DE102004013335A1 - Impfstoff gegen Influenza basierend auf Geflügelpestviren - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von klassischen Geflügelpestviren des Stammes A/FPV/Ro/34 (H7N1) mittels eines Systems der reversen Genetik sowie die Herstellung von Mutanten dieses Virusstammes, deren Genom weitestgehend mit dem Wildtyp-Stamm übereinstimmt. Diese Mutanten sind immunogen, allerdings - im Gegensatz zum FPV-Wildtypstamm - nicht pathogen. Weiterhin ermöglicht dieses System auch die Einbringung der Oberflächenantigene anderer hochpathogener aviärer Viren in das FPV-Genom. Die so erzeugten rekombinanten FPV werden als Ausgangsviren zur Erzeugung eines inaktivierten Impfstoffes gegen das Influenzavirus verwendet.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die gentechnologische Herstellung von klassischen Geflügelpestviren mittels reverser Genetik sowie die gentechnologische Herstellung von immunogenen, aber nicht pathogen Mutanten dieser Viren, deren Genom weitestgehend mit dem Wildtyp-Stamm der klassischen Geflügelpestviren übereinstimmt. Diese Virus-Mutanten werden zur Herstellung eines inaktivierten Impfstoffes gegen das Influenzavirus verwendet.
- Die Geflügelpestviren gehören dem Genus der Influenza-A-Viren innerhalb der Familie der Orthomyxoviren an. Alle Mitglieder dieser Familie besitzen ein segmentiertes Genom aus Negativ-Strang-RNA, welches bei Influenza-A-Viren 8 Segmente umfasst (zur Übersicht siehe: Lamb und Krug, 2001, 1487–1531, in: Fields, Virology, Lippincott, Williams and Wilkins). Aufgrund der hohen Fehlerrate der viruseigenen Polymerase kommt es im Laufe der Virusreplikation recht häufig zu Punktmutationen. Dies hat eine ausgeprägte Wandlungsfähigkeit der Viren zu Folge (zur Übersicht siehe: Wright und Webster, 2001, 1533–1579, in: Fields, Virology, Lippincott, Williams and Wilkins). Betreffen solche Punktmutationen immunogene Bereiche der beiden Hauptoberflächenantigene Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA), so spricht man von „Antigendrift". Aufgrund der segmentierten Natur des Genoms besitzen die Viren überdies die Fähigkeit, Gensegmente aus verschiedenen Virusstämmen neu zu kombinieren. Derzeit sind von den besagten Oberflächenproteinen 15 (HA) bzw. 9 (NA) serologisch unterscheidbare Subtypen bekannt. Ein Austausch dieser Gensegmente im Virus wird als „Antigenshift" bezeichnet. Antigendrift und -shift erlauben den Viren einem im Wirt bestehenden Immunschutz zu entgehen und eine Infektion hervorzurufen. Diese Wandlungsfähigkeit der Viren ist der Grund dafür, dass die beim Menschen zur Prophylaxe gegen Influenza eingesetzten Impfstoffe nahezu jährlich an die geänderten antigenen Eigenschaften des epidemischen Virus angepasst werden müssen und somit eine jährliche Wiederholung der Impfung angeraten ist. Nur so ist eine optimale Schutzwirkung der Vakzine gegen das jeweils kursierende Virus zu erreichen.
- Influenza A Viren können neben dem Menschen eine Vielzahl weiterer Säugetiere und auch Vögel infizieren. Letztere stellen offenkundig ein natürliches Reservoir für die Influenza A Viren dar, da Vertreter aller bekannten Subtypen aus Wildvögeln isoliert werden können. In infizierten Säugetieren verursachen die Viren klassischerweise mit Fieber ein hergehende Erkrankungen des oberen Respirationstraktes mit hoher Morbidität aber geringer Mortalität. Eine Ausbreitung der Infektion auf andere Organsysteme ist möglich aber selten; dabei kann es jedoch zu schweren Krankheitsverläufen mit Todesfolge kommen.
- In infizierten Wildvögeln hingegen verlaufen die Infektionen in aller Regel subklinisch und die infizierten Tiere erkranken somit nicht. Im Gegensatz zur Infektion in Säugetieren repliziert das Virus bei Vögeln im Gastrointestinaltrakt und wird mit dem Kot ausgeschieden. Dem Wildvögelreservoir kommt für die Epidemiologie der Influenzaviren eine enorme Bedeutung zu. Zum einen können durch Aufnahme von Gensegmenten aus Wildvogelviren sogenannte Virus-Reassortanten mit Pandemiepotential für die menschliche Bevölkerung entstehen. Die drei Influenza-Pandemien des letzten Jahrhunderts gingen alle von solchen Virus-Reassortanten aus, die durch Integration von Genen aus Influenzaviren aus dem Wildvogelreservoir ein hochpathogenes Potential erlangt hatten. Zum anderen kommt es immer wieder zur Einbringung von Influenzaviren aus diesem Wildvogelreservoir in domestizierte Geflügelbestände. Meist kursiert das eingebrachte Virus eine Zeitlang im Geflügelbestand mit keinerlei oder nur schwachen Krankheitssymptomen bei den infizierten Tieren. Man spricht dabei dann von einer niedrig pathogenen aviären Influenza (engl.: low pathogenic avian influenza, LPAI). Das Virus kann sich allerdings spontan in einen hoch pathogenen Erreger verwandeln und im infizierten Tier zu einer schweren systemischen Erkrankung, der sogenannten Geflügelpest, führen, die in nahezu 100% der Fälle tödlich endet (engl.: highly pathogenic avian influenza, HPAI). Diese Erkrankung ist extrem ansteckend und breitet sich rasant in den Vogelbeständen aus. Solche Influenzaausbrüche in Geflügelfarmen waren in der jüngeren Vergangenheit des öfteren zu verzeichnen:
- – 1993–1995: Ausbruch in Mexiko, Virussubtyp H5N2 (Swayne et al., Avian disorders 41, 335–346, 1997)
- – 1997: Ausbruch in Hong Kong, Virussubtyp H5N1 (Claas et al., Lancet 351, 472–477, 1998)
- – 1999: Ausbruch in Italien, Virussubtyp H7N1 (Capua und Marangon, Avian Pathology 29, 289–294, 2000)
- – 2003: Ausbruch in Niederlanden, Belgien, Deutschland, Virussubtyp H7N7 (Fouchier et al., PNAS 101, 1356–1361, 2004)
- – 2004: noch andauernder Ausbruch in Südostasien, Virussubtyp H5N1
- Diese highly pathogenic avian influenza (HPAI) -Ausbrüche sind einerseits von großer wirtschaftlicher Bedeutung, da zur Unterbrechung der Infektionskette und zur Eindämmung der Epidemie Millionen von Hühnern getötet werden müssen. Andererseits bergen diese Infektionen aber auch Gefahren für die menschliche Gesundheit. So konnte in einigen Fällen bei den genannten Ausbrüchen in Hong Kong, in den Niederlanden und in Südostasien ein Überspringen der aviären Influenzaviren auf den Menschen beobachtet werden. In der Folge kam es dabei teilweise zu schweren Erkrankungen des Respirationstraktes und weiterer Organsysteme wie Gastrointestinaltrakt, Leber und Nieren, die in einigen Fällen tödlich endeten. Im Falle des Hong Kong Ausbruches betrug die Mortalität 30% (Yuen et al., Lancet 351, 467–471, 1998). Aufgrund dieser Vorfälle geht also von den Vogelinfluenzaviren grundsätzlich auch eine potentielle Bedrohung für den Menschen aus.
- Influenzaviren benötigen für eine multizyklische Replikation und zur Ausbildung eines hochpathogenen Phänotyps im infizierten Tier die Spaltung ihres HA-Proteins durch eine Protease. Daher ist die proteolytische Aktivierung ein essentieller Schritt; Viren mit ungespaltenem HA sind nicht infektiös und können sich nicht im Organismus vermehren. Die dafür verwendete Protease ist keine virale Komponente, sondern wird vom Wirtsorganismus bereitgestellt. Welche Protease zur Wirkung kommt, hängt vom Spaltmotiv im HA ab (Klenk und Garten, Trends in Microbiology 2, 39–43, 1994).
- Interessanterweise waren hochpathogene Infektionsverläufe bisher nur bei Viren der Subtypen H5 und N7 zu beobachten. Diese beiden Subtypen wurden daher auch von der Weltgesundheits-Organisation im Rahmen des „WHO Global Influenza Programme" als „High Priority Subtypen" zur Entwicklung von Vakzinen eingestuft, da sie einerseits eine hohe Tendenz zeigen, sich aus einem niedrigpathogenen in einen hochpathogenen Stamm zu wandeln und andererseits nachweislich dazu in der Lage sind, Menschen zu infizieren.
- Trotz der Verfügbarkeit sogenannter „Neuraminidase-Inhibitoren" ist die Impfung nach wie vor die wirkungsvollste Schutzmaßnahme gegen eine Influenza-Infektion. Vakzinestämme werden klassischerweise durch Reassortment zweier Ausgangsstämme generiert. Damit wird erreicht, dass die antigenen Oberflächenproteine eines epidemischen Virus in einen Virusstamm eingebracht werden, der sich gut in embryonierten Hühnereiern vermehren lässt. Ein solcher gut im Hühnerei anzüchtbarer Stamm ist z.B. das humane Virusisolat A/PR8/34 (H1N1). Allerdings ist dieses Verfahren sehr zeitaufwendig und kostspielig. Um die Probleme bei der klassischen Reassortierung von Viren zu umgehen, wurde kürzlich ein System der reversen Genetik beschrieben, mit dem Influenzaviren ohne Helfervirus ausschließlich ausgehend von cDNA-Konstrukten mittels molekularbiologischer Techniken in Zellkultur generiert werden können (Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350, 1999).
- Für die klassischen Geflügelpestviren gibt es jedoch bisher kein gentechnologisches Herstellungsverfahren und keine immunogenen, aber nicht pathogen Mutanten dieser Viren, die zur Herstellung eines inaktivierten Impfstoffes gegen Influenzaviren geeignet sind.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von klassischen Geflügelpestviren bereit zu stellen und Mutanten der klassischen Geflügelpestviren bereit zu stellen, die immunogen, aber nicht pathogen sind und als inaktivierter Impfstoff gegen hochpathogene Influenza-Viren zur Impfung von Menschen verwendet werden können.
- Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Ansprüche 1-X.
- Als Ausgangsstamm zur Erzeugung eines inaktivierten Impfstoffes gegen hochpathogene pandemische Influenzaviren beispielsweise des Subtyps H7 wird dabei erfindungsgemäß der Prototyp eines aviären Influenzavirus, nämlich das Klassische Geflügelpestvirus (Influenza A/FPV/Rostock/34 [H7N1]) verwendet (Feldmann et al., Journal of Virology 74, 8018–8027, 2000). Die Infektion mit diesem Virus führt in Geflügel zur Ausbildung einer HPAI mit den typischen schweren Krankheitssymptomen und endet nahezu immer tödlich. In Menschen konnte allerdings bislang keinerlei pathogene Wirkung dieses Virus festgestellt werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von klassischen Geflügelpestviren bereit und darauf aufbauend Mutanten dieser klassischen Geflügelpestviren, die immunogen, aber nicht pathogen sind. Damit steht ein inaktivierter Impfstoff gegen hochpathogene Influenza-Viren zur Impfung von Menschen zur Verfügung.
- Die Erfindung beruht auf ursprünglich aviären Viren, die mittels eines Verfahrens der reversen Genetik in Zellkultur erzeugt werden. Vorteilhafterweise wird das Klassische Geflügelpestvirus (Influenza A/FPV/Rostock/34 [H7N1]) verwendet, das sich aufgrund seines aviären Ursprungs effizient im embryonierten Hühnerei vermehrt. Dies hat gegenüber bestehenden Systemen zur Erzeugung von Impfvirusstämmen den Vorteil, dass zur Erzielung einer guten Vermehrbarkeit keine zusätzlichen Virus-Stämme, wie z.B. der Stamm A/PR8/34 mehr notwendig sind.
- Die Erfindung führt zur gezielten Attenuation des klassischen Geflügelpestvirus (Influenza A/FPV/Rostock/34 [H7N1]) durch Einführen einer Mutation, so dass die proteolytische Aktivierung des Hämagglutinins im Tier verhindert und damit die Ausbildung schwerer Krankheitssymptome ausgeschlossen wird. Dies ist eine Grundvoraussetzung zur sicheren Produktion dieser Viren in großem Maßstab wie sie zur Impfstofferzeugung vonnöten ist. Aufgrund des Vorhandenseins entsprechender Proteasen lässt sich das im Tier stark attenuierte rekombinante klassische Geflügelpestvirus (Influenza A/FPV/Rostock/34 [H7N1], kurz FPV genannt) jedoch in großen Mengen in der Allantoishöhle embryonierter Hühnereier vermehren. Demzufolge besteht im embryonierten Hühnerei kein Selektionsdruck zur Reversion der Virusmutanten zurück zum Wildtyp, wodurch eine stabile und permanente Attenuation des rekombinanten Virus gewährleistet ist.
- Darüberhinaus werden auch weitere Oberflächenantigene anderer aviärer Influenzavirus-Subtypen in das FPV Genom eingebracht. Es ist bekannt, dass abhängig vom epidemischen Stamm Inkompatibilitäten zwischen HA oder NA und den übrigen 6 Genen des Stammes auftreten können, in die zur Erzielung einer guten Anzüchtbarkeit die Oberflächenantigene integriert werden sollen (Scholtissek et al., Journal of Virology, Vol. 76, 1781–1786, 2002). Es ist zu vermuten, dass die Einbringung von aviären Oberflächenantigenen in einen ebenso aviären Hintergrund mit wesentlich höherer Effizienz zu erreichen ist und solche Inkompatibilitäten deutlich geringer ausgeprägt sind. So werden mit dem beschriebenen FPV-System unter Anwendung des dem Fachmann bekannten Attenuierungsverfahrens auch inaktivierte Impfstoffe gegen weitere HPAI-Isolate erzeugt.
- Die folgende Zeichnung erläutert ausführlich den Erfindungsgegenstand:
-
1 : Schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung rekombinanter Influenzaviren des Stammes A/FPV/Rostock/34 (FPV). Bezeichnungen für die einzelnen Untereinheiten der Influenza Polymerase: PB1, Polymerase basisch 1; PB2, Polymerase basisch 2; PA, Polymerase acidic; NP, Nukleoprotein. -
2 : Westernblot-Analyse der Spaltung der Hämagglutinin-Mutanten in MDCK-Zellen -
3 : Überlebenszeiten von mit Virusmutanten inokulierten Hühnerembryonen -
4 : Gefrierschnitte mit Magengewebe von Hühnerembryonen zeigen die Ausbreitung der Virusinfektion -
5 : Pathogenitätsindizes der erzeugten Viren im Huhn -
1 zeigt die Herstellung des rekombinanten klassischen Geflügelpestvirus (A/FPV/Rostock/34). Diese erfolgt z. B. auf der Basis des von Neumann et al. beschriebenen Systems zur reversen Genetik (Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350, 1999). Das FPV-Isolat wird zunächst im embryonierten Hühnerei vermehrt, aufgereinigt und die acht viralen RNA-Gensegmente werden isoliert. Mittels genspezifischer Primer erfolgt die Umschreibung und Amplifikation der RNA in cDNA. Die cDNA-Segmente werden in RNA Polymerase I-gesteuerte Plasmide kloniert. Nach Transfektion dieser acht Plasmide in Zellen, vorzugsweise Zellen, die entweder aus dem Menschen oder Primaten isoliert wurden, insbe sondere 293T-Zellen (humane, embryonale Zellen, käuflich erwerbbar z.B. bei American type culture collection) kommt es zur Transkription von vRNA durch die zelluläre RNA Polymerase I. Die Untereinheiten der Influenzavirus Polymerase, die die Umschreibung dieser Primärtranskripte in mRNA und cRNA bewerkstelligt, werden mittels kotransfizierter RNA Polymerase II-gesteuerter Plasmide in den Zellen zum intakten Polymerasekomplex rekonstituiert. Die Zelle setzt nun rekombinante Influenzaviren frei. Ein solches plasmidbasiertes System erlaubt die gentechnologische Herstellung beliebiger (lebensfähiger) Virusmutanten und -reassortanten. - Die Herstellung von Mutanten der klassischen Geflügelpestviren, die immunogen, aber nicht pathogen sind und als inaktivierter Impfstoff gegen hochpathogene Influenza-Viren zur Impfung von Menschen verwendet werden können erfolgt durch Mutagenese des rekombinanten FPV-Virus (Isolat A/FPV/Rostock/34). Durch zielgerichtete Mutagenese wird die Sequenz des für das Hämagglutininprotein (HA) kodierenden Gensegments auf zweierlei Weise so verändert, dass die HA-Spaltstelle eine vom Wildtyp abweichende Aminosäurenabfolge aufweist und beispielsweise kein multibasisches Motiv mehr darstellt. Mittels des beschriebenen Systems der reversen Genetik werden unter Verwendung der in ein geeignetes Plasmid eingebrachten mutierten HA-Sequenzen die entsprechenden Virusmutanten erzeugt. Die Mutation beinhaltet auch Translokationen, Punktmutationen und Deletionen inner- oder außerhalb des HA-Spaltmotives, die dazu führen, dass das Hämagglutinin nicht mehr durch eine Protease beispielsweise Trypsin gespalten werden kann. Ein Beispiel für eine solche Mutation ist der Verlust des multibasischen Motiv.
- Exemplarisch gezeigt werden die Virusmutanten MutI und MutIV, fette Buchstaben markieren die Mutationsposition, das Sternchen* zeigt die Stelle, an der das Hämagglutinin gespalten wird. Die Spaltung erfolgt im Wildtyp zwischen den Aminosäuren R und G.
- FPV-HA Spaltstellen-Mutanten:
Wildtyp-HA ...PEPSKKRKKR*GLF... Mut I ...PEPSAAAKGR*GLF... Mut IV ...PEPS---KGR*GLF... - Dazu wird das mutierte HA-Plasmid zusammen mit den anderen sieben Pol I-Plasmiden und in Kombination mit den vier Pol II-Plasmiden zur Transfektion von Zellen, beispielsweise 293T Zellen eingesetzt. Dazu eignet sich prinzipiell jedes im Stand der Technik bekannte Transfektionsprotokoll. Um die multizyklische Replikation der Virusmutanten zu ermöglichen, wird dem Überstand der 293T-Zellen 2 Tage nach der Transfektion Trypsin zugesetzt. Nach weiteren 6 Stunden erfolgt die Passage eines Teils des Überstand auf MDCK-Zellen. Auch hier wird eine multizyklische Replikation der Virusmutanten durch Zugabe von Trypsin gewährleistet.
- Ferner werden mit dem beschriebenen System zur reversen Genetik auch rekombinante Viren produziert, die im Hintergrund der Gene des FPV das Hämagglutingen und das Neuraminidasegen – und damit auch die entsprechenden Oberflächenproteine – anderer aviärer epidemischer Influenzaisolate besitzen. Somit ist auf der Basis des FPV-Systems auch die Entwicklung inaktivierter Impfstoffe gegen weitere epidemische Vogelinfluenzaviren mit pathogenem Potential möglich.
- Aufgrund der veränderten HA-Spaltstelle sind die hier erzeugten Virusmutanten Mut I und Mut IV nicht mehr in der Lage, sich in einer Kultur aus Hundenierenzellen (Madin Darby Canine Kidney, MDCK) in Abwesenheit der Protease Trypsin zu replizieren. Dies zeigen Ergebnisse im Plaquetest zur Untersuchung der Replikation der Virusmutanten in MDCK-Zellen. Die Virusreplikation zeigt sich im Plaquetest durch kreisrunde Bereiche von Zellschädigung: Die als Ergebnis der Virusreplikation geschädigten oder zerstörten Zellen können mit Farbstoff nicht mehr angefärbt werden und erscheinen daher im Hintergrund der nichtinfizierten, dunkel gefärbten, Zellen hell. Im Gegensatz dazu können die wildtypischen (WT) FPV sowohl in An- als auch in Abwesenheit der Protease Trypsin replizieren. Die Replikation der erzeugten Virusmutanten ist also in MDCK-Zellen vollständig abhängig von der Anwesenheit der Protease Trypsin.
-
2 zeigt die Spaltung der Hämagglutinin-Mutanten in MDCK-Zellen in einer Westernblot-Analyse. In Abwesenheit von Trypsin (als Minus dargestellt) wird das HA (als HA0 dargestellt) der Virusmutanten MutI und MutIV nicht mehr in die Untereinheiten HA1 und HA2 gespalten, sondern liegt gänzlich als nichtprozessierter Vorläufer HA0 vor. Die Spaltung ist jedoch für die multizyklische Vermehrung der Viren im Wirt eine wichtige Grundvoraussetzung. Die Veränderung der HA-Spaltstelle stellt somit ein effizientes Attenuierungsprinzip dar, mit dem die Replikation von FPV in Abwesenheit von exogener zugegebener Protease Trypsin in Zellkultur vollständig unterdrückt werden kann. - Bei Anzüchtung in der Allantoishöhle embryonierter Hühnereier replizieren die Virusmutanten mit derselben Effizienz wie WT-FPV, mit einem Virustiter von ca. 4 × 108 bei WT, MutI und MutIV. Die Virusmutanten können somit mit gleicher Ausbeute wie WT-FPV im embryonierten Hühnerei gewonnen werden. In Bereich der Allantoishöhle existieren also Proteasen, die auch die mutierte Spaltstelle des HA prozessieren können und als Folge davon eine multizyklische Replikation der Viren ermöglichen. Es besteht in der Allantoishöhle somit kein Selektionsdruck zur Reversion der Virusmutanten zu WT-Sequenz. Bei Anzucht der Viren im embryonierten Hühnerei sind die erzeugten Virusmutanten also stabil.
- Auch im embryonierten Ei zeigt sich deutlich der attenuierte Phänotyp der FPV-Mutanten Mut I und Mut IV im Ausbleiben einer direkten Ausbreitung der Infektion auf den Hühnerembryo.
3 zeigt die Überle benszeiten von mit Virusmutanten inokulierten Hühnerembryonen. Während ein Absterben der Embryonen in den mit WT-FPV infizierten Eiern bereits 18 Stunden nach Inokulation beobachtet wird, überleben die Embryonen in mit FPV-Mutanten inokulierten Hühnereiern länger als 42 Stunden nach der Inokulation ehe auch hier der Tod eintritt, weil durch die Infektion der Allantoishöhle eine ausreichende Versorgung des Embryos nicht mehr gewährleistet ist. - Ebenso kann gezeigt werden, dass eine Virusinfektion oder -replikation im embryonalen Gewebe von Eiern, die mit FPV-Mutanten infiziert worden waren, nicht nachgewiesen werden kann.
4 zeigt exemplarisch das Ergebnis einer Untersuchung in Gefrierschnitten von Hühnerembryonen. Virale RNA wird hier mittels in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Influenza-spezifischen, markierten RNA Sonde detektiert. Während in WT-FPV infizierten Proben ein deutlich positiver Nachweis in den Blutgefäßen der Submukosa des Magens sichtbar ist (geschwärzte Bereiche des Gewebes in4 ), sind alle mit FPV-Mutanten infizierte Gewebe frei von Virusmaterial. Embryonale Gewebe aus mit Virusmutanten infizierten Eiern sind von uninfizierten Embryonen (Mock) nicht zu unterscheiden. - Weiterhin werden die intravenösen Pathogenitätsindizes der Virusmutanten nach Inokulation von Hühnern bestimmt. Es werden je Virustyp Gruppen von 10 Hühnern infiziert. Erwartungsgemäß zeigt das WT-FPV einen hochpathogenen Phänotyp. Es wird ein Pathogenitätsindex von 2,37 ermittelt. Alle Tiere dieser Gruppe erkranken schwer, 7 von 10 Tieren versterben. Die getesteten Virusmutanten sind deutlich attenuiert. Keines der Tiere verstirbt, nur ein Tier aus der mit der Virusmutante I infizierten Gruppe erkrankt leicht. Die auf der Basis dieser Ergebnisse ermittelten Pathogenitäts-indizes betragen 0,07 (Mut I) und 0,0 (Mut IV) wie in
5 dargestellt. - Trotz dieser ausgeprägten Attenuation der Virusmutanten im Vogel reagieren alle infizierten Tiere mit der Bildung von spezifischen Hämagglutinations-hemmenden Antikörpern gegen HA des Subtyps H7. Die Infektion mit den hochgradig attenuierten Virusmutanten führt im Versuchstier tatsächlich zur Entwicklung einer spezifischen Immunreaktion. Daher sind die Virusmutanten Mut I und Mut IV als inaktivierter Impfstoff gegen hochpathogene Influenza-Viren zur Impfung von Vertebraten, insbesondere Säugetieren wie Menschen und Primaten und auch Vögel geeignet.
- Zusammenfassend wird gezeigt, dass die Replikation von FPV-Mutanten mit veränderter HA-Spaltstelle sowohl in Zellkultur als auch in Hühnerembryonen vollständig blockiert ist. Jedoch können die Virusmutanten in großer Menge in der Allantoishöhle infizierter Hühnereier vermehrt werden, da sie sich hier mit gleicher Effizienz wie WT-FPV replizieren.
- Die ausgezeichnete Vermehrbarkeit in der Allantoishöhle embryonierter Hühnereier, die vollständige Attenuation im infizierten Vogel und die ausgewiesene Fähigkeit der Virusmutanten zur Induktion einer HA-spezifischen Antikörperantwort im infizierten Tier machen die hier erzeugten FPV-Mutanten zu hervorragend geeigneten Ausgangsviren zur Produktion eines inaktivierten Impfstoffes. Es ist bekannt, dass gegen das HA gerichtete Antikörper Influenzaviren neutralisieren und so eine Infektion in Vertebraten verhindern können.
- Das erfindungsgemäße gentechnologische Verfahren zur Herstellung von klassischen Geflügelpestviren und die Herstellung von Mutanten dieser Viren, die zwar immunogen, aber nicht pathogen sind, ist auch auf andere hochpathogene Influenzastämme, die eine multizyklische Spaltstelle im HA besitzen anwendbar. Auch dort führen Mutationen in der HA-Spaltstelle, die die Spaltung durch Proteasen verhindern zu einer deutlichen Attenuation der entsprechenden Viren.
- Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des inaktivierten Impfstoffes an Patienten, die einem Infektionsrisiko mit einem Influenza-Virus unterliegen.
- Der Begriff Patient bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltiere, insbesondere Vögel. Damit kann der Impfstoff in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Der therapeutisch wirksame Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird den Patienten, als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform verabreicht.
- Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können die Modifikationen als Salze, Ester, Amide und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.
- Der Terminus "Prodrug" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Verbesserung der Aufnahme transformiert werden, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut.
- Dosierungsformen für die örtliche Administration des Impfstoffes dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Preservativen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.
- Ausführungsbeispiele
- Beispiel 1: Herstellung und Anwendung eines hochpathogenen aviären Influenzavirus des Stammes A/FPV/Rostock/34
- Die Herstellung der rekombinanten Viren erfolgt unter Anwendung des plasmidbasierten Systems der reversen Genetik von Neumann et al., (PNAS 96, 9345–9350, 1999). Die Gene des Influenzavirus A/FPV/Rostock/34 (FPV) als Prototyp eines hochpathogenen Vogelinfluenzavirus werden isoliert und mittels RT-PCR so amplifiziert, dass eine Insertion in den Vektor pHH21 erfolgt. Als Ausgangsmaterial zur Virusgewinnung dient beispielsweise Allantoisflüssigkeit oder Zellkulturüberstände, die entsprechende Methodik ist dem Fachmann geläufig.
- Das Verfahren gliedert sich in 4 Schritte:
- 1. Anzucht des Influenzavirus beispielsweise A/FPV/Rostock/34 (FPV) in der Allantoishöhle von embryonierten Hühnereiern und Isolation des Virus aus Allantoisflüssigkeit oder Anzucht in Zellkultur und Isolation des Virus aus Zellkulturüberstand.
- 2. Erstellung von pHH21-Plasmidkonstrukten mit cDNA-Inserts, die für die viralen Gene kodieren.
- 3. Virusfreisetzung nach Transfektion von Zellen mit 4 Plasmiden zur Expression der Polymeraseproteine PB, PA und NP des Virus und 8 Plasmiden zur Expression von vRNA PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M und NS
- 4. Virusvermehrung in Zellkultur oder embryoniertem Hühnerei.
- 1. Virusanzucht
- Die Virusanzucht des FPV-Ausgangsisolates A/FPV/Rostock/34 (FPV) erfolgt alternativ in Hundenierenzellen (MDCK, Madin Darby Canine kidney) oder 11 Tage alten embryonierten Hühnereiern nach klassischer virologischer Methodik.
- 2. Erstellung der pHH21-Konstrukte
- Die Isolierung der viralen RNA erfolgt mittels des „High Pure RNA Isolation Kit" (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) nach Herstellerprotokoll. Die Umschreibung der 8 RNA-Segmente in cDNA und die Amplifikation der DNA erfolgt mittels RT-PCR unter Verwendung des „OneStep RT-PCR Kits" (Fa. Qiagen, Hilden).
- Laut Herstellerangabe wird folgender Reaktionsansatz bereitet:
RNAse-freies Wasser 37 μl 5fach Puffer 10 μl dNTP Mix (je 10mM) 2 μl Primer, vorwärts (fo), 100ng/μl 2 μl Primer, rückwärts (re), 100ng/μl 2 μl Enzym-Mix 2 μl Virale RNA Präparation 5 μl - Folgende Primerpaare zur Herstellung der RNA-Pol I -Plasmide zur Expression der vRNA kommen dabei zum Einsatz:
zur Amplifikation des viralen PB1-Gens:
5'ATATACCTGCATAAGGGAGCGAAAGCAGGCA3' (fo)
5'ATATACCTGCATATTATTAGTAGAAACAAGGCA3' (re)
zur Amplifikation des viralen PB2-Gens:
5'ATATGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC3' (fo)
5'ATATGGTCTCTTATTAGTAGAAACAAGGTC3' (re)
zur Amplifikation des viralen PA-Gens:
5'ATATGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC3' (fo)
5'ATATGGTCTCTTATTAGTAGAAACAAGGTAC3' (re)
zur Amplifikation des HA-Gens:
5'ATATGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGA3' (fo)
5'ATATGGTCTCTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTTC3' (re)
zur Amplifikation des NP-Gens:
5'ATATACCTGCATAAGGGAGCAAAAGCAGGGTA3' (fo)
5'ATATACCTGCATATTATTAGTAGAAACAAGGGTA3' (re);
zur Amplifikation des NA-Gens:
5'ATATGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAG3' (fo)
5'ATATGGTCTCCTTATTAGTAGAAACAAGGAGT3' (re)
zur Amplifikation des M-Gens:
5'ATATCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG3' (fo)
5'ATATCGTCTCTTATTAGTAGAAACAAGGTAG3' (re)
zur Amplifikation des NS-Gens:
5'ATATCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG3' (fo)
5'ATATCGTCTCTTATTAGTAGAAACAAGGGTG3' (re) - Die verwendeten Primer enthalten Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen BspM I (PB1, NP), Bsa I (PB2, PA, HA, NA) oder BsmB I (M, NS).
-
- Die erhaltenen RT-PCR Produkte werden mit Hilfe des „PCR-Purification Kits" (Fa. Qiagen) aufgereinigt, entsprechend des jeweilig verwendeten Primerpaares mit Restriktionsendonuklease gespalten und in den mit BsmB I geschnittenen pHN21-Vektor (Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350) ligiert.
- 3. Viruserzeugung und -freisetzung
- Die acht erstellten pHH21-Konstrukte werden zusammen mit RNA Polymerase II Promotor gesteuerten Expressionsplasmiden für die Proteine PB1, PB2, PA und NP (Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350) in Zellen, beispielsweise humane embryonale Nierenzellen (293T) transfiziert. Dazu werden die Zellen in Suspension gebracht und als Transfektionsagenz Lipofectamin 2000 (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Die praktische Durchführung erfolgt wie bei Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350 beschrieben.
- 4. Virusvermehrung
- Die im Anschluss an die Transfektion in den 293T-Zellen gebildeten rekombinanten FPV werden alternativ in MDCK-Zellkultur oder in der Allantoishöhle von 11 Tage alten embryonierten Hühnereiern vermehrt und die so erhaltenen Virus-Stocklösungen bei –80°C gelagert.
- Beispiel 2: Herstellung und Anwendung von Mutanten der hochpathogenen Influenzaviren, die immunogen, aber nicht pathogen sind
- Die Herstellung der rekombinanten Influenzaviren des Stammes A/FPV/Rostock/34 (FPV) erfolgt wie unter Beispiel 1 beschrieben in Anlehnung an das von Neumann et al. entwickelte System (Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350, 1999). Die gezielte Attenuation des hochpathogenen Influenzavirus A/FPV/Rostock/34 (FPV) FPV erfolgt durch Veränderung des Spaltstellenmotivs im Hämagglutinin-Gen.
- Das Verfahren gliedert sich in folgende Schritte:
- 1. Anzucht und Isolation des Influenzavirus
- 2. Mutagenese des Plasmides mit cDNA-Insert, welches das Hämagglutinin-Gen trägt
- 3. Virusfreisetzung nach Transfektion von Zellen mit 4 Plasmiden zur Expression der Polymeraseproteine PB, PA und NP des Virus und 7 Plasmiden zur Expression von vRNA PB1, PB2, PA, NP, NA, M und NS und des Plasmides mit cDNA-Inserts, welches die Mutation des Hämagglutinin-Gen trägt
- 4. Virusvermehrung in Zellkultur in Gegenwart der Protease Trypsin aus Pankreas vom Rind oder in embryonierten Hühnereiern.
- Mutagenese des Plasmides mit cDNA-Insert, welches das Hämagglutinin-Gen trägt
- Das Plasmid pHH21-HA (Neumann et al., PNAS 96, 9345–9350, 1999) kodiert für die RNA des viralen Oberflächenproteins Hämagglutinin (HA) des FPV. Diese Original-Sequenz wird beispielsweise mittels eines kommerziell erhältlichen Systems zur in vitro Mutagenese (QuickchangeTM-Mutagenesis Kit, Firma Stratagene, Amsterdam) auf beispielsweise 2 Weisen modifiziert, sodass die Nukleotidsequenz von Position 1030 bis 1047 im kodierenden Bereich des FPV-HA gegen:
- I) GCAGCAGCGAAAGGAAGA
- II) AAAGGAAGA
- Laut Herstellerangaben enthält der Reaktionsansatz:
RNAse-freies Wasser 38 μl 10fach Puffer 5 μl dNTP-Mix (25mM) 1 μl Primer, vorwärts (fo), 100ng/μl 2 μl Primer, rückwärts (re), 100ng/μl 2 μl Pfu-Polymerase (2,5U/μl) 1 μl Plasmid-DNA (50ng/μl) 1 μl -
-
- Danach erfolgt die Inkubation mit dem Restriktionsenzym Dpn I (Fa. New England Biolabs, Frankfurt) zur Entfernung methylierter DNA (Wildtyp-Plasmide und Hybridmoleküle) aus dem Reaktionsansatz. Dazu werden 10 U Dpn I dem Ansatz zugegeben und es wird für 2 h bei 37°C inkubiert. 2 μl des Reaktionsansatzes werden dann in kommerziell erhältliche superkompetente XL1-Blue E. coli Bakterien (Fa. Stratagene, Amsterdam) gemäß Herstellerangaben eingebracht. Im Anschluss an die Transformation werden Bakterienkulturen angeimpft und die Plasmid-DNA isoliert, beispielsweise unter Verwendung des Plasmid Maxi Kits (Fa. Qiagen, Hilden). Das Vorhandensein der eingeführten Mutationen wird mittels Sequenzierung der so erhaltenen Plasmid-DNA bestätigt.
- 2. Viruserzeugung und -freisetzung
- Die beiden mutierten Plasmide pHH21-HA(MutI) und pHH21-HA(MutII) werden zusammen mit den restlichen FPV-Gen tragenden pHH21-Konstrukten wie unter Beispiel 1, beschrieben, zur Erzeugung der entsprechend mutierten rekombinanten Viren eingesetzt.
- 3. Virusvermehrung
- Die im Anschluss an die Transfektion in den 293T-Zellen gebildeten mutierten FPV werden entweder in MDCK-Zellkultur oder in der Allantoishöhle von 11 Tage alten embryonierten Hühnereiern vermehrt. Zur Vermehrung in Zellkultur wird dazu die Protease TPCK-Trypsin aus Rinderpankreas (Fa. Sigma, Taufkirchen, Germany) in einer Konzentra tion von 0,5 μg/ml Zellkulturmedium zugegeben. Zur Anzucht der Virusmutanten im embryonierten Hühnerei ist die exogene Zugabe einer Protease nicht erforderlich. Die so erhaltenen Virus-Stocklösungen werden bei –80°C gelagert.
- Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
Claims (19)
- Verfahren zur Herstellung eines mutierten hochpathogenen aviären Influenzavirus bestehend aus den Schritten: i) Anzucht und Isolierung des hochpathogenen aviären Influenzavirus ii) Mutagenese eines Plasmides mit cDNA-Insert, welches das Hämagglutinin-Gen des hochpathogenen aviären Influenzavirus trägt iii) Transfektion von Zellen mit 4 Plasmiden die die Expression der RNA-Polymerase II-Proteine PB1, PB2, PA und NP des hochpathogenen aviären Influenzavirus ermöglichen und 7 Plasmiden zur Expression von RNA-Polymerase I Proteine PB1, PB2, PA, NP, NA, M und NS des hochpathogenen aviären Influenzavirus ermöglichen und des Plasmides mit cDNA-Insert, welches die Mutation des Hämagglutinin-Gens des hochpathogenen aviären Influenzavirus trägt iv) Virusfreisetzung v) Virusvermehrung
- Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die Mutation des Hämagglutinin-Gen eine Mutation im multibasische Motiv ist.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Mutation des Hämagglutinin-Gen im multibasischen Motiv zu den Aminosäuren PEPSAAAKGRGLF erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Mutation des Hämagglutinin-Gen im multibasischen Motiv zu den Aminosäuren PEPSKGRGLF erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Anzucht der Viren in der Allantoishöhle von embryonierten Hühnereiern und die Isolation der Viren aus der Allantoishöhle erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Anzucht der Viren in Zellkultur und die Isolation der Viren den Kulturüberständen dieser Zellen erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Transfektion von Zellen vorzugsweise mit 293T-Zellen erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Virusvermehrung in Zellkultur oder embryoniertem Hühnerei erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass das hochpathogene aviäre Influenza-Virus eine multizyklische Spaltstelle hat
- Verfahren einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass das hochpathogene aviäre Influenza-Virus den Subtyp H7 hat
- Impfstoff gegen hochpathogene Influenza-Viren des Subtyp H7 dadurch gekennzeichnet, dass er aus mutierten hochpathogenen aviären Influenza-Viren besteht, die zwar immunogen, aber nicht pathogen sind.
- Impfstoff gemäß Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, das die mutierten hochpathogenen aviären Influenza-Viren eine Mutation im Spaltungsmotiv des Hämagglutinin-Gen aufweisen.
- Impfstoff gemäß Anspruch 11 und 12 dadurch gekennzeichnet dass die Mutation im Spaltungsmotiv des Hämagglutinin-Gen das multibasische Motiv betrifft.
- Impfstoff gemäß Anspruch 11 bis 13 dadurch gekennzeichnet dass die Mutation im multibasischen Motiv zu den Aminosäuren PEPSAAAKGRGLF erfolgt.
- Impfstoff gemäß Anspruch 11 bis 14 dadurch gekennzeichnet dass die Mutation im multibasischen Motiv zu den Aminosäuren PEPSKGRGLF erfolgt.
- Impfstoff gemäß Anspruch 11 bis 15 dadurch gekennzeichnet, dass er zur Anwendung an Vertebraten insbesondere Säugetiere oder Vögel geeignet ist.
- Impfstoff gemäß Anspruch 11 bis 15 dadurch gekennzeichnet, dass er
- Impfstoff gemäß Anspruch 11–15 dadurch gekennzeichnet, dass er in einem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wurde.
- Verwendung eines Impfstoffes gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass er zu Impfung gegen eine Influenza-Virus-Infektion eingesetzt wird
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