BRPI0718183B1 - Proteína hemaglutinina H5 de vírus influenza e seus usos, vacina, seu processo de produção e seus usos, bem como kit de partes - Google Patents

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Abstract

proteínas h5, moléculas de ácido nucleico e vetores codificando aqueles, e seu uso medicinal a presente invenção refere-se a novas proteínas h5 hemaglutinina, ácidos nucleicos e vetores codificando aquelas assim como vacinas compreendendo quaisquer de tais proteínas h5, ácidos nucleicos ou vetores codificando aquelas proteínas h5. além disso, a presente invenção também refere-se ao uso medicinal de tais composições em seres humanos e animais. .

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA HEMAGLUTININA H5 DE VÍRUS INFLUENZA E SEUS USOS, VACINA, SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO E SEUS USOS, BEM COMO KIT DE PARTES".
Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo de medicina, preferivelmente ao campo de doenças infecciosas. Em particular a presente invenção refere-se a proteínas influenza, moléculas de ácido nucleico e vetores codificando aquelas proteínas, e vacinas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao uso de quaisquer tais proteínas, moléculas de ácidos nucleicos, vetores ou vacinas para o tratamento e prevenção de infecções influenza, além disso, para a prevenção de transmissão intra- e inter-espécies de vírus influenza. Antecedentes da Invenção Infecção influenza permanece uma importante infecção em animais e seres humanos. Influenza é causada por vírus que sofrem contínuas mudanças / modificações antigênicas e que possuem um reservatório animal. Assim novas epidemias e pandemias podem ocorrer no futuro, e erradicação da doença será difícil de obter. Vírus influenza são bem-conhecidos na técnica e descritos em mais detalhes, por exemplo, por P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, no. 12, pp. S 82 a S 86 of December 2004, com ainda referências. Resumidamente, o genoma do vírus influenza A consiste em oito segmentos de fita simples, e as partículas virais têm duas principais glicoproteínas sobre sua superfície: hemaglutinina (H) e neuraminidase (N). Com pelo menos 16 diferentes subtipos de hemaglutinina (H1 a H16) e 9 diferentes subtipos de neuraminidase (N1 a N9), existe uma considerável variação antigênica entre vírus influenza. Vírus influenza de tipo vírus H5N1 Fowl Plague foi demonstrado infectar aves domésticas, porcos e homem. O vírus também pode ser diretamente transmitido a partir de espécies de aves para seres humanos (Claas et al., Lancet 1998, 351:472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72:6678; Subbarao et al., Science 1998, 279:393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1): S26-S29). Mortalidade em casos clínicos humanos conhecidos a aproximadamente cerca de 50%.
No último século porcos foram um importante vetor para pande-mias de influenza. Porcos, camelos, e focas, preferivelmente porcos, podem servir como uma ‘câmara de mistura’ para vírus influenza de aves, e pelo que representam um potencial fator de risco para superação de obstáculos de espécies de aves domésticas, o reservatório natural de vírus influenza, para mamíferos. Isto ocorre normalmente através de infecções duplas dos animais susceptíveis, por exemplo, porco, com ambos, um mamífero (suíno) estabelecido, assim como um vírus influenza de ave. Esta infecção dupla pode criar novos vírus recombinantes que podem ser a causa de pandemias humanas ou suínas. Recente evidência pode, entretanto, indicar que uma recombinação de linhagens H5 de ave atual com vírus influenza de mamífero não resultará em recombinantes altamente virulentos. Por outro lado, vírus influenza de ave podem infectar porcos e através de mutações espontâneas podem se tornar adaptados a porcos. O obstáculo crítico será superar tão logo o vírus que possa causar infecções horizontais dentro de uma população de porcos (ou outro mamífero).
Ainda, uma maior parte de porcos de Sudeste Asiático foi infectada com linhagens de vírus influenza (H5) de aves originando-se de criação de aves domésticas vizinhas. Na medida em que aquelas infecções têm sido até agora subclínicas, elas somente podem ser diagnosticadas através de processos de laboratório e assim são frequentemente omitidas. Há um alto risco de que aqueles porcos infectados subclinicamente sirvam como uma oportunidade para o vírus adaptar-se ao sistema mamífero, disseminar dentro de população suína, e também infectar seres humanos.
Atuais vacinas de influenza incluem uma vacina de subunidade (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080): vacina atenuada (Horimoto et al., Vaccine 2004, 22(17-18):2244-2247), vacina de ADN (Watabe et al., Vaccine 2001, 19(31):4434-4444) e vacina influenza inativada (Cao et al., Vaccine 1992, 10(4):238-242), com a última sendo a mais amplamente usada em uma escala comercial (Lipatov et al., J Virol. 2004, 78(17):8951-8959).
Vacinas de subunidades, hemaglutinina recombinante e neura-minidase (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238: Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson etal., Vaccine 1999, 17(15-16): 2073-2080) podem ser uma alternativa atraente à vacina inativada, embora nenhuma esteja atualmente em uso como vacinas comerciais. A preparação de tais vacinas é obviamente mais segura que para uma vacina inativada. Além disso, vacinas de subunidades não geram respostas de anticorpos para proteínas virais ínfluenza internas e assim permitem distinção entre animais vacinados e infectados (Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274).
Proteína hemaglutinina é a glicoproteína de fusão de membrana e ligação de receptor de vírus ínfluenza e o alvo para anticorpos de neutralização de infectividade. A inteira proteína hemaglutinina (HA) do H5N1 é composta por 568 aminoácidos, com um peso molecular de 56 kDa. A molécula de HA consiste em subunidades HA1 e HA2, com a subunidade HA1 mediando contato inicial com a membrana de célula e HA2 sendo responsável por fusão com membrana (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63(1-2):129-136).
Sistemas de célula de inseto / báculovírus têm sido usados para expressão de genes hemaglutinina isolados de subtipos de ínfluenza de aves (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274: Johansson etal., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080): Nwe et al., BMC microbiology 2006, 6(16):doi: 10.1186/1471-2180-6-16). Entretanto, aquelas proteínas recombinantes parecem não ser protetoras em qualquer caso, ou somente menos eficazes pelo menos para algumas espécies (Treanor et al., Vaccine 2001, 19:1732-1737).
Assim, há uma necessidade de aumento de disponibilidade de vacinas aperfeiçoadas e novas abordagens de vacinação para provimento de melhores abordagens para controle de infecções Ínfluenza e para ter um impacto positivo sobre carga de doença.
Descrição da Invenção Antes das concretizações da presente invenção deve ser notado que como aqui usadas e nas reivindicações apostas, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem referência plural a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "uma preparação" inclui uma pluralidade de tais preparações; referência ao "veículo" é uma referência a um ou mais veículos e seus equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica, e assim por diante. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as faixas e valores dados podem variar por 1 a 5% a menos que de outro modo indicado ou de outro modo conhecido por aqueles versados na técnica, por isso, o termo "cerca" foi omitido da descrição. Embora quaisquer processos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, os processos preferidos, dispositivos e materiais são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para o propósito de descrição e amostra de substâncias, excipientes, veículos, e metodologias como reportadas nas publicações que podem ser usadas em conexão com a invenção. Nada aqui é para ser construído como uma admissão de que a invenção não é intitulada para antecipar tal exposição em virtude da invenção anterior. A solução do problema técnico acima é obtida através da descrição e as realizações caracterizadas nas reivindicações.
Proteínas influenza e moléculas de ácidos nucleicos codificando as mesmas A presente invenção refere-se a uma proteína H5 de vírus influenza, onde a proteína H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida. Preferivelmente, tal proteína H5 e ainda qualquer proteína H5 de acordo com a invenção é uma proteína H5 isolada. Foi surpreendentemente verificado que proteínas H5, tendo as modificações descritas acima, são altamente antigênicas comparadas a proteí- nas H5 que não têm os correspondentes aminoácidos em posição 223 e 328/329. O termo "hemaglutinina 5 (H5" ou Ή5 de vírus influenza de a-ves" ou "proteína H5" como aqui usado significa, mas não é limitado a qualquer proteína H5 ocorrendo naturalmente e quaisquer formas modificadas de proteína H5, incluindo qualquer mutante de supressão, substituição e/ou inserção de proteína H5, onde aquelas proteínas H5 têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+. A numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 como aqui usada refere-se à posição de aminoácidos como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1. A SEQ ID NO: 1 representa a sequência amino da hemaglutinina de linhagem de pato/China/E319-2/03 mas carecendo de peptídeo sinal de terminal amino. Em outras palavras, se é feita referência ao aminoácido na posição 223 (aminoácido 223), o resíduo de aminoácido é pretendido que corresponde ao aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1. Entretanto, isto não significa que as proteínas H5 de acordo com a invenção tenham a idêntica sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1. Isto somente diz, que os correspondentes aminoácidos das proteínas H5 de acordo com a invenção codificam o resíduo de aminoácido, como explicitamente mencionado. No caso atual, o aminoácido 223 pode ser serina (S). Os termos "223N" ou "155N" significam exemplarmente que o aminoácido em posições 223 e 155, respectivamente - numeração de acordo com posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 - devem codificar o aminoácido asparagina (N). Em outras palavras, se é feita referência à "proteína H5 tendo o aminoácido 223N", uma molécula de aminoácido H5 que normalmente codifica serina em posição de amino ácido 223 - numeração de acordo com as posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 - este aminoácido deve ser substituído por uma asparagina (N). O termo "328K+" ou "modificação 328K+" significa, que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 - numeração de acordo com as posições de SEQ ID NO: 1 -, uma segunda lisina (K+) é inserida. Em casos onde sequências de aminoácidos em posições 328 e 329 codificam naturalmente lisina - lisina, ainda nenhuma lisina (K) deve ser inserida. Entre- tanto, maioria de sequências H5 conhecidas codificam em posições de aminoácidos 328 e 329 lisina - arginina. Em tais casos, o termo modificação 328K+ significa, que uma segunda lisina (K) deve ser inserida entre lisina em posição 328 e arginina em posição 329. A sequência modificada pode ser lida então lisina - lisina - arginina (KKR).
Assim, a presente invenção refere-se a proteína H5 e quaisquer formas modificadas de proteína H5, incluindo qualquer mutante de supressão, substituição e/ou inserção de proteína H5, onde aquelas proteínas H5 têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SE ID NO: 1 onde a modificação 328k+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida. É autoexplanatório que qualquer uma das proteínas H5 como aqui providas são antigênicas, o que significa que elas mostram propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina para vírus ínfluenza.
Ainda de acordo com uma concretização, a presente invenção também refere-se a qualquer parte da proteína H5, o que significa qualquer peptídeo - fragmento que mostre propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, tendo pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde a numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida.
Uma proteína H5 mostra propriedades antigênicas se ela inibe hemaglutinação em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, por exemplo, como descrito no Exemplo 2. Normalmente a dita parte antigênica de proteína H5 compreende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 ou mais preferivelmente 105 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos que codifica a proteína H5 como mencionado acima, modificada ou não-modificada, que mostra propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito no Exemplo 2. Um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, por exemplo, também é descrito em Stephenson et al., Virus Research vol. 103, pp. 91-95 (2004) com ainda referências. Entretanto, o ensaio Hl como descrito no exemplo 2 deve ser entendido ser o ensaio referência relevante em conexão com todos os aspectos da invenção como aqui descrita.
Em resumo, ensaio Hl foi realizado para detectar a presença de anticorpos específicos de HÁ. Um vírus H5N2 heterólogo, A/galinha/méxico/ 232/94, foi usado em uma concentração de quatro unidades hemaglutinina [4 unidades HA] no ensaio Hl. Em placas de microtitulação de fundo em U diluições de soro de duas vezes seriais em PBS foram subsequentemente misturadas com iguais volumes (25 μΙ_) contendo 4 unidades HA de vírus, e incubadas em temperatura ambiente (cerca de 25°C) por 30 minutos. Células vermelhas de sangue de galinha, em uma concentração de 0,5% em PBS, foram adicionadas às cavidades contendo soro - vírus e incubadas por 40 minutos em temperatura ambiente. Os títulos Hl foram determinados como recíprocas das diluições de soro mais altas nas quais foi observada inibição de hemaglutinina.
De nota, Haesebrouck and Pensaert (1986) verificaram "que pode haver uma correlação entre os títulos de Hl contra o vírus desafio e proteção a partir do desafio". Haesebrouck and Pensaert (1986) também determinaram que porcos com títulos Hl de > 40 foram "completamente resistentes a desafio e nenhuma replicação dos vírus ocorreu no trato respiratóriono desafio". Assim, o desenvolvimento de títulos Hl > 40 no suíno vacinado pode correlacionar a proteção (F. Haesebrouck and M.B. Pensaert, 1986). Efeito de desafio intratraqueal de porcos engordando previamente imunizados com uma vacina H1N1 influenza inativada (Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239-249. Tem de se assumir que títulos de Hl H5 equivalentes ou pelo menos aproximadamente equivalentes também resultarão em uma completa proteção imuno de suínos contra vírus influenza de aves. Menores títulos, pelo menos resultam em uma soroconversão dos animais vacinados e resulta em proteção imune parcial daqueles animais, o que também pode reduzir dramaticamente o risco de uma pandemia.
Além disso, uma parte antigênica da proteína H5 de acordo com a invenção inclui, mas não está limitado a, mutantes de supressão de proteína H5, que compreendem: i. pelo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, ou mais preferivelmente 8 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos que circunda e inclui o aminoácido 223N; e ii. pelo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, ou mais preferivelmente 8 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos que circunda e inclui a modificação de aminoácido 328K+, e iii. onde qualquer uma de tal parte antigênica de proteína H5 mostra inibição de hemaglutinina em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito no Exemplo 2.
Preferivelmente, aqueles circundando aminoácidos de aminoácido 223N e/ou 328K+ são codificados por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.
Além disso proteínas H5 preferidas de acordo com a invenção são: i. qualquer uma daquelas mencionadas acima tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+; ii. qualquer uma daquelas mencionadas acima tendo o aminoácido 94N/223N e a modificação 328K+; iii. qualquer proteína H5 de origem aviárias tendo o aminoácido 223N, e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou iv. qualquer proteína H5de origem aviária tendo os aminoácidos 94N / 223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou v. qualquer proteína H5 de origem aviária tendo os aminoácidos 155N/223N e a modificação 328K+, onde de origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou vi. qualquer proteína H5 de origem aviária tendo o aminoácido 120N/155N/223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus ínfluenza de aves tipo 5; ou vii. qualquer proteína H5 tendo as modificações 94N/223N e a modificação 328K+; ou viii. qualquer proteína H5 tendo as modificações 94N/155N/223N e a modificação 328K+; ou, ix. qualquer proteína H5 tendo as modificações 94N/120N/ 155N/223N e a modificação 328K+; ou x. qualquer proteína H5 tendo a modificação 223N, a modificação 328K+, e um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 123-125: SDH
c. aa 128-130: SSG
d. aa 138-140: GSS
e. aa 226-228: MDF
f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL; ou xi. qualquer proteína H5 tendo o aminoácido 223N, e a modificação 328K+, e um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 128-130: SSG c. aa 138-140 GSS; ou xii. qualquer proteína H5 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Além disso, proteínas H5 preferidas como aqui providas incluem as proteínas H5 como descritas por Hoffmann et al. PNAS, vol. 106, no. 36, pp. 12915-12920 de 6 de setembro de 2005, onde aquelas proteínas H5 incluem uma ou mais das modificações como descrito acima, pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde a numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida. A exposição desta referência deve ser inteiramente aqui incluída por referência.
Além disso, proteínas H5 preferidas como aqui providas incluem proteínas H5 que compreendem um peptídeo que compreende o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida, e: i. As sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4, 5 ou 6 ou; ii. qualquer peptídeo que tenha pelo menos 85% de homologia de sequência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia de sequência, mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de homologia de sequência, ainda mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de homologia de sequência, e mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de homologia de sequência ao polipeptídeo de i) que compreende inibição de hemaglutinina em uma inibição padrão de hemaglutinina; ou iii. qualquer parte do polipeptídeo de i) ou ii) compreendendo pelo menos 35, 30, 25, 20, 18,15, 13, 10, 9, ou mais preferivelmente 8 ami-noácidos contíguos de qualquer um dos peptídeos de i) ou ii). iv. quaisquer peptídeos de i), ii) ou iii) tendo os aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, ou 120N/155N. v. qualquer peptídeo de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 123-125: SDH
c. aa 128-130: SSG
d. aa 138-140: GSS
e. aa 226-228: MDF
f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL; ou vi. qualquer peptídeo de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 128-130: SSG c. aa 138-140 GSS. "Homologia de sequência", como aqui usado, refere-se a um processo de determinação de relação de duas sequências. Para determinar homologia de sequência, duas ou mais sequências são otimamente alinhadas, e folgas são introduzidas se necessário. Em contraste, a identidade de sequência, substituições conservativas de aminoácidos são contadas como um emparelhamento quando determinando homologia de sequência. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo ou poiinucleotídeo tendo 95% de homologia de sequência com uma sequência referência, 85%, preferivelmente 90%, mesmo mais preferivelmente 95% dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos na sequência referência têm de emparelhar ou compreender uma substituição conservativa com um outro aminoácido ou nucleotídeo, ou um número de aminoácidos ou nucleotídeos até 15%, preferivelmente até 10%, mesmo mais preferivelmente até 5% dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos totais, não incluindo substituições conservativas, na sequência referência podem ser inseridas na sequência referência. Preferivelmente a sequência homóloga compreende pelo menos um estiramento de 50, mesmo mais preferido de 100, mesmo mais preferido de 250, mesmo mais preferido de 500 nucleotídeos. Com tal alinhamento, homologia de sequência é determinada em uma base posição-por-posição, por exemplo, as sequências são "homólogas" em uma particular posição se nesta posição, os nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos são idênticos. O número total de tais identidades de posições é então dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos na sequência referência para render % de homologia de sequência. Homologia de sequência pode ser facilmente calculada através de processos conhecidos, incluindo mas não limitado àqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994): Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Deve-reux, J., eds., M. Stockton Press,, New York (1991); e Carillo, H. and Lip-man, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988), os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referência. Processos preferidos para determinar a homologia de sequência são projetados para renderem o maior empare-Ihamento entre as sequências testadas. Processos para determinar homologia de sequências são codificados em programas de computador publicamente disponíveis que determinam identidade de sequência entre dadas sequências. Exemplos de tais programas incluem, mas não são limitados a, pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mo-lec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BlastX é disponível publicamente de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH, Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referência). Estes programas alinham otimamente sequências usando pesos de folga padrão de modo a produzirem o mais alto nível de homologia de sequência entre as sequências dadas e referências.
Além disso, proteínas H5 preferidas que compreendem a modificação 3328K+ como mencionado acima, e a sequência de aminoácidos provida na Tabela 1, ou qualquer sua parte imunogênica.
Tabela 1 Antígenos de H5 # as posições de aminoácidos dadas na Tabela 1 referem-se às posições como exemplarmente definidas em SEQ ID NO: 1. Em outras palavras, aminoácido 223 de Tabela 1 refere-se ao aminoácido 223 da sequência de SEQ ID NO: 1. - significa que os aminoácidos nestas posições são variáveis comparados à sequência referência.
Além disso, a presente invenção também refere-se a proteínas H5 tendo pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328k+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328k+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida, e compreende: i. um peptídeo tendo as sequências de NCBI Accession No. AAT652OT, CA3325S6, A8C47858, CAF21874, CAF21870, AAC58998, AAC58997 AAC 58996. AAC S 8 994, AAC 58993, AAC58992, AAC 58991, AAC589W. AAC58995, AAS4S134, AAN17270, AAN1728Ô, AAN17288, AAN17287, AAN17266, AAN172S5, AAN 17264. AAN172B3. AAN17262, AAN17281, AAN17280, AAN 17259, AAN17257. AAN172S6, AAN 17255, AAN172S4, AAA43083, AAA43CW2. AAB19079, 6^40898, 0AE48893, 0ΑΕ4ββ96. BAE48S95. BAE48884, BAE48892, 8ΑΕ«869ν BAE48690, 8AE4088», BAE4868B, BAE486S7, ΒΑΕ48688, BAE4868Í, ΒΑΕ48684, ΒΑΕ48683, AAC 58999, ABC72082, AAV91149, ΑΑΡ71993, AAP71W2, ΑΑΡ7199Ι, AAP7199Ü, ΑΑΡ71989, ΑΑΡ72Ο11, ΑΑΡ72010, ΑΑΡ72009, ΑΑΡ72008. ΑΑΡ720Ο7, AAP720Q6, ΑΑΡ72Ο05, ΑΑΡ72004, ΑΑΡ72003, AAP720Q2, AAP72Ô01. ΑΑΡ72000. ΑΑΡ7ΐ99β» ΑΑΡ71998, ΑΑΡ71Β97, ΑΑΡ71996, ΑΑΡ71995, ΑΑΡ71994, AAF9971B. ABF58847, AAG38534, AAC32102, AAC32099, AAL7S847, AAC32101, AAC32098, AAC32OB8, AAC32078, AAR99828, AAC32100, ΑΑΜ49585, AAL75843, AAL7M39. AAO13S73, AAD13S68, AAFO472Q, AAFO4719. AAC34263, AAR10155, AAD13574. AAD13570, ΑΑΟ13575, AAO13S72, AAD13569. ΑΑΟ13587, ΑΑΟ135ββ. AAKS75J», AAG01225, AAGO1215, AAGG120S, AAG01196, ou ABW3913 modificado em uma maneira descrita acima, que significa que aquelas sequências incluem as modificações mencionadas acima 223N e 328K+ que não são parte das sequências tipo selvagem: ou ii. qualquer peptídeo que tenha pelo menos 85% de homologia de sequência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia de sequência, mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de homologia de sequência, ainda mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de homologia de sequência, e mesmo mais preferível- mente pelo menos cerca de 99% de homologia de sequência ao polipeptídeo de i) e que mostra inibição de hemaglutinina em uma inibição padrão de hemaglutinina como descrito acima; iii. qualquer um dos peptídeos de i) ou ii) tendo os aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T, ou 120N/155N; ou iv. qualquer um dos peptídeos tais como i), ii), ou iii) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 123-125: SDH
c. aa 128-130: SSG
d. aa 138-140: GSS
e. aa 226-228: MDF
f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL; ou v. qualquer peptídeoi de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 128-130: SSG c. aa 138-140 GSS.
De acordo com ainda uma concretização, a presente invenção também refere-se a moléculas de ácidos nucleicos, que codificam qualquer uma das proteínas H5 como descrito supra. Preferivelmente, aquelas moléculas de ácido nucléico são ARN, ADN, ou cópias de moléculas de ADN(c). Assim, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucléico, preferivelmente uma molécula de ADNc codificando uma proteína H5 ou quaisquer formas modificadas de proteína H5, incluindo qualquer mutante de supressão, substituição e/ou inserção de proteína H5, onde aquelas proteínas H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácidos como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida.
De acordo com ainda uma concretização, a presente invenção também refere-se a uma molécula de ácido nucléico, preferivelmente uma molécula de ADNc codificando qualquer parte da proteína H5, o que significa codificando qualquer fragmento - peptídeo que mostre propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito supra, e tendo pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida. Normalmente tais moléculas de ácidos nucléicos, que codificam uma parte antigênica de proteína H5, compreendem 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330, ou mais preferivelmente 315 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína H5 como mencionado acima, modificada ou não-modificada, e que mostra propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como aqui descrito.
Ainda concretizações de partes antigênicas da proteína H5 são descritas supra. Está no conhecimento comum daqueles versados na técnica construir quaisquer tais moléculas de ácido nucléico, preferivelmente moléculas de ADNc que codificam a parte antigênica da proteína H5 como descrito supra. Isto também inclui mas não está limitado à construção de moléculas de ácido nucléico, preferivelmente moléculas de ADNc, que codificam partes antigênicas da proteína H5 como mencionado acima incluindo mutan-tes de supressão de proteína H5, que compreendem: i. pelo menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, ou mais preferivelmente 24 amino nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos que circunda e inclui a sequência codificante que codifica aminoácido 223N; e ii. pelo menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, ou mais preferivelmente 24 amino nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos que circunda e inclui a sequência codificante que codifica a modificação 328K+, e iii. onde qualquer de tal parte antigênica de proteína H5 mostra inibição de hemaglutinina em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito no Exemplo 2.
Preferivelmente, aqueles nucleotídeos circundantes dos nucleotídeos, que codificam aminoácidos 223N e/ou 328K+, codificando SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.
Além disso, moléculas de ácidos nucleicos preferidas codificando a proteína H5 de acordo com a invenção são: i. qualquer uma daquelas mencionadas supra codificando o aminoácido 223N e a modificação 328K+; ii. qualquer uma daquelas mencionadas supra codificando o a-minoácido 94N/223N e a modificação 328K+; iii. quaisquer moléculas de ácidos nucleicos de origem aviária codificando o aminoácido 223N, e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou iv. quaisquer moléculas de ácido nucléico de origem aviária codificando os aminoácidos 94N/223N e a modificação 328K+, onde de origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza aviário tipo 5; ou v. quaisquer moléculas de ácidos nucleicos de origem aviária codificando os aminoácidos 155N/223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza aviário tipo 5; ou vi. qualquer molécula de ácido nucléico codificando a proteína H5 de origem aviária tendo o aminoácido 120N/155N/223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a sequência H5 derivou de um iso- lado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus ínfluenza aviário tipo 5; ou vii. qualquer molécula de ácido nucléico codificando proteína H5 tendo as modificações 94N/223N e a modificação 328K+; ou viii. qualquer molécula de ácido nucléico codificando proteína H5 tendo as modificações 94N/155N/223N e a modificação 328K+; ou ix. qualquer molécula de ácido nucléico codificando proteína H5 tendo as modificações 94N/120N/155N/223N e a modificação 328K+; ou x. qualquer molécula de ácido nucléico codificando proteína H5 tendo as modificações 223N, a modificação 328K+, e um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 123-125: SDH
c. aa 128-130: SSG
d. aa 138-140: GSS
e. aa 226-228: MDF
f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL; ou xi. qualquer molécula de ácido nucléico codificando proteína H5 tendo o aminoácido 223N, a modificação 328K+, e um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF
b. aa 128-130: SSG c. aa 138-140 GSS, ou xii. qualquer molécula de ácido nucléico codificando proteína H5 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Além disso, proteínas H5 preferidas como aqui providas incluem as proteínas H5 como descritas por Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n- 36, pp. 12915-12920 de 6 de setembro de 2005, onde esta proteína H5 inclui uma ou mais das modificações como descrito acima, e pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde a numeração das posições de a-minoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácidos como exem- piarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida. A exposição desta referência deve ser inteiramente aqui incluída por referência. Assim, de acordo ainda com realizações, a presente invenção também refere-se a qualquer molécula de ácido nucléico, preferivelmente uma molécula de ADNc codificando qualquer uma de tais proteínas descritas por Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n° 36, pp. 12915-12920 de 6 de setembro de 2005, onde estas proteínas H5 incluem uma ou mais das modificações como descrito acima, pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação K3328+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida.
Processos, de como introduzir qualquer uma das modificações mencionadas acima dentro de sequência de nucleotídeos, incluindo a sequência codificante da proteína H5 de um vírus influenza, são bem-conhecidos na técnica. A sequência genômica do inteiro vírus influenza pode ser modificada de acordo com a invenção, por exemplo, de acordo com processos descritos na patente US 6 951 754, com ainda referências.
Além disso, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, e ADN recombinante dentro do conhecimento da técnica para modificar uma sequência de ácidos nucleicos codificando um antígeno como aqui descrito. Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.: DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.l. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wi- ley & Sons, Inc. 1994).
Ainda de acordo com uma concretização, a presente invenção também refere-se a um vetor que compreende qualquer uma de tais moléculas de ácidos nucléicos como descrito supra. Em outras palavras, a presente invenção refere-se a um vetor, que inclui a sequência codificante de qualquer tal proteína H5, ou sua parte como descrito supra. Preferivelmente, o dito vetor é um vetor de expressão, que permite a expressão de qualquer tal proteína H5 ou sua parte como descrito supra. Vetores de acordo com a invenção são aqueles que são apropriados para a transfecção ou infecção de células de bactérias, levedura ou animal, in vitro ou in vitro.
Vetores e processos para fabricação e/ou uso de vetores (ou recombinantes) para expressão pode ser através de ou análogos aos processos mostrados em: patentes US 4 603 112, 4 769 330, 5 174 993, 5 505 941, 5 338 683, 5 494 807, 4 722 848, 5 942 235, 5 364 773, 5 762 938, 5 770 212, 5 942 235, 382 425, publicações PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Application of pox virus vectors to vacci-nation: An update, "PNAS USA 93:11349-11353, outubro de 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vacci-nation, and safety", PNAS USA 93: 11341-11348, outubro de 1996, Smith et al., patente US 4 745 051, (báculovírus recombinante), Richardson, C.D. (E-ditor), Methods in Molecular Biology 39, "Báculovírus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Báculovírus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, N- 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Báculovírus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, N- 3, p. 399-406; EPAO 370 573, pedido de patente U.S. 920 197, depositado em 16 de outubro de 1986, publicação de patente EP 265785, patente US 4 769 331 (vírus recombinante de herpes), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PNAS USA 93:11307-11312, outubro de 1996, Andreansky et al., "The ap-plication of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 11313-11318, outubro de 1996, Ro-bertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, outubro 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications", PNAS USA 93: 11371-11377, outubro 1996, Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patentes US N-s 5 591 439, 5 552 143, WO 98/00166, pedidos de patente US permitidos 08/675 556, e 08/675 566, ambos depositados em 3 de julho de 1996 (adenovírus recombinante), Grunhaus et al., 1992, "Adenovírus as cloning vectors", seminars in Virology (Vo. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, Vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen. Virol. 70,42434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 e MecCIements et al., "Immunization with DNA Vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93:11414-11420, outubro 1996, e patentes US Nss 5 591 639, 5 589 466, e 5 580 859 assim como WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, W095/20660, Tang et al., Nature and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. Vide também WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41:736-739, 1998 (sistema de expressão lentiviral); Sanford et al., patente US N- 4 945 050; Fischbach et al., (INtracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology, vol. 9, pp. 271-283 (1997), (sistemas vetores de AND); Szoka et al., patente US No. (processo de inserção de AND em células vivas); McCormick et al., patente US N° 5 677 178 (uso de vírus citopáti-co); e patente US N° 5 928 913 (vetores para liberação de gene), assim como outros documentos aqui citados.
Um vetor viral, por exemplo, selecionado de vírus de herpes de porco, tal como vírus de doença de Aujeszky, vírus de varíola, especialmente vírus vaccinia, vírus avipox, vírus canarypox, e vírus de varíola suína, assim como vetores ADN (plasmídeos ADN) são vantajosamente empregados na prática da invenção.
Processos de produção de proteínas H5 de acordo com a presente invenção De acordo com um outro aspecto, a presente invenção provê processos de produção e/ou recuperação de altas quantidades de proteína H5 recombinante: i) através de permissão de infecção de células suscetíveis em cultura com um vetor viral recombinante contendo ADN H5 codificando sequências, onde proteína H5 é expressa pelo vetor viral recombinante, e ii) a seguir recuperando a proteína H5 de cultura de células. Altas quantidades de proteína H5 significa, mas não são limitadas a, mais que cerca de 20 pg/mL de cultura de células, preferivelmente mais que cerca de 25 pg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 30 pg/ml_, mesmo mais preferido mais que cerca de 40 pg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 50 pg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 60 pg/ml_, mesmo mais preferido mais que cerca de 80 pg/ml_, mesmo mais preferido mais que cerca de 100 ug/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 150 pg/mL, mais preferido mais que cerca de 190 pg/mL.
De acordo com uma concretização preferida, a proteína H5 é recuperada através de colheita de células SF+ inteiras (isto é, intactas) expressando a proteína H5. Células preferidas são aquelas suscetíveis a infecção com apropriado vetor viral recombinante, contendo um ADN H5 e expressando a proteína H5. Preferivelmente as células são células de inseto, e mais preferivelmente, elas incluem células de insetos comercializadas sob a marca registrada células de inseto SF+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Culturas de células preferidas têm uma contagem de células entre cerca de 0,3 - 2,0 x 106 células / mL, mais preferivelmente de cerca de 0,35 - 1,9 x 106 células / mL, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,4 - 1,8 x 106 células / mL, mesmo mais preferivelmente de cerca de 0,45-1,7x10® célu-las/mL, e mais preferivelmente de cerca de 0,5-1,5x10® células/mL.
Vetores virais preferidos incluem báculovírus como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), em particular contanto que as células de produção sejam células de insetos. Embora o sistema de expressão de báculovírus seja preferido, é entendido por aqueles versados na téc- nica que outros sistemas de expressão funcionarão para os propósitos da presente invenção, por exemplo a expressão de H5 no sobrenadante de uma cultura de células. Tais outros sistemas de expressão podem requerer o uso de uma sequência sinal de modo a causar expressão de H5 nos meios.
Apropriados meios de crescimento também serão determináveis por aqueles versados na técnica com os meios de crescimento preferidos sendo meios de células de insetos livres de soro como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) e similares. O vetor viral recombinante contendo as sequências de ADN H5 tem uma preferida multiplicidade de infecção (MOI) de entre cerca de 0,03-1,5, mais preferivelmente de entre cerca de 0,05-1,3, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,09-1,1, e mais preferivelmente de cerca de 0,1-1,0, quando usado para a infecção das células suscetíveis. Preferivelmente as MOIs mencionadas acima referem-se a um mL de fluido de cultura de células. Preferivelmente, o processo aqui descrito compreende a infecção de 0,35-1,9x10® células/mL, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,4-1,8x10® células/mL, mesmo mais preferivelmente de cerca de 0,45-1,7x10® célu-las/mL, e mais preferivelmente de cerca de 0,5-1,5x10® células/mL com um vetor viral recombinante contendo um ADN H5 e expressando a proteína H5 tendo uma MOI (multiplicidade de infecção) de entre cerca de 0,03-1,5, mais preferivelmente de cerca de 0,05-1,3, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,09-1,1, e mais preferivelmente de cerca de 0,1-1,0.
As células infectadas são então incubadas sobre um período de até dez dias, mais preferivelmente de cerca de dois dias a cerca de dez dias, ainda mais preferivelmente de cerca de quatro dias a cerca de nove dias, e mais preferivelmente de cerca de cinco dias a cerca de oito dias.
Condições de incubação incluem uma temperatura entre cerca de 22-32°C, mais preferivelmente de cerca de 24-30°C, ainda mais preferivelmente de cerca de 25-29°C, mesmo mais preferivelmente de cerca de 26-28°C, e mais preferivelmente cerca de 27°C. Preferivelmente, as células SF+ são observadas seguindo inoculação para características alterações induzidas por baculovírus. Tal observação pode incluir monitoramento de tendên- cias de densidade de células e a diminuição em viabilidade durante o período de pós-infecção. Foi verificado que pico de título viral é observado 3-5 dias após infecção e pico de expressão de proteína H5 nas células é obtido entre dias 5 e 8, e/ou quando viabilidade de célula diminui para menos que 10%.
Assim, um aspecto da presente invenção provê um processo de produção e/ou recuperação de proteína H5 recombinante, preferivelmente em quantidades descritas acima, através de i) permissão de infecção de um número de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI como definida acima, ii) expressão de proteína H5 pelo vetor viral recombinante, e iii) a seguir recuperação de proteína H5 das células obtidas entre dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição de viabilidade de células para menos que 10%. Preferivelmente, o vetor viral recombinante é um báculovírus recombinante contendo ADN H5 codificando sequências e as células são células SF+. Adicionalmente, é preferido que a cultura seja periodicamente examinada para evidência macroscópica e microscópica de contaminação ou para mudanças atípicas em morfologia de célula durante o período de pós-infecção. Qualquer cultura exibindo qualquer contaminação deve ser descartada.
Para recuperação de proteína H5 que será usada em uma composição imunogênica ou imunológica tal como uma vacina, a inclusão de uma etapa de inativação é preferida de modo a inativaro vetor viral.
Uma "composição imunogênica ou imunológica" refere-se a uma composição de matéria que compreende pelo menos um antígeno que elicita uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imunomediada por anticorpo e/ou celular à composição ou vacina de interesse. Usualmente, uma "resposta imunológica" inclui mas não é limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células T gama - delta, direcionada especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro mostrará uma resposta imunológica protetora ou terapêutica de modo que resistência à nova infecção será aperfeiçoada e/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada por uma redução ou falta de sintomas normalmente mostrados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título viral diminuído no hospedeiro infectado.
Assim, a presente invenção também refere-se a um processo de produção e/ou recuperação de proteína H5 recombinante, preferivelmente em quantidades descritas acima, através de i) permissão de infecção de um número de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI como definida acima, ii) expressão de proteína H5 pelo vetor viral recombinante, iii) a seguir recuperação de proteína H5 das células obtidas entre dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição de viabilidade de células para menos que 10% , e iv) inativação de vetor viral recombinante.
Preferivelmente, esta inativação é feita justo antes ou justo após a etapa de filtração, com após a etapa de filtração sendo o momento preferido para inativação. Qualquer processo de inativação convencional pode ser usado para propósitos da presente invenção. Assim, inativação pode ser realizada através de tratamentos químicos e/ou físicos. Em formas preferidas, o volume de fluidos colhidos é determinado e a temperatura é levada para entre cerca de 32-42°C, mais preferivelmente entre cerca de 34-40°C, e mais preferivelmente entre cerca de 35-39°C. Processos de inativação preferidos incluem a adição de etilenimina binária ciclizada (BEI), preferivelmente em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM, mais preferivelmente de cerca de 5 nM. Por exemplo, a inativação inclui a adição de uma solução de bromo-hidrato de 2-bromo etileno amina, preferivelmente de cerca de 0,4 M, que foi ciclizada para etilenimina binária (BEI) 0,2 M em NaOH 0,3N, aos fluidos para render uma concentração final de cerca de BEI 5 mM. Preferivelmente, os fluidos são então continuamente agitados por 72-96 horas e os fluidos colhidos inativados podem ser estoca- dos congelados a -40°C ou abaixo ou entre cerca de 1-7°C. Após inativação ser completa uma solução de tiossulfato de sódio, preferivelmente em 1,0 M é adicionada para neutralizar qualquer BEI residual. Preferivelmente, o tiossulfato de sódio é adicionado em quantidade equivalente comparado à BEI adicionada antes para inativação. Por exemplo, no caso de BEI ser adicionada para uma concentração final de 5 mM, uma solução de tiossulfato de sódio 1,0 M é adicionada para uma concentração mínima final de 5 mM para neutralizar qualquer BEI residual.
Assim, ainda um aspecto da presente invenção refere-se a um processo de produção de proteína H5 recombinante, preferivelmente em quantidades descritas acima, através de i) permissão de infecção de um número de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI como definida acima, ii) expressão de proteína H5 pelo vetor viral recombinante, e iii) a seguir recuperação de proteína H5 das células obtidas entre dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição de viabilidade de células para menos que 10%, e iv) inativação de vetor viral recombinante. Preferivelmente, o vetor viral recombinante é um báculovírus contendo ADN H5 codificando sequências e as células são células SF+. Etapas de inativação preferidas são aquelas descritas acima. Preferivelmente, inativação é realizada entre cerca de 35-39°C e na presença de BEI 2 a 8 mM, ainda mais preferido na presença de BEI cerca de 5 mM.
Ainda de acordo com um aspecto da presente invenção, o processo descrito acima também inclui uma etapa de neutralização após a etapa iv). Esta etapa v) compreende adição de uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro de solução. Preferivelmente, se o agente de inativação é BEI, adição de tiossulfato de sódio em uma quantidade equivalente é preferida. Assim, de acordo com ainda um aspecto, a etapa v) compreende adição de uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM mais preferivelmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.
Em formas preferidas e especialmente em formas que usarão a proteína H5 recombinante em uma composição imunogênica tal como uma vacina, cada lote de proteína H5 colhido será testado para inativação através de passagem nas células de inseto suscetíveis de baculovírus, dependentes de ancoragem, tais como células Sf9. Em uma forma preferida deste teste, 150 cm2 de apropriada monocamada de cultura de células são inoculados com 1,0 mL de fluidos H5 inativados e mantidos a 25-29°C por 14 dias com pelo menos duas passagens. No fim do período de manutenção, as monocamadas de células são examinadas para efeito citopatogênico (CPE) típico de baculovírus H5. Preferivelmente, controles vírus positivos também são usados. Tais controles podem consistir em uma cultura de células Sf9 inocu-ladas com um baculovírus H5 referência não-inativado e um frasco de células Sf9 que permanecem não-inoculadas. Após incubação e passagem, a ausência de células infectadas com vírus nos fluidos virais tratados com BEI pode constituir um teste de inativação satisfatório. As células controles ino-culadas com o vírus referência devem exibir CPE típico de baculovírus H5 e o frasco não-inoculado não deve exibir qualquer evidência de CPE de baculovírus H5. Alternativamente, no fim do período de manutenção, as amostras de sobrenadante podem ser coletadas e inoculadas sobre uma placa de 96 cavidades de Sf9, que foi carregada com células Sf9, e então mantida a 25-29°C por 5-6 dias. A placa é então fixada e manchada com anticorpo anti-H5 conjugado a FITC ou qualquer anticorpo marcado direcionado para proteínas específicas de baculovírus (isto é, gp64). A ausência de CPE, expressão de H5, ou expressão de proteínas específicas de baculovírus (isto é, gp64) nos fluidos virais tratados com BEI constitui um satisfatório teste de inativação. As células controles inoculadas com o vírus referência devem exibir CPE e atividade IFA e o frasco não-inoculado não deve exibir qualquer evidência de CPE de baculovírus H5 e não conter atividade IFA.
Assim, ainda um aspecto aqui descrito refere-se a um teste de inativação para determinação de eficácia da inativação do vetor viral de recombinação expressando proteína H5, compreende as etapas de: i) contato de pelo menos uma porção do fluido de cultura contendo o vetor viral recombinante com um agente de inativação, preferivelmente como descrito acima, ii) adição de um agente de neutralização para neutralizar o agente de inativação, preferivelmente como descrito acima, e iii) determinação de infectividade residual através de ensaios como descrito acima.
Após inativação, a relativa quantidade de proteína H5 recombinante em uma amostra pode ser determinada em um número de maneiras. Processos preferidos de quantificação incluem densitometria SDS-PAGE, ELISA, e estudos de vacinação animal que correlacionam quantidades conhecidas de vacina com resultados clínicos (sorologia, etc.), Quando SDS-PAGE é utilizada para quantificação, o material amostra contendo uma quantidade desconhecida de proteína H5 recombinante é corrido sobre um gel, junto com amostras que contêm diferentes quantidades conhecidas de proteína H5 recombinante. Uma curva padrão então pode ser produzida sobre as amostras conhecidas e a quantidade de H5 recombinante na amostra desconhecida pode ser determinada através de comparação com esta curva padrão. Devido ELISAs serem geralmente reconhecidos como o padrão de indústria para quantificação de antígeno, eles são preferidos para quantificação.
Vacinas compreendendo proteínas H5 ou moléculas de ácidos nucléicos ou vetores codificando as mesmas Ainda de acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a vacinas ou composições farmacêuticas em geral, que compreendem, i. uma ou mais das proteínas H5 como aqui descritas; ii. uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos como aqui descritas, codificando qualquer uma de tais proteínas H5; e/ou iii. um ou mais dos vetores como aqui descritos, incluindo quaisquer tais moléculas de ácido nucléico e codificando quaisquer tais proteínas H5 como aqui descritas; e iv. um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável. O termo "composição farmacêutica", "composição farmacêutica / vacina" como aqui descrito, inclui mas não é limitado a, vacinas para a redu- ção ou prevenção de uma infecção ou a uma composição de matéria para o tratamento e diminuição de uma infecção. A preparação de vacinas baseadas em ácido nucléico, preferivelmente vacinas de ADNc, codificando hemaglutinina ínfluenza é descrita, por exemplo, em Deck et al., Vaccine 1997; 15(1):71-78; Ulmer et al., Science 1993; 259-:1745-1749; Ulmer et al., Vaccine 1994:12(16):1541-1544. Qualquer um destes processos pode ser usado para a produção de vacinas baseadas em ácido nucléico, preferivelmente vacinas ADNc, codificando uma proteína H5 ínfluenza como aqui descrito.
Além disso, uma vacina, que compreende proteína H5 ou suas partes como aqui descrito, pode ser produzida através de abordagens convencionais, por exemplo, através de técnicas de expressão recombinante ou através de purificação bioquímica e técnicas de separação. Técnicas de expressão recombinante, incluindo a expressão em células de insetos, são bem-conhecidas na técnica, e descritas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.l. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994). Ainda exemplos de sistemas de expressão recombinante bem-estabelecidos são sistemas de expressão bacteriana tais como E. coli ou B. subtilis, sistemas de expressão baseados em levedura como S.cerevisiae ou S. pombe, ou sistemas de expressão em célula mamífera como os sistemas de expressão baseados em BHK, CHO e/ou NSO. Tais sistemas são bem-conhecidos na técnica e geralmente disponíveis, por exemplo, comercialmente através de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Paio Alto, Califórnia 94303-4607, USA. Ainda estratégias de expressão são, por exemplo, descritas em Luschow et al., Vaccine N° 19 (2001), pp. 4249-4259, ou Veit et al. PNAS vol. 103 (2006), pp. 8197-8202. Além disso, sistemas de vírus associado-adeno recombinantes são bem-estabelecidos e, por exemplo, descritos em US 5 436 146 ou W0200203872 com ainda referências. Além disso, sistemas de expressão baseados em vírus vacínia (varíola), por exemplo, como descrito em US 6 265 183 com ainda referências, também são bem-estabelecidos e apropriados para produção de antigeno(s) recombinante, composição(ões) antigênicas como u-sadas de acordo com a invenção. Ainda sistemas de expressão apropriados fazem uso de vírus popova recombinante, como SV40, vírus de epitelioma contagioso, vírus de pseudo-raiva e retrovírus.
As composições farmacêuticas / vacinas relevantes como aqui descritas, também podem compreender vírus inativados que compreendem proteína H5 como aqui descrito, uma versão apatogênica de um vírus vivo compreendendo proteína H5 como aqui descrita, preparação e/ou fragmentos de um vírus, onde a dita preparação e/ou fragmento compreende a proteína H5 como aqui descrita.
Aqueles versados na técnica conhecem componentes adicionais que podem ser compreendidos nas ditas composições / vacinas junto com antígeno (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed. Mack Publ., Easton). O especialista pode usar conhecidas soluções estéreis fisiologicamente aceitáveis, injetáveis. Para preparação de uma solução pronta-para-uso, soluções isotônicas aquosas, tais como, por exemplo, solução salina ou correspondentes soluções de proteína de plasma são facilmente disponíveis. A composição farmacêutica / vacina pode ser apresentada como preparações liofilizadas ou secas, que podem ser reconstituídas com uma solução injetável conhecida diretamente antes de uso sob condições estéreis, por exemplo, como um kit de partes.
Em adição as composições farmacêuticas / vacinas da presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis. Como aqui usado, "um veículo veterinário aceitável" inclui mas não é limitado a quaisquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizadores, diluentes, preservativos, agentes antibacterianos e antifungos, agentes isotônicos, agentes de retardo de adsorção, e similares.
Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizadores incluem al-bumina e sais alcalinos de ácido etileno diamino tetra-acético, entre outros.
Um preservativo como aqui usado, refere-se a um agente ativo antimicrobiológico, tal como, por exemplo, gentamicina, mertiolate, e similares. Em particular adição de um preservativo é mais preferida para a preparação de uma composição multidoses. Aqueles agentes ativos antimicrobio-lógicos são adicionados em concentrações eficaz para evitar que a composição de interesse seja contaminada microbiologicamente ou para inibição de qualquer crescimento microbiológico dentro da composição de interesse. "Adjuvantes" como aqui usados, podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech., Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham.AL), emulsão água-em-óleo, emulsão óleo-em-água, emulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser baseada em particular em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia): óleo isoprenóide como esqualano ou esqualeno; óleo resultante da oligomerização de alquenos, em particular de iso-buteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmente óleos de plantas, oleato de etila, di-(caprilato / ca-prato) de propileno glicol, tri-(caprilato / caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos graxos ramificados ou álcoois, em particular ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emulsificantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferivelmente tensoativos não-iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manita (por e-xemplo, oleato de anidro manitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácido oléico, isoesteárico, ricinoleico ou hidróxi esteárico, que são opcionalmente etoxilados, e copolímeros de bloco de polioxipropileno - poli-oxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart- Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) e Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Exemplos de apropriadas emulsões de oleo-em-água são adjuvantes baseados em Emulsigen®, tais como EMULSIGEN, EMUL-SIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, USA). Foi surpreendentemente verificado que composições farmacêuticas / vacina que compreendem proteína H5, preferivelmente proteína H5 recombinante como aqui descrita, receberam eficazmente adjuvantes emulsões óleo-em-água, preferivelmente tais adjuvantes baseados em Emulsigen, mais preferivelmente com EMULSIGEN® e EMULSIGEN-D®.
Além disso, é possível usar a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão de MF59 descrita na página 183 deste mesmo livro.
Ainda um exemplo de um adjuvante é um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros de anidrido maleico e derivado alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmente com polialquenila éteres de açúcares ou poli álcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbomero (Phameuropa Vol. 8, N° 2, junho de 1996). Aqueles versados na técnica também podem se referir a patente US 2 909 462 que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, preferivelmente não mais que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos com radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem eles próprios conter outros substituintes, como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, O-hio, USA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados com uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre eles, podem ser mencionados Carbopol 974P, 934P e 971P. É mais preferido o uso de Carbopol 971P. Entre os copolímeros de anidrido maleico e derivado de alquenila, os copolíme- ros EMA (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maleico e etileno. A dissolução destes polímeros em água conduz a uma solução ácida que será neutralizada, preferivelmente para pH fisiológico, de modo a render a solução adjuvante na qual a própria composição imunogênica, imunológica, ou vacina será incorporada.
Ainda adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados a, o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), Block co-polymer (CytRx, Atlanta, GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), mono fosforil lipídeo A, adjuvante lipídeo -amina Avridina, enterotoxina termoinstável de E. coli (recombinante ou outro modo)toxina de cólera, ou dipeptídeo muramila entre muitos outros Preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Mesmo mais preferido o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Mesmo mais preferido, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose. Mesmo mais preferido o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose. Mais preferido, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.
As composições farmacêuticas / vacinas ainda podem incluir um ou mais outros agentes imunomoduladores tais como, por exemplo, interleu-cinas, interferons, ou outras citocinas. As composições farmacêuticas / vacinas também podem incluir gentamicina e mertiolate. Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção possam ser facilmente determinadas por aqueles versados, a presente invenção contempla composições compreendendo de cerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante e preferivelmente cerca de 250 pg/1 mL de dose da composição de vacina. Em uma outra realização preferida, a presente invenção contempla composições de vacina compreendendo de cerca de 1 pg/mL a cerca de 60 pg/mL de antibióticos, e mais preferivelmente menos que cerca de 30 pg/mL de antibióticos.
Assim, de acordo com ainda uma realização, a presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica / vacina compreendendo i. uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das proteínas H5 de vírus ínfluenza como aqui descritas, onde a proteína H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda lisina (K+) é inserida; e ii. um adjuvante farmaceuticamente aceitável como descrito acima.
Preferivelmente, o adjuvante é selecionado do grupo consistindo em: a) EMULSIGEN®, uma emulsão de óleo-em-água (o/w); b) EMULSIGEN-D®, uma óleo-em-água (o/w) com brometo de dimetil diocta decil amônio (DDA); c) um Polygen, um copolímero d) EMULSIGEN-P®, uma óleo-em-água (o/w) com um estimulante imuno proprietário e) Carbigen é um polímero reticulado f) EMULSIGEN-75®, um adjuvante duplo compreendendo uma óleo-em-água (o/w) com um polímero reticulado g) ISA 70 é uma água-em-óleo (w/o) Mais preferivelmente, o adjuvante é uma emulsão de óleo-em-água tal como um adjuvante baseado em emulsigen selecionado do grupo consistindo em EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75®, EMULSIGEN® e EMULSIGEN-P®. Mais preferivelmente EMULSIGEN® e EMULSIGEN-P® são usados na formulação da presente invenção.
Ainda de acordo com um aspecto, as composições farmacêuticas / vacinas como aqui providas, compreendem um ou mais antígenos. Preferivelmente, este ainda antígeno é um antígeno de uma ave doméstica ou patógeno mamífero. Ainda de acordo com concretizações, este antígeno adicional é ainda um antígeno ínfluenza tal como hemaglutinina H3, H7, H9, ou qualquer outra hemaglutinina de vírus ínfluenza. O antígeno(s) adicional pode ser adicionado em uma forma purificada, como parte de uma prepara- ção antigênica, em forma de um microorganismo morto ou em forma de um microorganismo vivo modificado. O termo "antígeno", como aqui usado significa, mas não é limitado a, peptídeos, polipeptídeos, glicopeptídeos, ou polissacarídeos que são capazes de interação específica com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imuno, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T de modo a elicitar, ativar ou estimular uma resposta imunodirecionada ao dito antígeno em um hospedeiro ao qual o dito antígeno é administrado. O termo "antígeno" também refere-se a moléculas de ácidos nucleicos, preferivelmente moléculas de ADN ou ARN, cada uma das quais codifica e expressa um peptídeo, polipeptídeo, ou glicopeptí-deo que é capaz de interagir especificamente com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imune, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T de modo a elicitar, ativar ou estimular uma resposta imune contra o antígeno que é codificado pela molécula de ácido nucléico. O antígeno usado para a preparação da composição farmacêutica que é usada de acordo com a invenção é um microorganismo ou uma parte antigênica e/ou preparação do dito microorganismo. Neste sentido, o termo "imunização", como usado aqui, significa mas não está limitado a, qualquer causa ou aperfeiçoamento de uma resposta imune. O termo "resposta imune" já está descrito acima.
Estratégias de administração para vacinas influenza são bem-conhecidas na técnica. Estratégias de vacinação em mucosa para vacinas de vírus atenuado ou inativado são contempladas. Na medida em que a mucosa pode ser alvejada através de liberação local de uma vacina, várias estratégias foram empregadas para liberar proteínas imunogênicas para a mucosa.
Em uma concretização específica, a vacina pode ser administrada em uma mistura com, ou como um conjugado ou proteína de fusão qui-mérica com, toxina de cólera, tal como toxina B de cólera ou uma quimera de toxina A/B de cólera (Hajishengallis, J. Immunol., 154:4322-32, 1995; Jo-bling and Holmes, Infect. Immun. 60:4915-24, 1992). Vacinas de mucosas baseadas no uso da subunidade de toxina B de cólera foram descritas (Le-bens and Holmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994). Em uma outra concretização, uma mistura com enterotoxina instável termicamente (LT) pode ser preparada para vacina em mucosa.
Outras estratégias de imunização em mucosa incluem encapsu-lação de vírus em microcápsulas (US 5 075 109, US 5 820 883, e US 5 853 763) e uso de um veículo membranoso de potencialização imune (WO 98/0558). Imunogenicidade de imunógenos administrados oralmente pode ser aperfeiçoada através do uso de células vermelhas do sangue (rbc) ou fantasmas rbc (US 5 643 577), ou através de uso de antígeno língua azul (US 5 690 938).
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para preparação de uma composição farmacêutica / vacina como descrito acima, preferivelmente um processo para produção de uma vacina que compreende uma proteína H5 expressa em báculovírus, recombinante como descrito supra. Geralmente, este processo inclui as etapas de transfecção de uma construção em um vírus, onde a construção compreende i) ADNc H5 recombinante como aqui descrito, ii) infecção de células em meios de crescimento com o vírus transfectado, iii) fazer com que o vírus expresse a proteína H5 recombinante como aqui descrita, iv) recuperação de proteína H5 expressa a partir da cultura, v) e preparação de composição a-través de combinação de proteína H5 expressa com um adjuvante apropriado e/ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.
Adjuvantes preferidos são aqueles descritos acima. Assim, de acordo com ainda um aspecto, o processo para preparação de uma composição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para evocar uma resposta imune contra infecções ínfluenza compreende i) preparação e recuperação de proteína H5, e ii) mistura desta com adjuvantes apropriados.
Em adição, a composição de vacina da presente invenção também pode incluir diluentes, agentes isotônicos, estabilizadores e/ou preservativos. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Agentes isotônicos podem incluir sais inorgânicos ou orgâni- cos, por exemplo, cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, sacarídeos, trealose, manitol, sacarose, entre outros. Estabilizadores incluem albumina e sais alcalinos de ácido etileno diamino tetra-acético, entre outros. Apropriados adjuvantes, são aqueles descritos acima.
Uso medicinal de quaisquer de tais proteínas H5, moléculas de ácidos nucleicos, vetores e vacinas As proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer tais proteínas H5, os vetores compreendendo quaisquer tais moléculas de ácido nucleico codificando quaisquer tais proteínas H5 como aqui descritas, e qualquer composição farmacêutica / vacina compreendendo qualquer tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor podem ser usados como um medicamento, preferivelmente para o tratamento e profilaxia de infecções, causadas por vírus influenza, mais preferivelmente por vírus influenza A. As proteínas H5 aqui providas, as moléculas de ácido nucleico codificando tais proteínas H5, os vetores compreendendo quaisquer de tais moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer proteínas H5 como aqui descritas, e qualquer composição farmacêutica / vacina compreendendo qualquer uma de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor, como aqui descrito, podem ser usados para o tratamento ou profilaxia de seres humanos assim como em medicina veterinária. Quando usado em medicina veterinária, o tratamento de aves domésticas, preferivelmente, pássaro, galinha, pato, peru, e similares assim como mamíferos, preferivelmente porcos, gado, cavalos, focas, camelos, cães, gatos, hamsters, camundongos e similares, é preferido.
Assim, de acordo com um outro aspecto a presente invenção refere-se ao uso de proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucleicos codificando tais proteínas H5, os vetores compreendendo quaisquer tais moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer tais proteínas H5 como aqui descritas e quaisquer composições farmacêuticas / vacinas compreendendo qualquer um de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor como aqui descrito, pode ser usado como um medicamento, preferivelmente como um medicamento para seres humanos e/ou como medicamento veterinário.
Além disso, proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer tais proteínas H5, os vetores compreendendo quaisquer tais moléculas de ácidos nucleicos codificando qualquer tal proteína H5, como aqui descrita, pode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica como aqui descrita, para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por influenza viral. Como mencionado acima, aquelas composições farmacêuticas / composições de vacinas podem ser usadas para o tratamento e/ou profilaxia de seres humanos assim como para o tratamento e/ou profilaxia de animais, como aves domésticas, preferivelmente pássaro, galinha, pato, peru, e similares, assim como mamíferos, preferivelmente porcos, gado, cavalos, focas, camelos, cães, gatos, hamsters, camundongos, e similares.
Proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucle-icos codificando tais proteínas H5, os vetores compreendendo tais moléculas de ácidos nucleicos codificando tais proteínas H5, como aqui descritas, podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica, como aqui descrita, são apropriados para o tratamento e profilaxia de infecção influenza viral, que preferivelmente é causada por vírus influenza de ave, suíno ou humano ou qualquer sua combinação ou híbrido.
Ainda de acordo com um aspecto, a presente invenção também refere-se a um processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, onde o processo compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína H5 como aqui descrita, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento. Além disso, a presente invenção também refere-se a um processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, onde o processo compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer molécula de ácido nucléico H5 ou vetor como aqui descrito, que codifica qualquer proteína H5 como aqui descrita, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento. Além disso, a presente invenção também refere-se a um processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, onde o processo compreende adminis- tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina compreendendo qualquer tal proteína H5, molécula de ácido nucléico ou vetor, como aqui descrito, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento. O sujeito em sua necessidade pode ser um ser humano assim como um animal, preferivelmente aves domésticas, mesmo mais preferivelmente pássaro, galinha, pato, peru, ou um mamífero, preferivelmente porco, gado, cavalo, foca, camelo, cão, gato, hamster, camundongo e similares.
Preferivelmente, quando galinhas são vacinadas, a proteína H5 como aqui descrita pode ser usada para vacinação no dia 1 de idade ou depois, por exemplo, no dia 10, ou nos dias 1 a 10, ou no dia 10 ou depois.
Preferivelmente a infecção ínfluenza que pode ser tratada através de administração de qualquer proteína H5, a molécula de ácido nucléico ou vetor codificando qualquer tal proteína H5, ou quaisquer composições farmacêuticas / vacinas como aqui descritas, é causada por vírus Ínfluenza de aves, suínos ou seres humanos ou qualquer combinação ou híbrido das mesmas.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit de partes, que compreende i) qualquer uma proteína H5 como aqui descrita, a molécula de ácido nucléico ou vetor codificando qualquer tal proteína H5, ou qualquer composição farmacêutica / vacina compreendendo qualquer tal proteína H5, molécula de ácido nucléico ou vetor como aqui descrito, e ii) um folheto de embalagem indicando o uso de tal proteína H5, molécula de ácido nucléico, vetor ou vacina para o tratamento ou profilaxia de infecções causadas por vírus ínfluenza. Quando galinhas são vacinadas, a proteína H5 como aqui descrita pode ser usada para vacinação no dia 1 de idade ou depois.
Ainda de acordo com uma concretização, este kit em partes compreende ainda pelo menos um antígeno de patógeno de aves domésticas ou mamífero e a indicação de informação de uso medicinal, humano ou veterinário daquele antígeno adicional.
Exemplos Os seguintes exemplos mostram materiais e procedimentos preferidos de acordo com a presente invenção. É para ser entendido, entretan- to, que estes exemplos são providos por meio de ilustração somente. E nada ali deve ser julgado uma limitação sobre o escopo total da invenção.
Exemplo 1 Construção de um baculovírus recombinante codificando e expressando antígenos H5 HA O baculovírus recombinante contendo o antígeno HA H5 foi gerado como se segue: As sequências codificantes de HA H5 (SEQ ID NO: 2) foram sintetizadas quimicamente e subclonadas no vetor de transferência pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). O MutK+ de HA H5 (SEQ ID NO: 4) foi gerado através do uso de iniciadores oligonucleotídeos e o QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) e subclonado no vetor de transferência pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Os plasmídeos pVL1392 contendo os genes codificando antígeno HA H5 (SEQ ID NO: 2) e MutK+ HA H5 (SEQ ID NO: 4) foram então co-transfectados com ADN baculovírus DiamondBac® (Sigma) em células Sf9 de insetos (BD Biosciences Pharmingen) para gerar o baculovírus recombinante contendo os genes HA H5 codificando SEQ ID NO: 2 e mutK+ HA H5 codificando SEQ ID NO: 4. Os baculovírus recombinantes contendo os genes codificando HA H5 (SEQ ID NO: 2) e MutK+ HA H5 (SEQ ID NO: 4) foram purificados com placa e Vírus Semente Mestre (MSVs) foram propagados sobre a linha de células SF+, feitos alíquotas, estocados a -70°C. Células de insetos infectadas com baculovírus HA H5 como descrito acima para gerar MSV ou Vírus Semente de Trabalho expressa antígeno HA H5 (SEQ ID NO: 2) e antígeno MutK+ HA H5 (SEQ ID NO: 4) como detectado por anticorpos monoclonais ou soro policlonal em um ensaio de anticorpo fluorescente indireto ou Western blot.
Após serem semeados com as apropriadas quantidades de baculovírus recombinante (HA H5 e MutK+ HA H5, respectivamente), frascos rotatórios contendo células SF+ (Protein Sciences, Inc., Meriden, CT) foram então incubadas a 27±2°C por 7 dias e com agitação em 100 rpm durante este tempo. Os frascos usaram tampas ventiladas para permitirem fluxo de ar. A cultura de células brutas inteira contendo células SF+ infectadas com baculoví- rus e os sobrenadantes de cultura de células de cada cultura foram colhidos. Exemplo 2 Preparação de composições farmacêuticas (vacinas) compreendendo antí-genos H5 HA A proteína HA H5 de célula integral e proteína MutK+ HA H5 expressas em células de insetos através de sistema de expressão baseado em baculovírus foram colhidas. Baculovírus foram inativados na presença de etilenimina binária ciclizada (BEI) 5 mM (concentração final) entre cerca de 32 e 39°C por 72 a 96 horas. Após inativação ser completada, uma solução 0,3 M de tiossulfato de sódio foi adicionada para uma concentração final de 5 mM para neutralizar qualquer BEI residual. Após neutralização vários adjuvantes foram adicionados e as seguintes composições de vacinas / farmacêuticas foram geradas.
Vacinas Exemplo 3 Vacinação de suínos (porcos) contra influenza de aves 1. Introdução O propósito deste estudo foi determinar a habilidade de vacinas experimentais contendo um extrato bruto de antígeno hemaglutinina (HA) H5 recombinante para induzir inibição de títulos de hemaglutinação (Hl) em suínos. Vários adjuvantes foram avaliados com os antígenos HA H5.
Os protótipos H5 HA avaliados neste estudo contiveram antígeno a partir de HA H5 convencional ou MutK+ HA H5. HA H5 convencional foi derivada de A/pato/China/E319-2/03, enquanto mutK+ HA H5 consiste em HA H5 convencional que foi engenheirada para conter três específicas alterações de aminoácidos em S120N, D150N, S223N e 328mutK+. Ela também contém aminoácido 94N. As particulares mudanças de aminoácidos em MutK+ HA H5 resultam em uma HA H5 que parece mais de perto a HA de A/HK/213/03. A composição de aminoácidos da HA H5 de A/HK/213/03 é correntemente pensada auxiliarem reconhecimento de anticorpo da HA H5. 2. Desenho de estudo: Tabela 1. Sumário de estudo Os porquinhos foram de 3 semanas +/- 5 dias de idade no início do estudo. Os porquinhos foram clinicamente saudáveis no início do estudo. A-mostras de sangue foram obtidas nos dias de estudo 0, 21, e 35.
Todos os animais de estudo foram observados diariamente nos dias de estudo 1 até 35 em relação ao estado de saúde geral. Por sete dias seguindo cada vacinação, sítios de injeção foram investigados diariamente e reações visíveis foram anotadas. Na conclusão da fase animal do estudo no dia de estudo 35, todos os animais sofreram eutanásia. 3. Vacinas Vacinas 501 a 514 como descritas no EXEMPLO 2 foram usadas para o estudo de vacinação de porcos. 4. Ensaio de Inibição de Hemaglutinina Suínos foram vacinados com os protótipos contendo HA H5 nos dias 0 e 21. Soros de suínos foram coletados para avaliação através de ensaio de inibição de hemaglutinação nos dias 0, 21, 35. O ensaio Hl foi realizado para detectar a presença de anticorpos específicos HA. Um vírus H5N2 heterólogo, A/galinha/México/232/94, foi usado em uma concentração de quatro unidades hemaglutinantes [4 unidades HA] no ensaio Hl. Diluições de soro de duas vezes seriais em placas de microtitulação de fundo U em PBS foram subsequentemente misturadas com iguais volumes (25 pL) contendo 4 unidades HÁ de vírus, e incubadas em temperatura ambiente (cerca de 25°C) por 30 minutos. Células vermelhas de sangue de galinha, em uma concentração de 0,5% em PBS, foram adicionadas às cavidades contendo vírus - soro e incubadas por 40 minutos em temperatura ambiente. Os títulos de Hl foram determinados como recíprocas das mais altas diluições de soro nas quais inibição de hemaglutinação foi observada. 5. Resultados Teste Hl usou o antígeno H5N1 oficial do governo Mexicano (A/galinha/México/232/94) [4 unidades HA], Regime de vacinação de 1x1 mL nos dias 0 e 21. BIV Η5 (derivada de vírus influenza A (A/pato/China/E319-2/03 (H5N1)) BIV H5 K+ (BIV H5 mutante para incluir S120N, D155N, S223N, e 328K+ adicionado) Os resultados demonstram que maioria das composições de vacina elicitam uma resposta imune nos porcos vacinados. Em particular, maioria das composições de vacina resultam em uma soroconversão, que significa que maioria dos porcos vacinados desenvolveu específicos anticorpos contra o vírus influenza de aves usado no ensaio Hl. No total, os resultados clara e indubitavelmente provam que a idéia inventiva reivindicada funciona muito bem. O risco de infecção pandêmica de porcos (animal de uma segunda espécie), com vírus influenza de aves (patógeno de uma primeira espécie) pode ser dramaticamente reduzido através de vacinação de porcos com um antígeno relevante de vírus influenza de aves. Isto foi claramente demonstrado. Além disso, através de deste conceito de vacinação, a trans- missão e adaptação de vírus influenza de aves para mamíferos, incluindo seres humanos são dramaticamente reduzidos. Porcos são um dos reservatórios mais importantes para patógenos de aves, incluindo vírus influenza de aves. Se a replicação de vírus em porcos e por isso o risco de adaptação de influenza de aves para porcos é dramaticamente reduzida e controlada, o risco para qualquer adaptação de vírus influenza de aves a seres humanos é também dramaticamente reduzido. No caso, onde a administração de antígeno resulta em menor título Hl, que significa título menor que 30, ainda reforços com antígeno serão requeridos para ainda aperfeiçoar o título Hl e para aperfeiçoar a proteção imune nos porcos vacinados. Por isso, baixo título não significa que nenhuma proteção pode ser obtida, somente ensina que ainda reforços parecem ser requeridos para aperfeiçoar a resposta imune. O fato de que uma resposta imune pode ser medida em porcos vacinados demonstra que a idéia inventiva subjacente à presente invenção funciona muito bem. Em outras palavras, os experimentos aqui providos clara e indubitavelmente proporcionam evidência de que a idéia inventiva da presente invenção funciona.
Exemplo 4 Vacinação de pássaros contra influenza de aves 1. Introdução O propósito deste estudo foi determinar a habilidade de vacinas experimentais contendo um extrato bruto de antígeno mutK+ H5 recombi-nante + hemaglutinina (H5 HA mutK+) para induzir títulos de inibição de hemaglutinação (Hl) em galinhas. Em adição, um antígeno H5 recombinante convencional (HA H5) assim como a vacina inativada Volvac® Al (Boehringer Ingelheim Vetmedica, México) foram usados para controle. Além disso, vários adjuvantes foram avaliados com os antígenos HA H5. 2. Projeto de Estudo: Pássaros SPF (15-25) foram vacinados independentemente com diferentes vacinas experimentais em 1 ou 10 dias de idade através de via subcutânea com 0,5 mL na parte de trás do pescoço; todos os pássaros foram mantidos em isoladores durante o experimento. Alimento e água foram providos ad libitum. Desafio foi conduzido 31 ou 32 dias após vacinação com linhagem ínfluenza de aves altamente patogênica H5N2.
Amostras de soro foram obtidas através de sangramento de pássaros a partir de veia jugular em 15, e 30 dias após vacinação. Os soros obtidos foram estocados a 4°C até corrida de teste de inibição de hemaglutinação (Hl), como descrito no Exemplo 3, para obter os títulos de anticorpos. 3. Vacinas e Vírus de Desafio Quatro diferentes formulações foram avaliadas independentemente. 1. Convencional emulsão em óleo de Mut K+ HA H5: antígeno mutK+ HA H5 foi formulado em emulsão de óleo baseado (adjuvante incompleto Freund) em procedimentos de Boehringer Ingelheim Vetmedica. 2. MutK+ HA H5 Seppic: antígeno mutK+ HA H5 formulado com um adjuvante não-convencional (ISA 206, W/O/W, de Seppic) baseado na recomendação do fornecedor. 3. emulsão em óleo convencional HAH5: antígeno HA H5 foi formulado em emulsão em óleo baseado em procedimentos de Boehringer In-gelheim Vetmedica (adjuvante incompleto de Freund) 4. HAH5 Seppic: antígeno HA H5 formulado com um adjuvante não-convencional (ISA 206, W/O/W, de Seppic) baseado nas recomendações do fornecedor.
Uma vacina de emulsão em óleo de Boehringer Ingelheim Vetmedica de ínfluenza de aves foi usada como controle, Volvac® Al (Boehrin-ger Ingelheim Vetmedica, México).
Desafios foram conduzidos em galinhas vacinadas e não-vacinadas através de inoculação pela via intranasal com 0,2 mL contendo 106,7 CEID por pássaro do vírus desafio H5N2. Após o desafio, sinais e mortalidade foram anotados. Dez dias após inoculação todas as galinhas sobreviventes sofreram eutanásia de acordo com procedimentos de laboratórios para animais. 4, Resultados: Resultados são descritos nas tabelas que se seguem: Título de soro positivo é considerado log2 4 de acordo com padrões OIE. Baseado nestes critérios resultados sorológicos foram negativos, mas alguns valores positivos foram observados quando comparados com a linha base. Os melhores títulos sorológicos são observados na vacina formulada com adjuvante óleo e com o antígeno Mut K+ HAH5, em pássaros vacinados em 1 dia de idade ou 10 dias de idade. Os títulos sorológicos mais baixos foram observados no protótipo formulado com Seppic e o antígeno HAH5. No estudo de desafio foi observado, que protótipos de vacinas conferem proteção, particularmente com a vacina de emulsão em óleo convencional formulada com o antígeno Mut K+ HAH5. A proteção mais baixa no estudo de desafio foi observada com a HAH5 Seppic com 68% de mortalidade. Em contraste, o título sorológico mais alto foi observado em pássaros vacinados em 10 dias comparado com pássaros vacinados em um dia de idade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Boehringer ingelheim vetmedica GmbH
<120> PROTEÍNAS H5, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO E VETORES CODIFICANDO AQUELES, E SEU USO MEDICINAL <130> Caso 1-2150 <150> 60/863142 <151> 27-10-2006 <160> 6 <170> Versão de Patente 3.3 <210> 1 <211> 551 <212> PRT <213> Vírus Influenza Aviário <400> 1 Asp Gin ile Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn ser Thr Glu Gin vai 15 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Vai Thr vai Thr His Ala Gin Asp ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly vai Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile vai 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gin ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Vai ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly ser Ser ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Vai Vai Trp Leu ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Vai Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gin 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile ser vai Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 195 200 205 Leu vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg ser Lys Vai Asn Gly Gin Ser Gly 210 215 220 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 val Lys Lys Gly Asp ser Ala Ile Met Lys ser Glu vai Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asn Thr Lys cys Gin Thr Pro Met Gly Ala ile Asn ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Ile His pro Leu Thr ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr val Lys ser Asn Lys Leu val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320 Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 325 330 335 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met val Asp Gly Trp Tyr Gly 340 345 350 Tyr His His ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 355 360 365 ser 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Claims (19)

1. Proteína hemaglutinina H5 de vírus influenza, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido na posição 223 de SEQ ID NO: 1 é substituído por uma asparagina e, na posição de aminoácido 328, uma segunda lisina é inserida, em que o aminoácido na posição 155 de SEQ ID NO: 1 é substituído por uma asparagina, e em que o aminoácido na posição 120 de SEQ ID NO: 1 é substituído por uma asparagina.
2. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tal proteína H5 tem o aminoácido 94N.
3. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que tem um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93 - 95: GNF b. aa 123 - 125: SDH c. aa 128 - 130: SSG d. aa 139 - 141: GSS e. aa 226 - 228: MDF f. aa 268 - 270: EVE g. aa 309 - 311: NKL.
4. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.
5. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é originada de um vírus influenza de aves.
6. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
7. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a. a proteína hemaglutinina H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e b. um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o excipiente é um ou mais adjuvantes.
9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é uma emulsão de óleo em água.
10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais antígenos.
11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno é um antígeno de um patógeno de aves domésticas ou mamíferos.
12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno é H3, H7 ou H9 de vírus influenza.
13. Processo para produção de vacina compreendendo uma proteína hemaglutinina H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. obtenção de uma proteína hemaglutinina H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; b. mistura de proteína hemaglutinina H5 de etapa a) com um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
14. Uso da proteína hemaglutinina H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é como um medicamento.
15. Uso da vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que é como um medicamento.
16. Uso da proteína hemaglutinina H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por influenza viral.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a infecção influenza viral é causada por vírus influenza de aves, suínos ou seres humanos ou qualquer combinação ou híbrido dos mesmos.
18. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende: a. a proteína hemaglutinina H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou a vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 12 e b. um folheto de embalagem indicando o uso de tal proteína hemaglutinina H5, ou vacina de a) para o tratamento ou profilaxia de infecções causadas por vírus influenza.
19. Kit de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos ainda um antígeno de patógeno de aves domésticas ou mamíferos.
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