JP2003520573A - 分節化した（−）鎖ＲＮＡウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ再構築 - Google Patents

分節化した（−）鎖ＲＮＡウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ再構築

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Abstract

(57)【要約】 培養細胞において、ヘルパーウイルスの助けをかりずに、完全にベクターに基づいた系によって分節化(−)鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を開示する。この方法は、例えば、改変型インフルエンザウイルスを作製するのに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、培養細胞において、組換えDNAから、分節化した(−)鎖RNAウイルス
を再構築（レスキュー）することに関する。さらに特定すると、本発明は、例え
ば、３分節より多いゲノムvRNA分節をもつウイルス（特に、通常は８ゲノムvRNA
分節をもつインフルエンザウイルス）を、ヘルパーウイルスの必要性を回避する
完全なベクター駆動系によって、レスキューすることに関する。
【０００２】 ここ５年間で、組換えDNAから重要な非分節化(−)鎖RNAウイルスの大半をレス
キューできることが証明された。最初に、Schnellらが、組換えDNAからの狂犬病
ウイルスの回収に成功した(EMBO J. (1994) 13, 4195-4203)。その直後に、プラ
スミドをベースとしたレスキュー系が水疱性口内炎ウイルス(Lawsonら, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4477-4481; Whelanら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA (1995) 92, 8388-8392)、レスピラトリー・シンシチアルウイルス(Colli
nsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 11563-11567; Jinら, Virology
(1998) 251, 206-214)、麻疹ウイルス(Radeckeら, EMBO J. (1995) 14, 5773-5
784)、およびセンダイウイルス(Garcinら, EMBO J. (1995) 14, 6087-6094; Kat
oら, Genes Cells (1996) 1, 569-579)について開発された。比較的最近では、
ヒトのパラインフルエンザ３型(Durbinら, Virology (1997) 235, 323-332; Hof
fmanおよびBanerjee, J. Virol. (1997) 71, 4272-4277)、牛疫ウイルス(Baron
およびBarrett, J. Virol. (1997) 71, 1265-1271)、シミアンウイルス５(Heら,
Virology (1997) 237, 249-260)、ウシのレスピラトリー・シンシチアルウイル
ス(Buchholzら, J. Virol. (1999) 73, 251-259)、およびニューカッスル病ウイ
ルス(Peetersら, J. Virol. (1999) 73, 5001-5009)についてのプラスミドベー
スのレスキュー系が開発されている。
【０００３】 BridgenおよびElliott(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 14, 15400-15404
)は、アンチゲノムRNAおよびウイルスタンパク質をバクテリオファージT7プロモ
ーターの制御下で発現させることにより、cDNAからゲノムvRNA分節を３つしかも
たないブンヤウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキュー(helper virus-free
rescue)を報告している。しかしながら、インフルエンザウイルスのようなvRNA
分節数のより多い分節化(−)鎖RNAウイルスを、ヘルパーウイルスの助けをかり
ずに、レスキューするために、完全にプラスミドに基づいたストラテジーを成功
裏に使用できるか否かは、これまでのところ不明である。
【０００４】 インフルエンザは世界中でヒトの健康を絶えず脅かす存在であり、したがって
、ゲノムvRNA分節のいずれかに突然変異のあることが知られた改変型インフルエ
ンザウイルスをすぐに作製できる方法が必要とされている。また、異種配列を発
現させるためのインフルエンザvRNA分節の遺伝子工学的操作も、例えばインフル
エンザウイルスと第２の病原体に対して有効な新ワクチンを開発する上で、非常
に関心がもたれている。Ａ、ＢおよびＣ型と呼ばれる３種類のインフルエンザウ
イルスが知られている。これまでは、主としてＡ型インフルエンザウイルスが遺
伝子操作に関して注目されてきた。野生型のＡ型インフルエンザウイルスのゲノ
ムは８分節の一本鎖(−)センスRNAから構成されており、RNA依存性RNAポリメラ
ーゼタンパク質(PB1、PB2およびPA)、核タンパク質(NP)、マトリックスタンパク
質(M1、M2)、リポタンパク質外被から突き出ている２つの表面糖タンパク質（ヘ
マグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)）、ならびに非構造タンパク質NS
1およびNS2からなる10種類のポリペプチドをコードしている。HA、NA、NPおよび
ポリメラーゼタンパク質はモノシストロン性のゲノム分節によりコードされてい
る。
【０００５】 他の分節化した(−)鎖RNAウイルスの場合と同様に、インフルエンザウイルス
の複製サイクル中に、そのウイルスゲノムはmRNAに転写されて、相補的RNA(cRNA
)に複製される。そのためには、ゲノムvRNA分節が核タンパク質およびRNA依存性
RNAポリメラーゼと会合してリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成する必要がある
(Huangら, J. Virol. (1990) 64, 5669-5673; Garcia-Sastre, Trends In Biote
chnology (1998) 16, 230-235)。初期には、インフルエンザウイルスのゲノムを
操作するために、精製したインフルエンザウイルスから単離されたポリメラーゼ
タンパク質PB1 、PB2、PAおよび核タンパク質の存在下でプラスミドDNAから転写
されたRNAからin vitroでRNPを再構築していた(Enamiら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA (1990) 87, 3802-3805; EnamiおよびPalese, J. Virol. (1991) 65, 271
1-2713; MusterおよびGarcia-Sastre, Textbook of influenza (1998), ch. 9,
Nicholsonら編中のGenetic manipulation of influenza viruses)。in vitroで
再構築されたRNPを、ヘルパーインフルエンザウイルス（残りの必要なウイルス
タンパク質とRNA分節を提供する）に感染させた細胞にトランスフェクトすると
、トランスフェクタントウイルスが生じる。この技術はインフルエンザウイルス
の分子生物学および病原性の理解を深める上できわめて有用であった。しかしな
がら、ヘルパーウイルスからトランスフェクタントウイルスを分離するには、高
度に専門的な選別法が必要であるため、その使用は限られた数のウイルス株の特
定のRNA分節に制限されてしまう。
【０００６】 近年、細胞内で転写されたvRNA分節からのRNP複合体の細胞内再構築は、プラ
スミドにより発現されたNPおよびポリメラーゼタンパク質を用いても可能である
ことが判明した(Neumannら, Virology (1994) 202, 477-479; ZhangおよびAir,
Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200, 95-101; Pleschkaら, J. Virol.
(1996) 70, 4188-4192)。例えば、Pleschkaらは、プラスミドから発現させたＡ
型インフルエンザのPB1 、PB2、PAおよびNPが、トランスフェクトされたヒト293
細胞中で包膜し、転写し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(C
AT)レポーター遺伝子を含むインフルエンザウイルスvRNA様RNAを複製することを
明らかにした。このvRNA様レポーター遺伝子を、vRNAコード領域の上流にトラン
ケート型ヒトRNAポリメラーゼＩプロモーター（ヌクレオチド-250から-1）を有
するプラスミドDNA(pPOLI-CAT-RT)のトランスフェクションにより所定の宿主細
胞に導入した。転写されたvRNAの正しい3'末端を得るためのRNAプロセッシング
を確実にする目的で、デルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイム配列をvRNAコード
領域の下流に位置づけた。さらに、同じ研究グループによって、CATレポーター
遺伝子をコードするプラスミドを、真正Ａ型インフルエンザvRNA分節をコードす
るプラスミドで置き換えることによって、細胞内で再構築されたRNP複合体は、
トランスフェクト細胞にインフルエンザヘルパーウイルスを感染させると、トラ
ンスフェクタントウイルスへとレスキューされることが報告された。このような
ヘルパーウイルスに基づくレスキュー系は、Pleschkaらによって、細胞内転写さ
れた突然変異Ａ型インフルエンザNA vRNA分節を用いて研究された。しかし、イ
ンフルエンザウイルスのための完全にプラスミドをベースとしたレスキュー系へ
の動きは、必要とされる全配列の十分な発現および完全なウイルスを組み立てる
ためのこれら配列の正しい協力を得ることに関して、新たな問題点を提起した。
【０００７】 BridgenおよびElliottは、アンチゲノムRNAではなくゲノムvRNAセグメントの
発現を指令するプラスミドを用いて、Bunyamweraブンヤウイルスをレスキューす
ることに失敗した。しかし、今回、細胞培養物でのＡ型インフルエンザウイルス
のヘルパーウイルスフリーレスキューが、８分節のvRNAと、RNP複合体の形成に
必要な核タンパク質および３種のRNAポリメラーゼタンパク質と、を共発現する
ことができる12のプラスミドの培養細胞への共トランスフェクションにより実現
可能であることが見いだされた。この同じストラテジーを、多数のゲノムRNA分
節（例えば、６分節以上）をもつ他の種々の分節化(−)鎖RNAウイルス、例えば
、他の型のインフルエンザウイルス、６分節のvRNAを含むトゴトウイルス(thogo
tovirus)などのオルソミクソウイルス科の他のメンバーに応用することができる
。野生型のＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスはともに８分節のvRNAをもつ
が、追加のvRNA分節をもつ改変型のＡ型インフルエンザウイルスが記載されてお
り(Enamiら, Virology (1993) 185, 765-90)、Ｃ型インフルエンザウイルスは１
分節少ないvRNAをもつ。
【０００８】発明の概要 本発明は、したがって、培養細胞において、３分節より多いゲノムvRNA分節を
もつ分節化(−)鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を提供し、
前記方法は、 (i) 第１の集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖
を支持する能力があり、かつ、ゲノムRNA分節をもたらすヘルパーウイルスの不
在下で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA分節を提供するゲノムvRNA分節または対
応するcRNAを直接発現することができる第１のセットの発現ベクターを導入した
ものであり、 さらに、該細胞は核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼをもたらす能
力があり、それにより、該ウイルスのゲノムvRNA分節を含むRNP複合体を形成し
て、該細胞内で該ウイルス粒子を組み立てることができること、 (ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、 を含んでなる。
【０００９】 選ばれた宿主細胞は、例えば、さらに該細胞内で１種以上の必要なウイルスタ
ンパク質の発現を指令することができる１以上の別の発現ベクターを導入してい
てもよい。例えば、第２のセットの発現ベクターは宿主細胞において核タンパク
質とRNA依存性ポリメラーゼサブユニットの全てを発現させるために使用しうる
。有利には、これらタンパク質のそれぞれのための個別の発現ベクターを用いる
。あるいはまた、選ばれた宿主細胞は、例えば、必要な核タンパク質とRNA依存
性ポリメラーゼサブユニットの１種以上を発現するように遺伝子操作されてもよ
い。vRNAの包膜（キャプシド化）、転写および複製に不可欠な全タンパク質が出
発宿主細胞によって提供される場合は、第１のセットの発現ベクターのみが必要
となることが理解されよう。さらに、選ばれた出発宿主細胞は、所望のウイルス
のゲノムvRNA分節の１以上を発現するように遺伝子操作された細胞であってもよ
い。本発明の方法を用いることにより、分節化(−)鎖RNAウイルスのレスキュー
を、いかなるウイルスの助けもかりずに、例えば完全にプラスミドに基づいた方
法で、達成できることが理解されるだろう。
【００１０】 さらなる態様において、本発明は、培養細胞において、分節化(−)鎖RNAウイ
ルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を提供し、前記方法は、 (i) 第１の集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖
を支持する能力があり、かつ、(a) ヘルパーウイルスの不在下で該ウイルスのゲ
ノムvRNAと、(b) 核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと、をもたらす
能力があり、それにより、該ゲノムvRNAを含むRNP複合体を形成して、該ウイル
ス粒子を組み立てることができるように改変されており、 該ゲノムvRNAは該細胞内でヒトPolIプロモーターまたはその機能性誘導体の制
御下に直接発現されること、 (ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、 を含んでなる。
【００１１】 上記のようにウイルスレスキュー用に改変された宿主細胞は本発明の別の態様
を構成することが理解されるだろう。第１の集団の細胞により産生されたウイル
ス粒子は、例えば、第１の集団の細胞と同一のまたは異なる培養細胞を用いて、
１回以上のさらなる細胞感染ステップで増幅することができる。使用のために、
このようにして産生されたウイルス粒子を単離することができる。
【００１２】 宿主細胞により最初に産生されたウイルス粒子が弱毒化されていない場合は、
例えばワクチン用に製剤化する前に、通常の弱毒化またはウイルス不活化ステッ
プを行なうことができる。本発明により作製されるウイルス粒子は、異種配列を
発現することができる組換えウイルス粒子であってもよい。また、そのような粒
子は、必要ならば適宜に弱毒化または不活化した後で、ワクチン用にまたは他の
治療目的のために製剤化することができる。
【００１３】 初期のヘルパーウイルスに基づいたインフルエンザウイルスレスキュー法とは
対照的に、本発明の方法は、いくつかの異なる遺伝子に同時に複数の突然変異を
含むＡ、ＢおよびＣ型のいずれの感染性インフルエンザウイルスの作製にも容易
に適用することができる。かかる方法はまた、２種以上の親ウイルスに由来する
vRNA分節を含む再構築分節化(−)鎖ウイルスの、より簡便で、より直接的な生産
を可能とする。通常、再構築ウイルスは混合ウイルス感染の細胞からウイルス粒
子をスクリーニングすることにより得られる。本発明の方法は、古典的な方法で
単離するのが難しい再構築分節化(−)鎖ウイルスの生産に特に有利である。
【００１４】図面の説明 図１は、実施例１〜３に記載した本発明の実施形態の概略図であり、Ａ型イン
フルエンザウイルスのvRNA分節の直接発現、およびＡ型インフルエンザ核タンパ
ク質とRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットの発現のための12のプラスミドが
培養ベロ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）に共トランスフェクトされる。この
実施形態では、レスキューされたウイルス粒子のプラークアッセイおよび増幅の
ために、MDBK（Madin-Darbyウシ腎臓）細胞が用いられる。しかし、ベロ細胞やM
DCK（Madin-Darbyイヌ腎臓）細胞を含めて、Ａ型インフルエンザウイルスの増殖
を支持する他の細胞も同様にプラークアッセイおよび増幅に使用できることが理
解されよう。図１において、POL I＝トランケートされたヒトRNAポリメラーゼＩ
プロモーター、R＝ゲノム肝炎ウイルスリボザイム、MLP＝ヒトアデノウイルス２
型のスプライスされた三分節リーダー配列を含む合成配列に連結されたアデノウ
イルス２型主要後期プロモーター、およびpA＝SV40由来のポリアデニル化配列。
【００１５】詳細な説明 発現ベクターを用いて、所望のウイルスのゲノムvRNA分節を直接発現させるこ
とが好適である。これらは完全に野生型のvRNA分節であってもよいし、また、少
なくとも１つの非野生型vRNA分節、例えば１以上のヌクレオチド置換、挿入また
は欠失をもつ変異型vRNA分節を含んでいてもよい。
【００１６】 例えば、宿主細胞において提供される少なくとも１つのvRNA分節は、レスキュ
ーされたウイルスに感染している標的細胞内で、ウイルスゲノムに対して異種の
配列を発現しうるキメラvRNA分節であってよい。そのような異種配列はペプチド
またはポリペプチドをコードしうる。あるいは、それはリボザイムやアンチセン
ス核酸のような核酸をコードしてもよい。異種配列は、実施例８に記載したキメ
ラvRNA分節により例示されるように、完全な天然ウイルスタンパク質をさらにコ
ードするvRNA分節上に提供されるか、またはウイルスタンパク質のコード配列に
挿入される。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのHAタンパク質は、抗原部位
Ｂにおいてエピトープグラフト化(epitope-grafting)を許容できることが知られ
ている。そのようなキメラvRNA分節を構築する方法については、例えば、Muster
およびGarcia-Sastre, Ch.9, Textbook of Influenza (1998)およびPaleseら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 11354-11358を参照されたい。また、キ
メラインフルエンザウイルスvRNA分節を構築するためのストラテジーは、公開さ
れた国際特許出願WO 91/03552にすでに記載されている。
【００１７】 宿主細胞において提供されるvRNA分節は、追加的にまたは代わりに、１以上の
弱毒化性突然変異を組み込んでいてもよい。例えば、vRNA分節は、パン-ハンド
ル二重鎖プロモーター領域に弱毒化性の塩基対置換、特に、例えばNA特異的vRNA
の二重鎖領域の位置11-12'におけるCからAへのおよびGからUへの既知の弱毒化性
塩基対置換、をもつＡ型インフルエンザウイルスのvRNA分節であり得る(Fodorら
, J. Virol. (1998) 6283-6290)。本発明のレスキュー系を用いることによって
、新たな弱毒化性の突然変異を同定することができる。しかし、上述したように
、本発明の方法によって最初に弱毒化されていないウイルス粒子が産生されたな
らば、例えば古典的な方法で、その後ウイルス粒子の弱毒化または不活化を行な
うことができる。
【００１８】 本発明に従って産生された弱毒化または不活化ウイルスは、続いて、慣用方法
でワクチン組成物中に組み入れることができる。そのようなウイルスが外来抗原
をコードする上記のようなキメラvRNA分節をもつ場合は、２種以上の病原体に対
して同時にワクチン接種するために該ウイルスが製剤化される。本発明により産
生されたキメラvRNA分節を保有する弱毒化組換えウイルスは、その他の治療用途
、例えば抗腫瘍薬または遺伝子治療用ツールとしても設計することができ、その
場合には、ウイルスの生産後に、該ウイルスを製薬上許容される担体または希釈
剤と共に適切な医薬組成物中に組み入れる。
【００１９】 上でも示したように、本発明によるヘルパーウイルスフリーレスキューは、再
構築ウイルス、特にワクチン用に所望される再構築インフルエンザウイルスの作
製に有利である。例えば、本発明によるウイルスレスキューを用いて、インフル
エンザウイルス（例えば、ヒトへの投与に適すると認められているインフルエン
ザA/PR8/34）のHAおよびNA vRNA分節を、インフルエンザ感染症の流行に関係し
たインフルエンザ株のHAおよびNA vRNA分節と簡単に置換することができる。そ
のような再構築インフルエンザウイルスは、例えば、慣用方法で不活化インフル
エンザワクチンの製造に使用することができる（実施例４および６参照）。
【００２０】 用いる発現ベクターは、好ましくは、選ばれた宿主細胞内で複製する能力があ
るプラスミドである。必要とされるそれぞれのvRNA分節または対応するcRNAを直
接発現させるために別個の発現ベクターを提供してもよい。すでに上述したよう
に、核タンパク質および個々のRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニット（例えば
、インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼのPB1、PB2およびPAサブ
ユニット）のそれぞれに対して第２のセットの発現ベクターを提供してもよい。
しかし、上でも示したように、これらのタンパク質の１種以上を発現することが
できる細胞系を使用してもよく、その場合には第２のセットの発現ベクターを減
らしたり、排除さえしてもよい。実施例７には、核タンパク質を安定的に発現し
ている細胞系を用いた、そのようなＡ型インフルエンザウイルスのヘルパーウイ
ルスフリーレスキュー法が示される。
【００２１】 必要とされる全ての発現ベクターは、好ましくは、１回の共トランスフェクシ
ョンまたは共形質導入ステップで所定の宿主細胞に導入される。そのためには、
リポソームトランスフェクションを利用することが好ましく、例えば、DOTAPリ
ポソームトランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim) またはLipofectAMIN
E 2000(Gibco BRL)を用いる。しかしながら、２回以上のベクター導入ステップ
を行なってもよく、哺乳動物細胞にベクターを導入するための他の公知方法、例
えばエレクトロポレーション、DEAE−デキストラントランスフェクション、微粒
子ボンバードメント、およびウイルス形質導入（例えば、複製欠損レトロウイル
スの使用）を利用できることが理解されるだろう。また、リン酸カルシウム沈降
も特に好ましいものである（実施例５参照）。例えば、NPおよびポリメラーゼタ
ンパク質発現用の発現ベクターを宿主細胞に導入し、その後vRNA分節発現用の発
現ベクターを導入するように選択しうる。必要なベクターが導入される宿主細胞
は培養皿上にあってもよいし、ベクタートランスフェクションまたは形質導入の
ための他の適当な方法で培養してもよい。
【００２２】 vRNA分節または対応するcRNAの発現は、好ましくは、哺乳動物RNA PolIプロモ
ーターに由来するプロモーター配列の制御下におかれる。この目的に特に好適な
ものは、対応する天然プロモーターのヌクレオチド-250から-1までのトランケー
トされたヒトRNA PolIプロモーターまたはその機能性誘導体である(Jonesら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 669-673)。しかし、これとは別に、T7 R
NAポリメラーゼプロモーターをはじめとする他のプロモーターを使用してもよい
。発現されたそれぞれのvRNAまたはcRNAの正しい3'末端を確実にするために、各
vRNAまたはcRNA発現ベクターは、RNAコード配列の下流に、リボザイム配列また
は適切なターミネーター配列を含むだろう。これは、例えば、デルタ肝炎ウイル
スのゲノムリボザイム配列またはその機能性誘導体でありうる。あるいはまた、
例えば、PolIターミネーターを使用してもよい(Neumannら, Virology (1994) 20
2, 477-479)。RNA発現ベクターは、Pleschkaら, J. Virol. (1996) 70, 4188-41
92に記載されるvRNA発現ベクターと同様の方法で作製することができる。
【００２３】 １以上のタンパク質発現ベクターがRNP複合体の形成のためにウイルスタンパ
ク質を発現する必要がある場合は、それらは所望のウイルスに対して相同なウイ
ルスタンパク質を発現することが好ましい。核タンパク質とRNA依存性ポリメラ
ーゼサブユニットの発現は、好ましくは、例えば、Bergら, BioTechniques, 14,
972-978に記載されるような、ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分
節リーダー配列に連結されたアデノウイルス２主要後期プロモーターを含む調節
配列、または該調節配列の機能性誘導体の制御下におかれる。しかしながら、哺
乳動物細胞内で機能しうる代替プロモーター配列、例えばヒトサイトメガロウイ
ルス(CMV)即時型プロモーターまたはT7ポリメラーゼプロモーターなどの他のウ
イルスプロモーターで置換することもできよう。NPおよびポリメラーゼサブユニ
ット発現用の適切なプラスミドは、例えば、Bergらの上記論文に記載されるプラ
スミドpGT-hから出発して、作製することができる。
【００２４】 以下で、Ａ型インフルエンザウイルスのレスキューについて詳述することによ
り、本発明をさらに説明することにする。必要とされるvRNAを直接発現するプラ
スミドを利用した本発明のストラテジーによるＡ型インフルエンザウイルスのレ
スキューのためには、例えばベロ（アフリカミドリザル腎臓由来）細胞を用いる
ことが有利であると分かったが、インフルエンザウイルスの増殖を支持する他の
細胞、例えば好ましくは293Tヒト胚性腎細胞を使用することもできる。そのよう
な細胞は適当な培養皿の表面上でトランスフェクトされることが好ましい。
【００２５】 ベロ細胞はインターフェロン発現に欠陥のあることが知られており(Diazら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85, 5259-5263)、このことは良好なウイル
スレスキューを得るための一要因でありうる。それゆえに、本発明の実施におい
ては、ベロ細胞およびインターフェロン活性または応答に欠陥のある他の細胞が
有用であると推測され、これらの細胞は分節化した(−)鎖RNAウイルスの増殖を
支持するだろう。
【００２６】 本発明の方法を実施するためのベクターの適切な量および比率は、ルーチンな
実験操作により決定することができる。一つの指針としては、宿主細胞へのプラ
スミドのリポソームトランスフェクションまたはカルシウム沈降の場合、各プラ
スミドを数μg、例えば１〜10μgで使用して、慣用の方法でトランスフェクショ
ン試薬と混合する前に約0.1μg/mlの最終合計DNA濃度にまで希釈することが考え
られる。NPおよび／またはRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットを発現するベ
クターは、vRNA分節を発現するベクターよりも高濃度で使用することが好ましい
かもしれない。
【００２７】 さらなる態様において、本発明はさらに、培養細胞において、分節化した(−)
鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法を提供し、前記方法は、 (i) １つの集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖
を支持する能力があり、かつ、(a) ヘルパーウイルスの不在下で該ウイルスのゲ
ノムvRNAと、(b) 核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと、をもたらす
能力があり、それにより、該ゲノムvRNAを含むRNP複合体を形成して、該ウイル
ス粒子を組み立てることができるように改変されており、 該ゲノムvRNAは該細胞内で哺乳動物PolIプロモーターまたはその機能性誘導体
（例えば、上記のトランケートされたヒトPolIプロモーター）の制御下に直接発
現されること、 (ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、 を含んでなる。
【００２８】 そのようなウイルス産生細胞は、例えば好ましくは、ベロ細胞または分節化し
た(−)鎖RNAウイルスの増殖を支持するインターフェロン活性または応答に欠陥
のある他の細胞でありうる。前記ゲノムvRNA、核タンパク質およびRNA依存性RNA
ポリメラーゼのコード配列の全部または一部は、選ばれた宿主細胞に発現ベクタ
ーを導入することで、該細胞内に提供され得る。
【００２９】 以下の実施例は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレス
キューに関して本発明を例示するものである。しかし、上述したとおり、本発明
はそのようなウイルスに限定されるものではなく、他の分節化(−)鎖RNAウイル
ス、例えば他の型のインフルエンザウイルスにも応用することができる。
【００３０】実施例 実施例１ Ａ型インフルエンザウイルスのvRNA分節をコードするプラスミドの作製 インフルエンザA/WSN/33の異なるvRNA分節をそれぞれ発現する８種のプラスミ
ド(pPOL1-PB2-RT、pPOL1-PB1-RT、pPOL1-PA-RT、pPOL1-HA-RT、pPOL1-NP-RT、pP
OL1-NA-RT、pPOL1-M-RT、およびpPOL1-NS-RT)を用いた。これらは、Pleschkaら(
1996) J. Virol. 70, 4183-4192に記載される、vRNA分節をコードするモデルプ
ラスミドpPOL1-CAT-RTと構造上類似するpUC19またはpUC18系のプラスミドである
が、ただし、vRNA CATレポーター遺伝子分節をコードするcDNA（インフルエンザ
A/WSN/33のNSコード化vRNA分節の非コード領域により挟まれた負の極性のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのオープンリーディングフレーム）
が、インフルエンザA/WSN/33の天然vRNA分節をコードするcDNAで置換されている
。前記プラスミドのそれぞれにおいては、トランケートされたヒトRNA PolIプロ
モーター(位置-250から-1)をvRNA分節コード化cDNAの末端に融合させて、転写さ
れるvRNAの正しい5'末端を確実なものにした。また、vRNA分節コード化プラスミ
ドのそれぞれにデルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイム配列を含めて、転写され
るvRNAの正しい3'末端を確実なものにした。 上記プラスミドのcDNA挿入断片を調製するためのインフルエンザA/WSN/33のサ
ンプルは、例えばW.H.O. Collaborating Centre, Division of Virology, Natio
nal Institute for Medical Research (London, U.K.)から入手可能である。
【００３１】実施例２ インフルエンザA/WSN/33のPB1、PB2、PAおよびNPタンパク質の発現用プラスミド の作製 さらに、４種の発現プラスミド(pGT-h-PB1、pGT-h-PB2、pGT-h-PA、およびpGT
-h-NP)を作製した。各プラスミドは、必要とされるPB1、PB2、PAおよびNPタンパ
ク質から選ばれた異なるタンパク質を、ヒトアデノウイルス２型のスプライスさ
れた三分節リーダー配列を含む合成配列に連結されたアデノウイルス２主要後期
プロモーターの制御下で発現することができる。このプロモーターは無血清懸濁
培養に適応させた細胞においてタンパク質の高レベル発現をもたらすことが以前
に報告されている(Bergら(1993) BioTechniques, 14, 972-978)。pGT-hセットの
タンパク質発現プラスミドは、pGT-hプラスミドのBc1Iクローニング部位にPB1、
PB2、PAおよびNPタンパク質のオープンリーディングフレームを挿入することに
より構築した(Bergら(1993) 前掲)。
【００３２】 ウイルス核タンパク質と３種類のウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼのタンパ
ク質サブユニットをコードする発現プラスミドを、発現プラスミドpPOL1-CAT-RT
をもつヒト293細胞またはベロ細胞に共トランスフェクトした。トランスフェク
トされたヒト293細胞とベロ細胞の両方において、CAT活性が検出された。以下で
詳述するトランスフェクトされたvRNA分節からのインフルエンザA/WSN/33のヘル
パーウイルスフリー作製のためにはベロ細胞が選ばれたが、その理由は、ベロ細
胞がヒト293細胞よりも良好なインフルエンザA/WSN/33の増殖を支持するからで
ある（最大ウイルス力価において約１logの差）。
【００３３】実施例３ インフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリーレスキュー ウイルスレスキューのため、直径8.5cmの培養皿上のほぼ集密的なベロ細胞（
培養皿の約90%を覆う約107個の細胞）を、上記の４種のタンパク質発現プラスミ
ドと８種のvRNA転写プラスミドにより共トランスフェクトした。この共トランス
フェクションステップでは、５μgずつのポリメラーゼタンパク質発現プラスミ
ド、10μgのNP発現プラスミド、および３μgずつの８種のvRNAコード化プラスミ
ドを、20mM Hepesバッファー(pH7.5)により0.1μg/μlの濃度に希釈した。このD
NA溶液を、240μlのDOTAPおよび720μlの20mM Hepesバッファー(pH7.5)を含む希
釈DOTAPリポソームトランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim)に添加した
。トランスフェクション混合物を室温で15分インキュベートし、その後0.5%ウシ
胎児血清(FCS)、0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)、ペニシリンおよびストレプトマ
イシンを含む6.5mlの最少必須培地(MEM)と混合した。この混合物をPBSで洗浄し
たベロ細胞に加えた。24時間後、トランスフェクション培地を細胞から取り出し
、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む８mlの新鮮
な培地(MEM)と取り替えた。トランスフェクトされたベロ細胞はトランスフェク
ション後少なくとも４日間培養した。毎日、トランスフェクト細胞からの培地を
回収し、慣用方法によりMDBK細胞上で0.5mlアリコートを培養してプラークを形
成させることにより、インフルエンザウイルスの存在をアッセイした。培地の残
りは、レスキューされたウイルスの増幅のために亜集密的MDBK細胞の75cm2フラ
スコ中に移した。もとのトランスフェクト細胞は８mlの新鮮な培地を加えた後で
さらにインキュベートした。
【００３４】 この手順により、トランスフェクション後４日目に感染性のインフルエンザウ
イルスが回収された。約107個の細胞を含む8.5cm培養皿から約10〜20個のプラー
ク形成性ウイルス粒子が得られた。レスキューされたウイルスはインフルエンザ
A/WSN/33ウイルスに特徴的な特定の性質を示した。すなわち、それはトリプシン
の不在下においてMDBK細胞上でプラークを形成した。レスキューされたウイルス
が形成したプラークは、大きさの点で、同じMDBK細胞上で増殖させた対照の真正
A/WSN/33ウイルスサンプルによって形成されたプラークに匹敵するものであった
。
【００３５】 トランスフェクト細胞の培地から回収したウイルスにより処理したMDBK細胞上
で観察されたウイルスプラークが、クローン化cDNAに由来するものであることを
確かめるために、８種のvRNA分節cDNAのうちの２種に遺伝的タグを導入した。HA
vRNA分節の3'末端付近に６ヌクレオチドの突然変異をもつ該分節をコードするc
DNAを構築した。3'末端からのヌクレオチド31-35(3'-UUUUG-5')を3'-AAAAC-5'で
置換すると、シグナルペプチド内のHAのＮ末端付近のアミノ酸４(K→F)およびア
ミノ酸５(L→V)でアミノ酸置換が生じた。さらに、ヌクレオチド40にサイレント
なC→U突然変異を生じさせた。かかる変更により、ユニークなSpeI部位を含むい
くつかの新しい制限部位が導入された。NA分節をコードするcDNAには、新しいユ
ニークなSacI制限部位を導入するようにヌクレオチド1358および1360に２つのサ
イレント突然変異を含むNA分節をコードする突然変異を起こさせた(Pleschkaら,
J. Virol (1996) 70, 4188-4192)。
【００３６】 レスキューされたトランスフェクタントウイルスを感染させたMDBK細胞からの
培地を用いてvRNAを単離した。100μlの培地を5uのRNアーゼ不含DNアーゼで処理
して、キャリーオーバーの残留プラスミドDNAをすべて除去した。37℃で15分後
、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を使ってvRNAを単離した。遺伝的タグを含むと予想
されたHAおよびNA vRNAの短い領域をRT-PCRで増幅し、次にそれぞれSpeIおよびS
acI制限酵素で消化して分析した。対照として、真正インフルエンザA/WSN/33ウ
イルスから単離されたvRNAから、HAおよびNA分節の同一領域を同じRT-PCRプライ
マーを使って増幅した。
【００３７】 レスキューされたウイルスおよび対照ウイルスから得られたPCR産物は大きさ
が同じであった。レスキューされたウイルスのHAおよびNA分節に由来するものは
、それぞれSpeIおよびSacIで消化することができた。しかし、対照のウイルスに
対応するPCR産物は、予想どおり、同じ酵素によって消化されなかった。対照のR
T-PCR反応において逆転写酵素を省くと、肉眼で見えるPCR産物は全く得られなか
った。
【００３８】注解 上記の研究は、あらゆるヘルパーウイルスの不在下において、個々のvRNA分節
用の８種の転写プラスミドおよび必要なNP、PB1、PB2およびPAタンパク質をコー
ドする４種の発現プラスミドをベロ細胞に共トランスフェクトすることにより、
Ａ型インフルエンザウイルスをレスキューすることが可能であることを示してい
る。
【００３９】 上記の研究で強調すべき点は、(−)センスvRNA分節を発現させることによって
インフルエンザウイルスを作製できた点である。このことは、いくつかの初期の
研究と矛盾するようである。初期の研究では、ゲノムが３分節であるBunyamwera
ウイルスを含めて、(−)鎖RNAウイルスをレスキューするために(＋)鎖RNAを使用
することの重要性が強調されている(Schnellら(1994) EMBO J., 13, 4195-4203;
RobertsおよびRose (1998) Virology 247, 1-6; BridgenおよびElliot (1996)
93, 15400-15404)。しかし、比較的最近では、(−)センスvRNAからの非分節化(
−)鎖RNAウイルスの回収が成功したと報じられている(Katoら(1996) Genes Cell
s 1, 569-579; Durbinら(1997) Virology 235, 323-332)。
【００４０】 上に示した本発明のプロトコルでは、トランスフェクション後の早い段階で、
４種のタンパク質発現プラスミドからの(＋)センスmRNAが、転写プラスミドから
転写された裸の(−)センスゲノムvRNAと共存する。こうして、二本鎖RNAが形成
される。かかる二本鎖RNAをヒト細胞において形成させると、おそらく、インタ
ーフェロン媒介抗ウイルス応答が誘導され、その結果、レスキューされたウイル
スの増殖が抑制されるだろう。しかしながら、そのようなインターフェロン誘導
はベロ細胞では一つの問題として解消されている。なぜならば、ベロ細胞はイン
ターフェロン発現に欠陥があるからである。
【００４１】実施例４ A/PR/8/34インフルエンザ（ケンブリッジ変異体）のヘルパーウイルスフリーレ
スキュー 組換えDNAからA/PR/8/34を完全にレスキューするために、12のプラスミドを作
製した。これら12のプラスミドは、2,3の改変があるものの、A/WSN/33ウイルス
のレスキュー（上記の実施例１および２参照）に関して記載したものと同様であ
る。細胞性RNAポリメラーゼ１による８種のvRNA分節の合成に必要とされる８個
のプラスミドは、vRNA分節の正確な3'末端を生成するために、デルタ肝炎ウイル
スリボザイムの代わりにマウスrDNAターミネーター配列(GenBank、登録番号M120
74)をもつ。A/PR/8/34ポリメラーゼサブユニット(PB1 、PB2、PA)および核タン
パク質(NP)用の４種のタンパク質発現プラスミドは、サイトメガロウイルス(CMV
)プロモーターとウシ成長ホルモン(BGH)ポリ(A)部位を含む市販のpcDNA3(Invitr
ogen、カタログ番号V790-20)に基づくものである。
【００４２】プラスミドpPolISapITの構築 ８種のvRNA分節の容易なクローニングを可能にする目的で、新規の基本クロー
ニングベクターpPolISapITを構築した。この新しい構築物では、マウスrDNAター
ミネーター配列（位置+572から+715）がPolIプロモーターの下流に存在する。Po
lIプロモーターとターミネーター配列は、SapI制限部位を含む24bpのリンカー配
列(5'-AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3')によって分離されている。
【００４３】 プラスミドpPolISapITは、pPolI-CAT-RT（Pleschkaら, J. Virol. 70, 4188-4
192, 1996に最初に記載された）から誘導されたものである。マウスrDNAターミ
ネーター配列（位置+335から+715、GenBank登録番号M12074）を含むDNA断片を、
pPolI-CAT-RTのSalI部位に挿入してpPolI-CAT-Tを作製した。次に、逆PCR法を用
いて、CAT遺伝子、リボザイムおよびマウスrDNAターミネーター配列の一部（位
置+335から+571）をpPolI-CAT-Tから欠失させた。同時に、上記の24bpリンカー
配列をPolIプロモーターとマウスrDNAターミネーター配列の間にPCRプライマー
を介して導入した。
【００４４】vRNA発現ベクターの構築 SapIオーバーハングをもつPCRプライマーを使って、インフルエンザA/PR/8/34
ウイルス（ケンブリッジ変異体）より単離されたvRNAからcDNAを作製した。SapI
消化後、PCR産物を、SapIで消化したpPolISapITにクローニングした。
【００４５】ウイルスのレスキュー 12のプラスミドを、DOTAPトランスフェクション試薬を用いて実施例３に記載
のプロトコルに従ってベロ細胞に共トランスフェクトしたところ(Fodorら, J. V
irol. (November 1999) 73, 9679-9682も参照のこと)、トランスフェクション後
４日目に感染性のインフルエンザA/PR/8/34粒子が得られた。プラークアッセイ
およびウイルス増幅を0.5μg/mlのトリプシンの存在下にMDCK細胞上で行なった
。
【００４６】注解 これらの結果は、インフルエンザA/PR8/34ウイルスが本発明のヘルパーウイル
スフリーレスキュー法によって成功裏にレスキューされることを実証している。
このことには次の理由で特に興味がもてる。つまり、インフルエンザA/PR8/34は
ヒトには無毒性であることが知られているが(Beareら(1975)「A/PR8/34(HON1)お
よび野生H3 N2インフルエンザウイルスから作られた生存組換え体を用いたヒト
での実験」Lancet(ii) 729-732)、インフルエンザA/WSN/33は、マウスで神経向
性があることが分かっているため、ヒトへの投与には不向きであると考えられる
。したがって、インフルエンザA/PR8/34は、適切に弱毒化された形で、生ワクチ
ン開発用の親ウイルスとして適するであろう、と提案される。例えば、A/PR8/34
ウイルスのHAおよびNAゲノム分節を、インフルエンザ感染症の流行に関係したイ
ンフルエンザ株のHAおよびNAゲノム分節で置換する点を除けば、本発明のヘルパ
ーウイルスフリーレスキュー法を用いることにより、インフルエンザA/PR8/34の
vRNA用の発現ベクターから出発して弱毒化された再構築ウイルスを作製すること
ができる。再構築インフルエンザウイルスを作製するために本発明のヘルパーウ
イルスフリーレスキュー法を用いた別の例を以下の実施例６に示す。
【００４７】実施例５ インフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリーレスキューのための改良プロ トコル 実施例２に記載した４種のタンパク質発現プラスミドを、pcDNA3から誘導され
た実施例４に記載のタンパク質発現プラスミドと置き換えた。これら４種のタン
パク質発現プラスミドを実施例１(Fodorら, J. Virol. (November 1999) 73, 96
79-9682も参照のこと)に記載の８種のvRNA転写プラスミドと共に以下で説明する
３つのプロトコルにおいて使用すると、トランスフェクション後２日目に106個
の細胞から100〜10,000個のプラーク形成性ウイルス粒子が得られた。これは実
施例３で報告したトランスフェクション研究により得られたものより少なくとも
100倍多いウイルスである。
【００４８】プロトコル(a): 「LipofectAMINE 2000」トランスフェクション試薬を用いた29 3T細胞のトランスフェクション １μgずつの12のプラスミドを合わせ、OPTIMEM培地(Gibco BRL)を添加してそ
の容量を50μlに調整した。ポリスチレン製チューブの中に、12μlのLipofectAM
INE 2000(Gibco BRL、カタログ番号11668-027)と238μlのOPTIMEM培地を合わせ
て、この混合物を室温で５分インキュベートした。次に、DNA混合物を、希釈し
たLipofectAMINE 2000トランスフェクション試薬に滴下した。DNA-Lipofectamin
e混合物を室温で約20分インキュベートした後、この混合物を293T細胞懸濁液（1
0% FCSを含み抗生物質を含まないDMEM１ml中の約106個の細胞）に滴下した。ト
ランスフェクトしてから約16〜24時間後に、トランスフェクション混合物を取り
出し、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlの
DMEMと取り替えた。24〜48時間後、トランスフェクトされた293T細胞からの培地
100μlをMDBK細胞上に置いてプラークを形成させることにより、さらに、残りの
培地を25cm2の半集密的MDBKフラスコ中で継代することにより、レスキューされ
たウイルスをスクリーニングした。トランスフェクトされた293T細胞に0.5% FCS
、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのDMEMを加え、さ
らに２〜３日間インキュベーションを続けてから、MDBK細胞上でのプラーク形成
および増幅を繰り返した。
【００４９】プロトコル(b): リン酸カルシウム沈降を用いた293T細胞のトランスフェクショ ン リン酸カルシウム沈降を用いたトランスフェクションの場合は、１μgずつの1
2のプラスミドを合わせて、そのプラスミド混合物を250μlの2×HEBSバッファー
(40mM Hepes, 280mM NaCl, 10mM KCl, 2mM Na2HPO4, 10mM グルコース, pH7.05)
に加えた。その後、250μlの250mM CaCl2を添加し、チューブの内容物を激しく
混合した。室温で20〜30分後、沈降物を10% FCS、ペニシリンおよびストレプト
マイシンを含む１mlのDMEMと混合し、293T細胞懸濁液（10% FCSを含み抗生物質
を含まないDMEM１ml中の約106個の細胞）に添加した。トランスフェクトしてか
ら約16〜24時間後に、トランスフェクション混合物を取り出し、0.5% FCS、0.3%
BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのDMEMと取り替えた。24
〜48時間後、上記のプロトコル(a)と同様にしてレスキューされたウイルスをス
クリーニングした。
【００５０】プロトコル(c): DOTAPトランスフェクション試薬を用いたベロ細胞のトランス
フェクション １μgずつの12のプラスミドを合わせ、20mM Hepes(pH7.5)を添加してその容量
を120μlに調整し、約0.1μg/μlのDNA濃度を得た。次に、このDNA溶液を、ポリ
スチレン製チューブ中の60μlのDOTAPと200μlの20mM Hepes(pH7.5)を含む希釈D
OTAPトランスフェクション試薬(Boehringer)に添加した。DNA-DOTAP混合物を室
温で約15〜20分インキュベートした後、この混合物をベロ細胞懸濁液（10% FCS
、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのMEM中の約106個の細胞）に
滴下した。トランスフェクトしてから約16〜24時間後に、トランスフェクション
混合物を取り出し、0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を含む１mlのMEMと取り替えた。24〜48時間後、トランスフェクトされたベロ細
胞からの培地100μlをMDBK細胞上に置いてプラークを形成させることにより、さ
らに、残りの培地を25cm2の半集密的MDBKフラスコ中で継代することにより、レ
スキューされたウイルスをスクリーニングした。トランスフェクトされたベロ細
胞に0.5% FCS、0.3% BSA、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１mlのME
Mを加え、さらに２〜３日間インキュベーションを続けてから、MDBK細胞上での
プラーク形成および増幅を繰り返した。
【００５１】実施例６ 再構築インフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレスキュー 本発明に従うプラスミドベースのレスキューを用いて、再構築インフルエンザ
ウイルスを成功裏に作製した。以下の再構築ウイルスを作製した： (i) A/PR/8/34由来のPA分節をもつA/WSN/33 (ii) A/PR/8/34由来のNP分節をもつA/WSN/33 (iii) A/PR/8/34由来のM分節をもつA/WSN/33 (iv) A/FPV/Dobson/34由来のPB2分節をもつA/WSN/33 これらの実施例は、再構築ウイルスを単離するためのヘルパーウイルスフリー
法の有用性を実証するものである。A/PR8/34（または他の適当な株）に基づいた
再構築ウイルスは通常の不活化ワクチンの製造にとって必要なものである。とい
うのは、それらが孵化鶏卵（不活化インフルエンザワクチンの商業生産に使用さ
れる）中で高力価へと増殖するからである。したがって、先に示したように、本
発明によるヘルパーウイルスフリーウイルスレスキューの重要な用途は、２種類
の生存ウイルスによる細胞の混合感染から再構築ウイルスを単離する古典的方法
による場合よりも、再構築ウイルスをより簡単に、より直接的に単離することで
あることが分かる。重要なことは、本発明の方法を使用すると、必要とされる１
個のウイルスを単離する前に多くの可能性のある再構築ウイルスをスクリーニン
グする必要がない、ということである。
【００５２】実施例７ EcR-293細胞上でのインフルエンザA/WSN/33のヘルパーウイルスフリーレスキュ
ー 11のプラスミドをトランスフェクトすることによって、インフルエンザNPを安
定的に発現する細胞系であるEcR-293NP細胞上でインフルエンザA/WSN/33のレス
キューを行なった。
【００５３】 EcR-293NP細胞は、エクジソン受容体のRXRサブユニットおよびVgEcRを構成的
に発現する市販の細胞系EcR-293(Invitrogen、カタログ番号R650-07)から誘導さ
れた。かかる細胞でのインフルエンザNP発現はポナステロンＡに応答して誘導可
能である。LipofectAMINE 2000トランスフェクション試薬を用いる実施例５(a)
に記載したものと同じプロトコルを用いたが、vRNA分節の初期包膜用のNPタンパ
ク質はEcR-293NP細胞により提供されるので、pcDNA-NPを省いた。
【００５４】実施例８ 外来抗原を発現する組換えインフルエンザウイルスのヘルパーウイルスフリーレ スキュー インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA vRNA分節に基づくキメラvRNA分節を発
現することができるプラスミドpPOL1-E6N18-2A-NAを作製した。改変されたvRNA
コード配列を、実施例１に記載したPolI発現プラスミドの作製の場合と同様に、
トランケートされたヒトPol1プロモーターおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイム
に対応する配列間に挿入した。得られたキメラ遺伝子は、ヒトパピローマウイル
ス18(HPV 18)のE6タンパク質の最初の88アミノ酸と、これに続く口蹄疫ウイルス
(FMDV)の2Aプロテアーゼの自己開裂モチーフに対応する17アミノ酸と、これに続
くインフルエンザA/WSN/33のNAのアミノ酸配列をコードする長いオープンリーデ
ィングフレーム(ORF)を含んでいた。このコード領域の両末端にはA/WSN/33ウイ
ルスのNA遺伝子の非コード領域が隣接していた。このようにして、自己開裂を受
けるポリタンパク質をコードするキメラインフルエンザウイルス遺伝子が作製さ
れ、結果的にHPV由来ポリペプチドとNAタンパク質の生成が得られる。古典的なR
NP-トランスフェクションにより、作製したインフルエンザウイルスベクターか
ら外来抗原を発現させるための同様のストラテジーが以前に記載されている(T.
MusterおよびA. Garcia-Sastre,「インフルエンザウイルスの遺伝子操作」Textb
ook of Influenza, K.G. Nicholson, R.G. Webster & A.J. Hay編, pp.93-106 (
1998), Blackwell Science Ltd, Oxford, UK)。
【００５５】 HPV18由来抗原を発現する組換えインフルエンザウイルスベクターは、pPOL1-E
6N18-2A-NAを、実施例１に記載されるような野生型ウイルスRNA（すなわち、PB2
、PB1、PA、HA、NP、MおよびNS）をコードする７種のPol1発現ベクターおよび実
施例５に記載されるようなPB2、PB1、PAおよびNPタンパク質をコードする４種の
PolII発現ベクターと共に293T細胞に共トランスフェクトすることにより作製し
た。レスキューされたウイルスは、そのNA特異的ウイルスRNAの配列解析により
確認して、正しいヌクレオチド配列をもっていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１〜３に記載した本発明の実施形態の概略図であり、Ａ型インフルエン
ザウイルスのvRNA分節の直接発現およびＡ型インフルエンザ核タンパク質とRNA
依存性RNAポリメラーゼサブユニットの発現のための12のプラスミドが培養ベロ
細胞（アフリカミドリザル腎細胞）に共トランスフェクトされる。図中、POL I
＝トランケートされたヒトRNAポリメラーゼＩプロモーター、R＝ゲノム肝炎ウイ
ルスリボザイム、MLP＝ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リー
ダー配列を含む合成配列に連結されたアデノウイルス２型主要後期プロモーター
、およびpA＝SV40由来のポリアデニル化配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 7/04 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93 7/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フォダー，エルビン イギリス国 オーエックス１ ３アールイ ー オックスフォード，サー ウイリアム ダン スクール オブ パソロジー，ユ ニバーシティ オブ オックスフォード (72)発明者 パレス，ペーター アメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州 ニューヨーク，ワン ガステイブ エ ル．レヴィー プレイス，マウント シナ イ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー，デプ ト．オブ マイクロバイオロジー (72)発明者 ガルシア−サストレ，アドルフォ アメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州 ニューヨーク，ワン ガステイブ エ ル．レヴィー プレイス，マウント シナ イ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー，デプ ト．オブ マイクロバイオロジー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA03 4B065 AA90 AA95 AB01 BA02 BD13 CA45 4C085 AA03 BA51 BA55 DD01 DD21 DD62 DD63 EE01

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 培養細胞において、３分節より多いゲノムvRNA分節をもつ分
    節化(−)鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を作製する方法であって、 (i) 第１の集団の培養細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの
    増殖を支持する能力があり、かつ、ゲノムRNA分節をもたらすヘルパーウイルス
    の不在下で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA分節を提供するゲノムvRNA分節また
    は対応するcRNAを直接発現することができる第１のセットの発現ベクターを導入
    したものであり、 さらに、該細胞は核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼをもたらす能
    力があり、それにより、該ウイルスのゲノムvRNA分節を含むRNP複合体を形成し
    て、該細胞内で該ウイルス粒子を組み立てることができること、 (ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、 を含んでなる上記方法。
  2. 【請求項２】 前記細胞において、前記核タンパク質およびRNA依存性RNAポ
    リメラーゼサブユニットから選択される１種以上のタンパク質を発現させるため
    に、１以上の別の発現ベクターを用いる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 １種以上の前記核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラー
    ゼサブユニットを発現することができる細胞系を用いる、請求項１または２に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ウイルスがＡ、ＢまたはＣ型のインフルエンザウイルス
    である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ウイルスが２種以上の親ウイルスに由来するvRNA分節を
    もつ再構築ウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記細胞がベロ細胞、およびインターフェロン活性または応
    答に欠陥があり前記ウイルスの増殖を支持する能力がある他の細胞から選択され
    る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 第１のセットの発現ベクターが前記ウイルスのゲノムvRNA分
    節を直接発現することができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 第１の集団の細胞と同一のまたは異なる細胞を用いる１回以
    上の追加の細胞感染ステップにより、第１の集団の細胞により産生されたウイル
    ス粒子を増幅することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 感染性ウイルス粒子を単離することをさらに含む、請求項１
    〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ウイルスの弱毒化または不活化ステップをさらに含む、請
    求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 必要とされる全ての発現ベクターを、リポソームトランス
    フェクション試薬の存在下でまたはリン酸カルシウム沈降によって、前記細胞中
    に共トランスフェクトする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記発現ベクターがすべてプラスミドである、請求項１〜
    １１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 第１のセットの発現ベクターが、前記ウイルスの各vRNA分
    節または対応するcRNAを発現させるための別個の発現ベクターから構成される、
    請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 【請求項１３】 各vRNA分節またはcRNAの発現が哺乳動物PolIプロモーター
    から誘導されたプロモーター配列の制御下にある、請求項１〜１２のいずれか１
    項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プロモーター配列が、対応する天然プロモーターのヌ
    クレオチド-250から-1までからなるトランケートされたヒトPolIプロモーター配
    列またはその機能性誘導体である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 第１のセットの発現ベクター中の各vRNA分節またはcRNAの
    コード配列の後にリボザイム配列または転写ターミネーターが続き、前記各RNA
    の正しい3'末端を確実にする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記別の発現ベクターからの１種以上のウイルスタンパク
    質の発現が、ヒトアデノウイルス２型のスプライスされた三分節リーダー配列に
    連結されたアデノウイルス２主要後期プロモーターもしくはヒトサイトメガロウ
    イルスの即時型プロモーターから選択される調節配列、または該調節配列の機能
    性誘導体の制御下にある、請求項２に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ワクチン組成物中に弱毒化または不活化ウイルスを組み入
    れることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ウイルスが、該ウイルスに感染した標的細胞中で該ウ
    イルスに対して異種の配列の発現を指令することができる少なくとも１つのvRNA
    分節を含み、そして、前記方法が、該ウイルスを、適宜に弱毒化または不活化し
    た後で、製薬上許容される担体または希釈剤と共に医薬組成物中に組み入れるこ
    とをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ウイルスに対して異種の配列が抗原ペプチドまたは抗
    原ポリペプチドをコードし、そして、前記方法が該ウイルスをワクチン組成物中
    に組み入れることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１または６において規定された、前記ウイルス粒子
    を産生するように改変された細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の細胞を培養することを含む、分節化(
    −)鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子の産生方法。
  22. 【請求項２２】 培養細胞において、分節化(−)鎖ウイルスの感染性ウイル
    ス粒子を作製する方法であって、 (i) 第１の集団の細胞を用意すること、ここで、該細胞は、該ウイルスの増殖
    を支持する能力があり、かつ、(a) ヘルパーウイルスの不在下で該ウイルスのゲ
    ノムvRNAと、(b) 核タンパク質およびRNA依存性RNAポリメラーゼと、をもたらす
    能力があり、それにより、該ゲノムvRNAを含むRNP複合体を形成して、該ウイル
    ス粒子を組み立てることができるように改変されており、 該ゲノムvRNAは該細胞内で哺乳動物PolIプロモーターまたはその機能性誘導体
    の制御下に直接発現されること、 (ii) 該細胞を培養することにより、該ウイルス粒子を産生させること、 を含んでなる上記方法。
  23. 【請求項２３】 第１の集団の細胞と同一のまたは異なる細胞を用いる１回
    以上の追加の細胞感染ステップにより、第１の集団の細胞により産生されたウイ
    ルス粒子を増幅することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 感染性ウイルス粒子を単離することをさらに含む、請求項
    ２２または２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ウイルスの弱毒化または不活化ステップをさらに含む、請
    求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ワクチン組成物中に弱毒化ウイルス粒子または不活化ウイ
    ルス粒子を組み入れることをさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記
    載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記ウイルスが、該ウイルスに感染した標的細胞中で該ウ
    イルスに対して異種の配列の発現を指令することができる少なくとも１つのvRNA
    分節を含み、そして、前記方法が、該ウイルスを、適宜に弱毒化または不活化し
    た後で、製薬上許容される担体または希釈剤と共に医薬組成物中に組み入れるこ
    とをさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 第１の集団の細胞がベロ細胞、またはインターフェロン活
    性もしくは応答に欠陥があり前記ウイルスの増殖を支持する能力がある他の細胞
    である、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２２または２８において規定された細胞。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の細胞を培養することを含む、分節化(
    −)鎖ウイルスの感染性ウイルス粒子の産生方法。
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