foi removida e substituída por 1 ml de MEM contendo 0,5% FCS, 0,3% BSA, penicilina e estreptomicina. 24-48 horas mais tarde, o vírus recuperado foi testado através do plaque- 32 ΡΕ1194580 amento de 100 μΐ do meio das células Vero transfectadas em células MDBK e passando o resto do meio para um frasco de MDBK semiconfluente de 25 cm2. 1 ml de DMEM contendo 0,5% FCS, 0,3% BSA penicilina e estreptomicina foi adicionado às células 293T transfectantes e a incubação continuou durante mais 2 a 3 dias antes de repetir o plaqueamento e amplificação em células MDBK.

Exemplo 6

Recuperação de vírus da gripe resultado de redistribuição sem um vírus auxiliar A recuperação baseada em plasmídeos de acordo com o invento foi usado com êxito para gerar vírus da gripe com redistribuição de segmentos. Foram obtidos os seguintes vírus com redistribuição de segmentos: (i) A/WSN/33 com o segmento PA derivado de A/PR/8/34 (ii) A/WSN/33 com o segmento NP derivado de A/PR/8/34 (iii) A/WSN/33 com o segmento M derivado de A/PR/8/34 (iv) (A/WSN/33 com o segmento PB2 derivado de A/FPV/

Dobson/34.

Estes exemplos demonstram a utilidade do método sem vírus auxiliar para isolamento de produtos da redistribuição. Os vírus resultantes da redistribuição de segmentos baseado em A/PR8/34 (ou outras estirpes ade quadas) são necessários para a produção de vacinas mortas 33 ΡΕ1194580 convencionais devido a crescerem em títulos elevados em ovos de galinha embrionados - usado na produção comercial de vacinas da gripe mortas. Como anteriormente indicado atrás, uma aplicação importante da recuperação de vírus sem vírus auxiliar de acordo com o invento é assim vista como sendo um isolamento mais fácil e mais directo de vírus resultantes de redistribuição de segmentos do que pelo método de isolamento clássico de produtos da redistribuição de fragmentos a partir de uma infecção mista de células com dois vírus vivos. É importante que, usando um método do invento, é ultrapassada a necessidade de testar muitos potenciais produtos de redistribuição antes de ser isolado o necessário.

Exemplo 7

Recuperação de vírus da gripe A/WSN/33 em células EcR-293 sem vírus auxiliar A recuperação de vírus da gripe A/WSN/33 foi conseguida em células EcR-293NP, uma linha celular expressando estavelmente NP da gripe, através da transfecção de 11 plasmídeos. Células EcR-293NP foram obtidas a partir da linha celular EcR-293 comercializada (Invitrogen, Catalogue N° R650-07) que constitutivamente expressa as subunidades VgEcR e RXR do receptor da ecdisona. A expressão de NP da gripe em tais células é induzida como resposta a ponas- 34 ΡΕ1194580 terona A. O mesmo protocolo foi usado conforme especificado no Exemplo 5(a) empregando o reagente de transfecção Lipo-fectAMINE 2000 excepto pcDNA-NP ser omitido, uma vez que a proteína NP para a encapsidação inicial dos segmentos de vRNA foi proporcionada pelas células EcR-293NP.

Exemplo 8

Recuperação de um vírus da gripe recombinante expressando um antigénio estranho sem um vírus auxiliar

Obteve-se o plasmídeo pPOLI-E6Nl8-2A-NA capaz de expressar um segmento de vRNA quimérico baseado no segmento de vRNA NA do vírus da gripe A/WSN/33. A sequência codificadora do vRNA modificado foi inserida entre sequências correspondendo a um promotor Poli truncado humano e a ribozima do vírus da hepatite delta como para a preparação dos plasmídeos de expressão de Poli descritos no Exemplo 1. O gene quimérico resultante continha uma longa grelha de leitura aberta (ORF) codificadora dos primeiros 88 amino-ácidos da proteína E6 do papilomavírus humano 18 (HPV 18), seguido de 17 aminoácidos correspondendo ao motivo de autoclivagem da porteasse 2A do vírus da febre aftosa (FMDV), seguido da sequência de aminoácidos da NA do vírus da gripe A/WSN/33. A região codificadora foi flanqueada pelas regiões não codificadoras do gene NA do vírus da gripe A/WSN/33. Desta forma, foi gerado um gene do vírus da gripe quimérico codificador de uma poliproteína que sofre autoclivagem, resultando na geração de um polipeptídeo 35 ΡΕ1194580 derivado de HPV e a proteína NA. Uma estratégia semelhante para a expressão de antigénios estranhos por vírus da gripe vectores, gerados pela transfecção de RNP clássica, tinha sido previamente descrita (T. Muster e A. Garcia-Sastre, Genetic manipulation of influenza viruses, in Texbook of Influenza, K.G. Nicholson, R.G. Webster & A.J. Hay, eds., pp 93-106 (1998), Blackwell Science Ltd, Oxford, UK.) O vector do vírus da gripe recombinante expressando o antigénio derivado de HPV18 foi gerado por cotrans-fecção em células 293T pPOLl-E6Nl8-2A-NA juntamente com 7 vectores de expressão de Poli codificadores de RNAs virais selvagens, i.e. PB2, PB1, PA, HA, NP, M e NS como descrito no Exemplo 1 e os 4 vectores de expressão de Poli codificadores das proteínas PB2, PB1, PA e NP como descrito no Exemplo 5. O vírus recuperado tinha a sequência nucleo-tídica correcta como confirmado pela análise do seu RNA virai específico de NA.

Lisboa, 23 de Fevereiro de 2007

Claims (34)

1. ΡΕ1194580 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a produção de partículas virais infecciosas de um vírus de RNA de cadeia negativa segmentada tendo mais de 3 segmentos de vRNA genómico, o referido método compreendendo: introdução nas culturas celulares de vectores de expressão que expressam nas referidas células os segmentos de vRNA genómicos completos do referido vírus, ou os correspondentes cRNAs completos do referido vírus, em que as referidas células suportam o crescimento do referido vírus, as referidas células também proporcionando uma nucleoproteína e RNA polimerase dependente de RNA pelo que os complexos RNP contendo os segmentos de vRNA genómicos do referido vírus são formados e as referidas partículas virais infecciosas são produzidas pelas referidas células na ausência de um vírus auxiliar e em que as referidas células não produzem interferão.
2. 2. Um método como reivindicado na reivindicação 1, em que um ou mais de outros vectores de expressão são empregues nas referidas células para expressar uma ou mais proteínas seleccionadas entre a referida nucleoproteína e as subunidades da referida RNA polimerase dependente de RNA. 2 ΡΕ1194580
3. 3. Um método como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que é empregue uma linha celular, a qual é capaz de expressar a referida nucleoproteina e uma ou mais das subunidades da referida RNA polimerase dependente de RNA.
4. 4. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido vírus é um vírus da gripe tipo A, B ou C.
5. 5. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido vírus é um vírus resultante da redistribuição de segmentos tendo segmentos de vRNA derivados de mais de um dos vírus parentais.
6. 6. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que as referidas células são células Vero.
7. 7. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que os referidos vectores de expressão definidos na reivindicação 1 expressam segmentos de vRNA genómico do referido vírus.
8. 8. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ainda compreendendo a amplificação das referidas partículas virais através de um ou mais passos de infecção celular subsequentes empregando o mesmo tipo de células ou um diferente. 3 ΡΕ1194580
9. 9. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 que ainda compreende o isolamento de partículas virais infecciosas.
10. 10. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que ainda compreende um passo de atenuação ou inactivação virai.
11. 11. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que todos os vectores de expressão necessários são cotransfectados nas referidas células usando um reaqente de transfecção lipossomal, precipitação com fosfato de cálcio ou electroporação.
12. 12. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que os referidos vectores de expressão são todos plasmídeos.
13. 13. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que os referidos vectores de expressão definidos na reivindicação 1 consistem em vectores de expressão separados para a expressão de cada segmento de vRNA do referido vírus ou os correspondentes cRNAs.
14. 14. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações ala 13, em que a expressão de cada segmento de vRNA ou cRNA está sob o controlo de uma sequência de promotor derivada de um promotor Poli de mamífero. 4 ΡΕ1194580
15. 15. Um método como reivindicado na reivindicação 14, em que a referida sequência do promotor é uma sequência truncada do promotor Poli humano consistindo nos nucleó-tidos -250 a -1 do correspondente promotor nativo ou um seu derivado funcional.
16. 16. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a sequência codificadora de cada segmento de vRNA ou cRNA nos referidos vectores de expressão é seguida de uma sequência de ribozima ou termi-nador da transcrição que produz um extremo 3' correcto de cada referido RNA.
17. 17. Um método como reivindicado na reivindicação 2, em que a expressão de uma ou mais proteínas virais dos outros vectores de expressão está sob o controlo de uma sequência reguladora seleccionada entre o principal promotor tardio de adenovírus 2 ligado a uma sequência líder tripartida de um adenovírus tipo 2 humano ou do promotor precoce imediato de citomegalovírus ou um derivado funcional da referida sequência reguladora.
18. 18. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 que ainda compreende a incorporação de um vírus atenuado ou inactivado numa composição de vacina.
19. 19. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o referido vírus possui pelo menos um segmento de vRNA capaz de dirigir a expressão 5 ΡΕ1194580 de uma sequência heteróloga para o referido vírus nas células alvo infectadas pelo referido vírus.
20. 20. Um método como reivindicado na reivindicação 19, em que a referida sequência heteróloga para o referido vírus codifica um peptídeo antigénico ou polipeptídeo anti-génico e que ainda compreende a incorporação do referido vírus numa composição de vacina.
21. 21. Células modificadas como produzidas na reivindicação 1 ou reivindicação 6.
22. 22. Um método para a produção de partículas virais infecciosas de um vírus de cadeia negativa segmentado que compreende a cultura das células modificadas como reivindicado na reivindicação 21.
23. 23. Um método para a obtenção em culturas celulares de partículas virais infecciosas de um vírus de cadeia negativa segmentado o referido método compreendendo: obtenção de uma primeira população de células que são capazes de suportar a replicação do referido vírus e que foram modificadas para proporcionar (a) os vRNAs genómicos do referido vírus e (b) uma nucleoproteína e RNA polimerase dependente de RNA, pelo que os complexos RNP contendo os referidos vRNAs genómicos são formados e as referidas partículas virais infecciosas são montadas, os referidos vRNAs genómicos sendo directa-mente expressos nas referidas células sob o controlo de 6 ΡΕ1194580 um promotor Pol I de mamífero ou de um seu derivado funcional na ausência de um vírus auxiliar e em que as referidas células não produzem interferão.
24. 24. O método da reivindicação 22 compreendendo ainda amplificação das referidas partículas virais montadas através de um ou mais passos de infecção celular subsequentes empregando o mesmo tipo de células ou um diferente.
25. 25. Um método como reivindicado na reivindicação 23 ou reivindicação 24 que ainda compreende o isolamento de partículas virais infecciosas.
26. 26. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 23 a 25 que ainda compreende um passo de atenuação ou inactivação virai,
27. 27. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 23 a 26 que ainda compreende a incorporação de partículas virais atenuadas ou inactivadas numa composição de vacina.
28. 28. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 23 a 26, em que o referido vírus possui pelo menos um segmento de vRNA capaz de dirigir a expressão de uma sequência heteróloga para o referido vírus em células alvo infectadas pelo referido vírus e que ainda compreende a incorporação do referido vírus, se adequado após atenuação ou inactivação, numa composição farmacêutica juntamente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. 7 ΡΕ1194580
29. 29. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 23 a 28, em que as referidas células são células Vero.
30. 30. Células modificadas como produzidas na reivindicação 23 ou reivindicação 29.
31. 31. Um método de produção de partículas virais infecciosas de um virus de cadeia negativa segmentada que compreende a cultura das células modificadas como reivindicado na reivindicação 30.
32. 32. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 16 e 18 a 20, em que as células usadas para amplificação são células MDBK ou células MDCK.
33. 33. O método de qualquer uma das reivindicações 24 a 29, em que as células usadas para amplificação são células MDBK ou células MDCK.
34. 34. O método das reivindicações 1 a 20, 22 a 29 ou 31 a 33, em que as células são células EcR-293NP. Lisboa, 23 de Fevereiro de 2007