ES2391123T3

ES2391123T3 - Proteínas H5, moléculas de ácido nucleico y vectores que las codifican, y su uso medicinal

Info

Publication number: ES2391123T3
Application number: ES07863555T
Authority: ES
Inventors: Eric M. Vaughn; Paulino Carlos Gonzalez-Hemandez; Juergen Daemmgen
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2027-10-26
Also published as: EP2086576B1; RU2009119597A; WO2008052173A2; CO6210831A2; CA2664914C; BRPI0718183B8; US20080193471A1; KR20150041200A; US9375469B2; DK2086576T3; RU2479589C2; EP2086576A4; US20120231027A1; WO2008052173A9; SI2086576T1; AU2007308869A1; EP2086576B8; JP5442442B2; MY150226A; AU2007308869B2

Abstract

Proteína hemaglutinina H5 del virus de la gripe, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1,en donde la Serina en la posiicón 223 de SEQ ID NO:1 está sustituida con una Asparagina y está insertada unasegunda Lisina en la posición del aminoácido 328.

Description

Proteínas H5, moléculas de ácido nucleico y vectores que las codifican, y su uso medicinal

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la medicina, preferiblemente al campo de las enfermedades infecciosas. En particular, la presente invención se refiere a proteínas de la gripe, moléculas de ácido nucleico y vectores que codifican estas proteínas y vacunas. Más particularmente, la presente invención se refiere a cualquiera de dichas proteínas, moléculas de ácido nucleico, vectores o vacunas para uso en el tratamiento y la prevención de infecciones de gripe, además para la prevención de la transmisión intra- o inter-especies del virus de la gripe.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La infección de gripe sigue siendo una infección importante en animales y seres humanos. La gripe está causada por virus que sufren continuos cambios/modificaciones antigénicos y que poseen una reserva animal. Por lo tanto, en el futuro pueden producirse nuevas epidemias y pandemias, y la erradicación de la enfermedad será difícil de conseguir. Los virus de la gripe son bien conocidos en la técnica y se describen con más detalle por ejemplo en P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, Nº 12, págs. S82 a S86 de Diciembre de 2004, con referencias adicionales. En resumen, el genoma del virus de la gripe A consta de ocho segmentos de cadena sencilla y las partículas virales tienen dos glicoproteínas principales en su superficie: la hemaglutinina (H) y la neuraminidasa (N). Con al menos 16 subtipos de hemaglutinina diferentes (H1 a H16) y 9 subtipos de neuraminidasa diferentes (N1 a N9) hay una variación antigénica considerable entre los virus de la gripe.

Se ha demostrado que el virus de gripe del tipo del virus de la gripe aviar H5N1 infecta a aves de corral, cerdos y seres humanos. Los virus también se pueden transmitir directamente de las especies avícolas a los seres humanos (Claas et al., Lancet 1998, 351: 472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72: 6678; Subbarao et al., Science 1998, 279: 393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Supl. 1): S26-S29). La mortalidad en los casos clínicos humanos conocidos alcanza aproximadamente el 50%.

Durante el último siglo, los cerdos han sido un importante vector para las pandemias de gripe. Los cerdos, camellos y focas, preferiblemente los cerdos, pueden servir como una "cámara de mezcla" para los virus de la gripe aviar y, por lo tanto, representan un factor de riesgo potencial para superar las barreras entre especies desde las aves de corral, reserva natural de los virus de gripe, a los mamíferos. Esto ocurre normalmente por las infecciones dobles de los animales susceptibles, por ejemplo cerdos, tanto con un virus de mamífero establecido (porcino) como con un virus de la gripe aviar. Esta doble infección puede crear nuevos virus recombinantes que pueden ser la causa de pandemias humanas o porcinas. La evidencia reciente, sin embargo, indicaría que una recombinación de cepas de H5 aviar común con virus de gripe de mamíferos no produce recombinantes muy virulentos. Por otra parte, el virus de la gripe aviar puede infectar cerdos y, mediante mutaciones espontáneas, puede adaptarse a los cerdos. La barrera crítica se superará tan pronto como el virus pueda producir infecciones horizontales en una población de cerdos (u otro mamífero).

Además, un parte importante de los cerdos del sudeste asiático han sido infectados con cepas de virus de la gripe aviar (H5) originados en explotaciones de aves de corral vecinas. Como estas infecciones han sido hasta ahora subclínicas sólo pueden ser diagnosticadas mediante métodos de laboratorio y, por lo tanto, frecuentemente no se tienen en cuenta. Hay un riesgo elevado de que estos cerdos infectados subclínicamente sirvan como oportunidad para que el virus se adapte al sistema de los mamíferos, se extienda en la población porcina e infecte también a los seres humanos.

Las vacunas de la gripe común incluyen vacuna de subunidades (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9–10): 1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17 (15–16): 2073-2080), vacuna atenuada (Horimoto et al., Vaccine 2004, 22 (17–18): 2244-2247), vacuna de DNA (Watabe et al., Vaccine 2001, 19 (31): 4434-4444) y vacuna de gripe desactivada (Cao et al., Vaccine 1992, 10 (4): 238-242), siendo esta última la usada más ampliamente a escala comercial (Lipatov et al., J Virol 2004, 78 (17): 8951-8959).

Las vacunas de subunidades, hemaglutinina y neuraminidasa recombinantes (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9– 10):1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17 (15–16): 2073-2080) pueden ser una alternativa atractiva a la vacuna desactivada, aunque no hay ninguna usada actualmente como vacuna comercial. La preparación de tales vacunas es obviamente más segura que la de la vacuna desactivada. Además, las vacunas de subunidades no producen respuestas de anticuerpos en las proteínas víricas de la gripe y, por lo tanto, permiten distinguir entre los animales vacunados y los infectados. (Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274).

La proteína hemaglutinina es la glicoproteína de fusión de la membrana y de unión al receptor del virus de la gripe y la diana para los anticuerpos neutralizadores de la infectividad. La proteína hemaglutinina (HA) completa del H5N1 está compuesta por 568 aminoácidos, con un peso molecular de 56 kDa. La molécula de HA consta de las subunidades HA1 y HA2, mediando la subunidad HA1 el contacto inicial con la membrana celular y siendo la HA2

5 responsable de la fusión de la membrana (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63 (1–2):129-136).

Los sistemas baculovirus/células de insecto se han usado para expresar los genes de la hemaglutinina aislados de los subtipos de gripe aviar (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9–10): 1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17 (15–16): 2073-2080); Nwe et al., BMC Mircobiology 2006, 6 (16):

10 DOI: 10.1186/1471-2180-6-16). Sin embargo, estas proteínas recombinantes parecen no ser protectoras en ningún caso, o solo menos eficaces al menos para algunas especies (Treanor et al., Vaccine 2001, 19: 1732-1737).

El documento de patente chino CN 1 748 795 describe una vacuna contra la gripe aviar que comprende una proteína H5 del virus de la gripe, en donde la secuencia de aminoácidos tiene dos residuos lisina en las posiciones 328 y 329

15 correspondientes.

Por lo tanto, es necesario aumentar la disponibilidad de vacunas mejoradas y de nuevas propuestas de vacunación para proporcionar mejores enfoques para controlar las infecciones de gripe y tener un impacto positivo sobre la carga de la enfermedad.

20 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Antes de los modos de realización de la presente invención, se debe observar que como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen la referencia en 25 plural, a no ser que en el contexto se indique claramente de otro modo. Así, por ejemplo, la referencia a "una preparación" incluye varias de estas preparaciones; la referencia al "vehículo" es una referencia a uno o más vehículos y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos empleados en esta memoria tienen los mismos significados que los que entiende generalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Todos los intervalos 30 y valores dados pueden variar entre 1 y 5%, a no ser que se indique de otro modo o que se conozca de otro modo por el experto en la técnica, por lo tanto el término "aproximadamente" se ha omitido de la memoria descriptiva. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o ensayos de la presente invención, los métodos, mecanismos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria se incorporan en la misma como

35 referencia con el fin de describir y exponer las sustancias, excipientes, vehículos y metodologías tal y como se mencionan en las publicaciones que se pueden utilizar en relación con la invención. Nada en la presente memoria debe ser interpretado como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser un precedente de tal descripción en virtud de una invención anterior.

40 La solución al problema técnico anterior se alcanza con la descripción y los modos de realización caracterizados en las reivindicaciones. La presente invención se refiere a compuestos, composiciones, kits y métodos según se define por las reivindicaciones.

Proteínas de la gripe y moléculas de ácido nucleico que las codifican

45 La presente invención se refiere a una proteína H5 del virus de la gripe, donde la proteína H5 tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5.

50 Preferiblemente, dicha proteína H5 y cualquier proteína H5 adicional según la invención es una proteína H5 aislada. Se ha encontrado sorprendentemente que las proteínas H5 que tienen las modificaciones descritas anteriormente son muy antigénicas en comparación con las proteínas H5 que no tienen los aminoácidos correspondientes en la posición 223 y 328/329.

55 La expresión “hemaglutinina 5 (H5)” o “H5 del virus de la gripe aviar” o "proteína H5” como se usa en la presente memoria significa, pero sin limitarse a ellas, cualquier proteína H5 existente naturalmente y cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante por deleción, sustitución y/o inserción de la proteína H5, donde estas proteínas H5 tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+.

60 La numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína como se usa en la presente memoria se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1. La secuencia SEQ ID NO:1 representa la secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina de la cepa pato/China/E319-2/03 pero a falta del péptido señal aminoterminal. En otras palabras, si se hace referencia al aminoácido en la posición 223 (aminoácido 223), el resto aminoácido corresponde al aminoácido 223 en la secuencia SEQ ID NO:1. Sin embargo, esto no

significa que las proteínas H5 según la presente invención tengan idéntica secuencia de aminoácidos que la secuencia SEQ ID NO:1. Sólo indica que los aminoácidos correspondientes de las proteínas H5 según la invención codifican el resto aminoácido, como se ha mencionado explícitamente. En el caso habitual, el aminoácido 223 sería la serina (S). Los términos “223N” o “155N” significan a modo de ejemplo que el aminoácido en las posiciones 223 y 5 155 respectivamente - numerando según las posiciones de aminoácido de la secuencia SEQ ID NO:1 - debe codificar el aminoácido asparagina (N). En otras palabras, si se hace referencia a una "proteína H5 que tiene el aminoácido 223N", una molécula de aminoácido de H5 que normalmente codifica la serina en la posición de aminoácido 223 -numerando según las posiciones de aminoácido de la secuencia SEQ ID NO:1 - este aminoácido debe estar sustituido por una asparagina (N). El término “328K+” o “modificación 328K+” significa que en la posición 10 de aminoácido 328 de la proteína H5 -numerando según las posiciones de aminoácido de la secuencia SEQ ID NO:1

-: se ha insertado una segunda lisina (K+). En los casos en los que las secuencias de aminoácidos en las posiciones 328 y 329 codifican naturalmente la lisina-lisina, no se debe insertar una lisina (K) adicional. Sin embargo, la mayoría de las secuencias de la H5 conocidas codifican en las posiciones 328 y 329 la lisina-arginina. En cualquiera de estos casos, el término modificación 328K+ significa que debe insertarse una segunda lisina (K) entre la lisina en la

15 posición 328 y la arginina en la posición 329. La secuencia modificada debe ser entonces lisina-lisina-arginina (KKR).

Por lo tanto, la presente invención se refiere a la proteína H5 y cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante de la proteína H5 por deleción, sustitución y/o inserción, donde estas proteínas H5 20 tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5. Se explica por sí mismo que cualquiera de las proteínas H5 como se proporcionan junto con la presente memoria son antigénicas, los que significa que presentan propiedades antigénicas en un ensayo

25 convencional de inhibición de la hemaglutinina para los virus de la gripe.

Según un modo de realización adicional, la presente invención se refiere también a cualquier parte de la proteína H5, lo que significa cualquier fragmento peptídico que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina, que tiene al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la

30 numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5.

Una proteína H5 muestra propiedades antigénicas si inhibe la hemaglutinación en un ensayo convencional de

35 inhibición de la hemaglutinina, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 2. Normalmente, dicha parte antigénica de la proteína H5 comprende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 o más preferiblemente 105 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína H5 como se ha mencionado anteriormente, modificada o no modificada, la cual muestra propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se describe en el Ejemplo 2. Un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina también

40 se describe por ejemplo en Stephenson et al., Virus Research vol. 103, págs. 91-95 (2004) con referencias adicionales. Sin embargo, debe entenderse que el ensayo HI (inhibición de la hemaglutinina) como se describe en el Ejemplo 2 es el ensayo de referencia pertinente relacionado con todos los aspectos de la invención como se describe en la presente memoria.

45 En resumen, se realizó un ensayo HI para detectar la presencia de anticuerpos específicos para la HA. En el ensayo HI se usó un virus H5N2 heterólogo, A/pollo/Mexico/232/94, con una concentración de cuatro unidades de hemaglutinación [4 unidades HA]. En placas de microvaloración con fondo en U se mezclaron subsiguientemente diluciones a la mitad en serie de suero en PBS con volúmenes iguales (25 μL) que contenían 4 unidades HA de virus, y se incubaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante 30 minutos. Se añadieron glóbulos

50 rojos de pollo con una concentración de 0,5% en PBS a los pozos que contenían el suero-virus y se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente. Los títulos HI se determinaron como recíprocos de las mayores diluciones de suero en las que se observó la inhibición de la hemaglutinación.

De forma importante, Haesebrouck y Pensaert (1986) encontraron que "puede existir una correlación entre los títulos

55 HI frente al virus de ataque y la protección del ataque". Haesebrouck y Pensaert (1986) también determinaron que los cerdos con títulos HI > 40 fueron "totalmente resistentes al ataque y no se produjo replicación de los virus en el tracto respiratorio durante el ataque". Por lo tanto, el desarrollo de títulos HI > 40 en el ganado porcino vacunado se correlacionaría con la protección. (F. Haesebrouck y M.B. Pensaert, 1986). "Effect of intratracheal challenge of fattening pigs previously immunized with an inactivated influenza H1N1 vaccine" (Veterinary Microbiology, 11 (1986)

60 239-249). Se debe suponer que los títulos HI equivalentes o casi equivalentes de la H5 también producirán una protección inmune total del ganado porcino frente al virus de la gripe. Los títulos menores producen al menos la seroconversión de los animales vacunados y producen una protección inmune parcial de estos animales, lo cual puede también reducir de forma importante el riesgo de una pandemia.

Además, una parte antígena de la proteína H5 según la invención incluye, pero sin limitarse a ellos, mutantes por deleción de la proteína H5 que comprenden:

i. al menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, o más preferiblemente 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que rodea e incluye el aminoácido 223N; y

5 ii. al menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, o más preferiblemente 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que rodea e incluye la modificación de aminoácido 328K+, y

iii. donde cualquiera de tales partes antigénicas de la proteína H5 muestra inhibición de la hemaglutinina en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se ha descrito en el ejemplo 2.

10 Preferiblemente, estos aminoácidos que rodean el aminoácido 223N y/o 328K+ son codificados por la secuencia SEQ ID NO:1 o la secuencia SEQ ID NO:4.

Además, las proteínas H5 preferidas según la invención son:

i. cualquiera de las mencionadas anteriormente que tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+; 15 ii. cualquiera de las mencionadas anteriormente que tienen el aminoácido 94N/223N y la modificación 328K+;

iii. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

iv. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene los aminoácidos 94N/223N y la modificación 328K+, donde

20 el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

v. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene los aminoácidos 155N/223N y la modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

25 vi. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene los aminoácidos 120N/155N/223N y la modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

vii. cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/223N y la modificación 328K+; o

viii.cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/155N/223N y la modificación 328K+; o 30 ix. cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/120N/155N/223N y la modificación 328K+; o

x. cualquier proteína H5 que tiene la modificación 223N, la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

a. aa 93-95: GNF

b. aa 123-125: SDH 35 c. aa 128-130: SSG

d.: aa 138-140: GSS

e.: aa 226-228:MDF

f.: aa 270-272: EVE

g.: aa 309-311: NKL; o

40 xi. cualquier proteína H5 que tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

a.: aa 93-95: GNF

b.: aa 128-130: SSG

c. aa 138-140: GSS; o 45 xii. cualquier proteína H5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO:4.

Además, las proteínas H5 preferidas como se proporcionan junto con la presente memoria incluyen las proteínas H5 como se describen por Hoffmann et al, PNAS, vol. 106, no.36, págs. 12915-12920 del 6 de septiembre 6, 2005, donde las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones como se han descrito anteriormente, al menos el

50 aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de los aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se inserta una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5. La descripción de esta referencia debe incluirse totalmente en la presente memoria como referencia.

55 Además, las proteínas H5 preferidas como se proporcionan junto con la presente memoria incluyen las proteínas H5 que comprenden el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5, y

i. las secuencias de aminoácido de las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6; o

ii. cualquier péptido que tiene al menos una homología de secuencia de 85%, más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente 90%, todavía más preferiblemente al menos una

5 homología de secuencia de aproximadamente 95%, incluso más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente 97%, todavía incluso más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente 98% e incluso más preferiblemente al menos una homología de secuencia de 99% con el polipéptido de i) que comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se ha descrito anteriormente; o

10 iii. cualquier parte antigénica de los polipéptidos de i) o ii) que comprenden al menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o más preferiblemente 8 aminoácidos contiguos de cualquiera de los polipéptidos i) o ii).

iv. cualquiera de los péptidos de i), ii) o iii) que tienen los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, 223N o 120N/155N.

v.: cualquiera de los péptidos de i), ii), iii) o iv) que tienen uno o más de los siguientes agrupamientos de 15 aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

a.: aa 93-95: GNF

b.: aa 123-125: SDH

c.: aa 128-130: SSG

d.: aa 138-140: GSS 20 e. aa 226-228:MDF

f.: aa 270-272: EVE

g.: aa 309-311: NKL; o

vi. cualquiera de los péptidos de i), ii), iii) o iv) que tienen uno o más de los siguientes agrupamientos de

aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en: 25 a. aa 93-95: GNF

b.: aa 128-130: SSG

c.: aa 138-140: GSS.

“Homología de secuencia”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un método para determinar el grado de

30 relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, se alinean óptimamente dos o más secuencias y, si es necesario, se introducen huecos. En contraposición con la identidad de la secuencia, las sustituciones moderadas de aminoácidos se cuentan como un emparejamiento cuando se determina la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido con un 95% de homología de secuencia con una secuencia de referencia, el 85%, preferiblemente el 90%, incluso más preferiblemente el 95% de

35 los restos aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de referencia debe emparejarse o comprender una sustitución moderada con otro aminoácido o nucleótido, o un cierto número de aminoácidos o nucleótidos hasta el 15%, preferiblemente hasta el 10%, incluso más preferiblemente hasta el 5% de los restos totales de aminoácidos o nucleótidos, que no incluyen sustituciones moderadas, en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Preferiblemente, la secuencia homóloga comprende al menos un tramo de 50, incluso más

40 preferiblemente de 100, incluso más preferiblemente de 250, incluso más preferiblemente de 500 nucleótidos. Tras dicha alineación, la homología de secuencia se constata sobre una base de posición-por-posición, p. ej. las secuencias son “homólogas” en una posición particular si en esa posición los restos nucleotídicos o de aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide entonces por el número total de restos de nucleótidos o de aminoácidos en la secuencia de referencia para dar el % de homología de secuencia. La homología

45 de secuencia se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., comp., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., comp., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., comps., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer,

50 Gribskov, M. y Devereux, J., comps., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cuyas enseñanzas se incorporan en esta memoria como referencia. Se han diseñado métodos preferidos para determinar la homología de secuencia para obtener el mayor emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la homología de secuencia se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias

55 dadas. Ejemplos de este tipo de programas incluyen, pero sin limitarse a ellos, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al.,

J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX está públicamente disponible de NCBI y de otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan en esta memoria como referencia). Estos programas alinean de

60 forma óptima las secuencias utilizando pesos de huecos por defecto con el fin de producir el nivel más alto de homología de secuencia entre la secuencia dada y la de referencia.

Además, las proteínas H5 preferidas incluyen las proteínas H5 que comprenden la modificación 328K+ como se ha mencionado anteriormente y la secuencia de aminoácidos proporcionada en la TABLA 1, o cualquiera de sus partes inmunogénicas:

TABLA 1: antígenos de la H5

Nombre de la secuencia: Secuencia básica Posiciones de los aminoácidos*

36: 83 86 120 155 156 189 212 223 263

223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - - - N -

36T/223N/328K+: cualquier HA H5 T - - - - - - - N -

36K/223N/328K+: cualquier HA H5 K - - - - - - - N -

83A/223N/328K+: cualquier HA H5 - A - - - - - - N -

83T/223N/328K+: cualquier HA H5 - T - - - - - - N -

83D/223N/328K+: cualquier HA H5 - D - - - - - - N -

86A/223N/328K+: cualquier HA H5 - - A - - - - - N -

86V/223N/328K+: cualquier HA H5 - - V - - - - - N -

120N/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - N - - - - N -

120S/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - S - - - - N -

155N/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - N - - - N -

155S/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - S - - - N -

156A/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - A - - N -

156T/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - T - - N -

189R/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - R - N -

189K/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - K - N -

212K/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - - K N -

212R/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - - R N -

212E/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - - E N -

223N/263A/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - - - N A

223N/263T/328K+: cualquier HA H5 - - - - - - - - N T

120N/155N/223N/328K+: cualquier HA H5 - - - N N - - - N -

A/pato/China/E3192/03/328k+: AAR99628 T A A S D A R K N A

A/pato/China/E3192/03_223N/328k+: AAR99628 T A A S D A R K N A

A/pato/China/E3192/03_120N/223N/328k+: AAR99628 T A A N D A R K N A

A/pato/China/E3192/03_155N/223N/328k+: AAR99628 T A A S N A R K N A

A/pato/China/E319-: AAR99628 T A A S N N R K N A

2/03_120N/155N/223N/328k +

HA/HK/213/03/328k+: AY518362 T A A N N A R K N A

HA/Vietnam/1203/04: K T V S S T K R N T

HA/Vietnam/1203/04 _223N/328k+: K T V S S T K R N T

HA/Vietnam/3046/04 _223N/328k+: T A V S S T K R N T

HA/Vietnam/3062/04 _223N/328k+: T A V S S T K R N T

HA/pollo/Vietnam/ 39/04_223N/328k+: T A V S S T K R N T

HA/halcón/HKD0028/04_223N/328k+: T A A S S A K E N A

HA/pollo/Singapur/3/97_223 N/328k+: T D V S N A K E N A

HA/HK/156/97/328k+: T A A S S A K E N T

# las posiciones de aminoácidos dadas en la TABLA 1 se refieren a las posiciones definidas a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1. En otras palabras, el aminoácido 223 de la TABLA 1 se refiere al aminoácido 223 de la secuencia SEQ ID NO:1.

5 -significa que los aminoácidos en esta posición son variables en comparación con la secuencia de referencia.

Además, la presente invención se refiere también a las proteínas H5 que tienen al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+

10 significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5, y comprende:

i. un péptido que tiene las secuencias con Nº de registro de NCBI AAT65209, CAJ32556, ABC47656, CAF21874, CAF21870, AAC58998, AAC58997, AAC58996, AAC58994, AAC58993, AAC58992, AAC58991, AAC58990, AAC58995, AAS45134, AAN17270, AAN17269, AAN17268, AAN17267,

15 AAN17266, AAN17265, AAN17264, AAN17263, AAN17262, AAN17261, AAN17260, AAN17259, AAN17257, AAN17256, AAN17255, AAN17254, AAA43083, AAA43082, AAB19079, BAE48696, BAE48693, BAE48696, BAE48695, BAE48694, BAE48692, BAE48691, BAE48690, BAE48689, BAE48688, BAE48687, BAE48686, BAE48685, BAE48684, BAE48683, AAC58999, ABC72082, AAV91149, AAP71993, AAP71992, AAP71991, AAP71990, AAP71989, AAP72011, AAP72010, AAP72009, AAP72008, AAP72007,

20 AAP72006, AAP72005, AAP72004, AAP72003, AAP72002, AAP72001, AAP72000, AAP71999, AAP71998, AAP71997, AAP71996, AAP71995, AAP71994, AAF99718, ABF58847, AAG38534, AAC32102, AAC32099, AAL75847, AAC32101, AAC32098, AAC32088, AAC32078, AAR99628, AAC32100, AAM49555, AAL75843, AAL75839, AAD13573, AAD13568, AAF04720, AAF04719, AAC34263, AAR16155, AAD13574, AAD13570, AAD13575, AAD13572, AAD13569, AAD13567, AAD13566, AAK57506, AAG01225,

25 AAG01215, AAG01205, AAG01195, o ABD83813 modificadas de una forma descrita anteriormente, lo que significa que estas secuencias incluyen las modificaciones 223N y 328K+ mencionadas anteriormente que no son parte de las secuencias de fenotipo salvaje; o

30 homología de secuencia de aproximadamente 95%, incluso más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente 97%, todavía incluso más preferiblemente al menos una homología de secuencia de aproximadamente 98% e incluso más preferiblemente al menos una homología de secuencia de 99% con el polipéptido de i) y que presenta inhibición de la hemaglutinina en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se ha descrito anteriormente;

35 iii. cualquiera de los péptidos de i) o ii) que tienen los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T o 120N/155N; o

iv. cualquiera de dichos péptidos de i), ii) o iii) que tienen uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

a.: aa 93-95: GNF 40 b. aa 123-125: SDH

c.: aa 128-130: SSG

d.: aa 138-140: GSS

e.: aa 226-228: MDF

f.: aa 270-272: EVE 45 g. aa 309-311: NKL; o

v. cualquier péptido de i), ii), iii) o iv) que tiene uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

a. aa 93-95: GNF

b.: aa 128-130: SSG 5 c. aa 138-140: GSS

Según un modo de realización adicional, la presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas H5 como se han descrito anteriormente. Preferiblemente, estas moléculas de ácido nucleico son moléculas de RNA, DNA o (c)DNA. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una molécula 10 de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA que codifica una proteína H5 o cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante de la proteína H5 por deleción, sustitución y/o inserción, donde estas H5 tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del

15 aminoácido 328 de la proteína H5.

Según un modo de realización adicional, la presente invención se refiere también a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA que codifica cualquier parte de la proteína H5, lo que significa que codifica cualquier fragmento peptídico que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la 20 hemaglutinina como se ha descrito anteriormente, y que tiene al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5. Normalmente, dichas moléculas de ácido nucleico que codifican una parte antigénica de la proteína H5 comprenden 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360,

25 330 o más preferiblemente 315 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína H5 como se ha mencionado anteriormente, modificada o no modificada, y que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se describe en la presente memoria.

Modos de realización adicionales de las partes antigénicas de la proteína H5 se describen en la parte precedente. La

30 construcción de cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de cDNA, que codifican la parte antigénica de la proteína H5 como se ha descrito anteriormente es de conocimiento general de un experto en la técnica. Esto también incluye, pero sin limitarse a ella, la construcción de moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de cDNA, que codifican las partes antigénicas de la proteína H5 como se ha mencionado anteriormente, incluyendo los mutantes por deleción de la proteína H5, que comprenden:

35 i. al menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, o más preferiblemente 24 aminonucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que rodea e incluye la secuencia codificadora que codifica el aminoácido 223N; y

ii. al menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, o más preferiblemente 24 aminonucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que rodea e incluye la secuencia codificadora que codifica la modificación 328K+, y

40 iii. donde cualquiera de tales partes antigénicas de la proteína H5 muestra inhibición de la hemaglutinina en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se ha descrito en el ejemplo 2.

Preferiblemente, dichos nucleótidos que rodean los nucleótidos que codifican los aminoácidos 223N y/o 328K+, codifican las secuencias SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4.

45 Además, las moléculas de ácido nucleico preferidas que codifican la proteína H5 según la invención son:

i. cualquiera de las mencionadas anteriormente que codifican el aminoácido 223N y la modificación 328K+;

ii. cualquiera de las mencionadas anteriormente que codifican el aminoácido 94N/223N y la modificación 328K+;

50 iii. cualquier molécula de ácido nucleico de origen aviar que codifica el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

iv. cualquier molécula de ácido nucleico de origen aviar que codifica los aminoácidos 94N/223N y la

modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue 55 originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

v. cualquier molécula de ácido nucleico de origen aviar que codifica los aminoácidos 155N/223N y la modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

vi. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 de origen aviar que tiene los

60 aminoácidos 120N/155N/223N y la modificación 328K+, donde el origen aviar significa que la secuencia H5 deriva de un virus aislado que fue originalmente aislado de un ave de corral infectada con un virus de gripe aviar del tipo 5; o

vii. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/223N y la modificación 328K+; o

viii. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/155N/223N y la modificación 328K+; o ;

5 ix. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/120N/155N/223N y la modificación 328K+; o

x. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 que tiene la modificación 223N, la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

10 a. aa 93-95: GNF

b.: aa 123-125: SDH

c.: aa 128-130: SSG

d.: aa 138-140: GSS

e. aa 226-228:MDF 15 f. aa 270-272: EVE

g. aa 309-311: NKL; o

xi. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 que tiene el aminoácido 223N, la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en:

20 a. aa 93-95: GNF

b.: aa 128-130: SSG

c.: aa 138-140: GSS; o

xii. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica una proteína H5 que tiene la secuencia de aminoácidos de las secuencia SEQ ID NO:4.

25 Además, las proteínas H5 preferidas como se proporcionan junto con la presente memoria incluyen las proteínas H5 como se describen wn Hoffmann et al, PNAS, vol. 106, no.36, págs. 12915-12920 del 6 de Septiembre 6, 2005, donde las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones como se han descrito anteriormente, al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de los aminoácidos de la proteína

30 H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y en la que la modificación 328K+ significa que se inserta una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5. La descripción de esta referencia debe incluirse totalmente en la presente memoria como referencia. Por lo tanto, según modos de realización adicionales, la presente invención también se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA, que codifica cualquiera de dichas proteínas descritas por

35 Hoffmann et al, PNAS, vol. 106, no.36, págs. 12915-12920 del 6 de Septiembre 6, 2005, donde las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones como se han descrito anteriormente, al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de los aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y en la que la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5.

40 Métodos para introducir cualquiera de las modificaciones mencionadas anteriormente en la secuencia de nucleótidos, incluyendo la secuencia que codifica la proteína H5 de un virus de gripe, son bien conocidos en la técnica. La secuencia genómica completa del virus de la gripe puede modificarse según la invención, por ejemplo según los métodos descritos en el documento US 6.951.754, con referencias adicionales.

45 Además, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y de DNA recombinante conocidas por el experto en la técnica para modificar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un antígeno como se ha descrito en la presente memoria. Dichas técnicas están completamente explicadas en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring

50 Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture

[R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To

Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 55 1994).

Según un modo de realización adicional, la presente invención también se refiere a un vector que comprende cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico como se han descrito anteriormente. En otras palabras, la presente invención se refiere a un vector que incluye la secuencia que codifica cualquiera de dichas proteínas H5, o

60 una de sus partes, como se han descrito anteriormente. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión que permite la expresión de cualquiera de dichas proteínas H5 o una de sus partes como se han descrito anteriormente. Los vectores según la invención son aquellos que son adecuados para la transfección o infección de células bacterianas, de levaduras o animales, in vitro o in vivo.

Los vectores y los métodos para hacer y/o usar vectores (o recombinantes) para la expresión pueden ser los descritos, o sus análogos, en: las patentes estadounidenses Nº 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848, 5.942.235, 5.364.773, 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235 y 382.425, las publicaciones PCT WO 94/16716, WO 96/39491 y WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, octubre de1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, octubre de 1996, Smith et al., patente estadounidense Nº 4.745.051, (baculovirus recombinante), Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, dic., 1983, Vol. 3, Nº 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, Nº 3, p. 399-406; EPA0 370 573, solicitud de patente estadounidense Nº 920,197, presentada el 16 de octubre de 1986, publicación de patente EP Nº 265785, patente estadounidense Nº 4.769.331 (virus del herpes recombinante),

Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, octubre de1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, octubre 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, octubre 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075,1991; patentes estadounidenses Nº 5.591.439, 5.552.143, WO 98/00166, solicitudes de patente estadounidense permitidas Nº de serie 08/675.556 y 08/675.566 ambas presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante), Grunhaus et al., 1992,"Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65,Graham, Tibtech 8,8587, abril de 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49,1993 y McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, octubre de 1996, y las patentes estadounidenses Nº 5.591.639, 5.589.466 y 5.580.859, así como los documentos WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660, Tang et al., Nature y Furth et al. Analytical Biochemistry, relacionados con los vectores de expresión del DNA, entre otros. Véanse también los documentos WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736739,1998 (sistema de expresión lentiviral); Sanford et al., patente estadounidense Nº 4.945.050; Fischbach et al. (Intracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, págs. 271-283 (1997), (sistemas de vectores de DNA); Szoka et al., patente estadounidense Nº (método para insertar DNA en células vivas); McCormick et al., patente estadounidense Nº 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y la patente estadounidense Nº 5.928.913 (vectores para la administración de genes), así como otros documentos citados en la presente memoria.

En la práctica de la invención se usa ventajosamente un vector viral, por ejemplo, elegido entre los virus de herpes de cerdo, tal como el virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, virus de la viruela, especialmente virus de la vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela de los canarios y virus de la viruela porcina, así como vectores de DNA (plásmidos de DNA).

Métodos para producir las proteínas H5 según la presente invención

Según otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir y/o recuperar cantidades elevadas de proteína H5 recombinante: i) permitiendo la infección de células susceptibles cultivadas con un vector viral recombinante que contiene secuencias codificadoras de DNA de la H5, donde la proteína H5 es expresada por el vector viral recombinante, y ii) recuperando a continuación la proteína H5 del cultivo celular. Cantidades elevadas de proteína H5 significa, pero sin estar limitado a ello, más de aproximadamente 20 μg/mL de cultivo celular, preferiblemente más de aproximadamente 25 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 30 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 40 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 50 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 60 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 80 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 100 μg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 150 μg/mL y lo más preferiblemente más de aproximadamente 190 μg/mL.

Según un modo de realización preferido, la proteína H5 se recupera recogiendo totalmente (es decir, intactas) las células SF+ que expresan la proteína H5.

Las células preferidas son aquellas susceptibles de infección con un vector viral recombinante apropiado que contiene un DNA de H5 y que expresa la proteína H5. Preferiblemente, las células son células de insectos y, más preferiblemente, incluyen las células de insectos vendidas bajo la marca registrada células de insectos Sf+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Los cultivos de células preferidos tienen un recuento celular entre aproximadamente 0,3-2,0 x 106 células/mL, más preferiblemente de aproximadamente 0,35-1,9 x 106 células/mL, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,4-1,8 x 106 células/mL, incluso más preferiblemente de

aproximadamente 0,45-1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5-1,5 x 106 células/mL.

Vectores virales preferidos incluyen baculovirus, tal como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), en particular con la condición de que las células de producción sean células de insectos. A pesar de que se prefiere el sistema de expresión de baculovirus, se entiende por los expertos en la técnica que otros sistemas de expresión funcionarán para los fines de la presente invención, principalmente la expresión de la H5 en el sobrenadante de un cultivo celular. Estos otros sistemas de expresión pueden requerir el uso de una secuencia señal con el fin de producir la expresión de la H5 en los medios.

Medios de crecimiento apropiados también podrán ser determinados por los expertos en la técnica, siendo un medio de crecimiento preferido el medio de células de insecto exento de suero, tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) y similares.

El vector viral recombinante que contiene las secuencias de ADN de la H5 tiene una multiplicidad de infección (MOI por sus siglas en inglés: multiplicity of infection) preferida de entre aproximadamente 0,03-1,5, más preferiblemente de aproximadamente 0,05-1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09-1,1 y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1-1,0, cuando se utiliza para la infección de las células susceptibles. Preferiblemente, los valores de MOI arriba mencionados se refieren a un mL de fluido del cultivo celular. Preferiblemente, el método descrito en la presente memoria comprende la infección de 0,35-1,9 x 106 células/mL, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,4-1,8 x 106 células/mL, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45-1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5-1,5 x 106 células/mL, con un vector viral recombinante que contiene un ADN de la H5 y que expresa la proteína H5 con una MOI (multiplicidad de infección) de entre aproximadamente 0,03-1,5, más preferiblemente de aproximadamente 0,05-1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09-1,1 y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1-1,0.

Las células infectadas se incuban luego a lo largo de un periodo de hasta diez días, más preferiblemente de aproximadamente dos días a aproximadamente diez días, todavía más preferiblemente de aproximadamente cuatro días a aproximadamente nueve días, y lo más preferiblemente de aproximadamente cinco días a aproximadamente ocho días. Las condiciones de incubación preferidas incluyen una temperatura entre aproximadamente 22-32°C, más preferiblemente de aproximadamente 24-30°C, todavía más preferiblemente de aproximadamente 25-29°C, incluso más preferiblemente de aproximadamente 26-28°C, y lo más preferiblemente de aproximadamente 27°C. Preferiblemente, las células SF+ se observan después de la inoculación en cuanto a cambios característicos inducidos por baculovirus. Una observación de este tipo puede incluir la vigilancia de las tendencias de densidad celular y la disminución en la viabilidad durante el periodo post-infección. Se encontró que el título viral máximo se observa 3-5 días después de la infección y la expresión de la proteína H5 en las células se obtiene entre los días 5 y 8 y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos de 10%.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un método para producir y/o recuperar proteína H5 recombinante, preferiblemente en las cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células susceptibles (véase anteriormente) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI como se ha definido anteriormente, ii) expresando la proteína H5 mediante el vector viral recombinante, y iii) recuperando a continuación la proteína H5 de las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos de 10%. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus recombinante que contiene secuencias codificadoras de ADN de la H5 y las células son células SF+. Adicionalmente, se prefiere que el cultivo se examine periódicamente en cuanto a la evidencia macroscópica y microscópica de contaminación o en cuanto a cambios atípicos en la morfología de la célula durante el periodo postinfección. Debería desecharse cualquier cultivo que presente cualquier contaminación.

Para la recuperación de la proteína H5 que se utilizará en una composición inmunogénica o inmunológica, tal como una vacuna, se prefiere la inclusión de una etapa de desactivación con el fin de desactivar el vector viral.

Una “composición inmunogénica o inmunológica” se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno que induce una respuesta inmunológica en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitarse a ellos, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T gamma-delta, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped presentará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de modo que esa resistencia a la nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Una protección de este tipo se demostrará por una reducción o carencia de síntomas exhibidos normalmente por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título vírico disminuido en el huésped infectado.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir y/o recuperar proteína H5 recombinante, preferiblemente en las cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células susceptibles (véase anteriormente) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI como se ha definido anteriormente, ii) expresando la proteína H5 mediante el vector viral recombinante, iii) recuperando la proteína H5 expresada en las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos de 10%, y iv) inactivando el vector viral recombinate.

Preferiblemente, esta inactivación se hace bien justo antes o bien justo después de la etapa de filtración, siendo después de la etapa de filtración el tiempo preferido para la desactivación. Para los fines de la presente invención se puede utilizar cualquier método de desactivación convencional. Así, la inactivación se puede efectuar mediante tratamientos químicos y/o físicos. En formas preferidas, se determina el volumen de los fluidos recolectados y la temperatura se lleva a un intervalo entre aproximadamente 32-42°C, más preferiblemente entre aproximadamente 34-40°C, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 35-39°C. Métodos de inactivación preferidos incluyen la adición de etilenimina binaria (BEI por sus iniciales en inglés: binary ethylenimine) ciclada, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la desactivación incluye la adición de una disolución de hidrobromuro de 2bromoetilenamina, preferiblemente de aproximadamente 0,4M, que se ha ciclado a etilenimina binaria (BEI) 0,2M en NaOH 0,3N a los fluidos para dar una concentración final de BEI de aproximadamente 5 mM. Preferiblemente, los fluidos se agitan entonces continuamente durante 72-96 horas y los fluidos recolectados desactivados pueden almacenarse congelados a -40°C o menos o entre aproximadamente 1-7°C. Después de haberse completado la inactivación, se añade una disolución de tiosulfato de sodio, preferiblemente con una concentración 1,0M para neutralizar cualquier BEI residual. Preferiblemente, el tiosulfato de sodio se añade en una cantidad equivalente comparada con la BEI añadida antes de la desactivación. Por ejemplo, en el caso de añadir BEI hasta una concentración final de 5 mM, se añade una disolución de tiosulfato de sodio 1,0M para dar una concentración mínima final de 5 mM para neutralizar toda la BEI residual.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para producir y/o recuperar proteína H5 recombinante, preferiblemente en las cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un cierto número de células susceptibles (véase anteriormente) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI como se ha definido anteriormente, ii) expresando la proteína H5 mediante el vector viral recombinante, iii) recuperando la proteína H5 expresada en las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos de 10%, y iv) desactivando el vector viral recombinate. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene secuencias codificadoras de DNA de la H5 y las células son células SF+. Las etapas de desactivación preferidas son las descritas anteriormente. Preferiblemente, la inactivación se efectúa entre aproximadamente 35-39°C y en presencia de BEI 2 a 8 mM, todavía más preferiblemente en presencia de BEI de aproximadamente 5 mM.

Según un aspecto adicional de la presente invención, el método descrito anteriormente incluye también una etapa de neutralización después de la etapa iv). Esta etapa v) comprende añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza el agente de desactivación en la disolución. Preferiblemente, si el agente de desactivación es la BEI, se prefiere la adición de tiosulfato de sodio en una cantidad equivalente. Por lo tanto, según un aspecto adicional, la etapa v) comprende añadir una disolución de tiosulfato de sodio hasta una concentración final de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM, preferiblemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7 mM y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de desactivación es la BEI.

En formas preferidas y, especialmente, en formas que utilizarán la proteína H5 recombinante en una composición inmunogénica, tal como una vacuna, en cada lote de proteína H5 recolectada se analizará la desactivación mediante el paso en células de insecto dependientes del anclaje susceptibles al baculovirus, tales como las células Sf9. En una forma preferida de este ensayo, se inoculan 150 cm2 de monocapa de cultivo celular apropiado con 1,0 mL de fluidos de H5 desactivados y se mantienen a 25-29°C durante 14 días con al menos dos pasadas. Al final del periodo de mantenimiento, se determina en las monocapas celulares el efecto citopatogénico (CPE por sus iniciales en inglés: cytopathogenic effect) típico de baculovirus de H5. Preferiblemente, también se utilizan controles de virus positivos. Este tipo de controles pueden consistir en un cultivo de células Sf9 inoculadas con un baculovirus de H5 de referencia no desactivado y un matraz de células Sf9 que permanecen sin inocular. Después de la inoculación y de la pasada, la ausencia de células infectadas con virus en los fluidos virales tratados con BEI constituiría un ensayo de desactivación satisfactorio. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían presentar un CPE típico de baculovirus de H5 y el matraz no inoculado no debería mostrar evidencia alguna de CPE de baculovirus de H5. Alternativamente, al final del periodo de mantenimiento, las muestras de sobrenadante se podrían recoger e inocular en una placa de 96 pocillos con Sf9, que haya sido cargada con células Sf9, y luego se podrían mantener a 25-29°C durante 5-6 días. La placa se fija entonces y se tinta con anticuerpo anti-H5 conjugado con FITC o cualquier anticuerpo marcado dirigido a las proteínas específicas de baculovirus (p. ej. gp64). La ausencia de CPE, expresión de la H5 o expresión de las proteínas específicas de baculovirus (p. ej. gp64) en los fluidos virales tratados con BEI constituye un ensayo de inactivación satisfactorio. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían presentar un CPE y actividad IFA y el matraz no inoculado no debería mostrar

5 evidencia alguna de CPE de baculovirus de H5 ni contener actividad IFA.

Por lo tanto, un aspecto adicional descrito en la presente memoria se refiere a un ensayo de inactivación para determinar la eficacia de la inactivación del vector viral de recombinación que expresa la proteína H5, que comprende las etapas: i) poner en contacto al menos una parte del fluido del cultivo que contiene el vector viral

10 recombinante con un agente inactivante, preferiblemente como se ha descrito anteriormente, ii) añadir un agente de neutralización para neutralizar el agente de inactivación, preferiblemente según se ha descrito anteriormente, y iii) determinar la infectividad residual mediante los ensayos como se han descrito anteriormente.

Después de la inactivación, la cantidad relativa de proteína H5 recombinante en una muestra se puede determinar

15 por varías vías. Los métodos preferidos de cuantificación incluyen densiometría por SDS-PAGE, ELISA y estudios de vacunación de animales que se correlacionan con cantidades conocidas de vacuna con resultados clínicos (serología, etc.). Cuando se usa SDS-PAGE para la cuantificación, el material de la muestra que contiene una cantidad desconocida de proteína H5 recombinante se deposita sobre un gel junto con muestras que contienen cantidades conocidas diferentes de proteína H5 recombinante. Entonces se puede producir una curva convencional

20 basada en las muestras conocidas y se puede determinar la cantidad de H5 recombinante de la muestra desconocida por comparación con esta curva convencional. Como los análisis por ELISA se reconocen generalmente como el patrón industrial para la cuantificación de antígenos, se prefieren para la cuantificación.

Vacunas que comprenden proteínas H5 o moléculas de ácido nucleico o vectores que las codifican

25 Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a vacunas o composiciones farmacéuticas en general, que comprenden:

i. una o más de las proteínas H5 como se han descrito en la presente memoria;

ii. una o más de las moléculas de ácido nucleico como se han descrito en la presente memoria, que codifican 30 cualquiera de tales proteínas H5; y/o

iii. una o más de los vectores como se han descrito en la presente memoria, incluyendo cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico y que codifican cualquiera de tales proteínas H5 como se han descrito en la presente memoria; y

iv. un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

35 La expresión "composición farmacéutica" o "composición farmacéutica/vacuna" como se ha descrito en la presente memoria incluye, pero sin limitarse a ellas, vacunas para la reducción o prevención de una infección o una composición de materia para el tratamiento y la disminución de una infección.

40 La preparación de vacunas basadas en ácidos nucleicos, preferiblemente vacunas de cDNA, que codifican la hemaglutinina de gripe se describen por ejemplo en Deck et al, Vaccine 1997; 15 (1): 71-78; Ulmer et al., Science 1993; 259: 1745-1749; Ulmer et al., Vaccine 1994; 12 (16):1541-1544. Cualquiera de estos métodos se pueden usar para la producción de vacunas basadas en ácidos nucleicos, preferiblemente vacunas de cDNA, que codifican la proteína H5 de la gripe como se ha descrito en la presente memoria.

45 Además, una vacuna que comprende una proteína H5 o sus partes, como se han descrito en la presente memoria, se puede producir mediante enfoques convencionales, p. ej. mediante técnicas de expresión recombinante o mediante técnicas de purificación bioquímica y separación. Técnicas de expresión recombinante, incluyendo la expresión en células de insectos son bien conocidas en la técnica y se describen por ejemplo en Sambrook et al.,

50 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M.

55 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994). Ejemplos adicionales de sistemas de expresión recombinante bien establecidos son los sistemas de expresión bacteriana, tal como E. coli o

B. subtilis, sistemas de expresión basados en levaduras, tales como S. cerevisiae o S. pombe, o sistemas de expresión de células de mamíferos, tales como los sistemas de expresión basados en BHK, CHO y/o NS0. Dichos sistemas son bien conocidos en la técnica y están disponibles generalmente, por ejemplo comercialmente en

60 Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, Estados Unidos. Estrategias de expresión adicionales se describen por ejemplo en Lüschow et al., Vaccine no. 19 (2001), págs. 4249-4259, o Veit et al., PNAS vol. 103 (2006), págs. 8197-8202. Además, sistemas víricos adeno-asociados están bien establecidos y se describen por ejemplo en los documentos US 5.436.146 o WO200203872 con referencias adicionales. Además,

sistemas de expresión basados en virus de vaccinia (viruela), por ejemplo como se describen en el documento US

6.265.183 con referencias adicionales, también están bien establecidos y son adecuados para producir antígeno(s) recombinante(s), composición(ones) antigénica(s) y para usarse según la presente invención. Sistemas de expresión adecuados adicionales utilizan virus de popova recombinantes, tales como SV40, virus de viruela de las aves de

5 corral, virus de la pseudorrabia y retrovirus.

Las composiciones farmacéuticas/vacunas apropiadas como se han descrito en la presente memoria también pueden comprender virus desactivados que comprenden una proteína H5 como se ha descrito en la presente memoria, una versión apatogénica de un virus vivo que comprende una proteína H5 como se ha descrito en la

10 presente memoria, una preparación y/o fragmentos de un virus, donde dicha preparación y/o fragmento comprende una proteína H5 como se ha descrito en la presente memoria.

El experto conoce componentes adicionales que pueden estar comprendidos en dichas composiciones/vacunas junto con el antígeno (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ., 15 Easton). El experto puede utilizar disoluciones estériles inyectables, fisiológicamente aceptables, conocidas. Para preparar una disolución preparada para el uso hay disoluciones isotónicas acuosas fácilmente disponibles, tales como, p. ej., disolución salina o disoluciones correspondientes de proteínas en plasma. La composición farmacéutica/vacuna puede estar presente en forma de liofilizados o preparaciones secas, las cuales se pueden reconstituir con una disolución inyectable conocida directamente antes del uso en condiciones estériles, p. ej. en

20 forma de un kit en partes.

Además, las composiciones farmacéuticas/vacunas de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos aceptables desde el punto de vista veterinario. Tal como se emplea en la presente memoria, "un soporte aceptable desde el punto de vista veterinario" incluye, pero sin limitarse a ellos, uno y cualquiera entre disolventes, medios

25 dispersantes, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que retrasan la adsorción y similares.

Diluyentes pueden incluir agua, disolución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Estabilizantes incluyen albúmina y sales 30 alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.

Un conservante, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un agente activo anti-microbiológicamente tal como, por ejemplo, gentamicina, mertiolato y similares. En particular, la adición de un conservante es lo más preferido para la preparación de una composición en multi-dosis. Esos agentes activos anti-microbiológicamente se

35 añaden en concentraciones eficaces para prevenir cualquier contaminación microbiológica de la composición de interés o para la inhibición de cualquier crecimiento microbiológico en la composición de interés.

“Adyuvantes”, tal como se utilizan en la presente memoria, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, p. ej. Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., 40 Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua o emulsión de agua en aceite en agua.

La emulsión se puede basar, en particular, en aceite de parafina líquido ligero (tipo de la Farmacopea Europea); aceite isoprenoide, tales como escalano o escaleno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más 45 particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isosteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitan, de manida (p. ej. oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isosteárico, ricinoleico o 50 hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, en especial L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, págs. 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15: 564570 (1997). Ejemplos de emulsiones de aceite-en-agua son adyuvantes basados en Emulsigen, tales como EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, Estados

55 Unidos). Sorprendentemente, se ha encontrado que composiciones farmacéuticas/vacunas que comprenden una proteína H5, preferiblemente una proteína H5 recombinante como se ha descrito en la presente memoria, se han preparado de forma eficaz con emulsiones de aceite-en-agua como adyuvantes, preferiblemente con tales adyuvantes basadas en Emulsigen, más preferiblemente con EMULSIGEN® y EMULSIGEN-D®.

60 Además, es posible utilizar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro.

Un ejemplo adicional de adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con polialquenil-éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, nº 2, junio de 1996). Los expertos en 5 la técnica también pueden referirse a la patente de EE.UU. nº 2.909.462 que describe polímeros acrílicos de este tipo reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos sustituidos con radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono,

p. ej. vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener por sí

10 mismos otros sustituyentes tal como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alil-sacarosa o con alil-pentaeritritol. Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Lo más preferido es el uso de Cabopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua produce a una disolución ácida que será

15 neutralizada, preferiblemente hasta un pH fisiológico, con el fin de obtener la disolución adyuvante en la que se incorporará la propia composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna.

Adyuvantes adecuados adicionales incluyen, pero sin estar limitados a ellos, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero de bloques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil-lípido A, adyuvante de

20 lípido-amina Avridina, enterotoxina térmicamente lábil procedente de E. coli (recombinante o de otro modo), toxina del cólera o dipéptido muramilo, entre muchos otros.

Preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 μg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 μg

25 hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 500 μg hasta aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 750 μg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis. Lo más preferido, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.

30 Las composiciones farmacéuticas/vacunas pueden además incluir uno varios otros agentes inmunomoduladores tales como, p. ej., interleucinas, interferones u otras citocinas. Las composiciones farmacéuticas/vacunas también pueden incluir gentamicina y mertiolato. Si bien las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por el experto en la técnica, la presente invención contempla composiciones que comprenden de aproximadamente 50 μg a aproximadamente 2.000 μg de

35 adyuvante y preferiblemente aproximadamente 250 μg/1 mL de dosis de la composición de vacuna. En otro modo de realización preferido, la presente invención contempla composiciones de vacuna que comprenden entre aproximadamente 1 μg/mL y aproximadamente 60 μg/mL de antibióticos, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 μg/mL de antibióticos.

40 Por lo tanto, según un modo de realización adicional, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica/vacuna que comprende:

i. una cantidad terapéuticamente eficaz de una cualquiera de las proteínas H5 del virus de la gripe como se han descrito en la presente memoria, en la que la proteína H5 tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, donde la numeración de las posiciones de aminoácido de la proteína H5 se refiere a la posición de

45 aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO:1 y donde la modificación 328K+ significa que se ha insertado una segunda lisina (K+) en la posición del aminoácido 328 de la proteína H5; y

ii. adyuvantes farmacéuticamente aceptables como se han descrito anteriormente.

Preferiblemente, el adyuvante se elige entre el grupo que consiste en:

50 a) EMULSIGEN®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w por sus inciales en inglés: oil-in-water); b) EMULSIGEN-D®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA); c) un Poligen, un copolímero; d) EMULSIGEN-P®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con un inmunoestimulante patentado e) Carbigen, un polímero reticulado

55 f) EMULSIGEN-75®, un adyuvante doble que comprende una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con un polímero reticulado g) ISA 70, una emulsión de agua-en-aceite (w/o)

Más preferiblemente, el adyuvante es una emulsión de aceite-en-agua tal como un adyuvante basado en un

60 emulsigen elegido entre el grupo que consiste en EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN75®, EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P®. Más preferiblemente, se usan EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P® en la formulación de la presente invención.

Según un aspecto adicional, las composiciones farmacéuticas/vacunas como se proporcionan junto con la presente memoria comprenden uno o más antígenos. Preferiblemente, este antígeno adicional es un antígeno de un ave de corral o un mamífero. Según modos de realización adicionales, este antígeno adicional es un antígeno de gripe adicional, tal como hemaglutinina H3, H7, H9 o cualquier otra hemaglutinina del virus de la gripe. El (los) antígeno(s)

5 adicional(es) se puede(n) añadir en una forma purificada, como parte de una preparación antigénica, en forma de un microorganismo muerto o en forma de un microorganismo vivo modificado.

El término “antígeno”, como se usa en la presente memoria, significa, pero sin limitarse a ellos, péptidos, polipéptidos, glicopéptidos o polisacáridos que son capaces de interactuar específicamente con una molécula de

10 reconocimiento de un antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor antigénico de células T con el fin de inducir, activar o estimular una respuesta autoinmune dirigida a dicho antígeno en un huésped al que se le administra dicho antígeno. El término "antígeno" también se refiere a moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de DNA o RNA, cada una de las cuales codifica y expresa un péptido, polipéptido o glicopéptido que es capaz de interaccionar específicamente con una molécula de reconocimiento de un

15 antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor antigénico de células T con el fin de inducir, activar o estimular una respuesta inmune frente al antígeno que es codificado por la molécula de ácido nucleico. El antígeno usado para la preparación de la composición farmacéutica que se usa según la invención es un microorganismo o una parte y/o preparación antigénica de dicho microorganismo. En este sentido, el término "inmunización", como se usa en la presente memoria, significa, pero sin estar limitado a ellas, cualquier causa o

20 aumento de una respuesta inmune. El término "respuesta inmune" ya ha sido descrito anteriormente.

Estrategias de administración de vacunas de la gripe son bien conocidas en la técnica. Se contemplan estrategias de vacunación por vía mucosa para vacunas con virus desactivados y atenuados. Aunque la mucosa puede ser objetivo para la administración local de una vacuna, se han empleado varias estrategias para la administración de

25 proteínas inmunogénicas en la mucosa.

En un modo de realización específico, la vacuna puede administrarse mezclada o como conjugado o proteína de fusión híbrida con toxina del cólera, tal como toxina B del cólera o toxina híbrida A/B del cólera (Hajishengallis , J Immunol., 154: 4322-32, 1995; Jobling y Holmes, Infect Immun., 60: 4915-24, 1992). Se han descrito vacunas por

30 vía mucosa basadas en el uso de la subunidad B de la toxina del cólera (Lebens y Holmgren, Dev Biol Stand 82: 215-27, 1994). En otro modo de realización, se puede preparar una mezcla con una enterotoxina (LT) térmicamente inestable para la vacunación por vía mucosa.

Otras estrategias de inmunización por vía mucosa incluyen encapsular el virus en microcápsulas (véanse los

35 documentos US 5.075.109, US 5.820.883 y US 5.853.763) y usar un vehículo membranoso inmunopotenciador (véase el documento WO 98/0558). La inmunogenicidad de los inmunógenos administrados oralmente puede ser mejorada usando glóbulos rojos sanguíneos (rbc por sus iniciales en inglés: red blood cells) o rbc fantasma (véase el documento US 5.643.577) o usando antígeno de la enfermedad de la lengua azul (véase el documento US 5.690.938).

40 Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica/vacuna como se ha descrito anteriormente, preferiblemente un método para producir una vacuna que comprende una proteína H5 recombinante expresada en baculovirus, como se ha descrito anteriormente. Generalmente, este método incluye las etapas de transfectar un constructo en un virus, donde el constructo

45 comprende i) cDNA de H5 recombinante como se ha descrito en la presente memoria, ii) infectar células en medios de crecimiento con el virus transfectado, iii) hacer que el virus exprese la proteína H5 recombinante como se ha descrito en la presente memoria, iv) recuperar la proteína H5 expresada a partir del cultivo, y v) preparar la composición por combinación de la proteína H5 expresada con un adyuvante adecuado y/u otro vehículo farmacéuticamente aceptable.

50 Adyuvantes preferidos son los descritos anteriormente. Por lo tanto, según un aspecto adicional, el método para preparar una composición antigénica tal como, por ejemplo, una vacuna, para producir una respuesta inmune frente las infecciones de gripe comprende i) preparar y recuperar una proteína H5, y ii) mezclar esto con un adyuvante adecuado.

55 Además, las composiciones para vacuna de la presente invención también pueden incluir diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes y/o conservantes. Diluyentes pueden incluir agua, disolución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Agentes isotónicos pueden incluir sales inorgánicas u orgánicas, p. ej. cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, sacáridos, trahalosa, manitol y sacarosa, entre otros. Estabilizantes incluyen albúmina y

60 sales alcalinas de ácido etilendiamintetracético, entre otros. Adyuvantes adecuados son los descritos anteriormente.

Uso medicinal de cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico, vectores y vacunas

Las proteínas H5 como se proporcionan junto con la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o 5 vectores se pueden usar como medicina, preferiblemente para el tratamiento y la profilaxis de infecciones producidas por el virus de la gripe, más preferiblemente por el virus de la gripe A. Las proteínas H5 como se proporcionan junto con la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/vacuna que

10 comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar para el tratamiento o la profilaxis de seres humanos, así como en medicina veterinaria. Cuando se usan en medicina veterinaria, se prefiere el tratamiento de aves de corral, preferiblemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como de mamíferos, preferiblemente cerdos, ganado vacuno, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámster, ratones y similares.

15 Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de las proteínas H5 como se proporcionan junto con la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/vacuna que

20 comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar como medicina, preferiblemente para seres humanos y/o como medicina veterinaria.

Además, las proteínas H5 como se proporcionan junto con la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que

25 codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar en la preparación de una composición farmacéutica, como se ha descrito en la presente memoria, para la profilaxis o el tratamiento de infecciones causadas por la gripe viral. Como se ha mencionado anteriormente, estas composiciones farmacéuticas/vacunas se pueden usar para el tratamiento y/o la profilaxis de seres humanos así

30 como para el tratamiento y/o la profilaxis de animales, tales como aves de corral, preferiblemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como de mamíferos, preferiblemente cerdos, ganado vacuno, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámster, ratones y similares.

Las proteínas H5 como se proporcionan junto con la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que

35 codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar para la preparación de una composición farmacéutica, como se ha descrito en la presente memoria, para el tratamiento y la profilaxis de infecciones del virus de la gripe, que preferiblemente están causadas por virus de la gripe aviar, porcina o humana, o cualquiera de sus combinaciones o híbridos.

40 Según un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones del virus de la gripe, donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína H5, como se ha descrito en la presente memoria, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Además, la presente invención también se refiere a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones del

45 virus de la gripe, donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier molécula de ácido nucleico o vector de la H5, como se han descrito en la presente memoria, que codifica cualquier proteína H5, como se ha descrito en la presente memoria, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Además, la presente invención también se refiere a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones del virus de la gripe, donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la

50 vacuna que comprende cualquier proteína H5, molécula de ácido nucleico o vector, como se han descrito en la presente memoria, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. El que lo necesita puede ser un ser humano así como un animal, preferiblemente ave de corral, incluso más preferiblemente un pájaro, pollo, pato o pavo, o un mamífero, preferiblemente cerdo, ganado vacuno, caballo, foca, camello, perro, gato, hámster, ratón y similares.

55 Preferiblemente, cuando se vacunan pollos, la proteína H5, como se ha descrito en la presente memoria, su puede usar para la vacuna con 1 día de edad o más tarde, p. ej. en el décimo día, o entre el día 1 y el 10, o en el décimo día o más tarde.

Preferiblemente, la infección de la gripe que se puede tratar mediante la administración de cualquier proteína H5, la

60 molécula de ácido nucleico o vector que codifica cualquiera de dichas proteínas H5, o cualquier composición farmacéutica/vacuna, como se han descrito en la presente memoria, está causada por un virus de la gripe aviar, porcina o humana o cualquiera de sus combinaciones o híbridos.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit en partes que comprende i) cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, la molécula de ácido nucleico o vector que codifica cualquiera de dichas proteínas H5, o cualquier composición farmacéutica/vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores como se han descrito en la presente memoria, y ii) un

5 prospecto del envase que indica el uso de dicha proteína H5, molécula de ácido nucleico, vector o vacuna para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por el virus de la gripe. Cuando se vacunan pollos, la proteína H5 como se ha descrito en la presente memoria se puede usar para la vacunación con 1 día de edad o más tarde.

Según un modo de realización adicional, este kit en partes comprende al menos un antígeno adicional de un

10 patógeno de ave de corral o mamífero y la información que indica el uso medicinal, humano o veterinario, de dicho antígeno adicional.

EJEMPLOS

15 Los siguientes ejemplos recogen materiales y procedimientos preferidos según la presente invención. Ha de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración solamente, y nada en ellos debe considerarse una limitación tras el alcance global de la invención.

EJEMPLO 1 20 Construcción de baculovirus recombinantes que codifican y expresan antígenos de la HA H5

El baculovirus recombinante que contenía el antígeno de la HA H5 se generó como sigue: las secuencias codificadoras del HA H5 (SEQ ID NO:2) se sintetizaron químicamente y se subclonaron en el vector de transferencia 25 pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). La HA MutK+ H5 (SEQ ID NO:4) se generó usando iniciadores de oligonucleótido y el kit de mutagénesis dirigida QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) y se subclonó en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Los plásmidos pVL1392 que contenían los genes que codifican el antígeno HA H5 (SEQ ID NO:2) y la HA MutK+ H5 (SEQ ID NO:4) se transfectaron conjuntamente luego con DNA de baculovirus DiamondBac® (Sigma) en células de insecto Sf9 (BD 30 Biosciences Pharmingen) para generar el baculovirus recombinante que contenía los genes de la HA H5 que codificaban la secuencia SEQ ID NO:2 y la HA mutK+ H5 que codificaba la secuencia SEQ ID NO:4. Los baculovirus recombinantes que contenían los genes que codifican la HA H5 (SEQ ID NO:2) y la HA MutK+ H5 (SEQ ID NO:4) se purificaron en placas y se propagaron virus de la cepa madre (MSV por sus iniciales en inglés: master seed viruses) en la línea celular SF+, se tomaron alícuotas y se almacenaron a -70ºC. Las células de insecto infectadas con

35 baculovirus HA H5 como se han descrito anteriormente para generar MSV o virus de una cepa de trabajo que expresan el antígeno HA H5 (SEQ ID NO:2) y antígeno de la HA MutK+ H5 (SEQ ID NO:4) como se detectó mediante anticuerpos de suero policlonal o monoclonales por un análisis indirecto de anticuerpos fluorescentes o por transferencia de Western.

40 Después de sembrar con cantidades apropiadas de baculovirus recombinantes (HA H5 y HA MutK+ H5, respectivamente), se incubaron los matraces con agitación que contenían las células SF+ (Protein Sciences, Inc., Meriden, CT) a 27±2°C durante 7 días y con agitación a 100 rpm durante este tiempo. Los matraces utilizaban tapones ventilados para permitir el flujo de aire. Se recogieron el cultivo celular completo en bruto que contenía las células SF+ infectadas con baculovirus y los sobrenadantes de los cultivos celulares cada cultivo.

45 EJEMPLO 2 Preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comprenden antígenos de la HA H5

50 Se recogieron la proteína HA H5 y la proteína HA Mutk+ H5 del cultivo celular completo en bruto expresadas en células de insecto mediante un sistema de expresión basado en baculovirus. Los baculovirus se desactivaron en presencia de etilenimina binaria (BEI) ciclada 5 mM (concentración final) entre aproximadamente 32 y 39°C durante 72 a 96 horas. Después de que se completó la desactivación se añadió una disolución de tiosulfato de sodio 0,3M hasta una concentración final de 5 mM para neutralizar cualquier resto de BEI. Después de la neutralización se

55 añadieron varios adyuvantes y se generaron las siguientes composiciones farmacéuticas/vacunas.

VACUNAS

Nombre genérico del producto: 501

Antígeno: Proteína HA H5 de células completas en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió Emulsigen como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 502

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió Emulsigen-D como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 503

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió Polygen como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 504

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió Emulsigen-P como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 505

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió Carbigen como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 506

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió Emulsigen-75 como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 507

Formulación: Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresan la HA H5 recombinante. A la vacuna se le añadió ISA 70 como adyuvante.

Nombre genérico del producto: 508

Antígeno: Proteína HA MutK+ H5 de células completas en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.

Nombre genérico del producto: 509

Nombre genérico del producto: 510

Nombre genérico del producto: 511

Nombre genérico del producto: 512

Nombre genérico del producto: 513

Nombre genérico del producto: 514

Antígeno: Proteína HA K+ H5 de células completas en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.

EJEMPLO 3 Vacunación de ganado porcino (cerdos) frente a la gripe aviar 5

1. INTRODUCCIÓN

El objetivo de este estudio fue determinar la capacidad de las vacunas experimentales que contienen un extracto en bruto de antígeno de hemaglutinina (HA) H5 recombinante para inducir la inhibición de los títulos de hemaglutinación 10 (HI) en ganado porcino. Se evaluaron varios adyuvantes con los antígenos de la HA H5.

Los prototipos de HA H5 evaluados en este estudio contenían antígeno bien de HA H5 o bien de HA MutK+ H5. Se obtuvo HA H5 convencional a partir de A/pato/China/E319-2/03, mientras que la HA MutK+ H5 consistía en HA H5 convencional modificada por ingeniería genética para contener tres cambios en aminoácidos específicos en S120N,

15 D150N, S223N y 328mutK+. También contenía el aminoácido 94N. Los cambios en los aminoácidos particulares en la HA MutK+ H5 produjeron una HA H5 que se parecía fielmente a la HA de A/HK/213/03. Se cree que la composición de aminoácidos de la HA H5 de la A/HK/213/03 ayuda al reconocimiento de la HA H5 por los anticuerpos.

20 2. Diseño del estudio:

Tabla 1. Visión de conjunto del estudio.

Grupo: Número de Cerdos Vacuna Prototipo Día 0 Día 21 Día 35

1: 5 501 Extracción de sangre y vacunación intramuscular (grupo braquiocefálico) mediante la administración de 1 mL en la parte IZQUIERDA del cuello.) Extracción de sangre y vacunación intramuscular (grupo braquiocefálico) mediante la administración de 1 mL en la parte DERECHA del cuello.) Extracción de sangre y finalización del estudio

2: 5 502

3: 5 503

4: 5 504

5
5: 505

6: 5 506

7: 5 507

8: 5 508

9: 5 509

10: 5 510

11: 5 511

12: 5 512

13: 5 513

14: 5 514

15: 5 ninguno Extracción de sangre Extracción de sangre

Los lechones tenían 3 semanas ± 5 días de edad al principio del estudio. Los lechones eran clínicamente sanos al 25 principio del estudio. Se obtuvieron muestras de sangre en los días 0, 21 y 35 del estudio.

Todos los animales de estudio se observaron diariamente en los días 1 al 35 del estudio con vistas a conocer el estado general de salud. Durante los siete días siguientes a cada vacunación, se investigaron los lugares de la inyección diariamente y se registraron las reacciones visibles. A la conclusión de la fase animal del estudio en el día

30 35 del estudio, todos los animales se sacrificaron humanamente.

3. VACUNAS

Se usaron las vacunas 501 a 514 descritas en el ejemplo 2 para el estudio de vacunación de los cerdos. 35

4. ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTININA

Se vacunaron los cerdos con los prototipos que contenían HA H5 en los días 0 y 21. Se recogieron los sueros de ganado porcino para la evaluación del ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) en los días 0, 21 y 35. Se realizó el ensayo HI para detectar la presencia de anticuerpos específicos de la HA. En el ensayo HI se usó un virus H5N2 heterólogo, A/pollo/Mexico/232/94, con una concentración de cuatro unidades de hemaglutinación [4 unidades HA]. En placas de microvaloración con fondo en U se mezclaron subsiguientemente diluciones a la mitad en serie de suero en PBS con volúmenes iguales (25 μL) que contenían 4 unidades de HA del virus y se incubaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante 30 minutos. Se añadieron glóbulos rojos sanguíneos de pollo, con una concentración de 0,5% en PBS, a los pozos que contenían suero-virus y se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente. Los títulos HI se determinaron como recíprocos de las mayores diluciones de suero en las que se observó la inhibición de la hemaglutinación.

5. RESULTADOS

Para el ensayo HI se utilizó el régimen de vacunación con antígeno H5N1 oficial del gobierno mejicano (A/pollo/Méjico/232/94) [4 unidades de HA] de 1 x 1 mL los días 0 y 21.

Títulos HI

Día 0: Día 21 Día 35

501: H5 – Emulsigen 0 0 4

502: H5 -Emulsigen-D 0 0 4

503: H5 – Polygen 0 0 0

504: H5 -Emulsigen-P 0 0 2

505: H5 – Carbigen 0 0 4

506: H5 -Emulsigen-75 0 0 16

507: H5 ISA 70 0 0 16

508: H5 K+ -Emulsigen 0 0 128

509: H5 K+ -Emulsigen-D 0 0 64

510: H5 K+ -Polygen 0 0 16

511: H5 K+ -Emulsigen-P 0 0 0

512: H5 K+ -Carbigen 0 0 0

513: H5 K+ - Emulsigen-75 0 0 16

514: H5 K+ - ISA 70 0 4 32

Control: Ninguno 0 0 0

H5 de VIB [obtenidos a partir de virus A de la gripe (A/pollo/China/E319-2/03(H5N1)] H5 K+ de VIB (H5 de VIB mutada para incluir S120N, D155N, S223N y añadir 328K+)

Los resultados demostraron que la mayoría de las composiciones de vacuna inducen una respuesta inmune en los cerdos vacunados. En particular, la mayoría de las composiciones de vacuna produjeron una seroconversión, lo que significa que la mayoría de los cerdos vacunados desarrollaron anticuerpos específicos contra el virus de la gripe aviar usado en el ensayo HI. Conjuntamente, los resultados prueban claramente y sin ninguna duda que la idea inventiva reivindicada funciona muy bien. El riesgo de una infección pandémica de cerdos (animal de una segunda especie) con el virus de la gripe aviar (patógeno de una primera especie) puede reducirse de forma importante mediante la vacunación de los cerdos con un antígeno adecuado del virus de la gripe aviar. Esto ha sido claramente demostrado. Además, mediante este concepto de vacunación, se reduce de forma importante la transmisión y adaptación del virus de la gripe aviar a los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los cerdos son una de las reservas más importantes para los patógenos aviares, incluyendo el virus de la gripe aviar. Si se reduce de forma importante y se controla la replicación del virus en cerdos y, por lo tanto, el riesgo de adaptación de la gripe aviar a los cerdos, también se reduce de forma importante el riesgo de cualquier adaptación del virus de la gripe aviar a los seres humanos. En cualquier caso, cuando la administración del antígeno produce un título HI menor, los que significa un título menor que 30, se necesitaran estímulos adicionales con antígeno para mejorar adicionalmente el título HI y para mejorar la protección inmune en los cerdos vacunados. Además, títulos bajos no significan que no pueda obtenerse una protección, solo indica que parece que son necesarios estímulos adicionales para mejorar la respuesta inmune. El hecho de que se pueda medir una respuesta inmune en cerdos vacunados demuestra que la idea inventiva subyacente de la presente invención funciona muy bien. En otras palabras, los experimentos proporcionados junto con la presente memoria muestran claramente y sin ninguna duda la evidencia de que la idea inventiva de la presente invención funciona.

EJEMPLO 4 5 Vacunación de pájaros contra la gripe aviar

1. INTRODUCCIÓN

El objetivo de este estudio fue determinar la capacidad de las vacunas experimentales que contienen un extracto en bruto de antígeno de la hemaglutinina mutk+ H5(HA mutk+ H5) recombinante para inducir títulos de inhibición de la

10 hemaglutinación (HI) en pollos. Además, se usó un antígeno de H5 recombinante convencional (HA H5) así como la vacuna desactivada Volvac® AI (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Méjico) como control. Además, se evaluaron varios adyuvantes con los antígenos de la HA H5.

2. DISEÑO DEL ESTUDIO:

15 Se vacunaron pájaros SPF (15-25) independientemente con vacunas experimentales diferentes con 1 o 10 días de edad por vía subcutánea con 0,5 mL en la parte trasera del cuello; todos los pájaros se mantuvieron aislados durante el experimento. Se les proporcionó alimento y agua ad libitum. El ataque se realizó en los días 31 ó 32 después de la vacunación con la cepa de gripe aviar H5N2 que es altamente patogénica.

20 Se obtuvieron muestras de suero sangrando los pájaros en la vena yugular en los días 15 y 30 después de la vacunación. Los sueros obtenidos se almacenaron a 4°C hasta que se realizó el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), como se ha descrito en el ejemplo 3, para obtener los títulos de anticuerpos.

3. VACUNAS Y VIRUS DE ATAQUE:

25 Se evaluaron independientemente cuatro formulaciones diferentes:

1. Emulsión oleosa convencional de HA Mutk+ H5: El antígeno de HA mutk+ H5 se formuló en una emulsión con base oleosa (adyuvante incompleto de Freund) según los procedimientos de Boehringer Ingelheim Vetmedica.

30 2. HA Mut k+ H5 Seppic: El antígeno de HA mutk+ H5 se formuló con un adyuvante no convencional (ISA 206, W/O/W, de Seppic) siguiendo la recomendación de distribuidor.

3. Emulsión oleosa convencional de HA H5: El antígeno de HA H5 se formuló en una emulsión con base oleosa siguiendo los procedimientos de Boehringer Ingelheim Vetmedica (adyuvante incompleto de Freund).

4. HA H5 Seppic: El antígeno de HA H5 se formuló con un adyuvante no convencional (ISA 206, W/O/W, de 35 Seppic) siguiendo la recomendación de distribuidor.

Se usó una vacuna contra la gripe aviar, en emulsión oleosa de Boehringer Ingelheim Vetmedica como control, Volvac® AI (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Méjico).

40 Los ataques se realizaron en pollos vacunados y no vacunados mediante inoculación por vía intranasal con 0,2 mL que contenían 10 6,7 CEID por pájaro del virus de ataque N2 H5. Después del ataque, se registraron los síntomas y la mortalidad. Diez días después de la inoculación todos los pollos supervivientes se sacrificaron siguiendo los protocolos de los laboratorios de animales.

45 4. RESULTADOS:

Los resultados se recogen en las siguientes tablas: Se considera un título de suero positivo log2 4 de acuerdo con los estándares de la OIE. En función de este criterio,

Vacunación, 1 día de edad

Formulación: Ataque 31 días después de la vacunación

Nº de muertes: Mortalidad %

HA Mutk+ H5 Seppic: 8/25 32%

Emulsión oleosa convencional de HA Mutk+ H5: 0/24 0%

HA H5 Seppic: 17/25 68%

Emulsión oleosa convencional de HA H5: 4/25 16%

Volvac AI KV

Control negativo: 10/10 100%

Vacunación, 10 días de edad

Ataque 32 días después de la vacunación

Nº de muertes: Mortalidad %

0/20: 0%

0/20: 0%

7/19: 36,8%

2/20: 10%

0/14: 0%

14/14: 100%

Vacunación, 1 día de edad (0,5 mL)

Formulación de la vacuna: Títulos HI 30 días después de la vacunación (MG Log2) % de protección después del ataque

HA Mutk+ H5 Seppic: 0.56 68

Emulsión oleosa convencional de HA Mutk+ H5: 2,59 100

HA H5 Seppic: 0,18 32

Emulsión oleosa convencional de HA H5: 0,7 84

Volvac AI KV: ------------ --------------

Control negativo: ------------ --------------

Vacunación, 10 días de edad (0,5 mL)

Títulos HI 30 días después de la vacunación (MG Log2): % de protección después del ataque

2,5: 100

4,3: 100

1,3: 63.2

1,6: 100

8,8: 100

0
0

5 los resultados serológicos fueron negativos, aunque se observaron algunos valores positivos en comparación con la línea base. Los mejores títulos serológicos se observaron para la vacuna formulada con el adyuvante oleoso y con antígeno de HA Mutk+ H5, en los pájaros vacunados con 1 día de edad o con 10 días de edad. Los títulos serológicos menores se observaron en el prototipo formulado con Seppic y el antígeno de HA H5. En el estudio del ataque se observó que las vacunas prototipo proporcionan protección, particularmente con la vacuna en emulsión

10 oleosa convencional formulada con el antígeno de HA Mutk+ H5. La menor protección en el estudio del ataque se observó con la HA H5 Seppic con un 68% de mortalidad. Por el contrario, el título serológico mayor se observó en pájaros vacunados con 10 días de edad en comparación con los pájaros vacunados con un día de edad.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

5 <120> NUEVAS PROTEÍNAS H5, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO Y VECTORES QUE LAS CODIFICAN, Y SU USO MEDICINAL

<130> Caso 1-2150

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

15 <210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> Virus de la gripe aviar

20 <400> 1

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15

25Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val35 65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95

40Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu100 105 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser Ser Phe Phe 130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile50 145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175

55Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln180 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn65 225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255

5Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly260 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 15 305 310 315 320

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala325 330 335

20 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 340 345 350

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu355 360 365

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 370 375 380

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn30 385 390 395 400

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 405 410 415

35Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu420 425 430

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr 435 440 445

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn450 455 460

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 45 465 470 475 480

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg485 490 495

50Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 500 505 510

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu515 520 525

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 530 535 540

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile60 545 550

<210> 2

<211> 567 65 <212> PRT

<213> Virus de la gripe de patos

<400> 2

5 Met Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys15 50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

35Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg45 210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

65 Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 28

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly355 360 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 10 370 375 380

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile385 390 395 400

15Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn 405 410 415

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly420 425 430

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu 435 440 445

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr25 450 455 460

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 465 470 475 480

30 Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser485 490 495

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 500 505 510

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr515 520 525

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu 40 530 535 540

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser545 550 555 560

45Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565

<210> 3 50 <211> 568

<212> PRT

<213> Virus de la gripe de patos

<400> 3

55 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 65 50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80

5Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser15 130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp180 185 190

25 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly225 230 235 240

35Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser45 290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile340 345 350

55 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400

65 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 10 450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

15 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala25 530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560

30Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile565

<210> 4 35 <211> 568

<212> PRT

<213> Virus de la gripe aviar

<400> 4

40 Met Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys50 50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80

55Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser65 130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

5Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg15 210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile260 265 270

25 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

35Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys45 370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp420 425 430

55 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

65 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly545 550 555 560

15Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile565

<210> 5

<211> 263

<212> PRT

<213> Virus de la gripe aviar

<400> 5

25 His Ala Asn Asn Trp Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn1 5 10 15

Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly 20 25 30

Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys35 40 45

35 Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 50 55 60

Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn65 70 75 80

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Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys45 100 105 110

Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys 115 120 125

Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile130 135 140

Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 145 150 155 160

55 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp165 170 175

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Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr195 200 205

65 Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr

210 215 220

Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe225 230 235 240

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<210> 6

<211> 290 15 <212> PRT

<213> Virus de la gripe de patos

<400> 6

Gly Ser Ala Thr Met Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser1 5 10 15

Leu Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser20 25 30

25 Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His35 40 45

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35Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp85 90 95

Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro100 105 110

Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile115 120 125

Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp45 130 135 140

His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser145 150 155 160

Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala165 170 175

Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu180 185 190

55 Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr195 200 205

Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr210 215 220

Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn225 230 235 240

65 Gly Gln Ser Gly Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn

245 250 255

Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr260 265 270

Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu 275 280 285

Val Glu 10 290

Claims

REIVINDICACIONES

5 1.- Proteína hemaglutinina H5 del virus de la gripe, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, en donde la Serina en la posiicón 223 de SEQ ID NO:1 está sustituida con una Asparagina y está insertada una segunda Lisina en la posición del aminoácido 328.

10 2.-La proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1, en la que dicha proteína hemaglutinina H5 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4.
3.- Una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica la proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2. 15 4.- Una vacuna que comprende:

a.

la proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2, o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, y

b.

un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

20 5.- La vacuna según la reivindicación 4, en la que la vacuna comprende como un antígeno adicional la proteína hemaglutinina H3, H7 o H9 del virus de la gripe.
6.- Un método para producir la proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho método 25 comprende las etapas de:

a.

aislar o amplificar el ácido nucleico que codifica dicha proteína hemaglutinina H5;

b.

clonar la hemaglutinina H5 que codifica el ácido nucleico en un vector de expresión;

c.

expresar la proteína hemaglutinina H5.

30 7.- El método según la reivindicación 6, en el que el vector de expresión es un baculovirus recombinante.
8.- Un método para producir la vacuna que comprende una proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho método comprende las etapas de:

a. obtener una proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2;

35 b. mezclar la proteína hemaglutinina H5 de la etapa a) con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
9.- Un método para producir la vacuna que comprende un ácido nucleico de hemaglutinina H5 según la reivindicación 3, en el que dicho método comprende las etapas de: 40 a. obtener la molécula de ácido nucleico de hemaglutinina H5 según la reivindicación 3;

b. mezclar la molécula de ácido nucleico de hemaglutinina H5 de la etapa a) con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
10.- La proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2, para uso como una medicina.

45 11.- La proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2 o la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3 para uso para la profilaxis o el tratamiento de infecciones causadas por la gripe viral.
12.- Un kit en partes, que comprende: 50 a. la proteína hemaglutinina H5 según la reivindicación 1 ó 2, la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3 o la vacuna según la reivindicación 4 ó 5; y

b. un prospecto del envase que indica el uso de dicha proteína hemaglutinina H5, molécula de ácido nucleico, vector o vacuna de a) para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por un virus de la gripe.