EA006311B1 - Система трансфекции днк для получения инфекционного вируса гриппа - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение основано на создании системы с двойным промотором (предпочтительно РНК pol I-pol II системы) для эффективного внутриклеточного синтеза вирусной РНК. Полученная система, основанная на минимальном количестве плазмид, может быть использована для синтеза РНК вируса, предпочтительно вирусов с геномом, представленным отрицательной одноцепочечной РНК. Вирусный продукт системы образуется, когда плазмиды системы вводят в соответствующую клетку-хозяина. Одним из вариантов реализации изобретения является получение ослабленных реассортированных вирусов гриппа для использования их в качестве антигенов в вакцинах. Реассортированные вирусы, полученные путем котрансфекции плазмид, могут содержать гены, кодирующие поверхностные гликопротеины - гемагглютинин и невраминидазу из вируса гриппа, который в настоящее время инфицирует население, и внутренние гены из ослабленного вируса гриппа. Одним из достоинств настоящего изобретения является его универсальность; систему можно быстро и легко адаптировать для синтеза ослабленного варианта любого РНК вируса. Ослабленные или инактивированные РНК-вирусы, полученные согласно настоящему изобретению, при необходимости вакцинации можно вводить пациенту любым из нескольких способов, в том числе интраназально или внутримышечно.

Description

Настоящая заявка основана на предварительной патентной заявке США № 60/200.679, зарегистрированной 28 апреля 2000 г. и полностью приведенной здесь в качестве ссылки.

Исследования, которые привели к настоящему изобретению, были поддержаны грантами А195357, А129680, А108831, ΑΙ29559 и ΑΙ29680 на исследования в системе здравоохранения, выданными Национальным институтом аллергических и инфекционных заболеваний. В соответствии с этим правительство Соединенных Штатов может иметь определенные права на данное изобретение.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к разработке минимальной плазмидной системы для получения инфекционных РНК-вирусов, предпочтительно вирусов гриппа, из клонированной ДНК. В частности, данная ροϊ I - ροϊ II система с использованием нескольких плазмид способствует получению как рекомбинантных, так и реассортированных вирусов. В предпочтительных вариантах реализации изобретение содержит систему из восьми плазмид ροϊ I - ροϊ II для получения вирусов гриппа. Она может также применяться для получения других РНК-вирусов исключительно из клонированной кДНК.

Жизненный цикл РНК-вирусов

Геномы РНК-вирусов имеют различные конфигурации, в том числе мономолекулярные или сегментированные, однонитевые с (+) или (-) полярностью или двухнитевые. Однако вирусы должны удовлетворять двум важным общим требованиям: (1) геномные РНК должны в достаточной степени копироваться в форму, которую можно эффективно использовать для соединения в частицы вирусов потомства, и (2) должны синтезироваться мРНК, которые можно эффективно транслировать в вирусные белки. В общем случае РНК-вирусы (за исключением ретровирусов) кодируют и/или переносят РНК-зависимую РНК-полимеразу, чтобы катализировать синтез новой геномной РНК (для сборки в вирусные частицы потомства) и мРНК (для трансляции в вирусные белки). Поскольку эукариотическая клетка-хозяин обычно не содержит механизма для репликации РНК-матрицы или для трансляции полипептидов с отрицательной цепи или двухнитевой РНК-матрицы, вирусы, содержащие такие нуклеиновые кислоты в своих геномах, должны переносить белок РНК-полимеру в вирусных частицах. По этой причине депротеинизированные молекулы РНК-вирусов, несущих отрицательные одно- или двухнитевые РНК (в которых отсутствует ассоциированная РНК-полимераза), являются неинфекционными. В отличие от этого, депротеинизированная РНК из генома РНК-вируса, несущего положительную цепь, обычно является инфекционной, поскольку кодируемые вирусные белки могут транслироваться механизмом клетки-хозяина.

РНК вирусного генома должны быть упакованы в вирусные частицы, чтобы обеспечивать передачу вирусов. Некоторые капсиды РНК-вирусов имеют оболочку из липидных мембран от инфекцированных клеток-хозяев, а другие имеют наружную оболочку из вирусного белка без липидного бислоя. Независимо от этих различий между вирусными капсидами способ сборки вирусных частиц потомства и белок-белковые взаимодействия в процессе сборки являются сходными. Вирусные белки в целом классифицируют как структурные и неструктурные. В общем случае неструктурные белки участвуют в репликации генома, регуляции транскрипции и упаковке. Структурные белки обычно выполняют три типа функций, включая (1) связывание с геномной РНК (т. е. белок нуклеокапсида для вируса гриппа А), (2) образование связей между упакованной РНК и наружными белками (т.е. белком матрикса) и (3) формирование наружного слоя вируса (т.е. поверхностные белки, такие как гемагглютинин). Сборка в вирусные частицы обеспечивает эффективный перенос РНК-генома от одной клетки-хозяина к другой в одном или нескольких организмах-хозяевах.

Вирус гриппа

Вирус гриппа Α, ϋΠΐιοιηνχονίπάαο. является РНК-вирусом, несущим антисмысловую цепь РНК с сегментированным геномом. Геномные РНК содержат одну или несколько открытых рамок считывания, по обе стороны которых на 5'- и З'-концах располагаются некодирующие последовательности (Эеккейегдег с1 аГ Сепе 1980, 8:315). Вирусные РНК связаны с вирусным нуклеопротеином (НП) и полимеразными белками (РВ1, РВ2 и РА) в вирионах и в инфицированных клетках с образованием рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов (Нки е! ак, Ргос. ЫаИ. 8с1. И8А 1987, 84:8140).

Генетический состав позволяет этому вирусу развиваться путем реассортации сегментов генов из различных штаммов; такая реассортация создает новые варианты, для которых вновь инфицированный организм не имеет предсуществующей иммунной реакции. Известно, что из 15 подтипов гемагглютинина (НА) и 9 подтипов невраминидазы (ΝΑ) вируса гриппа, циркулирующих у водоплавающих птиц, три подтипа вызывают пандемии у человека (ХУеЬЧег е! ак, МкгоЬюк Вес. 1992, 56:152). Есть указания о том, что свиньи могут служить в качестве промежуточного хозяина (смесительный сосуд) для получения новых штаммов, которые являются патогенными для человека (8с1юЫ5ек е! ак, νίΓοϊο^ν 1985, 147:287). Вспышка эпидемии гриппа А, вызванная подтипом Η5Ν1 в Гонконге в 1997 г., показала, что высокопатогенные вирусы гриппа А также могут передаваться человеку непосредственно от птиц (Шаак е! ак, Ьапсе! 1998, 351:472; 8иагех е! ак, 1. νίίτοϊ. 1998, 72:6678; διώ^ηο е! ак, 8с1епсе 1998, 279:393; δΙιοΠπά^ ν3^ίικ 1999, 17 (δυρρϊ. 1):826-829). Потенциальные возможности вирусов гриппа А производить новые патогенные штаммы из огромного количества штаммов, циркулирующих в природном резервуаре, указывает на то, что для контроля над даным заболеванием необходимо обеспечить мониторинг этих вирусов и разработать усовершенствованные противовирусные терапевтические средства и вакцины. Скорость, с которой развиваются новые штаммы, требует оперативной организации такого монито ринга и привлечения всех возможностей современной технологии для производства достаточного количества вакцины против каждого нового идентифицированного патогенного штамма, чтобы предотвращать эпидемии или пандемии.

Для вируса гриппа А системы с использованием обратной генетики позволили манипулировать вирусным геномом (Ра1еке е! а1., Ргос. Ναΐΐ. Асаб. Зск ИЗА 1996, 93:11354; Ыеитапп апб Катаока; Αάν. Уник К.ек. 1999, 53:265). В отличие от вирусов с положительной цепью (т.е. полиовирусов) антисмысловые вирусные РНК (вРНК) вирусов гриппа А не являются инфекционными. Только молекулы вРНК, заключенные в капсид с четырьмя вирусными комплексными белками полимеразы (РВ1, РВ2, РА, ΝΡ), способны инициировать цикл вирусной репликации и транскрипции. После того как рибонуклеопротеины (РНП) проникают в ядро клетки, эти ассоциированные белки начинают транскрибировать (-) вРНК в мРНК и смысловые комплементарные РНК - (+), кРНК. Эти кРНК служат в качестве матриц для синтеза вРНК. Первой системой с использованием обратной генетики, которая была разработана для вируса гриппа А, был способ РНК-трансфекции (Ьцу1рек е! а1., Се11 1989, 59:1107; Епат1 е! а1., Ргос. №11. Асаб. Зс1. ИЗА 1990, 87:3802). После транскрипции ш νίίτο вирусоподобной вРНК РНК-полимеразой фага Т7 и восстановления молекул вирусного рибонуклеопротеина (вРНП) генетически измененные сегменты РНП путем трансфекции вводили в эукариотические клетки. Заражение вирусом-помощником приводило к получению вирусов, процессирующих ген, полученный из клонированной кДНК. Однако присутствие вируса-помощника в способах РНК и ДНК трансфекции жестко ограничивает практическую ценность этих методик, поскольку для устранения вируса-помощника требуется эффективная система селекции.

Разработка способа синтеза молекул вРНК ш νίνο под контролем РНК-полимеразы I (ро1 I) обеспечила внутриклеточное получение комплексов РНК (№итапп апб НоЬот, У1го1оду 1994, 202:477). В этой системе вирусоподобную кДНК встраивали между последовательностями промотора и терминатора ро1 I (2оЬе1 е! а1., №с1. Ас1бк Кек. 1993, 21:3607). В отличие от транскриптов мРНК, синтезированных РНКполимеразой II (ро1 II), у РНК, образованных ро1 I, отсутствовали как 5'-кэп, так и 3'-поли (А) хвост. Молекулы функциональных вРНП можно было получать путем инфицирования вирусом-помощником или с помощью контрасфекции экспрессионными плазмидами, кодирующими белки РВ1, РВ2, РА или № (№итапп апб НоЬот, кирга; Ейск е! а1., КNΑ, 1996, 2:1046; Р1ек11ка е! а1., 1. Уйго1, 1996, 70:4188; 2Ьои е! а1., У1го1оду 1998, 246:83).

Последние исследования показали, что плазмидная экспрессия всех восьми вРНК из промотора ро1 I и коэкспрессия белков полимеразного комплекса приводят к образованию инфекционного вируса гриппа А (Уеитапп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. Зск ИЗА 1999, 96:9345; Еобог е! а1., 1. Уйто1. 1999, 73:9679). Поскольку образование вируса гриппа А, вызываемое только плазмидами, не требует инфекции вирусом-помощником, не возникает необходимости в какой-либо системе селекции, поэтому всеми генными сегментами можно манипулировать без технических ограничений. В этой системе, разработанной №итапп е! а1. (см. выше), восемь кДНК встраивали между последовательностью промотора ро1 I человека (407 Ьр) и последовательностью терминатора мыши (174 Ьр). Экспрессию четырех РНП-комплексных белков проводили с использованием промотора цитомегаловируса человека. Трансфекция 12 плазмид в 10⁶ 293Т клеток привела к получению вируса в количестве более чем 10³ р£ц; этот выход можно увеличить до 5х10⁷ р£ц после трансфекции 17 плазмид. Еобог е! а1. (см. выше) разработали систему, в которой восемь кДНК встраивали между последовательностью промотора ро1 I человека (250 Ьр) и геномной рибозимной последовательностью вируса гепатита дельта, чтобы обеспечить точный 3'-конец вРНК. Для экспрессии генов полимеразного комплекса использовали плазмиды, содержащие основной поздний промотор аденовируса типа 2. После трансфекции 12 экспрессионных плазмид в клетки Уего из 10⁶ трансфецированных клеток получили только одну или две инфекционные вирусные частицы.

Однако система, не содержащая вирусов-помощников, описанная №итапп е! а1. (см. выше) и содержащая промоторы ро1 I и ро1 II с кДНК вируса гриппа на различных плазмидах, требует конструкции и котрансфекции по меньшей мере 12 плазмид для получения вируса и 17 плазмид для эффективного получения вируса. Трансфекция клеток таким большим количеством плазмид может ограничивать применение этой системы только клеточными линиями, которые имеют высокую эффективность трансфекции. Для того чтобы получать вирус из различных типов клеток, можно увеличить выход вируса за счет усиления репликации вируса гриппа А в этих клетках и увеличения набора клеток, пригодных для получения вакцин (Сомогкоуа е! а1., 1. У1го1. 1996, 70:5519).

Таким образом, существует потребность в более эффективном способе получения рекомбинантных вирусов гриппа. Кроме того, существует дополнительная потребность в эффективном получении реассортированных вирусов для получения вакцин против новых идентифицируемых вирусных штаммов. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих и других потребностей в данной области путем создания систем, в которых синтез как отрицательных сегментов геномных вирусных РНК (вРНК), так и вирусных мРНК, происходит из одной матрицы, что позволяет минимизировать количество плазмид, необходимых для получения вирусов, и обеспечивает эффективную и прогнозируемую реассортацию.

Вирусы Кеомтбае

Вирусы семейства Кеомтбае. в том числе вирусы рода Ко1а\згик. содержат двухнитевой сегментированный геном РНК. Ротавирус человека является самым распространенным вирусным агентом тяже лой детской диареи в Соединенных Штатах, вызывающей около 50000 случаев госпитализации и от 20 до 50 смертей в год, вызывая примерные ежегодные затраты более 1 миллиарда долларов. В развивающихся странах считается, что ротавирус ответственен за одну треть всех случаев госпитализации, связанных с диареей, и вызывает примерно 850000 смертей в год.

Существует двойная система обозначения серотипов ротавируса вследствие того, что реакция нейтрализации вызывается двумя вирусными белками (УР), УР7 и УР4. Серотипы УР7 обозначают как Стипы, а серотипы, полученные из У4, описывают как Р-типы. В настоящее время у человека обнаружены по меньшей мере 10 серотипов С и 7 серотипов Р. Поскольку гены УР4 и УР7 сегрегируют раздельно, новые ротавирусы образуются путем реассортации. В Соединенных Штатах наиболее часто встречаются серотипы от Р1 до Р4 и от С1 до С4; о других комбинациях поступали сообщения из таких стран, как Индия и Египет. Первая лицензированная вакцина против ротавируса человека была получена для серотип-специфичной защиты от четырех распространенных серотипов С1-С4. Однако эту вакцину изъяли из-за установленной связи между вакцинацией и увеличением степени инвагинации у вакцинированных реципиентов. Таким образом, существует потребность в получении антиротовирусной вакцины, представляющей все подтипы С и Р и не вызывающей нежелательных побочных эффектов. Настоящее изобретение обеспечивает векторы (предпочтительно плазмиды), способы и клетки-хозяева, которые можно использовать для получения ротавирусов исключительно из клонированной кДНК.

Определили 13 основных генных продуктов. Чтобы свести к минимуму перепутывания и обеспечить сравнение с белками, имеющими аналогичные функции других видов Веоушбае, использовали следующую номенклатуру: в соответствии с их миграцией при анализе 808-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), начиная с самого крупного белка, структурным белкам давали префикс УР, а неструктурным белкам - префикс Ы8Р и указывали в скобках функцию каждого белка. Так, например, аббревиатура УР1(Ро1) показывает, что самым крупным белком в частицах вируса является РНК-зависимая РНК-полимераза. Семь структурных белков соединяются в вирусные частицы, которые содержат три слоя структуры: (1) внутреннее вирусное ядро, содержащее бкРНК-геном, включает три белка, ассоциированных с ним, два из которых (УР1(Ро1) и УРЗ(Сар)) асоциированы с геномом непосредственно, в то время как третий (УР2(Т2)) образует оболочку ядра, (2) средняя белковая оболочка вириона, образованная 780 молекулами УР6(Т13), расположенными в 260 триметрических блоках, и (3) УР4 и УР7 образуют наружную оболочку. Структура белка выступов УР4 содержит сайт расщепления трипсином, который является важным для разрезания на УР5 и УР8, поскольку такое расщепление повышает инфекционность. Предполагается, что две формы УР7, УР7(1) и УР7(2), полученные из различных рамок считывания, включаются в вирионы.

Гораздо меньше известно о функциях шести неструктурных белков. Предполагают, что аналогично другим РНК-вирусам неструктурные белки играют важную роль в репликации вирусов, транскрипции, трансляции вирусных РНК и упаковке. Действительно, на основании анализов чувствительных к воздействию температуры в сегменте 8 вирусов можно предположить, что И8Р2(У1Р) играет непосредственную роль в репликации вирусов. Считают, что Ы8Р3 связывается с консервативными последовательностями на З'-конце вирусных мРНК и с клеточным кэп-связывающимся белком е1Е4С и таким образом дополнительно регулирует трансляцию мРНК-ротавируса, которые содержит 5'-кэп структуры, но не содержит хвостов З'-поли А. Ы8Р1 является несущественным, однако, он, вероятно, играет активную роль в репликации ротавируса в клеточной культуре. Предполагают, что Ы8Р4 участвует в вирусном морфогенезе. Два неструктурных белка, Ы8Р5 и Ы8Р6, кодируются двумя различными рамками считывания из сегмента 11, однако, их функция в жизненном цикле вирусов неизвестна.

Цикл репликации завершается в течение 10-12 ч при 37°С. Современные данные позволяют предположить, что вирусы могут проникать в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, однако, для попадания в клетки может существовать и альтернативный механизм. После попадания в клетку-хозяина наружная вирусная оболочка высвобождает транскрипционно активную частицу с двойной оболочкой в цитоплазму инфицированной клетки. Ферменты, связанные с вирионами, вырабатывают 5'-кэппированные неполиаденилированные мРНК, которые представляют собой полноразмерные транскрипты с отрицательной цепи каждого сегмента вирионного генома. Вирусные мРНК, полученные из каждого сегмента, выполняют две функции: во-первых, они транслируются для получения вирусных белков, кодируемых сегментом, и, во-вторых, вирусные мРНК также являются матрицами для репликации генома. Сборка сегмента генома происходит в результате отбора различных вирусных мРНК, которые требуются для получения предварительного ядра В1. За сборкой из 11 мРНК следует синтез отрицательной цепи, который происходит в ядре В1 и УР6(Т13)-В1, присутствующих в вироплазмах, которые находятся в цитоплазме инфицированной клетки. Следующие стадии морфогенеза вирионов потомства являются уникальными для ротавирусов и включают отпочковывание двуслойных частиц в эндоплазматический ретикулум в процессе, который происходит с участием Ы8Р4. Это приводит к тому, что частицы получают временную оболочку, которая разрушается на заключительных стадиях развития, когда добавляется наружная оболочка вирионов УР4 и УР7.

Сегментированный геном, высокоорганизованная структура генома и комплексный цикл репликации представляют собой основные трудности для разработки обратной генетической системы, предна значенной для получения ротавирусов. Однако настоящее изобретение можно использовать для простого и удобного способа получения ротавируса.

Противогриппозные вакцины

Противогриппозные вакцины, лицензированные в настоящее время органами здравоохранения для применения в Соединенных Штатах и Европе, являются противогриппозными вакцинами с применением инактивированных вирусов. Вирусы, представляющие собой эпидемиологически важные штаммы А и В вируса гриппа, выращивают в куриных яйцах с зародышем, а затем очищают вирусные частицы и инактивируют их с помощью химических средств. Всемирная организация здравоохранения ежегодно выбирает подтипы, циркуляция которых является наиболее вероятной: в настоящее время это два штамма вируса гриппа А (Η1Ν1) и (Η3Ν2), а также штамм В.

Для получения безопасной и эффективной вакцины важно, чтобы выбранные для вакцины штаммы имели близкое родство с циркулирующими штаммами, чтобы антитела могли нейтрализовать антигенно сходный вирус у вакцинированного населения. Однако не все вирусы, имеющие близкое родство, пригодны для получения вакцины, поскольку они плохо воспроизводятся в куриных яйцах. Поэтому представляется желательным получение реассортированного вируса с высокой степенью роста, чтобы обеспечить сочетание высокого выхода вируса лабораторного штамма (А/РК/8/34) (Η1Ν1) с антигенными характеристиками ожидаемого патогенного штамма. К сожалению, совместное инфицирование двумя вирусами гриппа, содержащими восемь сегментов, теоретически приводит к образованию 2⁸=256 различных вариантов вирусов потомства. Для получения вируса с высокой степенью роста и требуемыми гликопротеиновыми антигенами необходим способ отбора, обеспечивающий удаление соответствующих генных сегментов из родительского лабораторного штамма с высокой степенью роста. Процедура отбора для получения вируса с соответствующими гликопротеинами и проверкой совокупности генов является обременительной и трудоемкой. Хотя система ΚΡΝ-трансфекции (Ъи1)е5б с1 а1., Се11 1989, 59:1107) снижает возможное количество вирусов потомства, хороший метод отбора все-таки необходим.

Вакцины живого ослабленного вируса гриппа, вводимые интраназально, вызывают местный, мукозальный, клеточно-опосредованный и гуморальный иммунитет. Адаптированные к холоду (са) реассортированные (СК) вирусы, содержащие шесть внутренних генов живого ослабленного гриппа А/Апп АгЬог/6/60 (Η2Ν2) или В/Апп АгЬог/1/66, а также гемагглютинин (НА) и невраминидазу (ИА) современных вирусов гриппа дикого типа, оказываются надежно ослабленными. Такая вакцина эффективна для детей и молодежи. Однако она может оказаться слишком ослабленной, чтобы стимулировать идеальную иммунную реакцию у пожилых людей, которые составляют основную группу из 20-40 тысяч индивидуумов, ежегодно умирающих в США от заражения гриппом. Хотя последовательности внутренних генов са-вирусов описаны, вклад каждого сегмента в ослабленный фенотип определен недостаточно. Такую информацию можно получить только путем введения в вирус последовательностей специфических, определенных ослабляющих мутаций. Хотя способ ΚΝΡ-трансфекции позволяет вводить мутацию в геном вируса гриппа, потребность в системе отбора и технические трудности восстановления вирусных ΚΝΡ в искусственных условиях ограничивают применение этого способа для манипулирования внутренними генами.

Таким образом, существует потребность в разработке рекомбинантных противогриппозных вакцин, которые не используют вируса-помощника, хорошо вырастают в культуре (куриные яйца или клеточная культура), надежно обеспечивают получение реассортированных вирусов, которые можно размножить для разработки новых вакцин, а также обеспечивают возможность систематического мутирования для получения штаммов живых ослабленных вирусов для интраназальной вакцинации. Настоящее изобретение решает эти и другие известные в данной области задачи.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает получение экспрессионной плазмиды, содержащей промотор РНК-полимеразы I (ро1 I) и последовательности терминатора ро1 I, которые встроены между промотором РНК-полимеразы II (ро1 II) и сигналом полиаденилирования. Экспрессионная плазмида называется в данном описании ро1 ^ро1 II системой, экспрессионной системой с двойным промотором или экспрессионной плазмидой с двойным промотором. Такая плазмида оптимально содержит сегмент вирусного гена РНК-вируса, встроеннный между промотором ро1 I и сигналом терминации. РНК-вирус предпочтительно является вирусом гриппа (например, вирусом гриппа А или гриппа В).

Изобретение включает две системы на основе плазмидного вектора для получения инфекционных РНК-вирусов из клонированных генов или кДНК. В одной системе (двунаправленная система) ген или кДНК располагают между промотором ро1 II в обратном направлении и промотором ро1 I в прямом направлении. Транскрипция гена или кДНК с промотора ро1 II образует кэппированную смысловую вирусную мРНК, а транскрипция с промотора ро1 I образует антисмысловую некэппированную вРНК. В другой системе (однонаправленная система) ген или кДНК располагают в прямом направлении от промоторов ро1 I и ро1 II. С ро1 II промотора образуется кэппированная смысловая вирусная мРНК, а с промотора ро1 I образуется некэппированная смысловая вирусная кРНК.

Система согласно изобретению, основанная на минимальном количестве плазмид, позволяет получать инфекционные РНК-вирусы из клонированной вирусной кДНК. Такая система содержит набор плазмид, при этом каждая плазмида содержит один автономный вирусный геномный сегмент РНК вируса. В каждой плазмиде вирусная кДНК, соответствующая автономному вирусному геномному сегменту, встроена между последовательностями промотора и терминатора РНК-полимеразы I (ροϊ I), тем самым обеспечивая экспрессию вРНК, которые, в свою очередь, встроены между промотором РНКполимеразы II (ροϊ II) и сигналом полиаденилирования, что приводит к экспрессии вирусной мРНК. Таким образом, данная система использует технологию двунаправленных плазмид и обеспечивает эффективную реассортацию для получения РНК-вирусов, соответствующих текущим циркулирующим патогенным штаммам, например, для генов гриппа ΝΑ и НА, в фоновом штамме, хорошо адаптированном для роста в культуре клеток, и/или из ослабленного штамма. Указанным вирусом предпочтительно является вирус гриппа А или вирус гриппа В.

Изобретение обеспечивает клетки-хозяина, содержащие систему на основе плазмидного вектора, для получения инфекционных вирусов и способы получения вирионов РНК-вируса, включающие выращивание клеток-хозяев при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК.

Система на основе плазмидного вектора, клетки-хозяина и способ получения вирионов особенно пригодны для изготовления вакцины, специфичной по РНК-вирусам. Такие способы включают очистку вирионов. Очищенные вирионы можно инактивировать или ослабить. Вакцины согласно изобретению можно использовать для вакцинации против инфекции РНК-вирусов. Так, например, защитную дозу вакцины, содержащей инактивированные вирионы, можно вводить путем внутримышечной инъекции. Альтернативным способом защитную дозу вакцины, содержащей ослабленные вирионы, можно вводить субъекту интраназально.

Кроме того, изобретение включает вирионы реассортирующих вирусов и составы вакцин, содержащие такие вирионы, в том числе инактивированные и ослабленные вирионы.

В другом полезном варианте реализации изобретение обеспечивает способ получения ослабленного РНК-вируса. Этот способ включает мутацию одного или нескольких вирусных генов в системе, основанной на плазмидном векторе, с последующим определением, являются ли инфекционные РНК-вирусы, созданные системой, ослабленными. Такие ослабленные вирусы можно использовать для разработки интраназальных вакцин, включая интраназальные вакцины с повышенной эффективностью, вызывающие защитный иммунитет у престарелых и иных лиц, на которые не действуют известные ослабленные вакцины.

Описание прилагаемых фигур

Фиг. 1. Схематическое представление транскрипционной системы ροϊ ^ροϊ II, предназначенной для синтеза вРНК и мРНК. кДНК каждого из восьми сегментов вируса гриппа инсертирована между промотором ροϊ I (ρ^) и терминатором (1|) ροϊ I. По обеим сторонам от этой единицы транскрипции ροϊ I находятся промотор фнСМУ) ροϊ II цитотмегаловируса человека и сигнал (а_пВОН) полиаденилирования гена, кодирующего гормон роста быка. После трансфекции восьми экспрессионных плазмид синтезировалось два типа молекул. С промотора человека ροϊ I клеточной ροϊ I синтезировалась антисмысловая вРНК. Синтезированная вРНК содержит некодирующую область (ΝΟΚ,) на 5'- и 3'-концах. Транскрипция посредством ροϊ II приводит к образованию мРНК со структурами 5' кэпа и 3' поли (А) хвостами; эти мРНК транслируются в вирусные белки. ΑΤΟ кодон вирусной кДНК является первым ΑΤΟ в прямом направлении от сайта инициации транскрипции ροϊ II.

Фиг. 2. Система из восьми плазмид ροϊ ^ροϊ II для получения вируса гриппа А. Восемь экспрессионных плазмид, содержащих восемь вирусных кДНК, инсертированных между промотором ροϊ I человека и промотором ροϊ II (см. фиг. 1), трансфецировали в эукариотические клетки. Поскольку каждая плазмида содержит два различных промотора, клеточные ροϊ I и ροϊ II транскрибируют плазмидную матрицу, предположительно в различных ядерных компартментах, что приводит к синтезу вирусных мРНК и вРНК. После окончания синтеза вирусных белков полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, ΡΑ, ΝΡ) начинается цикл вирусной репликации. В конечном счете, соединение всех вирусных молекул, прямо (транскрипция ροϊ II) или косвенно (транскрипция ροϊ I и вирусная репликация) полученных в результате действия клеточных механизмов транскрипции и трансляции, приводит к взаимодействию всех синтезированных молекул (вРНП и структурных белков НА, ΝΑ, М1, М2, Ν82/ΝΕΡ) с образованием инфекционного вируса гриппа А.

Фиг. 3А и 3В. Схематическое изображение способа, разработанного для конструкции и трансфекции восьми экспрессионных плазмид с целью получения вируса Л/ТеаРНКЛУЗР/к? (Η6Ν1).

A. Вирусную РНК экстрагировали из вирусных частиц. КТ-РСК провели с праймерами, содержащими сегмент-специфические нуклеотиды и последовательности для рестрикционных эндонуклеаз типа II8-В8тВI или ВзаТ Восемь вирусных РСК фрагментов обработали В8тВI или Вза! и встроили в ρΗ\ν2000 (линеаризованную ВвтВ^. Такая инсерция привела к образованию восьми экспрессионных конструктов, в которых вирусные кДНК точно слиты с промотором и терминатором ροϊ I (в черных прямоугольниках показаны вирусные концевые последовательности ΑΟС-ΑСΤ для сегмента РВ2).

B. Восемь экспрессионных плазмид с промотором ροϊ I и промотором ροϊ II содержат по одной копии каждого из восьми сегментов вирусных кДНК. По обеим сторонам от открытых рамок считывания для 10 вирусных белков находятся сегмент-специфические некодирующие области (серые прямоугольники). Поскольку используемый промотор ροϊ I человека проявляет высокую активность только в клеточных линиях человека или родственных видов, клетки 293Т человека культивировали совместно со стандартной линией клеток, используемой для гриппа А (клетки МОСК). Вирусы, полученные в клетках 293Т после трансфекции, могут затем инфицировать клетки МОСК и реплицироваться.

Фиг. 4А и 4В. Идентификация полученных посредством КТ-РСК. вирусов.

A. РНК экстрагировали из вирусных частиц после двух пассирований супернатанта трансфецированных клеток (см. табл. 1 и 2) на клетках МОСК. КТ-РСК провели с праймерами, специфичными для сегмента гена N3, и с вРНК, экстрагированной из вирионов. Используемые праймеры N8 не были специфичными по штамму и поэтому обеспечивали амплификацию любого сегмента N8 гриппа А. Продукты реакции подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле. Для того чтобы обеспечить получение амплифицированных фрагментов ДНК с вРНК, а не с плазмидной ДНК, переносимой из трансфецированных клеток, одну реакцию проводили без добавления обратной транскриптазы (КТ) (-). Дорожки 1 и 2, рекомбинантный А/Теа1/НК/^/312/97 (табл. 1); дорожки 3 и 4, М-реассортация (табл. 2); дорожки 5 и 6, ^-реассортация (табл. 2); дорожки 7 и 8, рекомбинантный вирус Λ/\ν8Ν/33 (табл. 1); дорожки 9 и 10, четырехкратная реассортация (табл. 2).

B. №о1 расщепление фрагментов, показанных на фиг. А. Идентичность фрагментов N8 также проверяли с помощью анализа последовательности амплифированного продукта (не показано).

Фиг. 5. Однонаправленная транскрипционная система РНК ροϊ Ι-ρο1 II. В однонаправленной транскрипционной системе РНК ροϊ Ι-ροϊ II вирусную кДНК вводят с положительной ориентацией между промотором (р_1Ь) ροϊ I человека и последовательностью терминатора (¾). По обеим сторонам от всего этого транскрипционного блока ροϊ I находятся промотор ροϊ II фпСМУ: предранний промотор цитомегаловируса человека) и сайт полиаденилирования гена, кодирующего гормон роста быка (апВОН). После трансфекции ожидается синтез двух типов транскриптов РНК. Смысловая кРНК с трифосфатной группой на ее 5'-конце, синтезированная ροϊ I, и смысловая мРНК, синтезированная ροϊ II, со структурой 5'кэп, и поли (А) хвостом на ее 3'-конце. Для эффективной трансляции мРНК требуются оба элемента.

Фиг. 6. Вектор клонирования ρΗν 11 с промоторами ροϊ I и ροϊ II, расположенными последовательно. Плазмида содержит 225 όρ промотора РНК ροϊ I человека (ρ^) и 33 όρ терминатора мыши (¾). С обеих сторон последовательностей промотора и терминатора ροϊ I находятся промотор фнСМУ) РНК-полимеразы II мегаловируса человека и сигнал полиаденилирования гена, кодирующего гормон роста быка (а_пВОН). Для вставки вирусной кДНК между промотором и терминатором ροϊ I ввели два рестрикционных сайта ВдпВ! (показаны подчеркиванием). В результате рестрикции вектора ВзтВ! получили векторный фрагмент с липкими, но некомплементарными выступающими концами. Конструкция этого вектора позволяет выполнять точное слияние вирусной кДНК в положительной ориентации относительно промотора и терминатора ροϊ I. Для размножения в Е. сой плазмида имеет точку инициации репликации (οπ). а для отбора в среде, содержащей ампициллин, плазмида содержит ген бета-лактамазы (Ыа).

Фиг. 7А и 7В. Система с двойным промотором для получения инфекционных РНК-вирусов. Поскольку РНК-вирусы функционируют как клеточные паразиты, им приходится оптимизировать стратегию использования клеток-хозяев для экспрессии своей генетической информации. Все РНК-вирусы должны синтезировать мРНК, которые способны транслироваться в белки. В общем случае синтезированные белки требуются для репликации, транскрипции и получения новых частиц вирусного потомства. Для эффективной репликации геномных РНК необходимо образование РНК-транскриптов с точно определенными 5' и 3' концами.

Данная система содержит наружный и внутренний транскрипционные блоки. Внутренний транскрипционный блок содержит промотор (р(+РНК) или р(-РНК)), предпочтительно промотор роϊ I. кДНК РНКвирусов состоят из одной или нескольких открытых рамок считывания (ОКЕ), с обеих сторон от которых находятся некодирующие области ЩСК). Последовательности между вирусной кДНК и промотором предпочтительно отсутствуют. Отсутствие таких промежуточных последовательностей очень важно, поскольку концы 5' и 3' геномной вРНК обычно содержат последовательности, распознаваемые вирусными белками, необходимыми для транскрипции и репликации; дополнительные невирусные последовательности обычно мешают эффективному распознаванию и репликации вРНК вирусными белками. Отсутствие промежуточных последовательностей позволяет вирусным полимеразным белкам эффективно использовать транскрибируемую (-) цепь РНК (А) или (+) цепь РНК (В). Наружный транскрипционный блок имеет промотор (р(мРНК)), предпочтительно промотор роϊ II, который управляет транскрипцией мРНК с кДНК; мРНК включает 5' последовательности (например, метил О-кэпы) и 3' последовательности (например, поли А хвосты), которые требуются для инициации трансляции и получения вирусных белков. Поскольку способ трансляции допускает наличие дополнительных последовательностей между промотором наружного транскрипционного блока и вирусной кДНК, присутствие промежуточных последовательностей из внутреннего транскрипционного блока не вносит существенного ухудшения трансляции мРНК.

Эту систему можно модифицировать и усовершенствовать для РНК-вирусов, отличных от вируса гриппа, путем использования различных промоторов во внутреннем блоке транскрипции (например, роϊ II, ροϊ III, Т3, 8Р6, Т7 или какой-либо другой промотор для ДНК-зависимой РНК-полимеразы) и терминаторов или рибозимов для внутриклеточного синтеза вирусной РНК с точно определенными 5' и 3' концами (см. ниже). Наттегйеаб рибозимы или рибозимы вируса гепатита дельта (НОУ) можно использо вать для получения вирусной РНК с точно определенными концами (8сйпе11 е! а1., ЕМВО 1. 1994, 13:4195; ИезсЬка е! а1., 1. У1то1. 1996, 70:4188; Нето1б, 1. е! а1., 1. Уйо1 2000, 74(14):6394-400).

Наружный транскрипционный блок может содержать промотор ро1 I или III, промотор РНК-полимеразы фага Т7, промотор РНК-полимеразы фага Т3, промотор РНК-полимеразы 8Р6 или какой-либо иной промотор для ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Если промотор в наружном транскрипционном блоке управляет синтезом транскрипта, у которого отсутствует метил С-кэп, внутренний сайт посадки рибосом (ГКЕ8) можно поместить на 5' конце кодирующей последовательности кДНК, чтобы обеспечить инициацию трансляции (см. ниже).

Следует отметить, что вектор рН\У2000 содержит промотор Т7 между промотором СМУ и сайтом терминации. Транскрипты ро1 II синтезируются в ядре, при этом транскрипты Т7 синтезируются в цитоплазме клеток, экспрессирующих РНК-полимеразу Т7. Поэтому транскрипты, происходящие из нескольких промоторов наружного транскрипционного блока, можно получить в виде различных мРНК. Таким образом, экспрессионные плазмиды, полученные из рН\У2000. позволяют быстро оценить, является ли промотор ро1 II, или Т7, или сочетание их обоих оптимальным для синтеза мРНК-вирусов с положительной цепью, которые содержат внутренний сайт посадки рибосом (ГКЕ8).

Фиг. 8. Система с двойным промотором для получения РНК-вирусов с (+) цепью. Настоящее изобретение можно использовать также для получения вирусов, содержащих мономолекулярный геном из положительной цепи, в частности вируса гепатита С. В этом варианте реализации кДНК, содержащую геном вируса гепатита С (примерно 9500 нуклеотидов), встраивают в конструкт, который позволяет производить эффективную внутриклеточную транскрипцию кДНК в мРНК и полноразмерную отрицательную РНК (двунаправленная система) или мРНК и полноразмерную положительную РНК (однонаправленная система). кДНК состоит из одной открытой рамки считывания (ОВЕ), с обеих сторон от которой находятся некодирующие области (ΝΟΚ.). На фигуре показана экспрессионная плазмида, содержащая двунаправленную систему. Полноразмерную кДНК встраивают между последовательностями промотора (рЭ и терминатора (Е) ро1 I, что после трансфекции обеспечивает синтез полноразмерной (-) цепи РНК.

Внутренний транскрипционный блок окружен наружным транскрипционным блоком, который содержит промотор (р(мРНК)), управляющий синтезом мРНК. Этим промотором предпочтительно является промотор ро1 II. Однако, если синтезированная РНК имеет внутренний сайт посадки рибосом (ГВЕЗ), промотор ро1 II можно заменить промотором ро1 I, ро1 III, 8Р6, Т7 или Т3 (применение промоторов Т3 или Т7 требует, чтобы белки полимераз Т3 или Т7 были экспрессированы либо при котрансфекции плазмиды, кодирующей полимеразы, либо применением стабильной клеточной линии, экспрессирующей полимеразы). На 3' конце наружного транскрипционного блока используют сигнал поли А или встроенную последовательность поли А, чтобы обеспечить поли А хвост для синтезированной мРНК.

Полученная мРНК транслируется в большой полипротеин-предшественник, который расщепляется в процессе трансляции и после нее, образуя отдельные структурные и неструктурные вирусные белки.

Неструктурные белки Ν85;·ι и N856, которые являются РНК-зависимыми РНК-полимеразами, используют в качестве матрицы (-) РНК, синтезируемую внутренним транскрипционным блоком, чтобы инициировать цикл вирусной репликации/транскрипции. Таким образом, получается (+) РНК/мРНК, которая используется для трансляции в белок. В конечном счете образуются инфекционные вирусы, которые содержат (+) РНК вместе с вирусными структурными белками.

Фиг. 9. Система ро1 ^ро1 II для получения вируса III парагриппа человека. Настоящее изобретение можно использовать для получения вируса III парагриппа, который содержит мономолекулярный геном из отрицательной цепи, РНК. Вирусную кДНК можно встраивать в систему ро1 ^ро1 II в смысловой или антисмысловой ориентации. На фигуре представлена однонаправленная система. Промотор ро1 I управляет синтезом кРНК, а промотор ро1 II управляет синтезом мРНК. В этом варианте реализации промотор ро1 II создает полицистронную мРНК, с которой первая открытая рамка считывания эффективно транслируется в белок нуклеокапсида (ΝΡ). Этот белок требуется для репликации. Плазмиды, кодирующие Ьи Р-белки, также важные для репликации и транскрипции (но которые неэффективно транслируются с полицистронной мРНК), приготавливают и совместно трансфецируют на отдельных экспрессионных плазмидах. По сравнению с обратной генетической системой, разработанной ЭигЬт, А.Р. е! а1., У1го1оду 1997, 235 (2):323-332, система ро1 ^ро1 II имеет несколько преимуществ. За счет экспрессии ΝΡ с той же самой кДНК эта система с минимальным количеством плазмид требует конструкции и трансфекции всего трех вместо четырех плазмид для получения вируса III парагриппа только из клонированной кДНК. В отличие от обратных генетических систем, основанных на ίη угуо транскрипции с промотора Т7, система ро1 ^ро1 II полностью управляется эукариотическими ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые находятся в каждой клетке. Кроме того, инфицирование вирусом коровьей оспы, который управляет экспрессией РНК-полимеразы Т7, требует применения клеток, которые допускают воздействие вируса коровьей оспы (клетки НеЬа или их производные, в частности клетки Нер-2), но не являются оптимальными для роста вируса парагриппа человека, что ограничивает полезность такого подхода к получению инфекционных вирусов. Тяжелые цитопатические воздействия вируса коровьей оспы и правила безопасности, которые необходимо соблюдать при применении инфицирующих агентов, являются нежелательными особенностями этой системы. Применение системы ро1 ^ро1 II устраняет требование инфекции вирусом и позволяет использовать клетки ЬЬС-МК2 для трансфекции и выращивания вируса III парагриппа человека, что обеспечивает технологию получения ослабленных вирусов более простым и безопасным способом.

Фиг. 10. Система на основе плазмидного вектора для получения ротавируса из клонированной кДНК. Эту систему можно использовать для получения вирусов с геномами сегментированных двухнитевых РНК (например, ротавируса). Ее можно использовать, например, для вирусов, которые являются членами семейства Кеоушбае (10, 11, 12 сегментов бкРНК) или Ыгпаутбае (2 сегмента кРНК). В настоящее время для вирусов семейства Кеоушбае нет обратных генетических систем. Эта фигура показывает, как ротовирусы, которые содержат 11 сегментов бкРНК, можно получить с помощью настоящего изобретения, однако, аналогичные системы можно использовать для членов семейств ОгЫупик (10 сегментов бсРНК) или Ог1йогеоу1гикек (12 сегментов бкРНК).

Следующее обсуждение иллюстрирует способ получения ротавируса А/8А11 только из клонированной кДНК. Определены все 11 сегментов генома ротавируса обезьяны с двухнитевой РНК. Длина бкРНК в геноме составляет от 3302 Ьр до 663 Ьр, а размер всего генома составляет 18550 Ьр. Сегменты генома пронумерованы от 1 до 11 в порядке возрастания подвижности, определенной РАСЕ анализом (электрофорез в полиакриламидном геле). Сегменты являются полностью спаренными по основаниям, и положительная цепь содержит 5' концевую кэп-структуру (т7ОрррОтОРу), но не содержит сигнала полиаденилирования возле ее 3' конца. Все геномные сегменты обладают короткими консервативными 5' и 3' концевыми элементами с 10 нуклеотидным консенсусным элементом на 5' конце и 8 нуклеотидным консенсусным элементом на 3' конце. Непосредственно внутрь от этих концевых областей в каждом гене имеется вторая консервативная область по меньшей мере из 30-40 нуклеотидов, которые являются сегмент-специфическими. 5'-нетранслируемые области (ΝΤΚ) имеют различную длину, однако, все они менее 50 нуклеотидов, и во всех сегментах за ΝΤΚ следует по меньшей мере одна длинная открытая рамка считывания после первого АИО. Сегменты 9 и 11 кодируют два белка. 3' ΝΤΚ имеют длину в пределах от 17 нуклеотидов (сегмент 1) до 182 нуклеотидов (сегмент 10).

кДНК ротавируса клонируют в систему с двойным промотором, предпочтительно в систему ро1 Iро1 II. После трансфекции полученных плазмид в соответствующую клетку-хозяина образуются вирусные РНК и белки, что приводит к образованию инфекционного ротавируса. Для получения ротавируса предпочтительно используют однонаправленную транскрипционную систему. Данный поход приводит к внутриклеточному синтезу 11 молекул (+) РНК ротовирусного генома, которые содержат трифосфаты на 5' концах. Экспрессия вирусоподобной мРНК приводит к экспрессии вирусных белков. Вирусный белок УР3 (кэп), который обладает гуанилтрансферазной и метилтрансферазной активностью, катализирует добавление 5'-кэп структур ко всем 11 ротавирусным (+) РНК (Сйеп Ό., е! а1., У1го1оду 1999, 265:120130). Действительно, ранее было показано, что очищенный УР4 (кэп) вируса Ь1ие!одие (ВТУ), аналог УР3 (кэп) ротавируса, может добавлять кэп-структуры в вирусоподобные (+) РНК ίη уйго (Катабеу! Ν., е! а1. Ргос №11. Асаб. 8сг И8А 1998, 95(23): 13537-42). Ожидается, что ίη угуо транскрипция кДНК и внутриклеточная экспрессия УР3 (кэп) белка приводят к образованию кэппированных РНК для всех 11 ротавирусных геномных сегментов. Эти мРНК транслируются в вирусные белки или упаковываются в предварительное ядро КТ После образования частиц УР6(13)-К1 положительная смысловая мРНК используется в качестве матрицы для синтеза (-) РНК. В конечном счете, добавление УР4 и УР7 в процессе морфогенеза приводит к образованию инфекционных вирионов потомства.

Поскольку эффективная инициация репликации и морфогенеза может зависеть от оптимальной концентрации каждого вирусного белка, может оказаться предпочтительным получение отдельных плазмид для синтеза РНК и экспрессии белка. Однако уровень экспрессии белка можно оптимизировать за счет изменения количества плазмид в клетке-хозяине или за счет использования различных промоторов для синтеза мРНК, поэтому для большинства генов применение двух плазмид для одного сегмента, вероятно, не будет необходимым. Поскольку (+) РНК синтезируется с (-) РНК, внутриклеточная экспрессия (-) РНК и белка может приводить к созданию единиц, пригодных для репликации, которые образуют вирусную мРНК. Таким образом, система с двойным промотором позволяет использовать систему с минимальным количеством плазмид, которая содержит значительно меньше плазмид, чем 22, необходимых в случае, если плазмиды, экспрессирующие РНК и белок, находятся на отдельных плазмидах. Получение ротавируса можно выполнить аналогично тому, как получают вирус гриппа А.

Фиг. 11А-Э. Репликация и синтез мРНК геномов РНК-вирусов.

A. мРНК синтезировали с помощью вирусных полимеразных белков во время инфицирования вирусов с (-) цепью: одну или две мРНК для сегментированных РНК-вирусов или несколько мРНК для вирусов с мономолекулярными геномами. Механизмы антитерминации приводят к синтезу полноразмерных (+) цепей, которые можно копировать в (-) геномную РНК.

B. Сегментированные геномы РНК-вирусов с РНК любой ориентации копируются с образованием одной мРНК, в то время как вторая РНК синтезируется комплементарно.

C. В клетках, инфицированных вирусами с двухнитевой РНК, предварительно синтезированные мРНК могут быть транслированы в белок или служить в качестве матриц для синтеза (-) цепей, образуя двухнитевую геномную РНК.

-8006311

Ό. Для вирусов с (+) цепью геномная РНК также является мРНК и копируется в (-) цепь РНК, которую можно копировать в (+) геномную РНК. мРНК некоторых (+) РНК-вирусов не содержат поли А хвоста. В некоторых семействах образуются одна или несколько субгеномных РНК.

Подробное описание изобретения

Жизненный цикл всех РНК-вирусов включает синтез РНК и сборку вирусных частиц после окончания синтеза белка; эти функции обеспечивают концептуальную основу обратных генетических систем согласно настоящему изобретению, которые можно использовать для получения РНК-вирусов из клонированной кДНК. Настоящее изобретение упрощает и усовершенствует известные обратные генетические системы путем создания системы с двойным промотором для получения сегментированных вирусов с отрицательной цепью (например, грипп А, грипп В, Вцпуаушбае), несегментированных вирусов с отрицательной цепью РНК (например, Рагатухоу1бае, Мопопедау1га1е8) и вирусов с положительной цепью РНК (например, Р1ау1ушбае, Р1еогпаутбае, Согопаутбае, Тодаутбае). Поскольку система согласно настоящему изобретению использует одну вирусную кДНК для синтеза белка и синтеза геномной РНК, эта система уменьшает количество плазмид, которое требуется для получения вирусов, и позволяет быстро и экономично разрабатывать вакцины.

Если с помощью настоящего изобретения требуется получить вирус, содержащий сегментированный геном РНК, вирусную кДНК, соответствующую каждому гену в целевом геноме, вводят в экспрессионную плазмиду согласно изобретению. Изобретение включает двунаправленную систему экспрессии на основе плазмидного вектора и однонаправленную систему экспрессии на основе плазмидного вектора, в которых вирусную кДНК встраивают между промотором и терминатором ДНК-полимеразы I (ро1 I) (внутренний транскрипционный блок). По обеим сторонам всего этого транскрипционного блока ро1 I находятся промотор и сайт полиаденилирования РНК-полимеразы II (ро1 II) (наружный транскрипционный блок). В однонаправленной системе промоторы ро1 I и ро1 II расположены в прямом направлении к кДНК, и с них образуется некэппированная смысловая кРНК (с промотора ро1 I) и кэппированная смысловая мРНК (с промотора ро1 II). Промотор ро1 I, терминатор ро1 I, промотор и сигнал полиаденилирования ро1 II в однонаправленной системе можно назвать имеющими ориентацию сверху вниз. В двунаправленной системе промоторы ро1 I и ро1 II располагают по обеим сторонам от кДНК, при этом «выше» (црйгеаш) расположенный промотор ро1 II дает кэппированную смысловую мРНК, а «ниже» (ботепйгеаш) расположенный промотор ро1 I дает антисмысловую некэппированную вирусную РНК (вРНК). Такие системы ро1 ГОро1 II начинают с инициации транскрипции двух клеточных ферментов РНК-полимеразы из своих собственных промоторов, предположительно в разных компартментах ядра. Промотор ро1 I и терминатор ро1 I в двунаправленной системе можно назвать имеющими ориентацию снизу вверх (бо\\'П51геат-1оцр81геат), в то время как промотор ро1 II и сигнал полиаденилирования в двунаправленной системе можно назвать имеющими ориентацию сверху вниз (црДгеатбо-ботепйгеат).

Если интересующий вирус содержит сегментированный РНК-геном с положительной цепью, промотор ро1 I предпочтительно располагают выше от кДНК во внутреннем транскрипционном блоке (однонаправленная система). В этом варианте реализации получают РНК с положительной цепью для непосредственного включения в новые вирусы. Однако настоящее изобретение включает также варианты реализации, в которых с помощью однонаправленной системы получают вирусы, содержащие сегментированные РНК-геномы с отрицательной цепью.

Если интересующий вирус содержит сегментированный РНК-геном с отрицательной цепью, промотор ро1 I предпочтительно располагают ниже кДНК во внутреннем транскрипционном блоке (двунаправленная система). В этом варианте реализации получают РНК с отрицательной цепью для непосредственного введения в новые вирусы. Однако настоящее изобретение включает также варианты реализации, в которых с помощью двунаправленной системы получают целевые вирусы, содержащие сегментированные геномы РНК с положительной цепью.

Настоящее изобретение можно использовать также для получения вирусов, содержащих инфекционные или неинфекционные несегментированные РНК геномы (однонитевые или двухнитевые). В общем случае простое введение инфекционных вирусных геномных РНК в клетку-хозяина является достаточным для того, чтобы вызывать инициацию вирусного цикла жизни в клетке и конечного получения полных вирусов. Так, например, простое введение пикорнавирусной геномной РНК в клетку-хозяина достаточно для получения полных пикорнавирусов. Инициация жизненного цикла вируса, содержащего неинфекционную геномную РНК, обычно требует дополнительного введения других вирусных белков, которые обычно переносятся в вирусной частице вместе с геномом. Так, например, вирус III парагриппа переносит РНК-зависимую РНК-полимеразу, наличие которой требуется во вновь инфицированной клетке-хозяине для начала репликации вирусной геномной РНК и транскрипции вирусных мРНК; при отсутствии полимеразы геномная РНК парагриппа III не инфекционна. В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых получают вирусы, содержащие инфекционные, несегментированные геномные РНК, простое введение двойной экспрессионной плазмиды согласно изобретению, которая переносит нуклеиновую кислоту, включающую вирусный геном, в соответствующую клетку-хозяина, является достаточным, чтобы вызвать образование полных вирусов. В вариантах реализации, в которых получают вирусы, содержащие неинфекционную, несегментированную геномную РНК, может также потре боваться введение в клетку-хозяина дополнительных экспрессионных плазмид наряду с двойной экспрессионной плазмидой, переносящей вирусный геном. Дополнительная плазмида должна экспрессировать один или несколько белков, которые необходимы для инициации жизненного цикла вируса и которые обычно вводятся в клетку-хозяина при инфекции (например, РНК-зависимые РНК-полимеразы).

В вариантах реализации, в которых получают пикорнавирус, содержащий инфекционный несегментированный геном РНК, кДНК, содержащую полный вирусный геном, встраивают в экспрессионную плазмиду с двойным промотором согласно изобретению. Промотор, расположенный выше в наружном транскрипционном блоке, предпочтительно промотор ро1 II, управляет синтезом мРНК с положительной цепью, содержащей полный вирусный геном - полипротеин, транслируется с мРНК, и отдельные белки отщепляются и выделяются из полипротеина (например, протеазой в составе полипротеина). Поскольку вирусный геном содержит РНК с положительной цепью, второй расположенный выше во внутреннем транскрипционном блоке промотор (однонаправленная система), предпочтительно ро1 I, управляет синтезом копии генома в виде положительной цепи. Если вирусный геном содержит РНК с отрицательной цепью, второй промотор, расположенный ниже во внутреннем транскрипционном блоке (двунаправленная система), предпочтительно ро1 I, управляет получением копии генома в виде отрицательной цепи. Варианты реализации, в которых несегментированные РНК-вирусы с отрицательной цепью РНК получают с помощью однонаправленной системы, включаются в данное изобретение. Аналогично этому варианты реализации, в которых несегментированные РНК-вирусы с положительной цепью получают с помощью двунаправленной системы, также включаются в данное изобретение.

Настоящее изобретение позволяет также получать вирусы, содержащие неинфекционные несегментированные РНК-геномы, в которых полипротеин не образуется. Так, например, данную систему можно использовать для получения вирусов тйаЬбоушбае или вирусов рататухоушбае, предпочтительно вирусов III парагриппа, жизненный цикл которых обычно включает получение ряда моноцистронных мРНК с геномных РНК с отрицательной цепью под воздействием вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, при этом отдельные белки экспрессируются с моноцистронных мРНК. В этих вариантах реализации наружный транскрипционный блок, содержащий промотор, предпочтительно промотор ро1 II, управляет получением полицистронной копии вирусного генома с положительной цепью, из которой обычно транслируется только первый ген (ΝΡ). Кроме того, внутренний транскрипционный блок, содержащий промотор, предпочтительно промотор ро1 I, управляет экспрессией РНК копии генома, предназначенной для введения в новые вирусы. Поскольку вирусный геном парагриппа III содержит РНК в виде отрицательной цепи, промотор внутреннего транскрипционного блока располагают предпочтительно ниже (боупйтеат) от кДНК (двунаправленная система). Если вирусный геном содержит РНК в виде положительной цепи, промотор внутреннего блока транскрипции располагают предпочтительно выше от кДНК (однонаправленная система). Варианты реализации, в которых вирусы, содержащие геном РНК с положительной цепью, получают с помощью двунаправленной системы, и варианты реализации, в которых вирусы, содержащие геном РНК с отрицательной цепью, получают с помощью однонаправленной системы, включаются в настоящее изобретение. Для транскрипции и репликации вируса требуются дополнительные вирусные белки (Ь и Р) (отличные от белка, экспрессируемого с полицистронной мРНК), и эти белки поставляются индивидуально на отдельных экспрессионных плазмидах.

Изобретение может также включать варианты реализации, в которых получают вирусы, содержащие сегментированные геномы двухнитевых РНК. В этих вариантах реализации плазмиду, несущую каждый ген, из генома интересующего вируса вводят в экспрессионную плазмиду с двойным промотором согласно изобретению. Плазмида может представлять собой однонаправленную или двунаправленную плазмиду. Промотор в наружном транскрипционном блоке, предпочтительно промотор ро1 II, управляет экспрессией транскрипта мРНК каждого гена, который транслируется в кодированный белок. Промотор во внутреннем транскрипционном блоке, предпочтительно промотор ро1 I, управляет транскрипцией положительной цепи (однонаправленная система) или отрицательной цепи (двунаправленная система). Следовательно, первая образующаяся цепь может действовать как матрица для создания комплементарной цепи вирусной РНК-полимеразой. Полученный продукт двухнитевой РНК включается в новые вирусы.

Получение двух вирусов гриппа А, а именно Α/ΨδΝ/33 (Η1Ν1) и Л/Тса1/Н1<ЛУ312/07 (Η6Ν1), из системы, основанной на минимальном количестве плазмид, определяет полезность этой системы. Получение неразличимого по фенотипу штамма Α/ΡΚ./8/34 (Η1Ν1), который является стандартным для изготовления инактивированной вакцины против гриппа А, определяет полезность данной системы для разработки вакцин. Через 72 ч после трансфекции восьми экспрессионных плазмид в совместно культивированные клетки 293Т и МОСК выход вирусов в супернатанте трансфецированных клеток составлял от 2х10⁵ до 2х10⁷ инфекционных вирусов на мл. Эту восьмиплазмидную систему использовали также для получения одинарно и четырежды реассортированных между А/Теа1/НКЖ312/07 (Η6Ν1) и Α/ΨδΝ/33 (Η1Ν1) вирусов и получения вирусов и Α/Ψ3Ν/33 из последовательно ориентированной системы (которая создает кРНК и мРНК).

Благодаря тому, что система ро1 ^ро1 II способствует образованию и получению как рекомбинантных, так и реассортированных вирусов гриппа А, ее можно использовать также для получения других РНК-вирусов только из клонированной кДНК. Хотя кДНК является предпочтительной для применения в настоящем изобретении, любой другой тип нуклеиновой кислоты, которая кодирует вирусный ген, под лежащий экспрессии, можно использовать, если сохраняются основные элементы изобретения. Так, например, можно использовать амплифицированные РСК продукты или рестрикционные фрагменты, содержащие вирусные гены. Кроме того, гены, экспрессиованные в системе, основанной на плазмидном векторе, согласно изобретению могут присоединяться к другим генам или метиться ими, в частности, метками очистки/обнаружения (например, глютатион-8 трансфераза, полигистидин, зеленый флуоресцентный белок, метки тус и метки РБЛС). Настоящее изобретение включает также варианты реализации, в которых в данной системе в плазмидах используются частичные последовательности генов.

В следующей таблице приведен неограничительный список РНК-вирусов с отрицательной цепью, которые можно получить с помощью настоящего изобретения.

Класс

Семейство

Подсемейство

Мопопедау|га1е5

ΒοΓπενίόθβ

Род

Вирус Борна

Вид

Вирус болезни Борна

МопопедаУ1га1ез

ΕίΙονίπάββ

Мопопедау|га1е8

ΕϊΙονίπΰθθ

Мопопедау|га1ез

Рагатухоу|пс1ае

Рагатухоу|ппае

Эболаподобный вирус

Марбургподобный вирус

Респиро-вирус

Вирус Марбурга

Вирус парагриппа I человека

МопопедаУ1га1е8

Мопопедау|га1ез

Рагатухоу|пс1ае

Рагатухоу|пбае

Рагатухоу|ппае

Рагатухоу|ппае

Морбилли-вирус

Рубулавирус

Мопопедау|’га1е8

Рагатухоу|пс1ае

Рпеитоу|ппае

Пневмовирус

МопопедаУ1га1ев

Рагатухоу|пс1ае

РпеитоуИпае

Метапневмовирус

Мопопедау|га1е5

Везикуло-вирус

Вирус кори

Вирус эпидемического паротита

Респираторносинцитиальный вирус человека

Ринотрахеитный вирус индюка

Индианский вирус везикулярного стоматита

Мопопедау|га1е8

РЬаЬс1071П0ае

Вирус бешенства

Вирус бешенства

Мопопеда71га1ев

Эфемеро-вирус

МопопедаУ1га1ев

ΚΐΊθόάονίπάθΘ

Новирхабдовирус

Мопопеда71га1е8

РКаЬс1071пс1ае

Мопопеда71га1е5

КпаЬс1о71пс1ае

Мопопедау|га1е5

Мополедау|га1е5

Мопопедау|га1е5

Мопопедамга1е5

Мопопедау|га1ев

ОПИотухоУ1пс1ае

Ог!ЬотухоУ1Пс1ае

ОгИтотухоуИбае

ОШ1отухоУ1п<1ае Випуау|пс1ае

Циторхабдовирус

Нукпеорхабдовирус

Вирус гриппа А Вирус гриппа В Вирус гриппа С Вирус ТЬодо!о Випуау|Ш8

Бычий рабдовирус Инфекционный Нета1оро1ейс вирус некроза Ьейисе Ыесгобс ΥβΙΙοννδ Χ/ίΓΐΐδ

Ро!а!о ΥβΙΙονν Цм/аг! У!гив

Мопопедау|га1ев

Мопопедау|га1ев

Випуау|п4ае

ВипуампРае

НагИамгиз

Мопопедау|га1е5

Випуау|пс1ае

Мопопедау|га1ев

Випуампс1ае

ΝθίΓονίπΐδ

Флебовирус

Тосповирус

МопопедаУ1га1е5

Мопопедау|га1ев

ВипуаУ1пс1ае

Випуау|пс1ае

Тепимгив

Мопопедау|га1ев

Агепау|п4ае

Мопопедау|га1ев

Агепау|пс1ае

-11Офиовирус

Ареновирус

Дельтавирус

Вирус гриппа А

Вирус гриппа В Вирус гриппа С

Вирус Т1юдо!о Вирус

Випуаптл/ега

Вирус НаЫаап

Ыа1гоЬ| ЗМеер ϋίδββδβ νίίΐΐδ

Вирус флеботомной лихорадки

Тота1о Зройес! ννϋί νίπΊδ

Рюе 81пре \/1гиз

Сйгив ΡδΟΓΟδίδ νίίϋδ

Лимфоцитарный хориоменингитный вирус

Вирус гепатита дельта

Настоящее изобретение также частично основано на разработке двунаправленной транскрипционной конструкции, которая содержит вирусную кДНК, кодирующую РВ2, РВ1, РА, НА, ΝΡ, ΝΑ, М или N3 и расположенную между промотором РНК-полимеразы I (ροϊ I) для синтеза вРНК и промотором РНК-полимеразы II (ροϊ II) для синтеза вирусной мРНК. Полезность такого подхода доказана получением вируса после трансфекции конструкта ροϊ ^ροϊ П-промотор-РВ 1 вместе с вРНК-конструктом и конструкциями экспрессии белка для семи остальных сегментов. Поскольку такой подход уменьшает количество плазмид, которое требуется для образования вируса, он также уменьшает трудоемкость клонирования, повышает эффективность получения вирусов и расширяет возможности применения обратной генетической системы для клеточных линий, для которых невозможно осуществить эффективную совместную трансфекцию 17 плазмид. Кроме того, изобретение включает однонаправленную транскрипционную конструкцию, содержащую промоторы ροϊ I и ροϊ II, которые расположены выше (ιιρδΙίΌαιη) от последовательности, кодирующей вирусную кДНК. Оба промотора имеют общую «выше-ниже» (ιιρδΙίΌαιη-Ιοάο\νπ5ΐΐΌ3ΐη) ориентацию по отношению к гену. Хотя двунаправленная система обеспечивает более высокий титр вируса гриппа А, однонаправленная система полезна для других областей применения (например, для получения других вирусных штаммов с отрицательной цепью).

Промотор, терминатор или сигнал полиаденилирования находятся выше (ι.ιρκίΓοηιη) от гена, если они расположены ближе к началу гена (например, стартовому кодону) и дальше от конца гена (например, терминирующего кодона). Промотор, терминатор или сигнал полиаденилирования находятся ниже (άονη8ΐ^еат) от гена, если они расположены ближе к концу гена и дальше от начала гена. Промоторы в плазмидах согласно изобретению, которые функционально связаны с геном, ориентированы таким образом, чтобы обеспечить транскрипцию смысловой или антисмысловой цепи гена.

Используемый в настоящем описании термин экспрессионная плазмида означает вектор ДНК, содержащий внутренний транскрипционный блок и наружный транскрипционный блок. Как указано выше, экспрессионные плазмиды можно использовать для получения РНК-вируса любого типа, предпочтительно РНК-вирусов с положительной или отрицательной цепью, РНК-вирусов с сегментированным или несегментированным геномом или РНК-вирусов с двойной цепью. Наружный транскрипционный блок содержит промотор, предпочтительно промотор ροϊ II, который управляет транскрипцией с вирусной кДНК - мРНК, которая может затем транслироваться. Наружный транскрипционный блок может содержать промотор РНК-полимеразы фага Т7, промотор РНК-полимеразы фага Т3, промотор РНКполимеразы 3Ρ6 или другой промотор или сочетание генетических элементов, способных обеспечивать экспрессию транслируемого РНК продукта. Так, например, наружный транскрипционный блок может содержать промотор ροϊ I или ро1 II, если вирусная кДНК, которая подлежит экспрессии с плазмиды, генетически изменена таким образом, что включает сигнал полиаденилирования на 3' конце транскрибируемой РНК. Это можно реализовать путем инсерции цепи А нуклеотидов в 3' конец последовательности, кодирующей кДНК, непосредственно перед терминирующим кодоном. Кроме того, вирусную кДНК можно генетически изменить так, чтобы она включала внутренний сайт посадки рибосом (ЖЕЗ) на 5' конце кДНК для облегчения начала трансляции с транскрибированной РНК. Внутренний транскрипционный блок в экспрессионных плазмидах согласно изобретению расположен внутри наружного транскрипционного блока и содержит промотор, предпочтительно промотор ροϊ I, способный управлять транскрипцией вирусной кДНК, которая может реплицироваться с помощью вирусного механизма и включаться в новые вирусы. Промотор во внутреннем транскрипционном блоке предпочтительно транскрибирует РНК, которая не содержит избыточных, невирусных внешних последовательностей на 5' и 3' концах, предпочтительно путем точного слияния вирусной кДНК с промотором и терминатором ροϊ I. Однако изобретение включает варианты реализации, в которых блок внутренней транскрипции содержит промотор, управляющий образованием транскриптов РНК, содержащих дополнительную невирусную последовательность на 5' и 3' концах (например, промоторы ροϊ II, промоторы ροϊ III, промотор Т7 РНКполимеразы, промоторы Т3 РНК-полимеразы или промоторы 3Ρ6 РНК-полимеразы). В этих вариантах реализации дополнительные последовательности могут быть включены в экспрессионную плазмиду, благодаря которой РНК, полученная из внутреннего транскрипционного блока, не включает лишней невирусной последовательности. Так, например, экспрессионная плазмида может быть генетически изменена таким образом, чтобы включать рибозимные последовательности на концах транскриптов, полученных из внутреннего транскрипционного блока, при этом рибозимные части транскрибированной РНК расщепляют транскрипт, обеспечивая образование последовательностей 5' и 3' концов РНК, как имеющиеся в вирусной РНК. Кроме того, экспрессионные плазмиды могут быть генетически изменены таким образом, что включают терминаторные последовательности, которые вызывают терминацию транскрипции в конце последовательности, кодирующей вирусную кДНК, предотвращая при этом введение лишних нетранслируемых последовательностей в 3' конец транскрибированной РНК. Экспрессионная плазмида предпочтительно представляет собой ДНК вектор, использующий систему ροϊ ^ροϊ II. Таким образом, указанная плазмида содержит промотор РНК-полимеразы I (ροϊ I) и терминатор ροϊ I, которые инсертированы между промотором РНК-полимеразы II (ροϊ II) и сигналом полиаденилирования. В двунаправленной системе промотор РНК-полимеразы I регулирует экспрессию геномной некэппированной антисмысловой РНК (обозначаемой здесь как вРНК) кДНК, которая инсертирована в «антисмысловой» ориентации между данными промотором и терминатором. Промотор РНК-полимеразы II регулирует экспрессию матричной РНК; сегмент кДНК вирусного гена, введенный в смысловом между промотором ро1 II и сигналом полиаденилирования, приводит к экспрессии кэппированной вирусной смысловой мРНК. В однонаправленной системе вирусную кДНК вводят ниже от промоторов ро1 I и ро1 II в смысловой ориентации. Промотор ро1 II обеспечивает экспрессию кэппированной смысловой вирусной мРНК, а промотор ро1 I обеспечивает экспрессию некэппированной смысловой вирусной кРНК.

Плазмида может содержать практически все от другой основной плазмиды, если все гены и функциональные некодирующие участки основной плазмиды имеются в наличии. Так, например, плазмида, полученная простым удалением части полилинкера и введением чужеродного гена, содержит практически все от основной плазмиды.

Вирус РНК с отрицательной цепью представляет собой вирус, в котором вирусный геном представляет собой РНК в виде отрицательной цепи. РНК с отрицательной цепью является комплементарной по отношению к мРНК и в общем случае должна копироваться для трансляции белков в комплементарную мРНК с положительной цепью. Обычно эти вирусы содержат РНК-зависимую РНК-полимеразу для образования мРНК после инфицирования клетки-хозяина. Семейства РНК-вирусов с отрицательной цепью включают без ограничения ОгИотухоушбае, Агепаутбае и Випуаутбае. Вирусный геном предпочтительно относится к членам семейства вирусов ОгШотухоутбае и в оптимальном случае содержит сегментированный геном. Члены семейства вирусов ОгШотухоушбае включают без ограничения вирусы гриппа А, гриппа В, ТЬодо1оу1ги8, кори и свинки (Рагатухоуиик) или вирус ВЬаЫек (рабдовирус).

Вирус РНК с положительной цепью представляет собой вирус, содержащий РНК-геном в виде положительной цепи. Примеры РНК-вирусов с положительной цепью включают полиовирус (пикорнавирус), тогавирусы и флавивирусы. Геномная РНК этих вирусов имеет такое же направление, как мРНК и может функционировать как мРНК. Эти вирусы могут содержать сегментированный или несегментированный геном.

Вирус с двухнитевой РНК содержит геном в виде двухнитевой РНК. Реовирусы являются вирусами с двухнитевой РНК.

Вирусный геном может быть также сегментированным или несегментированным (мономолекулярным). Сегментированный геном содержит не менее двух нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует один или несколько вирусных генов. Сегментированный геном предпочтительно содержит отдельную нуклеиновую кислоту для каждого вирусного гена.

Ортомиксовирусы (вирус гриппа А, В или С), буньявирусы и аренавирусы содержат сегментированные РНК-геномы. Несегментированный геном содержит одну нуклеиновую кислоту, включающую все вирусные гены. Мононегавирусные вирусы, рабдовирусы, вирусы Р1ау1ушбае, вирусы Рюогпаушбае, вирусы Согоиаушбае, вирусы Тодаушбае и парамиксовирусы содержат несегментированный РНК геном.

Двухнитевую РНК можно сокращенно обозначить бкРНК. Однонитевую РНК можно сокращенно обозначить к&РНК. Однонитевую РНК в виде отрицательной цепи можно сокращенно обозначить 8&РНК. Однонитевую РНК в виде положительной цепи можно сокращенно обозначить + 88РНК.

Сегмент вирусного гена предпочтительно представляет собой клонированную кДНК, соответствующую молекуле геномной РНК из генома РНК-вируса. Этот термин может также включать ген или сегмент гена (например, продукт РСВ или рестрикционный фрагмент), который содержит ген, полученный из РНК-вируса.

Система, основанная на минимальном количестве плазмид представляет собой систему, в которой имеется экспрессионная плазмида, как указано выше, содержащая все автономные вирусные геномные сегменты из РНК-вируса. Таким образом, суммарное количество плазмид, которые содержат вирусные геномные последовательности, не будет превышать суммарное количество генных сегментов из исходного РНК-вируса. Изобретение включает варианты реализации, в которых другие плазмиды, не содержащие вирусных последовательностей, могут быть котрансфецированы в клетки-хозяева. Это является важным достоинством, поскольку ограничивает суммарное количество плазмид, необходимых для создания системы в клетке-хозяине, устраняет потребность в вирусе-помощнике, устраняет потребность в процессе отбора и позволяет эффективно воспроизводить реассортированные вирусы.

Определенные вирусные гены в системе, основанной на минимальном количестве плазмид согласно изобретению, можно получать из вирусного штамма, хорошо адаптированного для выращивания в культуре клеток, в частности штамма РВ/8/34 (Н1Ν1) или Α8Ν/33 (Н1Ν1), или из ослабленного штамма, в частности А/Апп АгЬог/6/60 (№N2) или для гриппа В/Апп АгЬог/1/66. Ослабленный штамм предпочтительно должен быть также хорошо адаптирован к выращиванию в культуре клеток. В частности, для гриппа А предпочтительные генные сегменты вируса в системе, основанной на плазмидном векторе, кодируют вирусные белки полимеразного комплекса, М белки и/или Ν/8 белки из штамма, хорошо адаптированного к выращиванию в структуре клеток, и/или из ослабленного штамма. Эти белки называются здесь вирусными внутренними белками или вирусным негликопротеином.

Геном вируса гриппа А обычно кодирует 10 различных белков: РВ2, который считают транскриптазой, РВ1, который считают транскриптазой, РА, который считают транскриптазой, НА, который считают гемагглютинином, №, который считают нуклеопротеином, связывающимся с РНК, NА, который счита

-13006311 ют невраминидазой, М1/М2, которые считают белками матрикса и интегральным белком наружной мембраны, соответственно, и Ν81/Ν82, которые считают неструктурными белками, способными влиять на процессинг и транспорт РНК. РВ1, РВ2, ΝΡ и РА рассматривают как часть транскрипционного полимеразного комплекса вируса гриппа.

Термин культивирование в клетках (сеП сиИШге), используемый в настоящем описании, предпочтительно относится к реализуемому в промышленных масштабах способу размножения вируса для производства вакцины, например, в куриных яйцах с зародышем, а также к выращиванию в клетках ίη νίΐτο в клетке-хозяине (см. Еигттдег, Ш: Νκΐιοϊδοη, ХУеЬ^ег апб Мау (ебк.), Τеx!Ьοοк ο£ Шбиепса, Οκιρ^Γ 24, ρρ. 324-332, ρηΠ^ΓΐϊηΓΚ· ρρ. 328-329).

Аналогично этому система на основе плазмидного вектора включает генные сегменты для антигенов, которые требуются для создания защитной иммунологической реакции. Защитная иммунологическая реакция содержит гуморальный (антитело) и/или клеточный компонент, достаточный для устранения вирионов и инфицированных клеток у иммунизированного (вакцинированного) субъекта. Таким образом, защитная иммунная реакция может предотвратить или устранить инфекцию РНК-вируса, например вируса гриппа. Антигены предпочтительно являются поверхностными антигенами, т.е. экспрессированными на поверхности вириона или на поверхности инфицированных клеток. Более предпочтительно поверхностные антигены являются гликопротеинами. Для гриппа основными гликопротеиновыми антигенами являются гемагглютинин (НА или Н) и невраминидаза (ΝΑ или Ν).

Используемый здесь термин иммуногенный означает, что полипептид способен вызывать гуморальную или клеточную иммунную реакцию, предпочтительно обе из них. Иммуногенный компонент является также антигенным. Иммуногенный состав представляет собой такой состав, который при введении животному вызывает гуморальную и/или клеточную иммунную реакцию. Молекула является антигенной, если она может специфически взаимодействовать с молекулой распознания антигена в иммунной системе, в частности с иммуноглобулином (антитело) или Т-лимфоцитным антигенным рецептором. Антигенный полипептид содержит эпитоп, который включает по меньшей мере около 5, а предпочтительно по меньшей мере около 10 аминокислот. Антигенная часть полипептида, также называемая здесь эпитопом, может представлять собой ту часть, которая является иммунодоминантной для распознавания антителом или Т-лимфоцитным рецептором, или она может быть той частью, которую используют для получения антитела к молекуле путем конъюгации антигенной части к полипептидному носителю для иммунизации. Молекула, которая является антигенной, не обязательно должна быть иммуногенной, т.е. способной вызывать иммунную реакцию без носителя.

Термин патогенный вирусный штамм используется в данном описании для обозначения вирусного штамма, способного вызывать заболевание; этот вирус предпочтительно содержится в действующем перечне вирусов, циркулирующих с определенной вероятностью, который публикует Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Центры контроля и предотвращения заболеваний (СЭС) или другие органы здравоохранения. Такие вирусы могут включать членов семейства вирусов гепатита, семейства реовирусов, семейства ортомиксовирусов, семейства парамиксовирусов, семейства ΠϊονίΓίάΓ^- семейства όοηκινί^^, семейства Ьиηуаν^^^бае. семейства агешпапбае, семейства ^ΐΌΐκινίι^κ, семейства полиовирусов или семейства рабдовирусов. Одним из достоинств изобретения является обеспечение возможности введения генов основных антигенов из таких штаммов в систему на основе плазмидного вектора, в которой остальные вирусные гены обладают желаемыми характеристиками культивирования и/или ослабленности, чтобы таким образом получить определенное количество вируса соответствующего антигенного фона для производства вакцины. Так, например, гены парамиксовируса, вируса III парагриппа человека (ген нуклеокапсида, ген фосфопротеина, ген матрикса, ген, отвечающий за слияние, ген белка гемагглютинин-полимеразы и большой ген) можно легко расположить в плазмидах согласно изобретению для получения вирионов вируса III парагриппа.

Предпочтительный реассортированный вирус согласно изобретению представляет собой вирус, в котором генные сегменты, кодирующие антигенные белки из штамма патогенного вируса, сочетаются с генными сегментами, кодирующими вирусный полимеразный комплекс или иные аналогичные гены (например, неглюкопротеиновые гены, включая М-гены и Ν/8-гены) из вирусов, адаптированных к росту в культуре (или ослабленных вирусов). При этом реассортированный вирус переносит желаемые антигенные характеристики в фоновую среду, которая обеспечивает эффективное воспроизводство в клеткехозяине, как описано выше. Такой реассортированный вирус является желаемым вирусным посевом для получения вирионов, предназначенных для производства вакцины (см. Бцгттдег, выше).

Термин клетка-хозяин означает клетку любого организма, которую выбирают, модифицируют, трансформируют, выращивают, используют или с которой манипулируют каким-либо образом с целью выработки указанной клеткой рекомбинантных РНК вирионов, предпочтительно вирионов с сегментированной РНК в виде отрицательной цепи. Примеры клетки-хозяина включают без ограничения МабшЭагЬу почечные клетки собаки (МОСК), клетки νΕΒΟ, клетки СУ1, клетки СО8-1 и СО8-7, а также клетки ВНК-1. В специфическом варианте реализации для получения вирионов предпочтительным является временное совместное культивирование. Выращивание в комбинированной культуре обеспечивает эффективную трансфекцию рецептивной клетки, в частности клетки 293Т, с последующей инфекцией пермиссивной клетки, в частности клетки МСЭК. для роста вирусов.

Термин вирионы РНК-вирусов относится к вирусным частицам, которые вначале являются полностью инфекционными, при получении из клеток-хозяев способом трансфекции или котрансфекции системой, основанной на плазмидном векторе согласно изобретению. Такая система вырабатывает вРНК и вирусные белки (из трансляции вирусной мРНК), которые приводят к образованию инфекционных вирусных частиц (вирионов).

Используемый в данном описании термин вакцина, специфичная к РНК-вирусу относится к составу, который при введении субъекту может вызывать защитный иммунитет к РНК-вирусу. Термин вакцина относится к составу, содержащему вирус, инактивированный вирус, ослабленный вирус, расщепленный вирус или вирусный белок, т.е. поверхностный антиген, который можно использовать для того, чтобы вызывать защитный иммунитет у реципиента (см. Еитттдет, выше). Следует отметить, что вакцина согласно изобретению, чтобы быть эффективной, может вызывать иммунитет у части населения, в то время как у некоторых индивидуумов не возникает устойчивая или защитная иммунная реакция, а в некоторых случаях вообще какая-либо иммунная реакция. Такая неспособность может быть следствием генетического фона индивидуума, или состоянием иммунодефицита (приобретенного или врожденного), или иммунодепрессии (например, при лечении иммунодепрессивными препаратами для предотвращения отторжения органа или подавления аутоиммунного состояния). Эффективность вакцины можно установить на модели животного.

Защитная доза вакцины представляет собой количество отдельной вакцины или в сочетании с адьювантом, достаточное для того, чтобы вызывать защитную иммунную реакцию у реципиента. Защитная доза может также зависеть от типа введения, например внутримышечно (предпочтительно для инактивированной вакцины) или интраназально (предпочтительно для ослабленной вакцины).

Термин субъект, используемый в данном описании, относится к живому организму, который поддерживает инфекцию РНК-вирусом, включая без ограничения организм водоплавающих птиц, цыплят, свиней и человека. Данный термин относится, в частности, к организму человека.

Адьювант - это молекула или состав, которые усиливают (потенциируют) иммунную реакцию иммуногена. Адьювант является допустимым для введения человеку, если он фармацевтически допустим, как указано ниже. Примеры адьювантов приведены ниже.

Используемый в данном описании термин выделенный (изолированный) означает, что указанный материал удален из его нативной среды, например из клетки. Таким образом, выделенный биологический материал может не содержать некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых нативный материал появляется естественным путем (например, цитоплазменный или мембранный компонент). Материал считается выделенным, если он присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. В случае молекул нуклеиновой кислоты выделенная нуклеиновая кислота включает продукт РСК, выделенную мРНК, кДНК или рестрикционный фрагмент. В другом варианте реализации выделенная нуклеиновая кислота предпочтительно вырезана из хромосомы, в которой она может находиться, а более предпочтительно больше не присоединена или не приближена к некодирующим областям (однако она может быть присоединена к своим нативным регуляторным областям или их частям) или к другим генам, расположенным выше или ниже относительно гена, содержащегося в молекуле выделенной нуклеиновой кислоты, когда она еще находилась в хромосоме. Еще в одном варианте реализации в выделенной нуклеиновой кислоте отсутствуют один или несколько интронов. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот включают последовательности, инсертированные в плазмиды, космиды, искусственные хромосомы и т.п., то есть, когда они образуют часть структуры химерной рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Таким образом, в специфическом варианте реализации рекомбинантная нуклеиновая кислота является выделенной нуклеиновой кислотой. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками и/или нуклеиновыми кислотами, с которыми он соединяется в клетке, или с клеточными мембранами, если это мембранно-ассоциированный белок. Выделенная органелла, клетка или ткань является удаленной из анатомического участка, в котором она находится в организме. Выделенный материал может быть очищенным, но не обязательно является таковым.

Термин очищенный, используемый в настоящем описании, относится к материалу, выделенному при условиях, которые уменьшают или устраняют присутствие чужеродных материалов, т.е. загрязнений, в том числе нативных материалов, из которых получен данный материал. Так, например, очищенный вирион предпочтительно практически не содержит компонентов клетки-хозяина или культуры, включая ткань культуры или белки яйца, неспецифические патогены и т.п. Используемый здесь термин практически не содержит используется в контексте аналитического контроля материала. Очищенный материал, который практически не содержит загрязнений, имеет чистоту предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Чистоту можно определить способами хроматографии, электрофореза в геле, иммунологического анализа, композиционного анализа, биологического анализа и другими способами, известными специалистам.

Способы очистки также хорошо известны специалистам. Вирусные частицы можно очистить способами ультрафильтрации или ультрацентрифугирования, предпочтительно длительного центрифугиро вания (см. Ецгттдег, выше). Другие способы также возможны и принимаются во внимание. Очищенный материал может содержать менее 50%, предпочтительно менее 75% и наиболее предпочтительно менее 90% клеточных компонентов, среды, белков или иных нежелательных компонентов или загрязнений (в соответствии с требованиями в каждом конкретном случае), с которыми он был ассоциирован в исходном состоянии. Термин практически чистый указывает на самую высокую степень чистоты, которую можно обеспечить с помощью обычных способов очистки, известных специалистам.

В каждом конкретном варианте реализации термин около или приблизительно означает в пределах 20%, предпочтительно 10% и более предпочтительно 5% от данной величины или диапазона. Альтернативно, с учетом логарифмических терминов, применяемых в биологии, термин около может означать в пределах одного порядка величины данного значения, а предпочтительно в пределах половины порядка величины данного значения.

Генная инженерия систем, основанных на плазмидном векторе

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать способы обычной молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, известные специалистам. Такие способы подробно описаны в литературе. См., например, 8атЬгоок, РгйхсН & МашаЩ Мо1еси1аг С1оптд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопй Еййюп (1989) Со1й 8рппд ИагЬог ЬаЬога!огу Ргехх, Со1й 8рппд ИагЬог, Ενν Уоигк (далее 8атЬгоок е1 а1., 1989); ΩΝΆ С1ошпд: А РгасИса1 АрргоасН, Уо1птех I апб ЬЬ (Ό.Ν. С1оуег ей. 1985); О11допис1ео!1йе 8уп111еы5 (М.1. Сак ей. 1984); ШсЫс Ас1й ЩЬ^Ф/айоп (Β.Ό. Иатех & 8.1. Ηφφπχ ейх. (1985)); Тгапхспрйоп Апй ТгапНайоп (Β.Ό. Η а тех & 8.1. Ηφβίπχ ейх. (1984)); Ашта1 Се11 СиНиге (КГ. РгехНпеу, ей. (1986)); ТттоЬШ/ей Се11х Апй Епхутех ЦКЬ Ргехх, (1986)); В. РегЬа1, А Ргасйса1 Сшйе То Мо1еси1аг С1ошпд (1984); ЕМ. АихиЬе1 е! а1. (ейх.), Сиггеп! Рго1осо1х т Мо1еси1аг Вю1оду, 1оНп \УПеу & 8опх, Ес. (1994).

Эти обычные способы можно использовать для получения плазмидных ро1 ^ро1 II систем, выделения кДНК клонов вирусных генных сегментов, вставки таких ДНК в плазмиды и трансфекции клеток плазмидой или системой на основе плазмидного вектора согласно изобретению. В частности, обычные способы сайт-управляемого мутагенеза или модификации генов позволяют модифицировать вирусные РНК гены, предпочтительно вирусные гены, представленные сегментированной РНК с отрицательной цепью, для получения ослабленного вируса, как указано ниже, или вирусных белков, которые включают новые эпитопы, например, стебель невраминидазы или для создания дефектных вирусов.

Термин амплификация ДНК, используемый в данном описании, относится к применению полимеразной цепной реакции (РСК) для увеличения содержания определенной последовательности ДНК в смеси последовательностей ДНК. Описание РСК см. 8апк1 е! а1., 8с1епсе 1988, 239:487.

Молекула нуклеиновой кислоты означает полимерную форму фосфатного эфира рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; молекулы РНК), или деоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксинуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; молекулы ДНК), или их фосфоэфирные аналоги, в частности фосфоротиоаты и тиоэфиры в однонитевой форме или в форме двойной спирали. Молекула рекомбинантной ДНК является молекулой ДНК, подвергнутой молекулярно-биологической манипуляции.

Полинуклеотид или нуклеотидная последовательность - это ряд нуклеотидных оснований (также называемых нуклеотидами) в ДНК и РНК и означает цепь из двух или нескольких нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность обычно переносит генетическую информацию, включая информацию, которую использует клеточный механизм для производства белков.

При этом полинуклеотиды могут быть окружены гетерологичными последовательностями, включая промоторы, внутренние сайты посадки рибосом (ШЕ8; СНаНах, е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 11:5848-5859, 1991) и другие последовательности сайтов посадки рибосом, энхансеров, респонсорных элементов, суппрессоров, сигнальных последовательностей, последовательностей полиаденилирования, интронов, 5'- и 3'некодирующих областей и т.п. Нуклеиновые кислоты могут быть также модифицированы множеством известных способов. Неограничительные примеры таких модификаций включают метилирование, образование кэпов, в частности 5'-7-метил-С(5')ррр(5'^ кэпов, замещение аналогом одного или нескольких естественных нуклеотидов и модификации нуклеотидов. Полинуклеотиды могут содержать одну или несколько ковалентно связанных дополнительных групп, в частности белков (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-Ь-лнзин и т.д.), интеркаляторов (например, акридин, псорален и т.д.), хелатирующих групп (например, металлы, радиоактивные металлы, железо, металлические окислители и т.д.) и алкилирующих групп. Полинуклеотиды могут преобразоваться путем образования метилового или этилового фосфотриэфира или алкилфосфорамидатной связи. Кроме того, полинуклеотиды можно также модифицировать с помощью метки, способной обеспечивать прямо или косвенно распознаваемый сигнал. Примеры меток включают радиоизотопы, флуоресцентные молекулы, биотин и т.п.

Кодирующая последовательность или последовательность, кодирующая продукт экспрессии, в частности полипептид, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая, будучи экспрессированной, приводит к получению указанного полипептида, т.е. нуклеотидная последовательность кодирует последовательность аминокислот для указанного полипептида. Кодирующая последовательность для белка может включать инициирующий кодон (обычно АТС) и терминирующий кодон.

-16006311

Термин ген, также называемый структурным геном, означает последовательность ДНК, которая кодирует определенную последовательность аминокислот или соответствует этой последовательности, содержащей полностью или частично один или несколько полипептидов, и может включать или не включать регуляторные последовательности ДНК, в частности промоторные последовательности, которые определяют, например, условия экспрессии гена.

Кроме того, настоящее изобретение позволяет использовать различные мутанты, консервативные варианты последовательностей и функционально консервативные варианты генных сегментов РНКвирусов, предпочтительно генных сегментов РНК-вирусов с отрицательной цепью, при условии, что все указанные варианты сохраняют необходимый иммунозащитный эффект. Действительно, одним из достоинств изобретения является возможность применения мутагенеза для получения ослабленных вирусных штаммов на систематической основе.

Термины мутант и мутация означают любое обнаруживаемое изменение в генетическом материале, например в ДНК, или любой процесс, механизм или результат такого изменения. Они включают мутации генов, в которых изменяется структура (например, последовательность ДНК) гена, ген или ДНК, получающиеся в результате процесса мутации, а также продукт экспрессии (например, белок), экспрессированный модифицированным геном или последовательностью ДНК. Термин вариант также может быть использован для указания модифицированного или измененного гена, последовательности ДНК, фермента, клетки и т.д., т.е. любого вида мутанта. Мутации можно вводить способами неспецифического мутагенеза или с помощью сайт-управляемого мутагенеза, включая модификацию последовательности с помощью РСК. Как отмечено выше и подробно описано далее, мутагенез одного или нескольких отдельных сегментов генов РНК-вируса (например, РНК-вируса с сегментированной отрицательной цепью) позволяет получать ослабленные вирусы, а также выяснить механизм ослабления. Кроме того, система, основанная на плазмидном векторе, согласно изобретению не имеет недостатков, присущих предшествующим попыткам получить ослабленные вирусы с помощью мутагенеза, в частности ограничений, связанных с эффективной системой селекции (см. В11ке1 апб Ка^аока, Ш: №с1ю1коп, УеЬк!ег апб Мау (ебк.) Тех!Ьоок оГ IΠί1иеπζа, СЬар!ег 32, рр. 422-434, екрес1а11у рр. 423-425).

Вариантами, консервативными по последовательности, являются такие варианты, в которых изменение одного или нескольких нуклеотидов кодона в данной позиции не приводит к изменению аминокислоты, кодированной в данной позиции. Аллельные варианты могут быть вариантами, консервативными по последовательности.

Функционально-консервативными вариантами являются такие варианты, в которых данный остаток аминокислоты в белке или ферменте изменен без изменения общей конформации и функции полипептида, включая без ограничения замену одной аминокислоты на другую с аналогичными свойствами (например, полярностью, потенциалом водородных связей, кислотностью, основностью, гидрофобностью, ароматичностью и т.п.). Некоторые аллельные изменения приводят к образованию функциональноконсервативных вариантов, в которых замена аминокислоты не приводит к резкому изменению функции белка. Аналогично этому гомологичные белки могут представлять собой функционально-консервативные варианты. Аминокислоты со сходными свойствами хорошо известны специалистам. Так, например, аргинин, гистидин и лизин являются гидрофильно-основными аминокислотами и могут быть взаимозаменяемыми. Аналогично этому изолейцин, гидрофобная аминокислота, может быть заменен лейцином, метионином и валином. Предполагают, что такие изменения оказывают небольшое влияние или не влияют на среднюю молекулярную массу или изоэлектрическую точку белка или полипетида. Аминокислоты, отличные от названных консервативными, могут различаться в белке или ферменте, поэтому процентное сходство последовательности белка или аминокислоты двух различных белков с аналогичной функцией может отличаться и составлять от 70 до 99%, что определяется схемой сравнительного анализа первичной структуры, в частности кластерным методом, при этом сходство основано на алгоритме МЕСАЫСК Функционально-консервативный вариант включает также полипептид или фермент, который имеет идентичность аминокислот по меньшей мере 60% по определению алгоритмами ВЬАЗТ или ЕАЗТА, в которых параметры выбирают таким образом, чтобы обеспечить максимальное соответствие между проверяемыми последовательностями по всей длине базовой (геГегепсе) последовательности, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, и который имеет такие же или практически аналогичные свойства или функции, как нативный или родительский белок или фермент, с которым его сравнивают.

Используемый в настоящем описании термин гомологичный во всех его грамматических формах и вариантах написания относится к родству между белками, которые имеют общее эволюционное происхождение, включая белки из суперсемейств (например, суперсемейство иммуноглобулина) и гомологичные белки из различных видов (например, миозин с легкой цепью, и т.д.) (Кееск, е! а1., Се11 50 667, 1987). Такие белки (и их кодирующие гены) имеют гомологию последовательностей, что отражается сходством их последовательностей как с точки зрения процентного сходства, так и присутствия специфических остатков или структур.

В соответствии с этим термин сходство последовательностей во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между нуклеиновой кислотой или аминокислотны ми последовательностями белков, которые могут иметь или не иметь общее эволюционное происхождение (см. Кееск, е! аГ, выше). Однако в общеупотребительном смысле и для данного применения термин гомологичный, видоизмененный наречием, в частности высоко, может относиться к сходству последовательностей и может быть связан или не связан с общим эволюционным происхождением.

В специфическом варианте реализации две последовательности ДНК являются практически гомологичными или практически сходными, если достаточное количество нуклеотидов соответствует на определенной длине последовательностей ДНК, позволяющей отличать указанные последовательности от других последовательностей согласно алгоритмам сравнения последовательностей, в частности 6^8+ ΡΑ8ΤΑ, ΌΝΑ 81г1с1ег и другим, где параметры выбирают таким образом, чтобы обеспечить максимальное соответствие между проверяемыми последовательностями по всей длине базовой последовательности. Последовательности, которые являются практически гомологичными, можно идентифицировать путем сравнения последовательностей с помощью стандартного программного обеспечения, содержащегося в базе данных последовательностей, или в эксперименте по δοπΐ^Γη гибридизации, например, при жестких условиях, определенных для конкретной системы. Такие жесткие условия известны специалистам и описаны в Сштеп! РюЮ^Е ίη Мοϊесиϊа^ Вюкду, ίοΗπ Убеу & δοηκ, Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Неограничительным примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6 Х хлориде натрия/цитрате натрия (88С) примерно при 45°С с последующей одной или двумя промывками в 0,2 Х 88С, 0,1% 8Ό8 при 50°С, предпочтительно при 55°С и более предпочтительно при 60 или 65°С.

Аналогично этому в конкретном варианте реализации две последовательности аминокислот являются практически гомологичными или практически сходными, если достаточное количество аминокислот идентично или аналогично (функционально идентично) на определенной длине для отличия одних последовательностей от других последовательностей. Аналогичные или гомологичные последовательности предпочтительно идентифицируют путем сравнительного анализа первичной структуры с помощью, например, блочной программы ОСО (Сепейсз Сοтρи!е^ ΟΐΌΐιρ. Ргодгат МатЫ Γογ Ше ОСО Раскаде, Уегзюп 7, Мэдисон, Висконсин) или одной из вышеуказанных программ (8^8% ΡΕ8ΤΑ и т.д.). Следующая литература по алгоритму В^Α8Τ включена в данное описание в качестве ссылки: АЛГОРИТМЫ В^Α8Τ: Α!8θΗπϊ, 8.Р., СкЬ, У., МШег, У., Муегз, Е.У. & ^^ρтаη, Ό.Γ, I. Μοϊ. Вюк 215:403-410, 1990; СкЬ, У. & 8!а!ез, Ό.Γ, №1Шге Сепе!, 3:266-272, 1993; Маббеп, Т.Ь., Τа!изον, К.Ь. & 2Ьапд, I., Ме!Ь. Εηζутοϊ. 266:131-141, 1996; ΑϊΐδΛπϊ, 8.Г., Маббеп, ТЬ., 8сЬиГГег, Α.Α., 2Ьапд, I., 2Ьапд, Ζ., МШег, У., ^^ρρтаη, Ό.Ι., ШсШс Αα6δ Кез. 25:3389-3402, 1997; Ζΐκ-ιι^, I. & Маббеп, ТЬ., Сегюте Кез. 7:649-656, 1997; Уοοйοη, ГС. & ГебегЬеп, 8., Сοтρи!. СЬет. 17:149-163, 1993; Наптоск, ГМ. & Απιδιό ад, Г8., Сοтρи!. Αρρϊ. Вюзсг 10:67-70, 1994; СИСТЕМЫ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ: ПауШВ/ М.О, 8сЬ^аги, К.М. & Огсий, В.С. (1978) Α тοбеϊ οΓ еνοϊиί^οηа^у сЬапде т ρΐΌΚίι^. Ш 'Абаз οΓ Рго!ет 8ес.|иепсе апб з1гис1иге, νοϊ. 5, 3ΐιρρϊ. 3. М.О. Оау^ГГ (еб.), ρρ. 345-352, №Й. Вютеб. Кез. Роипб., УазЫпдЩп, ОС; Αϊ^Λπϊ, 8.Р., I. Мοϊ. ВюГ 219:555-565,1991; 8!а!ез, Ό.Γ, СкЬ, У., Αϊ^^ϊ, 8.Р., МеШοбз 3:66-70, 1991; НелЫ, 8. & Ηеη^кοГГ, ГС., Ртос. Νίώ. Αсаб. 8α. υ8Α 89:10915-10919, 1992; Αί^Μ 8.Р., I. Мοϊ. Ενοϊ. 36:290-300, 1993; СТАТИСТИКА СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ: Кагйп, 8. & Αϊ^^ϊ, 8.Р., Рюс. Ν3ϋ. Αсаб. 8α. υ8Α 87:2264-2268, 1990; КаШп, 8. & Αϊ^Λώ, 8.Р., Ртос. Αсаб. 8ск υ8Α 90:58735877, 1993; ^етЬο, Α., КаШп, 8. & Ζеη!οиη^, О., Αηη. РтоЬ. 22:2022-2039, 1994 апб Αϊ^^ϊ, 8.Р., (1997) Е^Шиабпд !Ье зРайз!^ з1дпйюапсе οΓ тиϊйρϊе бкйпс! ϊοсаϊ айдптепк. Ш Τ^οΐΐ!^ апб Сοтρи!айοηаϊ Мебюбз т Сегюте КезеагсЬ. (8. 8иЬа1, еб.), ρρ. 1-14, Ρϊеηит, №\ν Υο6<.

Промоторная последовательность представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию последовательности. Для определения в рамках настоящего изобретения промоторная последовательность, которая расположена выше кДНК, ограничена на ее 3' конце сайтом инициации транскрипции и продолжается в обратном направлении (в направлении 5') для включения минимального количества оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, которые обнаруживаются по превышению фона. Промоторная последовательность, которая расположена ниже кДНК (для экспрессии (-) РНК), ограничена на ее 5' конце сайтом инициации транскрипции и проходит в прямом направлении (в направлении 3') для включения минимального количества оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, которые обнаруживаются по превышению фона.

Двунаправленная система согласно изобретению включает промоторы прямого и обратного направления (выше и ниже расположенные); однонаправленная система включает только промоторы прямого направления (выше расположенные). В промоторной последовательности находится сайт инициации транскрипции (обычно определяемый, например, картированием с нуклеазой 81), а также домены, связывающие белки (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.

Любой известный промотор можно использовать в настоящем изобретении при условии сохранения существенных элементов изобретения. Так, например, промоторы ροϊ II, которые могут быть использованы для регулирования экспрессии гена, включают без ограничения цитомегаловирусный (СМУ) промотор (патент США № № 5.385.839 и 5.168.062), участок раннего промотора 8У40 (Вегюк! апб СЬатЬοη, №1иге 290:304-310, 1981), промотор, содержащийся в длинном 3' концевом повторе вируса саркомы Рауса

-18006311 (Уатато1о, е! а1., Се11 22:787-797, 1980), промотор тимидинкиназы герпеса (^адпег, е! а1., Ргос. Ναΐΐ. Лсаб. 8с1. и.8.Л. 78:1441-1445, 1985), регуляторные последовательности гена металлотионеина (Впп81ег, е1 а1., №ш.1ге 296:39-42, 1982); промоторы РНК-полимеразы Т7; промоторы РНК-полимеразы Т3; промоторы РНК-полимеразы 8Р6 и другие промоторы, эффективные в клетке-хозяине, представляющей интерес. Промоторы ро1 I для экспрессии некэппированных РНК находятся во всех эукариотах и включают РНК-полимеразу I человека (см. Мо1еси1аг Се11 Вю1оду, Оагпе11 е! а1., еб8 1986, рр.311, 365-6). Промоторы РНК-полимеразы III также могут быть использованы в настоящем изобретении.

Кодирующая последовательность находится под управлением, функционально ассоциирована или оперативно ассоциирована с последовательностями, управляющими транскрипцией и трансляцией (например, промотор ро1 I или ро1 II) в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует данную кодирующую последовательность в РНК, например мРНК или вРНК.

Термины экспрессировать или экспрессия означают пропускание или создание информации в гене или последовательности ДНК, которая обеспечивает их проявление, например получение РНК (включая кРНК, вРНК и мРНК-вируса) или белка путем активирования клеточных функций, участвующих в транскрипции и трансляции соответствующего гена или последовательности ДНК. Последовательность ДНК экспрессируется в клетке или клеткой для получения продукта экспрессии, в частности белка. Сам продукт экспрессии, например полученный белок, также можно назвать экспрессированным клеткой.

Термин трансфекция означает введение чужеродной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина таким образом, чтобы клетка-хозяин экспрессировала введенный ген или последовательность для получения желаемого полипептида, кодированного введенным геном или последовательностью. Введенный ген или последовательность, которые можно также назвать клонированным или чужеродным геном или последовательностью, могут включать регуляторные и управляющие последовательности, в частности старт-, стоп-, промоторные, сигнальные секреторные последовательности, или другие последовательности, используемые генетическими механизмами клетки. Указанные ген или последовательность могут включать нефункциональные последовательности или последовательности, не обладающие известной функцией. Клетка-хозяин, которая получает и экспрессирует введенную ДНК или РНК, трансформируется и представляет собой трансформант или клон. ДНК или РНК, введенная в клетку-хозяина, может поступать из любого источника, включая клетки того же самого рода или вида, что и клетка-хозяин, или другого рода или вида.

Термины вектор, клонирующий вектор или экспрессионный вектор означают средство переноса, с помощью которого последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген), можно ввести в клетку-хозяина, чтобы трансформировать хозяина и способствовать экспрессии (например, транскрипции и трансляции) введенной последовательности. Согласно изобретению предпочтительными векторами являются плазмиды.

Векторы обычно содержат трансмиссивную ДНК агента, в который инсертирована чужеродная ДНК. Общий способ вставки одного сегмента ДНК в другой сегмент ДНК включает применение ферментов, которые называют рестрикционными и которые расщепляют ДНК в специфических сайтах (специфических группах нуклеотидов), называемых рестрикционными сайтами. Термин кассета относится к кодирующей последовательности ДНК или сегменту ДНК, кодирующему продукт экспрессии, который может быть инсертирован в вектор в определенных рестрикционных сайтах. Кассетные рестрикционные сайты предназначены для обеспечения вставки кассеты в соответствующую рамку считывания. Как правило, чужеродную ДНК вставляют в один или несколько рестрикционных сайтов вектора ДНК, а затем переносят вектором в клетку-хозяина вместе с трансмиссивной ДНК вектора. Сегмент или последовательность ДНК, содержащие вставленную или добавленную ДНК, в частности экспрессионный вектор, можно назвать также конструкцией ДНК (ДНК конструктом). Общим типом вектора является плазмида, которая обычно представляет собой автономную молекулу двухнитевой ДНК, обычно бактериального происхождения, которая может легко принимать дополнительную (чужеродную) ДНК и которую можно легко вводить в соответствующую клетку-хозяина. Плазмидный вектор часто содержит кодирующую ДНК и ДНК промотора и имеет один или несколько рестрикционных сайтов, пригодных для вставки чужеродных ДНК. Кодирующая ДНК - это последовательность ДНК, которая кодирует конкретную последовательность аминокислот для конкретного белка или фермента. ДНК промотора - это последовательность ДНК, которая инициирует, регулирует, управляет или иным образом участвует в экспрессии кодирующей ДНК. ДНК промотора и кодирующая ДНК могут быть из одного или разных генов, а также могут быть из одного или разных организмов. Рекомбинантные клонирующие векторы часто включают одну или несколько систем репликации для клонирования или экспрессии одного или нескольких маркеров для селекции в хозяине, например резистентности к антибиотиками, и одну или несколько экспрессионных кассет.

Термин система экспрессии означает клетку-хозяина и совместимый вектор при соответствующих условиях, например, для экспрессии белка, кодированного чужеродной ДНК, которая переносится вектором и вводится в клетку-хозяина.

-19006311

Термин гетерологичный относится к сочетанию элементов, которое не встречается в естественных условиях. Так, например, гетерологичной ДНК называют ДНК, которая в естественных условиях не находится в клетке или в сайте хромосомы клетки. Гетерологичная ДНК предпочтительно включает ген, чужеродный клетке. Гетерологичный элемент, регулирующий экспрессию, - это такой элемент, который оперативно связан с геном, отличным от того гена, с которым этот элемент связан в естественных условиях. В контексте настоящего изобретения ген, кодирующий полипептид, содержащий последовательность из библиотеки последовательностей, является гетерологичным для ДНК вектора, в который он вставлен для клонирования или экспрессии, и гетерологичен для клетки-хозяина, содержащей такой вектор, в которой он экспрессируется.

Как отмечено выше, изобретение позволяет получать реассортированные вирусы с помощью гетерологичных вирусных генов. Кроме введения генов для вирусных антигенов в генетический фон вирусного штамма, адаптированного для хорошего выращивания в культуре, изобретение позволяет создавать межвидовые реассортации, например антиген гриппа В в фенотипе гриппа А.

Вакцины

Как указано выше, настоящее изобретение обеспечивает эффективную и экономичную стратегию получения вакцин для лечения или предотвращения инфекций РНК-вирусов, предпочтительно инфекций РНК-вирусов с отрицательной цепью. Система, основанная на минимальном количестве плазмид, согласно изобретению устраняет необходимость селекции и обеспечивает строгий контроль вариантов реассортированных вирусов. Для получения инактивированной вакцины гриппа шесть плазмид, содержащих негликопротеиновые сегменты (например, РВ1, РВ2, РА, N6, М и N8), из штамма с высоким выходом (например, РК/8/34 (Н1М)) можно котрансфецировать с двумя экспрессионными плазмидами, содержащими НА и NА кДНК рекомендованного субтипа вакцины. Поскольку вирус-помощник не требуется, полученный вирус является вирусом гриппа с желаемой генной структурой. Аналогичным подходом можно воспользоваться для получения любого вида инактивированного реассортированного РНК вируса для применения в вакцине. Экспрессионные плазмиды, содержащие сегменты вирусных генов для интересующего вируса (например, негликопротеиновые сегменты), могут быть котрансфецированы с другими экспрессионными плазмидами, кодирующими белки, которые соответствуют данному субтипу инфекционного вируса (например, вирусному субтипу, который в текущее время циркулирует среди населения). Вирус, полученный в соответствии с изобретением, можно использовать в традиционных или новых подходах к вакцинации (см. ВНке! апб ΙΚηναοΚα Ш: N^с11ο15οп. '№еЬДег апб Мау (ебз.), ТеxΐЬοοк οί [пПиепха, Сйаρΐе^ 32, ρρ. 422-434), в особенности в разработке живых ослабленных вакцин (более подробно рассматривается ниже). Настоящее изобретение, в частности, устраняет недостатки известной технологии, которые касаются разработки реассортированных вирусов с ограниченным кругом хозяев или непрогнозируемым ослаблением (там же).

Множество попыток было предпринято для разработки противогриппозных вакцин (см. νοο6 апб \νίϊϊίηιη5, Ш: N^с1ю15οп. '№еЬ81:ег апб Мау (ебз.), ТеxΐЬοοк οί Мие^а, Сйаρΐе^ 23, ρρ. 317-323). Хотя основная часть данного раздела относится к противогриппозным вакцинам, настоящее изобретение включает все вакцины РНК-вирусов, предпочтительно вакцины вирусов РНК с сегментированной отрицательной цепью, и в частности к вакцинам против Οπίιοιηνχονίι^^.

В настоящее время существует три типа инактивированных противогриппозных вакцин: цельновирионные, субъединичные и поверхностно-антигенные вакцины (см. Vοοб, Ш: N^сйοкοη, VеЬ8ΐе^ апб Мау (ебз.), ТеxΐЬοοк οί Iпί1иепζа, Сйаρΐе^ 25, ρρ. 333-345). Поскольку настоящее изобретение обеспечивает быстрое развитие желаемого реассортированного вируса с приемлемыми характеристиками роста в культуре, оно позволяет изготовителю вакцины получать достаточное количество вакцины, чтобы удовлетворять потребностям здравоохранения, и обеспечивает стандартизацию, что является важным требованием для производства вакцины в клинически необходимых количествах, обычно за период от 8 до 9 месяцев (см. выше, Vοοб, ρ. 333).

Безопасность вакцины тажке является важной задачей (см. \νί^ϊ1<η Ш: N^сйοкοη, ’№еЬ§1ег апб Мау (ебз.), ТеxΐЬοοк οί Iпί1иепζа, Сйаρΐе^ 26, ρρ. 346-357). Поскольку вакцины согласно изобретению можно получать в системах определенных клеточных культур, они не содержат неспецифических патогенов, бактерий и аллергенных белков, которые могут присутствовать в промышленных вакцинах, получаемых в куриных яйцах с зародышем.

С вакцинами (в частности, с противогриппозными вакцинами) используют адъюванты (см. выше, -Ψοο6 апб \νίϊϊίηιη5). Термин адъювант относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунную реакцию на антиген. Адъювант может служить в качестве тканевого депо, которое медленно выделяет антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, которая неспецифически усиливает иммунную реакцию (Ηοο6 е1 ак, ^тиго^^у, 8есοпб Еб., 1984, Вещатгп/Ситттдз: Меп^ Рагк, Саййгша, ρ. 384). Часто первичное контрольное заражение одним антигеном при отсутствии адъюванта не вызывает гуморальной или клеточной иммунной реакции. Адъюванты включают без ограничения полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, в частности гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, в частности лизолецитин, плуроновые высокомолекулярные спирты, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии и адъюванты, потенциально полезные

-20006311 для человека, в частности ВСС (ЬасШе Са1те!!е-Сиегт) и СогупеЬас!егшт рагуцт. Примером предпочтительного синтетического адъюванта является 08-21. В качестве адъюванта можно использовать альтернативно или дополнительно иммуностимулирующие белки, как описано ниже, с целью увеличения иммунной реакции на вакцину. Предпочтительно адъювант является фармацевтически допустимым.

Термин фармацевтически допустимый относится к молекулярным структурам и составам, которые приемлемы физиологически и при введении человеку обычно не вызывают аллергической или сходной неблагоприятной реакции, в частности желудочного расстройства, головокружения и т.п. Используемый в настоящем описании термин фармацевтически допустимый предпочтительно означает разрешенный компетентным органом федерального правительства или правительства штата или включенный в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею в качестве препарата, разрешенного для введения в живой организм, и более конкретно в организм человека. Термин носитель относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводят данное соединение. В качестве носителей, особенно в случае растворов для инъекций, предпочтительно используют стерильную воду или водные физиологические растворы, а также водный раствор декстрозы и растворы глицерина. Пригодные фармацевтические носители описаны Е.^. Майш, Веттд!оп'8 РЬагтасеибса1 8с1епсе5.

Эффективность вакцинации можно повысить путем совместного введения с вакциной, в частности с векторной вакциной, иммуностимуляторной молекулы (8а1да11ег апб Ьобде, 1. 8игд. Опсо1. 1998, 68:122), например иммуностимуляторного, иммунопотенциирующего или противовоспалительного цитокина, лимфокина или хемокина. Так, например, можно использовать цитокины или гены цитокинов, в частности интерлейкин ΣΕ-1, [Ь-2, [И-3, [И-4, [Ь-12, [И-13, гранулоцитомакрофаг-(СМ) - колониестимулирующий фактор (С8Е) - и другие колониестимулирующие факторы, воспалительный фактор макрофагов, лиганд Е1!3 (Ьутап, Сигг. Орт. Нета!о1., 5:192, 1998), а также некоторые ключевые костимуляторные молекулы или их гены (например, В7.1, В7.2). Эти иммуностимуляторные молекулы можно вводить системно или локально, в виде белков или путем экспрессии вектора, который кодирует экспрессируемые молекулы.

Направленная доставка препарата в дендритные клетки

Вакцинацию можно проводить путем направленной доставки препарата в дендритные клетки (8!ештапп, I. ЬаЬ. С1т. Меб., 128-531, 196; 8!еттап, Ехр. Нета!о1., 24:859, 1996; Табе е! а1., Ьеикет1а, 13:653, 1999; Ау1дап, В1ооб Веу., 13:51, 1999; О1№со1а е! а1., Су!окте§ Се11 Мо1. Тбег., 4:265, 1998). Дендритные клетки играют ключевую роль в активации Т-лимфоцитзависимого иммунитета. Пролиферирующие дендритные клетки можно использовать для того, чтобы ш 8Йи захватить антигены белков в иммуногенной форме, а затем представить эти антигены в такой форме, которую могут распознать и стимулировать Т-лимфоциты (см., например, 8!е1птап, Ехрег. Нета!о1. 24:859-862, 1996; Шаба, е! а1., Е Ехр. Меб., 188:2163-73, 1998 и патент США № 5.851.756). Для ех у1уо стимуляции дендритные клетки высевают в планшете с культурой и подвергают воздействию вирионов (кратковременному) в достаточном количестве и в течение достаточного периода времени, чтобы обеспечить связь вирусных антигенов с дендритными клетками. После этого прошедшие обработку клетки можно снова трансплантировать субъекту, подвергающемуся лечению, например путем внутривенной инъекции. Предпочтительно используют аутологические клетки, т. е. дендритные клетки, полученные от субъекта, подвергаемого лечению, однако, возможно использовать дендритные клетки, соответствующие МНС (главный комплекс гистосовместимости)-класс II, которые можно получить от донора соответствующего типа или путем генной инженерии дендритных клеток для экспрессии желаемых молекул МНС (и предпочтительно подавления экспрессии нежелательных молекул МНС).

Дендритные клетки предпочтительно используют в качестве мишеней в живом организме для поглощения вируса или вирусных субблоков. Существуют различные стратегии для направленной доставки препарата в дендритные клетки в живом организме за счет использования рецепторов, которые обеспечивают представление антигенов, в частности ИЕС-205 (8\\щдагб е! а1., Се11. Iттиηо1., 165:302-11, 1995; 8!ештап, Ехр. Нета!о1., 24:859, 1996) и рецепторов Ес.

Инактивированные вакцины

Вакцины инактивированных вирусов успешно применяют для вакцинации против инфекции РНКвируса (например, вируса гриппа) (см. №с1ю1, Ш: №сбо1§оп, ^еЬ§!ег апб Мау (еб§.), Тех!Ьоок о£ Iηί1иеηζа, Сбар!ег 27, рр. 358-372). Для получения инактивированного вируса трансфецированный вирус выращивают в клеточной культуре или в куриных яйцах с зародышами. Вирус можно инактивировать путем обработки формальдегидом, бета-пропиолактоном, эфиром, эфиром с детергентом (например, Ттееп-80), цетилтриметилбромидом аммония (СТАВ) и Тгбоп N101, дезоксихолатом и три(н-бутил)фосфатом (см. выше, Ецгттдег; \Уооб апб ^ббатк). Инактивацию можно проводить после или до осветления аллантоиновой жидкости (от вируса, выращенного в куриных яйцах); вирионы выделяют и очищают путем центрифугирования (см. выше, Ецгттдег, р. 326). Чтобы определить эффективность вакцины, можно использовать пробу на простую радиальную иммунодиффузию (8ВЭ) (8сЫ1б е! а1., Ви11. \Уог1б Неабб Огдап. 1975, 52:43-50 апб 223-31 МоЧо\у е! а1., I. С1т. М1сгоЬю1. 1975, 2:531). Доза, необходимая для получения удовлетворительной иммунной реакции, стандартизирована и составляет 15 мкг НА/штамм/доза. Инактивированную вакцину можно вводить внутримышечно с помощью инъекции.

-21006311

Живые ослабленные противогриппозные вакцины

Ослабленные, адаптированные к холоду живые вакцины РНК-вирусов (противогриппозные вакцины) являются известными (см. Кейе1 апб Р1ебга, Ш: №с1ю1коп, \АеЬк1ег апб Мау (ебк.), Тех!Ьоок оГ Iπί1иепζа, С11ар1ег 28, рр. 373-390; Скебоп, Ш: №ско1коп, \АеЬк1ег апб Мау (ебк.), ТехЛоок оГ Iπί1иеπζа, Скар!ег 29, рр. 391-399). Возможность образования вирусов гриппа всего из восьми плазмид позволяет регулировать ослабление штамма вакцины и получать штамм вакцины, оптимально подходящий для вакцинируемой части населения (см. В11ке1 апб Катеаока, выше). Поскольку штаммы гриппа А/Апп АгЬог/6/60 (Η2Ν2) или В/Апп АгЬог/1/66 в настоящее время используют для получения живых ослабленных вакцин, можно вводить каждую из шести кДНК внутренних генов (РВ2, РВ1, РА, ΝΡ, М, N8) в плазмиду, в частности в рН\У2000. Две плазмиды, содержащие гликопротеины НА и ΝΑ соответствующего штамма гриппа, конструируются и котрансфецируются с шестью главными плазмидами, кодирующими негликозилированные белки гриппа.

Предполагается, что генетическая модификация кодирующей или некодирующей области внутренних генов повышает безопасность, инфицирующую способность, иммуногенность и защитную эффективность вакцины, а также обеспечивает получение ослабленного вируса.

Манипуляция геном НА также может увеличивать безопасность штамма вакцины. Так, например, удаление основных аминокислот, содержащихся в соединительном пептиде гликопротеинов Н5 или Н7 высокопатогенных вирусов гриппа А птиц, может увеличивать безопасность вакцины.

Вакцинация через слизистую оболочку

Стратегия вакцинации через слизистую оболочку особенно эффективна для множества патогенных вирусов, поскольку инфекция часто проникает через слизистую оболочку. Слизистая оболочка накапливает дендритные клетки, которые являются важными мишенями для вакцин ΕΒΝΑ-1 и иммунотерапии. Таким образом, рассматривается стратегия вакцинации через слизистую оболочку инактивированными и ослабленными противовирусными вакцинами.

Поскольку вакцину можно вводить в слизистую оболочку локально, используют различные стратегические подходы для доставки иммуногенных белков в слизистую оболочку.

В специфическом варианте реализации вакцину можно вводить в смеси или в качестве конъюгата или химерного белка слияния с холерным энтеротоксином, в частности с холерным энтеротоксином В или химерой холерного энтеротоксина А/В (НадккепдаШк, 1. Iттипо1., 154:4322-32, 1995; 1оЬ1тд апб Но1тек, !пГес1. Iттип., 60:4915-24, 1992). Вакцины для введения в слизистую оболочку на основе применения субъединицы холерного энтеротоксина В описаны в литературе (ЬеЬепк апб Но1тдгеп, Эеу. Вю1. 8!апб. 82:215-27, 1994). В другом варианте реализации примесь с термолабильным энтеротоксином (ЬТ) можно получить для вакцинации через слизистую оболочку.

Другие стратегические подходы к иммунизации через слизистую оболочку включают инкапсуляцию вируса в микрокапсулы (патенты США № 5.075.109, № 5.820.883 и № 5.853.763) и использование иммунопотенциирующего мембранного носителя (ААО 98/0558). Иммуногены, вводимые иммуногенетически или перорально, можно усилить с помощью красных кровяных телец (гЬс) или гемолизированных эритроцитов (патент США № 5.643.577), а также путем применения антигена «Ь1ие 1опдце» (патент США № 5.690.938).

Примеры

Настоящее изобретение поясняется следующими примерами, которые иллюстрируют изобретение, не ограничивая его.

Пример 1. Амтисмысловой подход к получению вируса гриппа А: синтез вРНК и мРНК с одной матрицы.

На первом этапе уменьшения количества плазмид данный пример описывает конструкцию и трансфекцию плазмид, содержащих промотор ро1 I и ро1 II на одной и той же плазмиде, и подтверждает, что эта система позволяет выполнять экспрессию вРНК и белка с одной матрицы. Этот пример опубликован в литературе (НоГГтапп е! а1., У1го1оду 2000, 267:310).

Материалы и методики

Клонирование плазмид.

Все реакции клонирования и РСК выполняли согласно стандартным протоколам. Вкратце, экспрессионные плазмиды для генов полимеразного комплекса ЛЛА8\А№33 получали из рс^NΑ3 Дпуйтодеп), содержащей предранний промотор для цитомегаловируса (СМУ) человека и поли(А)-сайт гена, кодирующего гормон роста быка (ВСН). Вирусные кДНК получали из плазмид р\У№143, р\У8№Л3, р\У8№В2-14, рС\А-РВ1, чтобы получить экспрессионные конструкции рН\У25-№, рН\У23-РА, рН\У21-РВ2, рН\У22-РВ1. рН\У12 получали путем вставки промотора ро1 I человека и последовательностей терминатора между промотором ро1 II и поли(А)-сайтом. Плазмиду рН\У52 получали из рН\У12 вначале путем вставки олигонуклеотидов, содержащих некодирующую область РВ1, расширенную сайтами НшбШ и ХйоБ а затем путем вставки в эти сайты РВ1-кодирующей области из рН\У22-РВ1. Плазмиду рН\У82-РВ1 получали из рН\У52-РВ1 путем удаления последовательностей промотора СМУ. Кодирующую область для энхансерного зеленого флуоресцирующего белка (ЕСЕР) в репортерной конструкции рН\У72-ЕСЕР получили после РСК-амплификации с помощью рЕСЕР-ΝΙ (С1оп!еск) в качестве матрицы и вставки кДНК после разрезания БасП/ХМ в плазмиду рН\72, содержащую промотор ро1 I человека и терминатор мыши, а некодирующую область М-сегмента отделили сайтами 8асП/ХйоР рН\ 127-М и рН\128-Ы8 конструировали путем амплификации КТ-РСК вирусной РНК с праймерами, содержащими сегмент-специфические последовательности и сайты ВктВ[ для вставки в вектор рНН21, ферментированный ВктВ[ (Е. Нойатапп, Рй. Ό. Тйекк 1997, 1ик!ик ЫеЫд Ищуегкйу, С1екеп, Сегтапу; №итапп е! а1., Ргос. №И. Асаб. δοΐ. И8А 1999, 96:9345). Конструкция плазмид рРОП-Ш№РВ1; рРОП-Ш№РВ2, рРОИ-\δΝ-РВА, рРОП-^δΝ-ΝΓ; рРОП-№8№НА, рРОП-Ш№т, рЕ\\'8\-НА и рСАСС8-У\А15 широко описана (см. выше, №итапп е! а1.).

Культура и трансфекция клеток.

Клетки почек собаки Мабш-ЭагЬу (МОСК) поддерживали на модифицированной среде Игла (МЕМ), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ8), почечные клетки эмбриона человека 293Т выращивали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (ИМЕМ) и содержащей 10% РВ8. ТгапЧТ ЬТ-1 (Рапуега, Мэдисон, Висконсин) использовали согласно инструкциям изготовителя для трансфекции 1х10⁶ клеток 293Т. Различное количество плазмид (табл. 1) смешивали с ТгапкГТ ЬТ-1 (2 мкл ТгапкГТ ЬТ-1 на 1 мкг ДНК), выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин и добавляли к клеткам. Через 6 ч трансфекционную смесь ДНК заменяли на ОрЕ-МЕМ (61Ьсо/ВКЬ, СаййегкЬигд, Магу1апб), содержащую 0,3% альбумина бычьей сыворотки (В8А) и 0,01% РВ8. Через 48 ч после трансфекции кондиционированную среду, содержащую вирус, титровали в клетках МОСК.

Выделение РНК и КТ-РСК.

Вирусную РНК выделяли из вирусных частиц с помощью набора Кпеаку-Кй (О|а§еп, Валенсия, Калифорния) согласно инструкциям изготовителя. Для характеризации рекомбинантных вирусов гриппа использовали набор Ассекк КТ-РСК (Рготеда, Мэдисон, Висконсин) согласно представленному протоколу. Следующие праймеры использовали в экспериментах с КТ-РСК: 8ес.| РВ1#1: 5'-АСС АТС ССА ТТС СТС ААС С-3' (8ЕС) ГО ^:1); 8е(] РВ1#2: 5'-ССТ АТС СТТ ТСС АСА ССС СС-3' (8ЕС) ГО ^:2); ВтРВ1-1: 5'-ТАТ ТСС ТСТ САС ССА ССС ААА ССАССС А-3' (Б ЕС) ГО ^:3); Вт-РВ1-2341К: 5'-АТА ТСС ТСТ ССТ АТТ АСТ АСА ААС ААС ССА ТТТ -3' (8ЕС) ГО ^:4). Эксперименты с КТ-РСК проводили с помощью установки РТС-200 ЭХА (М1 Кекеагсй, Уотертаун, Массачусетс). Программу амплификации начинали с 1 цикла при 48°С в течение 45 мин (синтез первой цепи кДНК) и 1 цикла при 94°С в течение 2 мин (инактивация обратной транскриптазы АМУ и денатурация кДНК). За этими циклами следовали 40 циклов при 94°С в течение 20 с, 52°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с (амплификация РСК); программу завершал один цикл при 72°С в течение 5 мин. Продукты РСК анализировали способом электрофореза в агарозном геле и секвенировали с праймером 8ес.|-РВ1#1 или 8ес.|-РВ1#2.

Проточная цитометрия.

Через 48 ч после трансфекции клетки 293Т промыли фосфатно-буферным физиологическим раствором (РВ8), осадили центрифугированием и ресуспендировали в РВ8 плюс 5% РВ8. Анализ способом проточной цитометрии проводили с помощью проточного цитометра РАС8 СайЬиг (Вес!оп Оюкткоп) и анализировали данные с помощью комплекта программного обеспечения Се110иек1. Для анализа экспрессии ЕСРР использовали излучение с длиной волны 530 нм (РЬ1), чтобы обеспечить высокую чувствительность для определения ЕСРР по флуоресценции.

Результаты и обсуждение

Конструкция и характеристики клонирующего вектора рН\ 12, содержащего два эукариотических промотора.

Вирусы гриппа А являются сегментированными вирусами, которые содержат молекулы РНК с отрицательной полярностью. Во время цикла репликации распознавание структур 5'- и 3' концов восьми сегментов вРНК белками рибонуклеопротеинового комплекса (РВ2, РВ1, РА, ΝΕ) приводит к репликации и транскрипции генов вирусов гриппа. Поскольку элементы концевой последовательности являются чрезвычайно консервативными, транскрибируемая искусственная РНК должна иметь такие же последовательности на 5' и 3' концах (Ьио е! а1., I. У1го1. 1991, 65:2861; Рйск е! а1., КИА 1996, 2:1046). Клонирующий вектор рН\ 12 сконструировали таким образом, чтобы обеспечить вставку представляющих интерес последовательностей между промотором и терминатором ро1 I с помощью рестрикционной эндонуклеазы ВктВк С обеих сторон от транскрипционного блока ро1 I расположены промотор ро1 II из цитомегаловируса (СМУ) и сигнал полиаденилирования гена, кодирующего бычий гормон роста. Промотор СМУ, поли(А)-сайт и каркас плазмиды получают из клонирующего вектора рсОНА3.

Экспрессия белка РВ1 в двунаправленной транскрипционной системе ро1 ^ро1 II.

Для испытания плазмидной транскрипционной системы кДНК гена РВ1 вируса А/\8Н/33 инсертировали в клонирующий вектор рН\12 для получения плазмиды рН\52-РВ1. Рестрикционные сайты НшбШ и XйоI инсертировали в некодирующие 5' и 3' области этого гена. Эти генетические метки были включены, чтобы обеспечить возможность идентификации полученного рекомбинантного вируса при КТ-РСК. Мы ожидали, что клетки человека, трансфецированные этой плазмидой, образуют два типа РНК: РВ1-вРНК, синтезированную клеточным ро1 I, и мРНК со структурой 5'-кэп, синтезированную ро1 II. Трансляция мРНК приводит к синтезу белка РВ1.

-23006311

Чтобы проверить, образуется ли белок РВ1 из этой конструкции, мы испытали репликацию и транскрипцию искусственной вРНК путем конструирования плазмид ρΗ\21-ΡΒ2, ρΗ\ν23-ΡΑ и ρΗ\ν25ΝΡ, которые содержат кДНК, кодирующие белки РВ2, РА и ΝΡ от Α/ν3Ν/33 под управлением промотора СМУ. Для ίη νίνο синтеза искусственной вРНК мы сконструировали репортерную плазмиду ρΗ\ν72ΕΟΕΡ, содержащую ΕΟΕΡ кДНК, с обеих сторон от которой находятся некодирующая область М-сегмента и промотор ро1 I человека и терминатор мыши. 5 плазмид (2 мкг ρΗ\ν21-ΡΒ2, 2 мкг ρΗ\ν52-ΡΒ1 (конструкция промотора ро1 Ьро1 II), 2 мкг ρΗ\ν23-ΡΑ, 2 мкг ρΗ\ν25-ΝΡ и 1 мкг ρΗν72-Ε6ΕΡ) трансфецировали в клетки 293Т. Через 24 и 48 ч после трансфекции клетки анализировали способом флуоресцентной микроскопии. Через 24 ч наблюдали флуоресцирующие клетки. Этот результат показывает, что в течение 24 ч полимеразные белки синтезируются в концентрации, достаточной для того, чтобы обеспечить распознавание специфических концов ΕΟΕΡ-вРНК вируса гриппа. Эти белки синтезируют МРНК, которая транслируется в Ε6ΕΡ.

Для оценки эффективности такой системы мы провели проточный цитометрический анализ, чтобы рассчитать количество флуоресцентных клеток. Через 48 ч после трансфекции пяти плазмид 18,72% популяции клеток проявили флуоресценцию. Без добавления плазмиды ρΗ\ν52-ΡΒ1 наблюдали только фоновый уровень флуоресцентных клеток (0,06%); этот результат согласуется с проведенными ранее исследованиями, которые показали, что все четыре комплексных белка ΡΝΡ необходимы для амплификации вРНК (Инапд е! а1., ί. У1го1. 1990, 64:5669). Полученные результаты показывают, что транскрипция РВ1-кДНК и концентрация образующегося белка РВ1 вместе с другими белками ΚΝΡ комплекса достаточна для инициации процесса вирусной транскрипции/репликации.

Получение рекомбинантного вируса гриппа А.

Для получения инфекционного вируса гриппа А необходимо, чтобы плазмида ρΗ\ν52-51 обеспечивала получение не только мРНА РВ1 и белка, но и достаточного количества вРНК РВ1, которую можно упаковать в вирус потомства. Для остальных семи вРНК мы использовали плазмиды, которые содержат кДНК для полноразмерных РНК вируса Α/Ψ3Ν/33, находящиеся между промотором ро1 I человека и терминатором мыши. Трансфекция этих плазмид должна приводить к синтезу всех восьми вирусных РНК, которые реплицируются и транскрибируются полимеразными белками, образующими новые νΚΝΡ. После синтеза структурных белков ΡΝΡ упаковываются в новые вирусные частицы.

Мы трансфецировали клетки 293Т различным количеством плазмиды ρΗ\ν52-ΡΒ1 (0, 2, 4 мкг) вместе с плазмидами ρΡο11-ν3Ν-ΡΒ2, ρΡο11-ν3Ν-ΡΑ, ρΡο11-\\'3\-11.У ρΡο11-ν3Ν-ΝΡ, ρΡο11-ν3Ν-ΝΑ, ρΗ\ν127-Μ, ρΗ\ν128-Ν3 (по 1 мкг каждой). Экспрессионные плазмиды для белков ρΗ\ν21-ΡΒ2 (1 мкг), ΡΗν23-ΡΑ (0,1 мкг), ρΗ\ν25-ΝΡ (1 мкг), ρΕνδΝ-ΗΑ (1 мкг) и ρί.Ά663-\νΝΑ15 (1 мкг) были котрансфецированы. Экспрессионные плазмиды для гемагглютинина (НА) и невраминидазы (ΝΑ) включили для увеличения выхода трансфектантного вируса.

Через 48 ч после трансфекции супенатант первично трансфецированных клеток 293Т перенесли в клетки МОСК. Во всех опытах по трансфекции, в которых добавляли плазмиду ρΗν52-ΡΒ1, через 24 ч после пассирования мы наблюдали вирусно-индуцированный цитопатический эффект. Если плазмиду, экспрессирующую РВ1, не включали в трансфекционную реакцию, цитопатический эффект отсутствовал. Вирусный титр определяли путем титрования супернатанта трансфецированных клеток на клетках МОСК; при этом определили, что супернатант содержит 2х10⁴-2х10⁵ р£и/мл. Этот результат показывает, что после трансфекции плазмиды ΡΒ1-ρο1 Ьро1 П-промотор (вместе с экспрессионными плазмидами) в клеточной линии 293Т человека синтезируются вРНК РВ1 и белок РВ1 на уровне, достаточном для получения инфекционных вирусов гриппа А. В опытах по контрафекции с плазмидами, содержащими РВ1кДНК, разделенные между двумя плазмидами (рИ\82-РВ1 и ρΗ\ν22-ΡΒ1), титр вируса получили равным 2х10⁴ р£и/мл; аналогичный опыт с использованием плазмид с последовательностями РВ1 дикого типа (ρΡο1 !-\§Ν-ΡΒ1 и ρΗ\ν22-ΡΒ1) дал результат титра вируса 3х10⁶ р£и/мл.

В отличие от экспрессионной конструкции с промотором ро1 II, которую использовали в предшествуем исследовании (Ыеитап е! а1., Ριόο. Ыаб. Αοο6. ЗсР ϋδΑ 1999, 96:9345), мы применили плазмиду ρΗν52-ΡΒ1, которая содержит последовательности, полученные из транскрипционного блока ро1 I и инсертированные между промотором СМУ и сайтом полиаденилирования. Экспрессия репортерного гена ΕΟΕΡ показывает, что общая экспрессия белка РВ1 в этой системе достаточна для образования комплексов ΕΟΕΡ-ΚΝΡ. Хотя область промотора/терминатора ро1 I содержит последовательности распознавания специфических факторов транскрипции и терминации ро1 I (Βесктаηη е! а1., Заепсе 1995, 270:1506; Βе11 е! а1., Заепсе 1998, 241:1192; КиЬп е! а1., ΕМΒΟ 1. 1994, 13:416), эти ДНК связывающие белки, видимо, не препятствуют транскрипции посредством ро1 II. Эти результаты согласуются с результатами, согласно которым ро1 I специфичные ДНК связывающие белки более изобильно представлены в ядрышке, т.е. в компартменте, в котором происходит транскрипция клеточной рДНК (Буегк е! а1., ΕМΒΟ ί. 1995, 14:1248). Эти результаты показывают, что после трансфекции ро1 Ήρο1 II промоторной конструкции в клетку некоторые плазмиды доставляются в ядрышко, где происходит транскрипция посредством ро1 I, а другие остаются в ядре, где они транскрибируются РНК-полимеразой II.

Поскольку репортерная структура ρΗ\ν52-ΡΒ1 содержала дополнительные последовательности, не относящиеся к вирусу гриппа (рестрикционные сайты) в некодирующей области перед инициирующим кодоном и после терминирующего кодона, нас заинтересовал вопрос, сохраняется ли стабильность этих последовательностей в РВ1 сегменте вирусной РНК. Поэтому мы выделили вРНК после второго пассирования вируса трансфектанта на клетках МОСК и провели анализ с помощью КТ-РСК Амплификация вРНК с РВ1-специфическими праймерами привела к образованию фрагментов кДНК с ожидаемыми размерами. При использовании тех же самых вирусной ДНК и праймеров, но без добавления обратной транскриптазы, продукт амплификации не образовывался; отсюда следует, что из супернатанта трансфецированных клеток переносится кРНК, полученная из вирусной РНК, а не из плазмидной ДНК.

Секвенирование продуктов РСК показало, что обе последовательности рестрикционного сайта присутствуют в молекуле РНК. Полученные результаты показывают, что система транскрипции ροϊ I/ ροϊ II позволяет получать инфекционный рекомбинантный вирус и что вирус с чужеродными последовательностями в некодирующей области гена РВ1 является жизнеспособным. Этот модифицированный сегмент РВ1 все-таки реплицируется, транскрибируется и упаковывается в вирусные частицы. Предварительно изменили некодирующую область сегментов вируса гриппа А за счет использования системы трансфекции ΚΝΡ. Путем замены некодирующей области гена ΝΑ соответствующей последовательностью сегмента N3 трансфектанта гриппа В получили вирусы гриппа (Мийег с1 ак, Ргос. ΝαΙϊ. Асай. Зек ИЗА 1991, 88:5177; ВегдтаЬЬ апй Ми51ег, 1. Сеп. νίτοϊ. 1995, 76:3211). Этот тип вируса с химерным сегментом ΝΑ показал ослабленный фенотип у мышей и защищал мышей, инокулированных нелетальной дозой, от заражения инфекцией вируса гриппа дикого типа. Эти результаты показывают, что генетическое изменение некодирующей области сегмента РНК может менять биологические свойства трансфектантного вируса. Здесь мы впервые сообщаем о том, что даже чужеродные вирусу гриппа последовательности могут быть инсертированы в некодирующую область сегмента РВ1.

С помощью транскрипционной системой ροϊ νροϊ II теперь стало возможным систематически модифицировать эти элементы последовательностей в некодирующей области сегмента РВ1 и оценивать, приводят ли эти генетические манипуляции к изменениям биологических свойств рекомбинантных вирусов. Действительно, низкий выход вирусов с мутированным сегментом РВ1 по сравнению с вирусом дикого типа указывает на то, что инсертированные последовательности оказывают отрицательное влияние на рост вируса.

Разработанная недавно система на основе плазмидного вектора (см. выше, №итапп е1 ак) является чрезвычайно эффективной для получения вируса гриппа, однако, она требует клонирования 14-17 плазмид. В данном исследовании мы снизили до 13 количество плазмид, необходимых для эффективного получения штамма вируса Α/\ν3Ν/33 гриппа. Уменьшение количества плазмид, которое обеспечивает данный подход, обещает увеличение эффективности трансфекции клеточных линий, отличных от клеток 293Т, что позволяет доставлять гены в такие клеточные линии, в которые затруднена эффективная доставка 14 плазмид. Ρο^τ е1 ак (1. νίτοϊ. 1999, 73:9679) смогли получить вирус гриппа после трансфекции 12 плазмид, однако, выход вируса в этом эксперименте составил всего 1-2 частицы инфекционного вируса на 10⁶ трансфецированных клеток Vе^ο.

Пример 2. Конструирование рекомбинантных вирусов гриппа А из системы с минимальным количеством плазмид.

Данный пример описывает применение трансфекционной системы на основе плазмидного вектора для получения вируса гриппа А исключительно из клонированной кДНК. В отличие от известных систем на основе плазмидного вектора эта система для получения вируса гриппа А использует конструкцию и трасфекцию всего восьми экспрессионных плазмид, каждая из которых содержит одну копию отличной вирусной кДНК, соответствующей сегменту вирусного гена. Такая обратная генетическая система уменьшает количество плазмид, необходимое для получения вирусов гриппа А, и позволяет выполнять прогнозируемое и эффективное воспроизведение реассортированных вирусов.

Материалы и методики

Клонирование плазмид.

Плазмиду ρΗν2000 (фиг. 3А) получили из ρΗν12 (пример 1). Клонирующий вектор ρΗν2000 содержит 225 Ьρ промотора ροϊ I человека и 33 Ьρ терминатора мыши, отделенные двумя сайтами ВлпВк Элементы промотора ροϊ I и терминатора находятся между процессированным предранним промотором цитомегаловируса человека (начиная примерно на 350 Ьρ выше начального сайта траснкрипции, как в ρηΟΝΑ3, Ρινί) годен, Карлсбэнд, Калифорния) и сигналом полиаденлирования гена, кодирующего гормон роста быка. Восемь плазмид, содержащих кДНК вируса Α/ν3νΝ/33 (Η1Ν1) (ρΗν181-ΡΒ2, ρΗν181РВ1, ρΗν183-ΡΑ, ρΗν184-ΗΑ, ρΗν185-ΝΡ, ρΗν186-ΝΑ, ρΗν187-Μ и ρΗν188-Ν3), сконструировали путем вставки фрагментов Αρаϊ-3аII (с вирусной кДНК и последовательностями промотора и терминатора ροϊ I) плазмид ρΡοϊϊ-V3N-РВ2, ρΡοϊϊ-ν3Ν-ΡΒ1, ρΡοϊϊ-ν3Ν-ΡΑ, ρΡοϊϊ-ν3Ν-ΝΡ, ρΡοϊϊ-ν3Ν-ΗΑ, ρΡοϊϊν3Ν-ΝΑ (№итапп е1 ак, Ргос.№Й. Αсай.3с^. υ3Α 1999, 96:9345), ρΗν127-Μ и ρΗν128-Ν3 (пример 1) во фрагмент вектора Αρа1-3а1I ρΗν2000. Восемь плазмид, содержащих кДНК Α/Теа1/ΗК/V312/97 (Η6Ν1) (ρΗν241-ΡΒ2, ρΗν242-ΡΒ1, ρΗν243-ΡΑ, ρΗν244-ΗΑ, ρΗν245-ΝΡ, ρΗν246-ΝΑ, ρΗν247-Μ и ρΗν248-Ν3) сконструировали с помощью амплификации вирусной РНК ПЦР с обратной транскриптазой (КТ-РСК). Праймеры, используемые в реакции РСК, содержали сегмент-специфические последовательности на 3' конце и последовательности рестрикционных сайтов 35тВ! или 35а! на 5' конце. После разре

-25006311 зания продуктов РСК с помощью ВзтВ1 или Вза1 фрагменты клонировали в вектор р11^2000 (фиг. 3А). Последовательности праймеров, используемые для амплификации генома вируса ААеа1/НКЖ312/97 (Η6Ν1), приведены ниже. Праймеры показаны слева направо, что соответствует 5' и 3' концам. Специфические нуклеотиды вируса гриппа А подчеркнуты.

• N3:

Βπ>Ν8#Ι: ТАТТСОТСТСАСООАССААААССАСССТС (ЗЕО 0 N0:5)

Вт4\18#2: АТАТСОТСТСОТАТТАОТАОАААСААОООТОТТТ (ЗЕО 0 N0:6) • М:

Вп>М#1: ТАТТС0ТСТСА666А0САААА6САС0ТА0 (ЗЕО 0 N0:7)

Вт-М#2: АТАТС0ТСТС0ТАТТАСТА0АААСААС0ТА01Ι ΓΤΙ I (ЗЕО0N0:8) • ΝΑ

Вт-ΝΑΜ: ТАТТС0ТСТСА600А6САААА0СА66А0ТГТААСАТ0 (ЗЕО 0 N0:9) ΒΓΠ-ΝΑ-1413Β: АТАТСОТСТСОТАТТАОТАОАААСААООАОТТТГТ (ЗЕО 0 N0:10) • НА

Вт-Н64 ТАТГСОТСТСАОООАОСААААОСАССООААААТС (ЗЕО 0 N0:11)

Βγπ-Ν3#2: АТАТС0ТСТС0ТАТТА6ТА0АААСАА000Т0ТТТ (ЗЕО 0 N0:12) (примечание: сегменты НА и ΝΑ в этой части некодирующей области имеют идентичные последовательности) • ΝΡ:

Ва-ΝΡ-Ι: ТАТТСОТСТСАбООАбСОАААОСАОООТА (ЗЕО 0 N0:13)

Β3-ΝΡΙ565Β: АТАТСОТСТСОТАТГАОТАОАААСААОООТАТТ (ЗЕО 0 N0:14) • РА

Вт-РА1-1: ТАТТСОТСТСАОООАОСОАААССАСОТАСТОАТСС (ЗЕО 0 N0:15)

ВГП-РА1-2231 К: АТАТС6ТСТС0ТАТТА0ТА0АААСАА0СТАСТТТТТ (ЗЕО 0 N0:16) • РВ1:

Вт-РВ1 а-1: ТАТТСОТСТСАОООАОСОАААОСАООСАААСС (ЗЕО 0 N0:17)

Вт-РВ1-2341 В: АТАТСОТСТСОТАТТАОТАОАААСААООСАТТТ (ЗЕО 0 N0:18) • РВ2:

Ва-РВ24: ТАТТ06ТСТСА060А0С0АААССА0СТСААТТАТАТТС (ЗЕО 0 N0.19)

Ва-РВ2-2341К: АТАТ06ТСТС6ТАТТАСТА0АААСАА66ТС6ТТПТ (ЗЕО 0 N0:20)

Реакцию КТ проводили с праймером 5'-АОСААААОСАОО-3' (8ЕР ΙΌ N0:21). Для проверки того, что вирусные кДНК, полученные в результате амплификации КТ-РСК в экспрессионных плазмидах, не содержат нежелательных мутаций, инсертированные кДНК секвенировали.

Вирусы и клеточная культура.

Вирусы гриппа А/Теа1/НКЖ312/97 (Η6Ν1) культивировали в 10-дневных куриных яйцах. Клетки почек собак Мабт-БагЬу (МОСК) поддерживали в модифицированной среде Игла (МЕМ), содержащей 10% ТВ8. Клетки почек эмбриона человека 293Т культивировали в Ορΐΐ-МЕМ Е (1чТе Тесйпо1од1ез, Гайтесбург, Мериленд), содержащей 5% ТВ8. Для опытов по трансфекции использовали планшеты с шестью лунками для культуры тканей. Накануне трансфекции конфлюэнтные клетки 293Т и МОСК во флаконе объемом 75 см² обработали трипсином и 10% каждой клеточной линии смешали в 18 мл ОрЕМЕМ I; 3 мл этой клеточной суспензии высеяли в одну из шести лунок планшета. Совместно культивируемые клетки МОСК и 293Т (0,2-1х10⁶ клеток каждого типа в лунке) использовали в опытах по трансфекции. Для трансфекции клеток использовали Тгапз1Т ЕТ-1 (Рапуега, Мэдисон, Висконсин) согласно инструкциям изготовителя. Вкратце, смешали 2 мкл Тгапз1Т ЕТ-1 на 1 мкг ДНК, вырастили при комнатной температуре в течение 45 мин и добавили к клеткам. Через 6 ч трансфекционную смесь заменили на ОрЕМЕМ I. Через 30 ч после трансфекции к клеткам добавили 1 мл Ορΐΐ-МЕМ I, содержащей ТРСК-трипсин; это добавление привело к конечной концентрации ТРСК-трипсина, равной 0,5 мкг/мл, в клеточном супернатанте. Вирусный титр клеточного супернатанта определяли титрованием супернатанта на клетках МОСК.

Выделение РНК и КТ-РСК.

Вирусные РНК выделяли из вирусных частиц с помощью набора Кпеазу-КЕ (Р1а§еп, Валенсия, Калифорния), который использовали согласно инструкциям изготовителя. Для характеризации рекомбинантных вирусов гриппа использовали набор Ассезз КТ-РСК (Рготеда, Мэдисон, Висконсин) согласно представленному протоколу. Следующие праймеры использовали в экспериментах по КТ-РСК: Вт-№#1 (5'-ТАТ ТСО ТСТ САО ООА ОСА ААА ОСА ООО ТО-3; 5ЕО ΙΌ N0:5) и Вт-^#2 (5'-АТА ТСО ТСТ СОТ АТТ АОТ АОА ААС ААО ООТ ОТТ ТТ-3; ВЕС) ΙΌ N0.12). Эксперименты с КТ-РСК проводили с

-26006311 помощью установки РСТ-200 ΌΝΑ (М1 Кезеатсй, Уотертаун, Массачусетс). Программу амплификации начинали с 1 цикла при 48°С в течение 45 мин и 1 цикла при 94°С в течение 2 мин.

За этими циклами следовали 40 циклов при 94°С в течение 20 с, 52°С в течение 30 с и 72°С в течение 40 с; программу завершал один цикл при 72°С в течение 5 мин. Продукты РСК анализировали способом электрофореза в агарозном геле и секвенировали с праймером Βιη-ΝΒ1^;;1. Последовательность матрицы ДНК определяли в Центре биотехнологии детской исследовательской больницы Сент-Джуда с помощью наборов реактивов для секвенирования с использованием терминационного цикла с родамином или красителем бКобашш, Атр11Тад®ДНК-полимеразой Е8 (Регкт-Е1тег, Лррйеб Вю8у81еш8, 1пс. (ΡΕ/ΑΒΙ), Фостер Сити, Калифорния) и с синтетическими олигонуклеотидами. Образцы подвергали электрофорезу, детекции и анализу на ДНК секвенаторах ΡΕ/ΑΒΙ модели 373, модели 373 81ге1сй или модели 377.

Результаты

Применение системы ро1 1-ро1 II для получения вируса Α/^8Ν/33 (Η1Ν1).

Поскольку вирус гриппа А содержит восемь сегментов, обоснованно предположили, что вставка всех восьми кДНК вируса гриппа между промотором ро1 I и промтором ро1 II должна приводить к транскрипции восьми вРНК во все вирусные РН, и к синтезу всех 10 вирусных белков (фиг. 1). После сборки всех вирусных рибонуклеопротеинов со структурными белками должен образовываться инфекционный вирус гриппа А (фиг. 2).

Для проверки возможности получения вируса гриппа А с помощью такой кДНК-двунаправленной транскрипционной системы сконструировали восемь экспрессионных плазмид (рН^181-РВ2, рН^181РВ1, рН^183-РА, рН^184-НА, рНШ85-ЯР, р[ |\С186-\Л. рНШ87-М и р[ 1\С188А'8р содержащих восемь кДНК вируса Α/^8Ν/33 (НШ1). Восемь плазмид (1 мкг каждой плазмиды) котрансфецировали в кратковременно совместно культивированные клетки 293Т-МЭСК. Обе клеточные линии совместно культивировали в одной лунке для клеточной культуры накануне трансфекции, чтобы обеспечить условия для высокой эффективности трансфекции ДНК (клетки 293Т) и эффективной репликации (клетки МОСК) вирусов гриппа А. Через 48 и 72 ч клетки МОСК проявили вирусно-индуцированный цитопатический эффект, однако, после трансфекции экспрессионой конструкции из семи плазмид без РВ-1 (табл. 1) цитопатического эффекта не наблюдали. Вирусный титр супернатанта определяли через различные периоды времени после трансфекции путем титрования в клетках МОСК. Через 24 ч после трансфекции клеточный супернатант содержал 1х10³ вирусов в мл; 2х10⁷ инфекционных вирусов в мл получили через 72 ч после трансфекции (табл. 1). Полученные вирусы 2 раза пассировали на клетках МОСК. Для проверки того, что полученный вирус действительно является предполагаемым вирусом Α/^δΝ, получили кДНК для гена Νδ с помощью КТ-РСК (фиг. 4 А, дорожка 8). Получение двух фрагментов после разрезания рестрикционной эндонуклеазой (фиг. 4В, дорожка 8) и анализ последовательностей амплифированного фрагмента подтвердили, что полученный вирус действительно представлял собой предполагаемый вирус Α/^δΝ. Эти результаты показывают, что синтез вРНК и мРНК под действием ро1 ^ро1 II с восьми матриц приводит к образованию инфекционного вируса гриппа А.

Таблица 1 Наборы плазмид, используемых для получения вирусов Α/^δΝ/33 (IΙ6Ν1) и А/Теа1/НКЖ312/97 (IΙ6Ν1)

Сегмент ΑΛ/νδΝ/33 (Η6Ν1) А/Теа1/НКМ/312/97 (Η6Ν1)

1	рН\Л/181-РВ2	рН\Л/181-РВ2	ρΗ\Λ/241-ΡΒ2	р1-М/241-РВ2
2	...	ρΗν\/182-ΡΒ1	...	рНУУ242-РВ1
3	рНУ\/183-РА	рЩЛ/183-ΡΑ	ρΗ\Λ/243-ΡΑ	ρΗ\Λ/243-ΡΑ
4	рН\Л/184-НА	рНУУ184-НА	ρΗ\Λ/244-ΗΑ	ρΗνν244-ΗΑ
5	ρΗννΐ85-ΝΡ	ρΗ\Λ/185-ΝΡ	ρΗ\Λ/245-ΝΡ	ρΗν\/245-ΝΡ
6	ρΗννΐ86-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ	рНУУ246-ЦА	ρΗ\Λ/246-ΝΑ
7	рН\Л/187-М	рН\Л/187-М	рНУУ247-М	ρΗ\Λ/247-Μ
8	ρΗννΐ88-Ν8	ρΗ\Λ/188-Ν8	ρΗ\Λ/248-Ν8	ρΗνν248-Ν8
Вирусный титр §
1 = 24 часа	0	1 χ103	ο	0
1 = 48 часов	0	2χ106*	0	2χ103
1 = 72 часа	0	2χ107*	0	2χ105*

§ Количество инфекционных вирусных частиц, содержащихся в 1 мл супернатанта трансфецированных клеток через 24, 48 и 72 ч после трансфекции.

* В совместно культивированных клетках МОСК наблюдали цитопатический эффект.

Получение вируса Л/Теа1/НК/^312/97 (IΙ6Ν1) путем контрафекции восьми плазмид

Вирус гриппа Α/^δΝ/33 (Н1Ν1), первоначально полученный из пандемического штамма гриппа человека в 1918 г. (Со!о апб Ка\уаока, Ргос. Лсаά. 8сг υδΑ 1998, 95:1022; Ке1б е! а1., Ргос. №11. Лсаά. 8сг иЗА 1999, 96:1651), был перенесен в мозг мыши и хорошо адаптировался к росту в клеточной культуре. Для того чтобы оценить эффективность восьмиплазмидной системы с точки зрения получения вируса из клонированной кДНК, которая еще не адаптирована для роста в клеточной культуре, попробовали получить вирус А/Теа1/НК/\312/97 (Η6Ν1) только из клонированной кДНК. Этот вирус Η6Ν1 выделили у мертвого чирка во время вспышки инфекции Η5Ν1 в Гонконге в 1997 г. Генетический анализ этого вируса выявил наличие у него семи сегментов с нуклеотидной гомологией более 97% относительно штаммов патогенного вируса Η5Ν1. РНК экстрагировали из инфицированной аллантоиновой жидкости и инсертировали КТ-РСК-амплифицированные кДНК в рН\2000; эта инсерция привела к образованию восьми экспрессионных плазмид (фиг. 3). Через 72 ч после трансфекции рН\241-РВ2, рН\242-РВ1, рН\243-РА, рН\244-НА, р11\\'245А'Р, р11\\'246А'А, рН\247-М и р11\\'248А'З (1 мкг каждого) в совместно культивированные клетки 29.3Т-М[)СК в клетках МОСК наблюдали вирусно-индуцированный цитопатический эффект (табл. 1). Выход вирусов составил 2х10⁵ инфекционных вирусов на мл супернатанта трансфецированных клеток. Как показано на фиг. 4 (А и В, дорожка 2), идентичность полученного вируса проверили путем характеризации сегмента №. Эти результаты показывают, что данная плазмидная система требует клонирования всего восьми кДНК каждой в один плазмидный вектор и что трансфекция восьми экспрессионных плазмид позволяет получать вирус гриппа А, при этом антигенность вируса еще не адаптирована к росту в клетках млекопитающих.

Получение реассортированных вирусов гриппа А.

Испытали полезность восьмиплазмидной системы для получения реассортированных вирусов. Поскольку эта система трансфекции ДНК не требует никакой селекционной системы, получение реассортированных вирусов возможно путем соответствующих комбинаций экспрессионных плазмид в реакциях трансфекции. Семь экспрессионных плазмид, содержащих кДНК вируса А/Теа1/НК/\312/97 (ΙΙ6ΝΊ), контрафецировали одной экспрессированной плазмидой, содержащей кДНК вируса А/\'З^33 (Н1N 1) (табл. 2). Высокий выход вируса получили для реассортированных вирусов, содержащих семь сегментов вируса чирка и М сегмент или № сегмент вируса \5Ν. Более низкий выход вируса получили для вирусов, реассортированных по NΑ и НА (табл. 2). Поскольку одиночно-реассортированные вирусы получили с помощью восьмиплазмидной системы, следующим шагом было определение возможности выделения вируса с реассортацией нескольких сегментов, полученных из одного вируса. Для этого четыре экспрессионные плазмиды, содержащие кДНК К№-комплексных генов вируса ΙΙ6Ν1 (рН\241-РВ2, рН\242-РВ1, рН\243-РА и р1 Ι\\'245-Ν Р), трансфецировали вместе с плазмидами рН\184-НА, р11\\'186А'А, рН\187-М и рН\188-№, содержащими кДНК вируса \5Ν (табл. 2). В результате получили 4х10⁶ вирусов в мл клеточного супернатанта. Как показано на фиг. 4 (дорожка 10), амплифицированный сегмент № четырехкратно реассортированного вируса расщеплен ΝΑό!; таким образом, сегмент № образуется из вируса \5Ν. Эти результаты показывают, что восьмиплазмидная система трансфекции позволяет получать однократно и четырехкратно реассортированные вирусы.

Таблица 2 Получение реассортированных вирусов гриппа А, промежуточных между вирусами А/Теа1/НК/\312 (IΙ6Ν1) и А/\ЗК/33 (Μ1Ν1), путем контрафекции восьми плазмид

Сегмент*	НА	ΝΑ	Μ	N8	ΗΑ-ΝΑ-Μ-Ν8
1	рН\Л/241-РВ2	рНУ7241-РВ2	рН\Л/241-РВ2	ρΗ\Λ/241-ΡΒ2	рНУУ241-РВ2
2	рНУ\/242-РВ1	рНУ7242-РВ1	рНУУ242-РВ1	ρΗνν242-ΡΒ1	ρΗ\Λ/242-ΡΒ1
3	рН\Л/243-РА	ρΗ\Λ/243-ΡΑ	рН\Л/243-РА	ρΗνν243-ΡΑ	ρΗ\Λ/243-ΡΑ
4	ρΗνν245-ΝΡ	ρΗνν245-ΝΡ	ρΗ\Λ/245-ΝΡ	ρΗ\Λ/245-ΝΡ	ρΗνν245-ΝΡ
5	рН\Л/184-НА	ρΗ\Λ/244-ΗΑ	рН\Л/244-НА	ρΗν\/244-ΗΑ	рНУУ184-НА
6	ρΗ\Λ/246-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ	ρΗ\Λ/246-ΝΑ	ρΗν\/246-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ
Ί	рНИ/247-Μ	ρΗνν247-Μ	рНМ187-М	рН\Л/247-М	ρΗννΐ87-Μ
8	ρΗνν248-Ν8	ρΗνν248-Ν8	ρΗν\/248-Ν8	ρΗννΐ88-Ν5	ρΗννΐ88-Ν8

Вирусный	2 ХЮ2	2Χ 103	2 ХЮ5	2 ХЮ7	2Х 107
титр§

* Плазмиды, содержащие кДНК вируса А/\З^33 (Μ1Ν1), выделены полужирным шрифтом.

§ Количество инфекционных вирусных частиц, содержащихся в 1 мл супернатанта трансфецированных клеток через 72 ч после трансфекции.

Обсуждение

Возможность получать вирус гриппа после трансфекции восьми экспрессионных плазмид, содержащих кДНК вирусов А/Теа1/НК/\312 (ΙΙ6Ν1) или А/\З^33 (Μ1Ν1), доказывает, что транскрипционная система ро1 1-ро1 II обеспечивает достаточное количество вРНК и вирусных белков для образования инфекционного вируса гриппа А. При этом синтезируются два типа мРНК, которые отличаются своими некодирующими областями (фиг. 1). Один тип мРНК, кодирующий все вирусные белки, непосредственно транскрибируется ро1 II. Кроме последовательностей некодирующих областей (Ν(Ί/) вируса гриппа эти мРНК содержат последовательности промотора ро1 I и терминатора мыши. Важно, что разработанная экспрессионная ро1 ^ро1 II система содержит только 33 Ьр терминатор мыши. Предшествующие исследования с использованием репортерных генов хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) и зеленым флуоресцентным белком (СЕР) показали, что 174-Ьр последовательность области терминатора снижала экспрессию белка посредством ро1 II (НоГГтапп, Е., Р1. Ό. Тйе818 1997, 1и8!и8 ЫеЫд Ищуегкйу, С1е88еп, Сегтапу). Второй тип вРНК формируется после инициации процесса вирусной репликации и транскрипции (фиг. 2). Эта мРНК синтезируется вирусными полимеразными белками и содержит структуру 5-кэп, полученную из клеточных РНК путем захвата кэпов перед некодирующими последовательностями вируса гриппа. Структурные белки, траслированные с обеих мРНК, соединяются с комплексами В№, образуя новые вирусные частицы. После отпочковывания трансфектантных вирусов полученные частицы вирусов могут реплицироваться в клетках 293 и в культивированных совместно с ними клетках МОСК.

В отличие от подходов, рассмотренных выше в начале описания, способ согласно данному изобретению использует восемь кДНК в восьми плазмидах, которые содержат 225 Ьр последовательности экспрессии четырехкратно реассортированного промотора ро1 I и 33 Ьр последовательности терминатора. В системе ро1 ^ро1 II все 10 вирусных белков экспрессируются с усеченного предраннего промотора цитомегаловируса человека. Тот факт, что экспрессия всех структурных белков с 17-плазмидной системой (№итапи е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 1999, 96:9345) и с 8-плазмидной системой (данное исследование) повышает эффективность получения вирусов по сравнению с контрафекцией плазмид, экспрессирующих белки В№ комплекса (№итапи е! а1., кирга; Еобог е! а1., 1. У1го1. 1999, 73:9679), подтверждает идею о том, что образование инфекционного вируса гриппа А интенсифицируется за счет появления белков НА, ΝΆ, М1, М2 и N82 сразу после трансфекции.

Цикл вирусной репликации включает комплексное взаимодействие вирусных белков друг с другом и с клеточными факторами (Ъиб\\щ е1 а1., У1го1. Iттио1. 1999, 12:175). Таким образом, для образования инфекционного вируса синтез вирусных молекул, управляемый плазмидами, должен обеспечивать оптимальные концентрации вирусных белков для инициации репликационного цикла и для образования вирусоподобных частиц. Хотя восьмиплазмидная система доказала свою эффективность, возможно дополнительное увеличение эффективности производства вирусов. Было показано, что соотношение трансфецированных плазмид, экспрессирующих комплексные белки В№, и белка М1 оказывает влияние на активность транскриптазы (Р1ексйка е! а1., 1. У1го1., 1996, 70:4188; Регех апб Оошк, У1го1оду 1998, 249:52). Эффективность образования вирусоподобных частиц также зависит от концентрации структурных вирусных белков (Мепа е! а1., 1. У1го1. 1996, 70:5016; Сотех-Риейак е! а1., 1. Сеп. У1го1., 1999, 80:1635; №итапп е1 а1., 1. У1го1. 2000, 74:547). Поэтому эффективность получения инфекционного вируса с системой ро1 Iро1 II можно дополнительно повысить путем изменения концентраций плазмид, используемых в реакции трансфекции, или за счет применения экспрессионных плазмид с различными ро1 II промоторами. Поскольку эффективность сплайсинга, определяемая клеточными факторами, оказывает влияние на способность к репликации вируса гриппа А (Баи апб 8сНо111Ккек, Упо1оду 1995, 212:225), применение клеточных линий, отличных от 293Т, может увеличивать выход вирусов для определенных штаммов гриппа А. Высокий выход четырехкратно реассортированного вируса (табл. 2) согласуется с тем, что быстрая репликация вируса А/А8Щ33 (Ή1Ν1) в культивированных клетках обеспечивается сегментами НА, NА и М (Со!о апб Качаока, Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 1998, 95:10224; 8с1и1тап апб Ра1еке, 1. Уио1. 1997, 24:170; Уекиба е! а1., 1. Упо1. 1994, 68:8141).

Образование жизнеспособных реассортированных вирусов (табл. 2), промежуточных между вирусом птиц Н6Ю и вирусом человека НШ1, указывает на то, что этот вирус Н6Ю может получать генные сегменты от дальних родственных вирусов. Генетический анализ дает основания полагать, что патогенные вирусы 45Ν1 образуются за счет реассортации (Хи е! а1., Упо1оду 1999, 261:15). Генные сегменты, подобные Н5Ш, найдены в субтипах Н6Ш и 49Ν2 (Сиап е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 1999, 96:9363), этот результат указывает на то, что такие вирусы могут быть предшественниками патогенных вирусов Н5Ш. Реассортация, которая может создавать новые патогенные вирусы гриппа, может быть реализована и в будущем. Однако возможность получать эти вирусы и манипулировать с ними упрощенным способом, разработанная в настоящем изобретении, поможет исследователям лучше понимать биологические свойства этих новых вирусов и создавать эффективные вакцины для защиты населения от них. Длительность периода времени между появлением нового патогенного штамма и получением вакцины является критической переменной для оценки эффективности программы вакцинации. Возможность получения вирусов клонированием всего восьми плазмид сокращает время, необходимое для создания потенциальных кандидатов для вакцины, и совершенствует существующие обратно-генетические системы за счет упрощения процесса создания вирусов и снижения общей стоимости производства вакцины.

Концепцию введения вирусной кДНК между промотором ро1 I и промотором ро1 II в эукариотические клетки для получения вируса можно использовать также для получения других членов семейства Оййотухоушбае. Для вируса гриппа В эта стратегия потребует конструкции и котрансфекции восьми плазмид, для гриппа С - семи, а для Тйодо!оу1ги8 - шести. Транскрипция ш у1уо 5'-кэппированной мРНК, а также вРНК с той же самой кДНК матрицы тоже может упростить системы на основе плазмидных век торов для других РНК-вирусов или даже способствовать образованию систем ροϊ ^ροϊ II для вирусов из других семейств (например, Α^еηаν^^^бае, Βиηуаν^^^бае).

Пример 3. Система ροϊ ^ροϊ II РНК для получения вируса гриппа В исключительно из клонированной ДНК.

Каждый из вирусов гриппа А и В содержит восемь сегментов однонитевой РНК с отрицательной полярностью (см. ЬатЬ апб Кгид, Οπίιοιηνχονί^κ: \агикек апб Ше1г ^еρϊ^са!^οη, ш Ρ^еϊбк (Еб.), νίΓοϊοβ.ν; ρ. 1353-1395). В отличие от гриппа А восемь сегментов гриппа В кодируют 11 белков. Три самых больших гена кодируют компоненты РНК-полимеразы, РВ1, РВ2 и РА, сегмент 4 кодирует гемагглютинин. Сегмент 5 кодирует нуклеопротеин, главный структурный компонент, связанный с вирусной РНК, сегмент 6 кодирует невраминидазу (ΝΑ) и белок ΝΒ. Оба белка, ΝΒ и ΝΑ, транслируются с перекрывающихся рамок считывания бицистронной мРНК. Сегмент 7 гриппа В также кодирует два белка: ВМ1 и ВМ2. Самый миниатюрный сегмент кодирует два продукта: Ν81 транслируется из непроцессированной РНК, в то время как Ν82 транслируется из мРНК, подвергнутой сплайсингу.

Для конструирования экспрессионных плазмид, содержащих кДНК гриппа В, используют такую же стратегию, как описано для получения вируса гриппа Α Α/^;·ιϊ/ΗΙ</\ν312/97 (Η6Ν1). Первые РНК выделили из частиц вируса, полученных из инфицированной аллантоиновой жидкости, например В/Ьее/40. На основе консервативных последовательностей некодирующей области приготовили праймеры для ВТРСВ и использовали их для синтеза кДНК. На 5' конце эти праймеры содержат последовательности для рестрикции эндонуклеазами ΒδΐηΒ! или ВкаР Разрезание продуктов РСВ ΒδΐηΒ! или 85а! позволяет получать вставку в клонирующий вектор ρΗν2000 (или ρΗνΗ), линеаризованный ВктВР Для уверенности в том, что кДНК в плазмидах не содержат нежелательных мутаций вследствие ошибок, внесенных полимеразой в процессе РСВ, конструкции должны быть секвенированы.

Котрансфекция совместно культивированных клеток 293-МОСК (или клеток СО8-1-МОСК) и добавление трипсина приводят к образованию инфекционного вируса гриппа В. Затем супернатанты трансфецированных клеток пассируют на новых клетках МСОК. Титры полученного вируса можно определить стандартными способами, например с помощью анализа НА или анализа бляшкообразования. ВТ-РСВ, выполненные со специфическими праймерами для каждого генного сегмента, позволяют проводить амплификацию РНК из рекомбинантного вируса гриппа В. Секвенирование продуктов подтверждает, что полученный вирус действительно является желаемым вирусом гриппа В.

Пример 4. Восьмиплазмидная система получения исходного вакцинного штамма вируса гриппа А.

Для определения промышленной полезности такой системы на основе плазмидного вектора для производства вакцин мы получили основной вакцинный штамм Α/РΒ/8/34 (Η1Ν1), используемый в настоящее время для получения инактивированной вакцины, исключительно из клонированной кДНК, как описано в примере 2. Выход вируса согласно анализу НА после прохождения рекомбинантного вируса в куриные яйца был таким же высоким, как выход родительского вируса дикого типа. Эти результаты доказывают, что полученный рекомбинантный вирус имеет такие же характеристики роста, как родительский вирус, выращенный в куриных яйцах, и указывают, что способ восьмиплазмидной трансфекции может усовершенствовать применяемые в настоящее время способы получения вакцинных вирусов.

Материалы и методики

Вирусы и трансфекция.

Вирус гриппа Α/РΒ/8/34 (Η1Ν1) получили из хранилища детской исследовательской больницы Сент-Джуда и вырастили в 10-дневных куриных яйцах с зародышем. Клетки почки собаки Мабт-ОагЬу выдерживали в МЕМ, содержащей 10% РВ8. Клетки почки эмбриона человека 293Т и клетки νΕΚΟ культивировали в среде Ορύ-МЕМ I (Ь1£е ТесЫ-ю^Дек, Гайтерсбург, Мэриленд), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (РВ8). Для опытов по трансфекции использовали планшеты для культуры тканей с шестью лунками. Для этих опытов использовали совместно культивированные клетки МОСК и 293Т (0,21х10⁶ клеток каждого типа в одной лунке). Для трансфекции клеток применяли ТгапЧТ ЬТ-1 (Ракш, Мэдисон, Висконсин) согласно инструкциям изготовителя. Вкратце, смешивали 2 мкл ТгапПТ ЬТ-1 с 1 мкг ДНК, выращивали при комнатной температуре в течение 45 мин и добавляли к клеткам. Через 6 ч ДНК-траснфекционную смесь заменили на Ορΐί-МЕМ I. Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавили 1 мл среды Ορΐί-МЕМ I, содержащей ТРСК-трипсин, эта добавка привела к окончательной концентрации ТРСК-трипсина 0,5 мкг/мл в клеточном супернатанте. Титр вируса определяли путем пассирования клеточного супернатанта на клетках МОСК с помощью анализа бляшкообразования (ρϊ;·κ.|ΐκ аккау).

ВТ-РСВ и конструкция плазмид.

Вирусную РНК экстрагировали из 200 мкл аллантоиновой жидкости куриного яйца с зародышем с помощью набора 01адеп ВЫеаку. Двухстадийную ВТ-РСВ использовали для амплификации всех вирусных генных сегментов. Вкратце, РНК транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазы ΑМV (ΡοΗκ Оха^юЩс, Германия) согласно предоставленному протоколу, а затем амплифицировали с помощью системы Εxρаηб Ηφΐι НбеШу РСВ (Βοсйе Оха^юЩс, Германия). Программа амплификации начиналась с одного цикла при 94°С в течение 2 мин, затем следовали 30 циклов при 94°С в течение 20 с, 54°С в течение 30 с и 72°С в течение 3 мин; программу завершал один цикл при 72°С в течение 5 мин.

-30006311

Используемые праймеры содержали последовательности для Вка! или ВктВк чтобы обеспечить точность встраивания разрезанных РСК фрагментов в клонирующий вектор РН\2000 (см. пример 2).

Для клонирования генов НА, ΝΡ, ΝΑ, М и N8 фрагменты РСК разрезали ВктВ[ или ВМ и лигировали в клонирующий вектор рН\\2000. Для клонирования Р-генов выделяли два (РВ2, РА) или три (РВ1) фрагмента, разрезали и лигировали их в рΗV2000-В8тВI. Чтобы проверить отсутствие в генах нежелательных мутаций, секвенировали фрагменты, полученные в результате РСК. Восемь плазмид, содержащих непроцессированную кДНК вируса А/РК/8/34 (Η1Ν1), обозначили как рН\191-РВ2, рН\191-РВ1, рН\193-РА, рН\194-НА, рН\195-№, р11 \У' 196-Ν А, рН\\' 197-М и рН\\'198А8. Последовательность матрицы ДНК определяли в Центре биотехнологии детской исследовательской больницы Сент-Джуда с помощью наборов реактивов для секвенирования цикла терминации родамином или красителем бКобапйп с Атр11Тад®ДНК-полимеразой Р8 (Регкш-Е1тег, Аррйеб Вюкуйетк, Бчс. (РЕ/АВЦ Фостер Сити, Калифорния) и с синтетическими олигонуклеотидами. Образцы подвергали электрофорезу, детекции и анализу на ^NΑ секвенаторах ΡЕ/ΑВI модели 373, модели 373 81ге1сН или модели 377.

Результаты

Для проведения внутриклеточного синтеза вирусоподобных вРНК и мРНК мы использовали систему экспрессии РНК ро1 ^ро1 II (см. пример 2). В этой системе вирусная кДНК инсертирована между промотором и терминатором РНК полимеразы I (ро1 I) человека. Весь этот блок транскрипции находится между промотором РНК-полимеразы II (II) и поли (А) сайтом. Ориентация двух транскрипционных блоков позволяет синтезировать антисмысловую вирусную РНК и смысловую мРНК с одной матрицы вирусной кДНК. Такая система ро1 ^ро1 II начинается с инициации транскрипции двух клеточных ферментов РНК-полимеразы из своих собственных промоторов, предположительно в различных компартментах ядра (см. фиг. 1). Трансфекция восьми плазмид в клетки 293Т приводит к взаимодействию всех молекул, полученных в результате клеточной и вирусной транскрипции и действия механизма трансляции, в конечном счете вызывая образование инфекционного вируса гриппа А. Эта система оказалась очень эффективной для получения вирусов гриппа АЛ\8М33 (НШ1) и А/Теа1/НК/\312/97 (Н6№) (пример 2).

Поскольку в настоящее время исходным вакцинным штаммом для получения инактивированной вакцины гриппа является А/РК/8/34 (НШ1), мы попытались получить этот вирус только из клонированной ДНК. кДНК, представляющие восемь сегментов РНК, инсертировали в вектор рН\ 2000. Полученные плазмиды (рН\191-РВ2, рН\191-РВ1, рН\193-РА, рН\194-НА, рН\195А1Р, рН\196АА, рН\197-М и рН\\198А8) трансфецировали в совместно культивированные клетки 293Т-МЭСК или клетки Уего-МЭСК. Через 72 ч после трансфекции определили титр вируса путем титрования на клетках МОСК. Супернатант совместно культивированных клеток Уего-МЭСК содержал 1х10⁴ рГи, а супернатант совместно культивированных клеток 293Т-МЭСК содержал 2х10⁶ рГи на мл. Более высокий выход в клетках 293Т-МЭСК, по всей вероятности, вызван более высокой эффективностью трансфекции клеток 293Т по сравнению с клетками Уего. Эти результаты показывают, что восьмиплазмидная система позволяет получать вирус А/РК/8/34 (Н1М) из клонированной кДНК.

Для сравнения роста вируса дикого типа и полученного рекомбинантного вируса высевали в куриные яйца с зародышем вирус дикого типа или рекомбинантный вирус. Через 48 ч после инфицирования отбирали аллантоиновую жидкость. Выход вируса определяли с помощью НА анализа. Хотя НА титры отличались для отдельных яиц, мы установили, что оба вируса имели НА титры между 5120 и 10240 единиц гемагглютинина. Это показывает, что оба вируса являются изолятами с высоким выходом. Таким образом, рекомбинантный вирус, который получили с помощью трансфекции ДНК, имеет такой же сильный культуральный фенотип, как и родительский изолят.

Обсуждение

Восьмиплазмидная система согласно изобретению не использует отдельных плазмид для экспрессии белка (см. начальную часть описания), что упрощает способ получения вируса гриппа А только из клонированной кДНК. Производство вакцин включает получение вируса, который используют в качестве вирусного посевного материала для получения вакцинного вируса в куриных яйцах или в клеточной культуре. Эффективность программы вакцинации зависит от выбора субтипа, который хорошо соответствует циркулирующим патогенным штаммам для стимулирования титра высокоспецифичных антител у вакцинированного населения, чтобы обеспечить эффективную защиту. Шесть исходных вакцинных плазмид (рН\191-РВ2, рН\191-РВ1, рН\193-РА, рН\194-НА, рН\195АР, рΗ\196-NΑ. рН\197-М и рН\\198А8) вируса А/РК/8/34, кодирующих внутренние гены вируса гриппа А, теперь можно использовать для трансфекции с плазмидами, кодирующими гликопротеины НА и NΑ циркулирующего в данное время штамма. Возможность манипулировать каждым генным сегментом позволяет нам также оценивать, насколько важным является тот или иной сегмент для обеспечения высокого выхода рекомбинантных вирусов в куриных яйцах, а также в клеточной культуре.

Тот факт, что мы можем получать два лабораторных штамма вируса гриппа (АЛ\8М33 (Н1М) и А/РК/8/34 (Н1N1)) и один полевой изолят (А/Теа1/НК/\312/97 (НШ1)) путем контрансфекции всего лишь восьми плазмид, предполагает, что эта система может применяться для живых ослабленных противогриппозных вакцин. Противогриппозные вакцины с живым ослабленным вирусом, вводимые интраназально, вызывают местный, клеточный и гуморальный иммунитет, а также иммунитет слизистой оболоч ки. Адаптированные к холоду (са) рекомбинантные (СК) вирусы, содержащие шесть внутренних генов живого ослабленного вируса гриппа А/Апп АгЬог/6/60 (12Ν2) и гемагглютинин (НА), а также невраминидазу ЩА) действующих вирусов дикого типа, оказываются надежно ослабленными. Эффективность такой вакцины для детей и молодежи доказана (Кейе1 & Р1ейга ΣΠ !ех!Ьоок оП Iпί1иепζа, №с1ю1хоп е! а1., ейх. 1998, 373-390). Однако она может быть слишком ослабленной, чтобы стимулировать идеальную иммунную реакцию у пожилых людей, которые составляют основную группу среди 20000-40000 человек, которые ежегодно умирают в США от инфекции гриппа. Вклад каждого сегмента в ослабленный фенотип еще недостаточно хорошо определен (см. выше Ке1!е1 & Р1ейга). Информацию об этом можно получить только путем секвенированного введения в вирус специфических, определенных ослабляющих мутаций. Поскольку подробный анализ требует испытания большого количества измененных вирусов, конструкция и трансфекция всего восьми плазмид упрощает такую задачу и снижает время и стоимость для достижения этой цели.

Пример 5. Однонаправленная транскрипционная система РНК-полимеразы I - полимеразы II для получения вируса гриппа А из восьми плазмид.

Предыдущие примеры описывают систему для получения вируса гриппа А путем контрансфекции всего лишь восьми плазмид, из которых экспрессируются антисмысловые вРНК и смысловые мРНК (эта работа опубликована позднее; см. ИоПатапп е! а1., 2000, Ргосеейшдх оП !1е №Шопа1 Асайету оП 8с1епсех, И8А 97, 6108-6113). Данный пример описывает использование другой системы транскрипции для экспрессии вирусоподобных РНК, обеспечивающих внутриклеточный синтез некэппированных смысловых кРНК и 5'-кэппированной мРНК из одной матрицы. Контрафекция восьми плазмид с тандемным промотором РНК ро1 ^ро1 II, содержащих кДНК вируса АЛУ8Ж33 (Η1Ν1), приводила к образованию инфекционного вируса гриппа А, хотя и с более низким выходом вируса, чем двунаправленная система. Наш подход к получению вРНК и мРНК или кРНК и мРНК внутриклеточно из минимального набора плазмид полезен для использования или оптимизации обратных генетических систем других РНК-вирусов.

Результаты, полученные в этом примере, опубликованы в литературе (см. ΗоППтаηп апй %еЬх1ег, 1. Сеп. У1го1. 2000, 81:2843).

В качестве матрицы для получения РНК-вируса отрицательного направления может служить антисмысловая вРНК или смысловая кРНК. С целью уменьшения количества плазмид, необходимых для получения вируса, мы предположили возможность синтеза кРНК и мРНК клеточными РНК ро1 I и ро1 II с одной матрицы. Для этого мы попытались разработать однонаправленную транскрипционную систему ро1 ^ро1 II (фиг. 5). Вирусная кДНК инсертирована в положительной ориентации между промотором ро1 I кДНК и концевой последовательностью. Весь этот транскрипционный блок инсертирован в положительной ориентации между промотором ро1 II РНК и сайтом полиаденилирования (фиг. 5). В отличие от нашей двунаправленной транскрипционной системы (фиг. 1), где образуются вРНК отрицательного направления и мРНК положительного направления, в данном случае ожидали синтеза двух типов смысловой мРНК. С промотора роI II мРНК со структурой 5'-кэп должна транскрибироваться в нуклеоплазму. Этот транскрипт должен быть транслирован в белок. Ожидается, что в ядрышке клеточная полимераза ро1 I синтезирует непроцессированную смысловую кРНК вируса гриппа с трифосфатной группой на 5' конце (фиг. 5). Сконструировали клонирующий вектор ]3Η\νΗ, который можно использовать для вставки случайных фрагментов кДНК (фиг. 6). Эта плазмида содержит промотор ро1 II (предранний промотор цитомегаловируса человека) и промотор человека ро1 I, которые расположены выше последовательности терминатора ро1 I и поли(А)-сайта.

Для проверки возможности получения инфекционного вируса гриппа А путем синтеза кРНК и мРНК из одной матрицы мы сконструировали восемь плазмид. Плазмиды рΗV171-ΡΒ2, рΗV171-ΡΒ1, рΗV173-ΡА, рΗV174-ΗА, р1 ΐν^Χ-ΝΕ ))1^176-4.% р11%177-\) и р11%178-48 содержат кДНК, представляющие восемь генных сегментов штамма А^8Ж33 (Η1Ν1) вируса гриппа А. Все эти кДНК имеют положительную ориентацию относительно промоторов ро1 I и ро1 II. Восемь плазмид (по 1 мкг каждой плазмиды) трансфицировали в клетки 293Т и СО8-1 при совместном культивировании с клетками МОСК, как описано в примере 2, или без совместного культивирования.

Выход вируса в супернатанте трансфецированных клеток через различные периоды времени определяли с помощью анализа бляшкообразования после пассирования на клетках МОСК. Через 48 ч после трансфекции получили 2-5х10³ инфекционных вирионов (табл. 3). Через 72 ч после трансфекции супернатант содержал 4х10⁴ рПи/мл после трансфекции клеток 293Т или 2х10⁴ рПи/мл после трансфекции клеток СО8-1. Через 72 ч выход вируса можно было увеличить путем совместного культивирования клеток 293Т или клеток СО8-1 с клетками МЭСК (табл. 3).

Образование вируса доказывает, что после трансфекции восьми плазмид ро1 I РНК синтезировала восемь некэппированных смысловых кРНК. Четыре вирусных полимеразных белка транслировались с транскриптов, синтезированных клеточной РНК ро1 II, соединялись с голыми вирусоподобными кРНК, образуя сК№. Субъединица РВ1полимеразы важна для распознавания концевой структуры и присоединения вирусопободных кРНК (Сопха1ех & Огйп ЕМВО 1. 1999, 18:3767; Сопха1ех & Ог!ш ЕМВО 1. 1999, 73:631; апй 1999Ь; Ь1 е! а1., ЕМВО 1. 1998, 17:5844). Взаимодействие с другими полимеразными белками инициировало репликационно-транскрипционный цикл, который приводил к синтезу вРНП и вирусных мРНК (Тоуоба е! а1., 1. Сеп. У1го1. 1996, 77:2149; Сопха1ек е! а1., №с1. Лс1бк Кек. 1996, 29:4456). В транскрипционной системе ро1 ГОро1 II синтезируются два различных типа мРНК. Один из них непосредственно транскрибируется с ДНК плазмид с помощью РНК ро1 II и содержит 225-нуклеотидную промоторную последовательность ро1 I на 5' конце и последовательность терминатора ро1 I на 3' конце. Другие мРНК синтезируются белками вирусного полимеразного комплекса, которые используют вРНК в качестве матрицы. Структура 5'-кэп этой мРНК получается за счет механизма кэп-захвата, под действием которого полимеразный субблок РВ2 получает кэп от клеточных РНК (И1тапеп е! а1., Ргос. №!1. Лсаб. 8ск И8Л 1981, 21:3607). Хотя оба типа мРНК отличаются своими 5' и 3' некодирующими областями, они содержат одинаковые открытые рамки считывания для всех вирусных белков. Транслированные структурные белки соединяются с вРНП, образуя инфекционный вирус гриппа А.

Таблица 3

Наборы плазмид, используемые для получения Λ/\ν8Ν/33 (Н1М)

	Плазмиды*
Вирусный генный сегмент	Однонаправленная система	Двунаправленная система
1	ρΗννΐ71-ΡΒ2	рН\Л/171-РВ2	ρΗννΐ71-ΡΒ2	ρΗ\Λ/171-ΡΒ2	рН\Л/181-РВ2	рН\Л/181-РВ2	ρΗ\Λ/181-ΡΒ2	ρΗννΐ81-ΡΒ2
2	рН\ЛИ72-РВ1	ρΗ\Λ/172-ΡΒ1	ρΗν\Ζ172-ΡΒ1	ρΗ\Λ/172-ΡΒ1	рН\Л/182-РВ1	ρΗννΐ82-ΡΒ1	ρΗννΐ82-ΡΒ1	ρΗν\/182-ΡΒ1
3	рН\Л/173-РА	ρΗννΐ73-ΡΑ	ρΗννΐ73-ΡΑ	ρΗννΐ73-ΡΑ	ρΗννΐ83-ΡΑ	ρΗ\Λ/183-ΡΑ	ρΗ\Λ/183-ΡΑ	рНУУ183-РА
4	рН\Л(174-НА	рН\Л/174-НА	ρΗν\/174-ΗΑ	рН\/У174-НА	ρΗ\Λ/184-ΗΑ	рН\Л/184-НА	рН\Л/184-НА	ρΗ\Λ/184-ΗΑ
5	ρΗννΐ75-ΝΡ	ρΗννΐ75-ΝΡ	ρΗννΐ75-ΝΡ	ρΗννΐ75-ΝΡ	ρΗννΐ85-ΝΡ	ρΗννΐ85-ΝΡ	ρΗννΐ85-ΝΡ	ρΗννΐ85-ΝΡ
6	ρΗννΐ76-ΝΑ	ρΗ\Λ/176-ΝΑ	ρΗννΐ76-ΝΑ	ρΗννΐ76-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ	ρΗννΐ86-ΝΑ
7	рН\Л/177-М	ρΗ\Λ/177-Μ	ρΗννΐ77-Μ	ρΗ\Λ/177-Μ	ρΗννΐ87-Μ	рН\Л/187-М	рН\ЛИ87-М	рНУУ187-М
8	рН\Л/178-№	ρΗννΐ78-Ν5	ρΗν\/178-Ν5	ρΗννΐ78-Ν5	ρΗννΐ88-Νδ	ρΗννΐ88-Ν5	ρΗννΐ88-Ν5	ρΗννΐ88-Ν5
Трансфецированные клетки*	293Τ	293Τ	ΟΟδ-1	ΟΟδ-1	293Τ	293Τ	ΟΟδ-1	ΟΟδ-1
+МОСК		+К/ЮСК		+МЭСК		+ΜϋΟΚ
Транскрипты*	кРНКи μΡΗΚ	вРНКи μΡΗΚ
Вирусный титр (рТи/мл)§
24 часа	0	0	0	0	5χ102	4χ 102	1 χ 103	1 χ 103
48 часов	4χ103	5χ103	2 χ 103	5χ 103	8x10®	1 χ107	6χ106	1 χ107
72 часа	4χ 104	2χ105	2χ104	4χ105	1 χ107	2χ108	1 χ107	Зх 108

* Плазмиды с однонаправленными транскрипционными блоками и плазмиды с двунаправленными транскрипционными блоками (фиг. 1) содержат кДНК, представляющие восемь генных сегментов Α/ν8Ν/33 (НШ1).

# Клетки 293Т и СО8-1 трансфицировали с совместно культивированными клетками МОСК или без них.

⁺ Транскрипты, синтезированные ро1 I или ро1 II.

§ Вирусный титр супернатанта определяли через указанные интервалы времени (24, 48 и 72 ч) после трансфекции с помощью анализа бляшкообразования на клетках МОСК.

Хотя получение вирусов ν8Ν из клеток, трансфецированных восемью плазмидами с тандемно расположеными промоторами, оказалось вполне надежным, выход вируса при таком кРНК-мРНК подходе был ниже, чем в случае двунаправленной системы, которая вырабатывает транскрипты вРНК и мРНК (табл. 3). Через 72 ч после того, как клетки 293Т или СО8-1 трансфецировали восьмью плазмидами, содеражщими двунаправленную ро1 ГОро1 II транскрипционную систему (фиг. 1; пример 2; см. НоГГтапп е! а1., Ргос. №!1. Лсаб. 8ск И8Л 2000, 97:6108; рН№181-РВ2, РН№181-РВ1, рН№183-РЛ, рН№184-НЛ, рΗV185-NΡ, рΗV186-NΑ, рΗV187-М и рΗV188-N8), титр вируса составлял 1х10⁷ рГи/мл (табл. 3). Через 24 ч после трансфекции клеток СО8-1 или 293Т в супернатанте было обнаружено 0,4-1х10³ рГи/мл. Эти данные показывают, что двунаправленная система из восьми плазмид имеет такую же эффективность для получения вирусов и такую же кинетику, что и более сложная и громоздкая мультиплазменная система, требующая котрансфекции 12 или 17 плазмид (№итапп е! а1., Ргос. №И. Лсаб. 8ск И8Л 1999, 96:9345).

Инфекционные вирусы не были обнаружены через 24 ч после трансфекции восьмью плазмидами с тандемно расположеными промоторами (табл. 3). Эти результаты предполагают, что различия в выходах вируса между вРНК-мРНК и кРНК-мРНК подходами вызваны различными полярностями первичных ро1 I траснкриптов. Двунаправленная система начинается с внутриклеточного синтеза вРНК, что является сходной ситуацией с природной инфекцией вируса гриппа А, при которой вРНП транспортируются в ядро, а вРНК вначале служат в качестве матриц для синтеза мРНК и кРНК. В однонаправленной системе кРНП являются первыми образующимися репликационно-компетентными элементами. Чтобы получить мРНК, необходимо реплицировать кРНК в вРНК, а вРНП в конечном счете упаковываются в частицы вирусного потомства (Нки е! а1., 1. Сеп. Упо1. 1987, 77:2575). Поскольку для получения вРНП из кРНП необходимо протекание дополнительных реакций, образование вирусов в однонаправленной системе занимает более длительное время, чем образование вируса при применении двунаправленной системы.

-33006311

Другие возможные причины отличия выходов вируса в двух системах заключаются в том, что элементы последовательности в кДНК уменьшают эффективность транскрипции за счет терминации транскрипции или последовательности в РНК траснкриптах уменьшают уровень устойчивости траснкриптов ροϊ I или ро1 II. Более низкая концентрация всего лишь одной из восьми вирусоподобных кРНК или мРНК уменьшает общую эффективность этой системы, поскольку все вРНП и структурные белки должны синтезироваться в концентрациях, оптимальных для вирусной репликации и вирусной сборки.

Высокая эффективность восьмиплазмидной системы для получения вируса гриппа А указывает на то, что эта система применима для других ортомиксовирусов, например вируса гриппа В, вируса гриппа С и ΤΙιοβοΙονίπίδ. Результаты данного исследования предполагают, что вРНК-мРНК система откроет наиболее эффективный путь для получения этих вирусов исключительно на основе плазмид. Настоящее изобретение позволяет использовать систему на основе ροϊ I для получения РНК-вирусов, отличных от семейства Οπίιοιηνχονίι^^, например членов семейств Ра^атуxον^^^бае, Агепаушбае или Випуаутбае (^ЬеПз, А. & ^зе, ГК., νίιυϊοβν 1998, 247:1-6; Впбдеп & Εϊϊϊοΐ, Ргос. №16. Асаб. 8с1. И8А 1996, 93:15400; Ьее е1 а!, I. νίΓοϊ. 2000, 74:3470). В отличие от ортомиксовирусов, основная часть РНК-вирусов реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток. В процессе их эволюции РНК этих вирусов не подвергались давлению отбора, которое обнаруживается в ядре, например сплайсингу. Как правило, обратные генетические системы для несегментированных РНК-вирусов с отрицательной цепью основаны на внутриклеточной транскрипции с промотора Т7, что впервые установил βοι^ϊ™!'!!·! с коллегами при получении гаЬ1езу1гиз (8сбпеб е1 аЬ ЕМВО I. 1994, 13:4195). Экспрессия вирусоподобных РНК происходит под действием РНК-полимеразы Т7, которая поставляется либо путем инфицирования рекомбинантным вирусом осповакцины, либо за счет использования клеточных линий, конститутивно экспрессирующих РНК-полимеразу Т7. В отличие от транскрипции ροϊ I, которая происходит в ядре, транскрипция РНК-полимеразой Т7 имеет место в цитоплазме. Применение транскрипционной системы ροϊ I для цитоплазменных РНК-вирусов потребовало транспорта РНК транскриптов из ядра. Тот факт, что транскрипты ροϊ I действительно транспортируются из ядра, подтверждается наличием производства белка в клетках, содержащих транскрипты ροϊ I, которые имели внутренний сайт посадки рибосом, инсертированный в его некодирующую 5' область (Рабпег е1 аЬ Шск Ас1бз. Кез. 1993, 21:3451). Поскольку информация о последовательностях, критичных для экспорта или сохранения транскриптов ροϊ I, ограничена, синтезсмысловой или антисмысловой РНК может приводить к различным эффективностям ядерного экспорта. Кроме того, экспорт из ядра большого коронавирусопододного транскрипта, образованного ροϊ II (и содержащего более 30 000 нуклеотидов) (Абпахап е1 аГ, Ргос. №16. Асаб. 8ск И8А 2000, 97:5516), показывает, что критическими для экспорта могут быть скорее специфические последовательности РНК, чем длина транскрипта. Разработанные нами клонирующие векторы ροϊ ^ροϊ II и эффективный способ клонирования, основанный на применении рестрикционных эндонуклеаз типа Из, позволят синтезировать в ядре смысловые или антисмысловые РНК для получения цитоплазменных РНК-вирусов при разумных затратах и в разумный период времени.

Настоящее изобретение не ограничивается пределами описанных здесь специфических вариантов реализации. Различные модификации изобретения, кроме описанных здесь, являются очевидными для специалистов из предшествующего описания и прилагаемых фигур. Предполагается, что такие модификации охватываются прилагаемой формулой изобретения.

Кроме того, следует понимать, что все приведенные значения являются приближенными и предназначены для описания.

Все патенты, патентные заявки, публикации и другие цитируемые в данном описании материалы приведены здесь полностью в качестве ссылки.

-34006311

Список последовательностей <110> Сэйнт Джуд Чилдрен’з Ресеч Хоспитал

Гофман Эрик < 120> Система трансфекции ДНК для получения инфекционного вируса гриппа <130> 2427/20772^0 <140> РСТ/и801/13656 <141> 2001-04-27 <160> 21 <170> Ра1еп11п νεΓδίοη 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> ϋΝΑ <213> АгйГ1С1а1 зециепсе <220>

<223> РСКргппег (8βς-ΡΒ1#1) <400> 1 адда1ддда11сс1саадд 19 <210> 2 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> АП1Г1С1а1 зециепсе <220>

<223> РСК рптег (8ец-РВ1#2)

-35006311 <400> 2 §с1а1д§П1 ссададсссд 20 <210> 3 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> Аг1й!с1а1 хедиепсе <220>

<223> РСК рптег (Вт-РВ 1 -1) <400> 3

1а11с§1с1с адддадсдаа адсаддса 28 <210> 4 <211> 33 <212> ϋΝΑ <213> АП1Г1С1а1 зециепсе <220>

<223> РСВ рптег (Вт-РВ 1-2341В) <400> 4 а1а1сд1с1с £1аИа§1ад ааасааддса 111 33 <210> 5 <211> 29 <212> ϋΝΑ <213> АП1Г1С1а1 зедиепсе <220>

<223> РСВ рптег (Βιη-Ν8#1) <400> 5

1аИс§1с1с адддадсааа а§саддд1§ 29 <210> 6 <211> 34

-36006311 <212> ϋΝΑ <213> Агй£1С1а1 зециепсе <220>

<223> РСК рптег (Βπι-Ν8#2) <400> 6 а(а(сд1с1с §1айад1а§ ааасаадддг §й! 34 <210> 7 <211> 29 <212> ΏΝΑ <213> Аг11Г1С1а1 кедиепсе <220>

<223> РСК рптег (Вт-М#1) <400> 7

1айсд1с1с адддадсааа адсаддГад 29 <210> 8 <211> 37 <212> ϋΝΑ <213> Апйгс1а1 зедиепсе <220>

<223> РСК рптег (Вт-М#2) <400> 8 ага1сд1с1с §1айа§1ад ааасаад§1а §ййй 37 <210> 9 <211> 37 <212> ϋΝΑ <213> Агй1!с1а1 зедиепсе <220>

<223> РСК рптег (Вт-ΝΑΙ-Ι)

-37006311 <400> 9

1айс§1с1с адддадсааа адсаддадй 1ааса1§ 37 <210> 10 <211> 35 <212> ϋΝΑ <213> АП1Г1С1а1 зециепсе <220>

<223> РСВрпшег (Βιη-ΝΑ-1413Β) <400> 10 а1а1сд!с1с §1а11ад1ад ааасааддад ίίΐίί 35 <210> 11 <211> 34 <212> ΏΝΑ <213> АгйЯс1а1 зециепсе <220>

<223> РСВ рптег (Вт-Н6-1) <400> 11

1айс§1с1с адддадсааа адсаддддаа аа!§ 34 <210> 12 <211> 34 <212> ϋΝΑ <213> АП1Г1С1а1 кециепсе <220>

<223> РСВ рптег (Βπι-Ν8#2) <400> 12 а(а1с§1с1с §1айад1а§ ааасааддд! §111 34 <210> 13 <211> 29

-38006311 <212> ΌΝΑ <213> АП1йс1а1 зециепсе <220>

<223> РСК рптег (Ва-ΝΡ-1) <400> 13

1аИд§1с1с адддадсдаа адсадддГа 29 <210> 14 <211> 33 <212> ΌΝΑ <213> Агбйс1а1 яециепсе <220>

<223> РСК рптег (Β3-ΝΡ1565Κ) <400> 14 а1а1££1с1:с дСайадСад ааасаадддс аСС 33 <210> 15 <211> 35 <212> ΌΝΑ <213> ΑηϊΓιοΐβΙ зециепсе <220>

<223> РСК рптег (Вт-РА 1-1) <400> 15

1а11с§1с1с адддадсдаа адс১1ас1 даСсс 35 <210> 16 <211> 36 <212> ΌΝΑ <213> АгбГкла! «ециепсе <220>

<223> РСК рптег (Вт-РА 1-2231К)

-39006311 <400> 16 а1а(с§1с1с д1айа§1ад ааасаа§д1а сйй! 36 <210> 17 <211> 32 <212> ϋΝΑ <213> АП1йс1а1 зеяиепсе <220>

<223> РСК рпшег (Вт-РВ 1 а-1) <400> 17

1айс§1с1с адддадсдаа адсаддсааа сс 32 <210> 18 <211> 33 <212> ϋΝΑ <213> АП1Г1С1а1 зециепсе <220>

<223> РСК рпшег (Вт-РВ 1-2341К) <400> 18 а!а1с§1с1с £1айа§1ад ааасааддса И1 33 <210> 19 <211> 38 <212> ΏΝΑ <213> АП1Г1с1а1 зециепсе <220>

<223> РСК рпшег (Ва-РВ2-1) <400> 19

1айддййс адддадсдаа адсад§1саа йа!айс 38 <210> 20 <211> 36

-40006311 <212> ϋΝΑ <213> АП1Дс1а1 бециепсе <220>

<223> РСК рпшег (Ва-РВ2-2341К) <400> 20 а1а1££1с(с д1'Мад1ад аааса১1с §1йй 36 <210> 21 <211> 12 <212> ϋΝΑ <213> Аг1й1с1а1 хедиепсе <220>

<223> РСК рпшег <400> 21 а§саааа£са дд 12

Claims (41)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Экспрессионная плазмида, содержащая промотор РНК-полимеразы I (ροϊ I) и последовательности терминатора ροϊ I, которые инсертированы между промотором РНК-полимеразы II (ροϊ II) и сигналом полиаденилирования.
2. 2. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что промотор ροϊ I проксимален к сигналу полиаденилирования, а последовательность терминатора ροϊ I проксимальна к промотору ροϊ II.
3. 3. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что промотор ροϊ I проксимален к промотору ροϊ II, а последовательность терминатора ροϊ I проксимальна к сигналу полиаденилирования.
4. 4. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанная плазмида соответствует плазмиде, которая имеет карту, выбранную из группы, включающей ρΗ\2000, ρΗ\11 и ρΗ\12.
5. 5. Экспрессионная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что содержит также сегмент вирусного гена РНК вируса с отрицательной цепью, инсертированный между промотором и сигналом терминации ροϊ I.
6. 6. Экспрессионная плазмида по п.5, отличающаяся тем, что РНК-вирус с отрицательной цепью является членом семейства вирусов ΟΓΐΗοιτινχονίΓίάαβ.
7. 7. Экспрессионная плазмида по п.6, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа А.
8. 8. Экспрессионная плазмида по п.7, отличающаяся тем, что сегмент вирусного гена кодирует ген, выбранный из группы, содержащей белок комплекса вирусной полимеразы, М белок и N8 белок, при этом гены получают из штамма, хорошо адаптированного к росту в клеточной культуре, и/или из ослабленного штамма.
9. 9. Экспрессионная плазмида по п.6, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа В.
10. 10. Экспрессионная плазмида по п.8, отличающаяся тем, что плазмида имеет карту, выбранную из группы, состоящей из ρΗ\241-ΡΒ2, ρΐ 1\\241-РВ 1, ρΗ\243-ΡΑ, ρΗ\244-ΗΑ, ρΗ\245-ΝΡ, ρΗ\246-ΝΑ, ρΗ\247-Μ и ρΗ\248-Ν8.
11. 11. Экспрессионная плазмида по п.8, отличающаяся тем, что плазмида имеет карту, выбранную из группы, состоящей из ρΙΙ\\Ί81-ΡΒ2, ρΗ\181-РВ1, ρΙΙ\\Ί83-ΡΑ, ρΙΙ\\Ί84-ΙΙΑ, ρΗ\185-ΝΡ, ρΙΙ\\Ί86-ΝΑ, ρΗ\187-Μ и ρΗ\\Ί88-Ν8.
12. 12. Экспрессионная плазмида по п.7, отличающаяся тем, что сегмент вирусного гена кодирует ген, выбранный из группы, состоящей из гена гемагглютинина (НА) гриппа и гена невраминидазы (ΝΑ).
13. 13. Экспрессионная плазмида по п.12, отличающаяся тем, что ген вируса гриппа получают из патогенного штамма вируса гриппа.
14. 14. Экспрессионная плазмида по п.8, отличающаяся тем, что плазмида имеет карту, выбранную из группы, состоящей из ρΗ\244-ΗΑ, ρΗ\246-ΝΑ, ρΗ\184-ΗΑ, ρΗ\186-ΝΑ.

    -41006311
15. 15. Система, основанная на минимальном количестве плазмид, для получения инфекционных РНКвирусов с отрицательной цепью из клонированной вирусной кДНК, содержащей набор плазмид, отличающаяся тем, что каждая плазмида содержит один автономный вирусный геномный сегмент, а также тем, что вирусная кДНК, соответствующая автономному вирусному геномному сегменту, инсертирована между последовательностями промотора и терминатора РНК-полимеразы I (ро1 I), что приводит к экспрессии вРНК, которые, в свою очередь, инсертированы между промотором РНК-полимеразы II (ро1 II) и сигналом полиаденилирования, вызывая при этом экспрессию вирусной мРНК.
16. 16. Система, основанная на минимальном количестве плазмид по п.15, отличающаяся тем, что промотор ро1 I проксимален к сигналу полиаденилирования, а последовательность терминатора ро1 I проксимальна к промотору ро1 II.
17. 17. Система, основанная на минимальном количестве плазмид по п.15, отличающаяся тем, что промотор ро1 I проксимален к промотору ро1 II, а последовательность терминатора ро1 I проксимальна к сигналу полиаденилирования.
18. 18. Система, основанная на плазмидах по п.15, отличающаяся тем, что РНК-вирус с отрицательной цепью является членом семейства вирусов ОйЪотухоушбае.
19. 19. Система, основанная на плазмидах по п.18, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа А.
20. 20. Система, основанная на плазмидах по п.18, отличающаяся тем, что вирус является вирусом гриппа В.
21. 21. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что сегмент вирусного гена кодирует белок, выбранный из группы, содержащей белок комплекса вирусной полимеразы, М белок и Ν3 белок, при этом указанные гены получают из штамма, хорошо адаптированного к росту в клеточной культуре, и/или из ослабленного штамма.
22. 22. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что вирусные геномные сегменты содержат гены, которые кодируют белок, выбранный из группы, состоящей из гемагглютинина и гена невраминидазы или их обоих, при этом указанные гены получают из патогенного вируса гриппа.
23. 23. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что указанная система содержит одну или несколько плазмид, имеющих карту, выбранную из группы, состоящей из ρΗ\ν241-ΡΒ2, ρΗν241-ΡΒ1, ρΐ 1^243-0/% ρΗ№244-ΗΑ, ρΗ^245-ΝΡ, ρΗν246-ΝΑ, ρΐ Ι\ν247-\1 и ρΐ 1У248-Х3.
24. 24. Система, основанная на плазмидах по п.19, отличающаяся тем, что указанная система содержит одну или несколько плазмид, имеющих карту, выбранную из группы, состоящей из ρΗ\ν 181-ΡΒ2, ρΗν181-ΡΒ1, ρΐ 1\\'183-РД, ρΗ№184-ΗΑ, ρΗν185-ΝΡ, ρΗν186-ΝΑ, ρΐ ПУШ-М и ρΐ ΙΧΥ188-Χ3.
25. 25. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.15.
26. 26. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.18.
27. 27. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.19.
28. 28. Клетка-хозяин, содержащая систему, основанную на плазмидах по п.22.
29. 29. Способ получения вириона РНК-вируса с отрицательной цепью, включающий культивирование клетки-хозяина по п.25 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
30. 30. Способ получения вириона ОйЪотухоушбае, включающий культивирование клетки-хозяина по п.26 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
31. 31. Способ получения вириона вируса гриппа, включающий культивирование клетки-хозяина по п.27 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
32. 32. Способ получения патогенного вириона гриппа, включающий культивирование клетки-хозяина по п.28 при условиях, которые позволяют получать вирусные белки и вРНК или кРНК.
33. 33. Способ получения вакцины, специфической для РНК-вируса с отрицательной цепью, включающий очистку вириона, полученного способом по п.29.
34. 34. Способ по п.33, отличающийся тем, что включает также инактивацию вириона.
35. 35. Способ по п.33, отличающийся тем, что вирус РНК с отрицательной цепью является ослабленным вирусом.
36. 36. Способ вакцинации субъекта против инфекции РНК-вируса с отрицательной цепью, включающий введение указанному субъекту защитной дозы вакцины по п.33.
37. 37. Способ вакцинации субъекта против инфекции РНК-вируса с отрицательной цепью, включающий внутримышечную инъекцию указанному субъекту защитной дозы вакцины по п.33.
38. 38. Способ вакцинации субъекта против инфекции РНК-вируса с отрицательной цепью, включающий интраназальное введение указанному субъекту защитной дозы вакцины по п.33.
39. 39. Способ получения ослабленного РНК-вируса с отрицательной цепью, включающий

    а) мутирование одного или нескольких вирусных генов в системе, основанной на плазмидах по п.15, и

    б) определение, являются ли инфекционные РНК-вирусы, полученные в указанной системе, ослабленными.
40. 40. Состав, содержащий вирион РНК-вируса с отрицательной цепью, отличающийся тем, что вирусные внутренние белки вириона получают из вирусного штамма, хорошо адаптированного к росту в культуре, или из ослабленного штамма, или из них обоих, а вирусные антигенные белки вириона получают из штамма патогенного вируса.
41. 41. Состав, содержащий вирион РНК-вируса с отрицательной цепью, полученный способом по п.29.