PT2086576E

PT2086576E - Proteínas h5, moléculas de ácido nucleico e vectores que as codificam e sua utilização medicinal

Info

Publication number: PT2086576E
Application number: PT07863555T
Authority: PT
Inventors: Juergen Daemmgen; Eric M Vaughn; Paulino Carlos Gonzalez-Hemandez
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2012-10-11
Also published as: JP2014012008A; MY150226A; ES2391123T3; US9375469B2; EP2086576A2; BRPI0718183B1; WO2008052173A8; WO2008052173A2; AU2007308869A1; SI2086576T1; US20140050755A1; CO6210831A2; JP5442442B2; EP2086576B8; AU2007308869B2; KR20090078362A; CA2664914A1; WO2008052173A3; EP2086576B1; US20080193471A1

Description

DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS H5, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO E VECTORES QUE AS CODIFICAM E SUA UTILIZAÇÃO MEDICINAL"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da medicina, de um modo preferido, ao campo das doenças infecciosas. Em particular, a presente invenção refere-se a proteínas gripais, moléculas de ácido nucleico e vectores codificando essas proteínas, e vacinas. Muito particularmente, a presente invenção refere-se a qualquer dessas proteínas, moléculas de ácido nucleico, vectores ou vacinas para utilização no tratamento e prevenção de infecções gripais e, além disso, para a prevenção da transmissão intra-espécies e inter-espécies do vírus da gripe.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A infecção gripal continua a ser uma importante infecção em animais e humanos. A gripe é causada por vírus que sofrem alterações/modificações antigénicas contínuas e que possui um reservatório animal. Deste modo, no futuro, podem ocorrer novas epidemias e pandemias e a erradicação da doença será difícil de alcançar. Os vírus da gripe são bem conhecidos na técnica e descritos em mais detalhe, por exemplo, por P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, n° 12, p. S 82 a S 86, de Dezembro de 2004, com referências adicionais. Resumidamente, o genoma do vírus da gripe A consiste de oito segmentos de cadeia simples e as 1 partículas virais têm duas glicoproteínas principais na sua superfície: hemaglutinina (H) e neuraminidase (N) . Com, pelo menos, 16 subtipos de hemaglutinina diferentes (Hl a H16) e 9 de neuraminidase diferentes (NI a N9), há uma considerável variação antigénica entre os vírus da gripe.

Demonstrou-se que os vírus da gripe do tipo H5N1 do vírus da Peste Aviária infectam aves domésticas, porcos e humanos. Os vírus também podem ser transmitidos directamente de espécies aviárias para humanos (Claas et ai., Lancet 1998, 351: 472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72: 6678; Subbarao et al., Science 1998, 279: 393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Supl. 1): S26-S29). A mortalidade, em casos clínicos humanos conhecidos, aproxima-se de cerca de 50%.

Ao longo do último século, os porcos têm sido um importante vector para a pandemia da gripe. Porcos, camelos e focas, de um modo preferido, porcos, podem servir como uma "câmara de mistura" para vírus da gripe aviária e, por conseguinte, representam um potencial factor de risco para superar as barreiras de espécie das aves domésticas, o reservatório natural dos vírus da gripe, para mamíferos. Isto ocorre, normalmente, por infecções duplas dos animais susceptíveis, e. g., porco, com um vírus da gripe de mamífero estabelecido (porcino), assim como um vírus da gripe aviária. Esta infecção dupla pode criar novos vírus recombinantes que podem ser a causa de pandemia humana ou porcina. Evidência recente, contudo, indica que uma recombinação de estirpes H5 aviárias actuais com vírus da gripe de mamífero não resultará em recombinantes altamente virulentos. Por outro lado, o vírus da gripe aviária pode infectar porcos e, por mutação espontânea, pode adaptar-se a porcos. A barreira crítica 2 será superada logo que o vírus consiga causar infecções horizontais numa população de porcos (ou outro mamífero).

Todavia, uma parte importante dos porcos do Sudeste Asiático foi infectada com estirpes de vírus da gripe aviária (H5), originários de criações de aves vizinhas. Dado que essas infecções têm, até agora, sido subclínicas, podem apenas ser diagnosticadas por métodos laboratoriais e, deste modo, são frequentemente descuradas. Há um alto risco de que esses porcos infectados subclinicamente sirvam como uma oportunidade para que o virus se adapte ao sistema de mamífero, propague na população porcina e também infecte seres humanos.

As actuais vacinas da gripe incluem uma vacina de subunidade (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9-10):1223-1238; Crawford et al. , Vaccine 1999, 17 (18):2265-22 74/ Johansson et al.r Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080), vacina atenuada (Horimoto et al. , Vaccine 2004, 22 (17-18):2244-2247), vacina de ADN (Watabe et al. , Vaccine 2001, 19(31):4434-4444,) e vacina da gripe inactivada (Cao et al., Vaccine 1992, 10(4):238-242), sendo a última a mais largamente utilizada numa escala comercial (Lipatov et al., J Virol 2004, 78(17):8951-8959).

As vacinas de subunidade, hemaglutinina e neuraminidase recombinantes (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238/ Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274/ Johansson et al. , Vaccine 1999, 17 (15-16):20 73-2080), podem ser uma alternativa atractiva à vacina inactivada, embora não estejam actualmente nenhumas em utilização como vacinas comerciais. A preparação dessas vacinas é, obviamente, mais segura do que para uma vacina inactivada. Além disso, as vacinas de subunidade não produzem respostas de anticorpo a proteínas virais de gripe 3 internas e, deste modo, permitem a distinção entre animais vacinados e infectados (Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18) :2265-2274) . A proteína hemaglutinina é a glicoproteína de ligação de receptor e de fusão membranar do vírus da gripe e o alvo para anticorpos neutralizantes de infecciosidade. A proteína hemaglutinina (HA) integral do H5N1 é composta de 568 aminoácidos, com um peso molecular de 56 kDa. A molécula de HA consiste nas subunidades HA1 e HA2, com a subunidade HA1 mediando o contacto inicial com a membrana celular e HA2 sendo responsável pela fusão membranar (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63(1-2):129-136).

Os sistemas de baculovírus/célula de insecto têm sido utilizados para expressar genes de hemaglutinina isolados de subtipos da gripe aviária (Babai et al., Vaccine 1999 17 (9-10) : 1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999 17(18):2265-2274/ Johansson et al., Vaccine 1999 17 (15-16) :2073-2080,) ; Nwe et al., BMC Mircobiology 2006 6(16):doi:10.1186/1471-2180-6-16) . Contudo, essas proteínas recombinantes não parecem ser protectoras em qualquer caso ou parecem ser apenas menos eficazes para algumas espécies (Treanor et al., Vaccine 2001, 19: 1732-1737). O documento de patente Chinesa CN 1748795 divulga uma vacina contra a gripe aviária, compreendendo uma proteína H5 do vírus da gripe, em que a sequência de aminoácidos tem dois resíduos de lisina nas correspondentes posições 328 e 329. 4

Deste modo, existe uma necessidade de aumentar a disponibilidade de vacinas melhoradas e novas abordagens de vacinação para proporcionar melhores abordagens ao controlo de infecções gripais e ter um impacto positivo na carga de doença.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Antes das formas de realização da presente invenção, deverá ser notado que, como utilizado aqui e nas reivindicações anexas, salvo o contexto dite claramente o contrário, as formas singulares "um", "uma", e "o" e "a" incluem a referência plural. Deste modo, por exemplo, referência a "uma preparação" inclui uma pluralidade dessas preparações; referência ao "veiculo" é uma referência a um ou mais veículos e equivalentes conhecidos dos especialistas na técnica e assim por diante. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados como geralmente compreendido por alguém com conhecimentos gerais na técnica a que esta invenção pertence. Todas as gamas e valores proporcionados podem variar de 1 a 5%, salvo indicado em contrário ou conhecido, em contrário, pelo especialista na técnica, por conseguinte, o termo "cerca de" foi omitido da descrição. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou verificação da presente invenção, são agora descritos os métodos, dispositivos e materiais preferidos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência, para efeitos de descrição e divulgação das substâncias, excipientes, veículos e metodologias como referidos nas publicações que possam ser utilizadas em relação à invenção. Nada disto deve ser interpretado como um reconhecimento de que a 5 invenção nao antecipa essa divulgação em virtude de invenção anterior. A solução para o problema técnico acima é alcançada pela descrição e formas de realização caracterizadas nas reivindicações. A presente invenção refere-se a compostos, composições, kits e métodos como definidos pelas reivindicações.

Proteínas gripais e moléculas de ácido nucleico que as codificam A presente divulgação refere-se a uma proteína H5 do vírus da gripe, em que a proteína H5 tem o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N° : 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+) . De um modo preferido, essa proteína H5 e qualquer proteína H5 adicional, de acordo com a divulgação é uma proteína H5 isolada. Verificou-se surpreendentemente que as proteínas H5, que têm as modificações descritas acima, são altamente antigénicas em comparação com proteínas H5 que não têm os correspondentes aminoácidos na posição 223 e 328/329. 0 termo "hemaglutinina 5 (H5)" ou "H5 do vírus da gripe aviária" ou "proteína H5", como aqui utilizado, significa mas não está limitado a qualquer proteína H5 de ocorrência natural e quaisquer formas modificadas da proteína H5, incluindo qualquer mutante de deleção, substituição e/ou inserção da proteína H5, 6 em que as proteínas H5 têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+. A numeração das posições de aminoácido da proteína H5, como aqui utilizada, refere-se à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1. A SEQ ID N°: 1 representa a sequência amino da hemaglutinina da estirpe pato/China/E319-2/03, mas desprovida do péptido sinal amino terminal. Por outras palavras, se for feita referência ao aminoácido na posição 223 (aminoácido 223), pretende-se significar o resíduo de aminoácido que corresponde ao aminoácido 223 da SEQ ID N°: 1. Contudo, tal não significa que as proteínas H5 de acordo com a divulgação tenham a sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID N°: 1. Apenas refere que os correspondentes aminoácidos da proteína H5 de acordo com as invenção, codificam para o resíduo de aminoácido, como explicitamente mencionado. No presente caso, o aminoácido 223 seria Serina (S) . Os termos "223N" ou "155N" significam, de modo exemplif icativo, que o aminoácido nas posições 223 e 155, respectivamente - numeração de acordo com as posições de aminoácido da SEQ ID N°: 1 - deverão codificar para o aminoácido Asparagina (N) . Por outras palavras, se for feita referência a "proteína H5 que tem o aminoácido 223N", uma molécula de aminoácido de H5 que normalmente codifica para Serina na posição 223 de aminoácido numeraçao de acordo com as posiçoes de aminoácido da SEQ ID N°: 1 - esse aminoácido deverá ser substituído por uma Asparagina (N) . 0 termo "328K+" ou "modificações 328K+" significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5 - numeração de acordo com as posições de aminoácido da SEQ ID N°: 1 - é inserida uma segunda Lisina (K+). Nos casos onde as sequências de aminoácidos nas posições 328 e 329 codificam naturalmente para Lisina-Lisina, não deverão ser 7

Contudo, inseridas Lisinas (K) adicionais. Contudo, a maioria das sequências de H5 conhecidas codifica nas posições de aminoácido 328 e 329 para Lisina-Arginina. Em qualquer desses casos, o termo modificação 328K+ significa que uma segunda Lisina (K) deverá ser inserida entre Lisina na posição 328 e Arginina na posição 329. A sequência modificada seria, então, lida como Lisina-Lisina-Arginina (KKR).

Deste modo, a presente divulgação refere-se à proteína H5 e quaisquer formas modificadas da proteína H5, incluindo qualquer mutante de deleção, substituição e/ou inserção da proteína H5, em que as proteínas H5 que têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+). É auto-explanatório que quaisquer das proteínas H5, como aqui proporcionadas, são antigénicas, o que significa que mostram propriedades antigénicas num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina para vírus da gripe.

De acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere a qualquer parte da proteína H5, o que significa qualquer fragmento peptídico que mostra propriedades antigénicas num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina que tem, pelo menos, o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplif icativo, na SEQ ID N° : 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+) .

Uma proteína H5 mostra propriedades antigénicas se inibir a hemaglutinação num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, por exemplo como descrito no Exemplo 2. Normalmente, a referida parte antigénica da proteína H5 compreende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 ou, de um modo muito preferido, 105 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos que codifica para a proteína H5 como mencionado acima, modificada ou não modificada, que mostra propriedades antigénicas num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, como descrito no Exemplo 2. Um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, por exemplo, também é descrito em Stephenson et al. , Virus Research vol. 103, p. 91-95 (2004), com referências adicionais. Contudo, o ensaio de Hl, como descrito no Exemplo 2, deverá ser compreendido como sendo o ensaio de referência relevante relativamente a todos os aspectos da invenção, como aqui descrito:

Resumidamente, o ensaio de Hl foi realizado para detectar a presença de anticorpos específicos de HA. Um vírus H5N2 heterólogo, A/galinha/México/232/94, foi utilizado numa concentração de quatro unidades de hemaglutinação [4 unidades HA] no ensaio de Hl. Em placas de microtitulação de fundo em U, diluições séricas duplas, em série, em PBS foram subsequentemente misturadas com volumes iguais (25 pL) contendo 4 unidades HA de vírus e incubadas à temperatura ambiente (cerca de 25 °C) , durante 30 min. Glóbulos vermelhos de galinha, a uma concentração de 0,5% em PBS, foram adicionados aos poços contendo vírus em soro e incubados, durante 40 min, à temperatura ambiente. Os títulos de Hl foram determinados como os inversos das diluições séricas mais elevadas, nas quais foi observada a inibição de hemaglutinação. 9 É de salientar que, Haesebrouck e Pensaert (1986) verificaram "que pode existir uma correlação entre os títulos de Hl contra o vírus de provocação e a protecção da provocação". Haesebrouck e Pensaert (1986) também determinaram que porcos com títulos de Hl de >40 foram "completamente resistentes a provocação e não ocorreu replicação do vírus no aparelho respiratório na provocação". Deste modo, o desenvolvimento de títulos de Hl >40 no suíno vacinado correlacionar-se-ia com protecção. (F. Haesebrouck e M.B. Pensaert, 1986) . Efeito da provocação intratraqueal de porcos de engorda anteriormente imunizados com uma vacina da gripe H1N1 inactivada (Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239-249. Tem que se assumir que títulos de Hl de H5 equivalentes ou, pelo menos, quase equivalentes, também resultarão numa protecção imunitária completa do suíno contra o vírus da gripe aviária. Títulos inferiores resultam, pelo menos, numa seroconversão dos animais vacinados e resultam em protecção imunitária parcial desses animais, o que também pode reduzir dramaticamente o risco de uma pandemia.

Além disso, uma parte antigénica da proteína H5 de acordo com a divulgação inclui, mas não está limitada a, mutantes de deleção da proteína H5, que compreende: i . pelo menos, 35, 30, 25, O CM OD \—1 15, 13, 10, 9 ou, de um modo muito preferido, 8 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos que circunda e inclui 0 aminoácido 223N; e ii. pelo menos, 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 ou, de um modo muito preferido, 8 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos que circunda e inclui a modificação de aminoácido 328K+, e 10 iii. em que qualquer dessa parte antigénica da proteína H5 mostra inibição de hemaglutinina num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, como descrito no Exemplo 2.

De um modo preferido, esses aminoácidos circundantes do aminoácido 223N e/ou 328K+ são codificados pela SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 4 .

Além disso, as proteínas H5 preferidas, de acordo com divulgação, são: i. qualquer das mencionadas acima que têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+; ii. qualquer das mencionadas acima que têm o aminoácido 94N/223N e a modificação 328K+; iii. qualquer proteína H5 de origem aviária que têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de uma ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou iv. qualquer proteína H5 de origem aviária que têm os aminoácidos 94N/223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou v. qualquer proteína H5 de origem aviária que tem os aminoácidos 155N/223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de 11 ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou vi. qualquer proteína H5 de origem aviária que tem o aminoácido 120N/155N/223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou vii. qualquer proteína H5 que tem as modificações 94N/223N e a modificação 328K+; ou viii. qualquer proteína H5 que tem as modificações 94N/155N/223N e a modificação 328K+; ou; ix. qualquer proteína H5 que tem as modificações 94N/120N/155N/223N e a modificação 328K+; ou x. qualquer proteína H5 que tem as modificações 223N, a modificação 328K+ e um ou mais dos seguintes aglomerados de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de:

a. aa 93 - 95: GNF b. aa 123 - 125: SDH c. aa 128 -130: SSG d. aa 138 - 140: GSS e. aa 226 - 228: MDF f. aa 270 - 272: EVE g. aa 309 - 311: NKL qualquer proteína H5 que tem o aminoácido 223N e a modificação 328K+ e um ou mais dos seguintes aglomerados de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de:

a. aa 93 - 95: GNF

b. aa 128 - 130: SSG 12 c. aa 138 - 140: GSS; ou xii. qualquer proteína H5 que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4.

Além disso, as proteínas H5 preferidas, como aqui proporcionadas, incluem as proteínas H5 como descritas por Hoffmann et al. , PNAS, vol. 106, n° 36, p. 12915-12920 de 6 de Setembro de 2005, em que essas proteínas H5 incluem uma ou mais das modificações como descritas acima, pelo menos, o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+).

Além disso, as proteínas H5 preferidas, como aqui proporcionadas, incluem proteínas H5 que compreendem um péptido que compreende o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+), e : i. as sequências de aminoácidos das SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 6 ou; ii. qualquer péptido que tenha, pelo menos, 85% de homologia de sequência, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de homologia de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de homologia de 13 sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 9 7% de homologia de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 98% de homologia de sequência e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de homologia de sequência com o polipéptido de i) que compreende inibição de hemaglutinina numa inibição de hemaglutinina padrão, como descrito acima; ou qualquer parte antigénica dos polipéptidos de i) ou ii) compreendendo, pelo menos, 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 ou, de um modo muito preferido, 8 aminoácidos contíguos de qualquer dos péptidos de i) ou ii). quaisquer péptidos de i), ii) ou iii) que têm os aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 12 0 S, 155N. 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, 223N ou 120N/155N. qualquer péptido de i), ii), iii) ou iv) que tem um ou mais dos seguintes aglomerados de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de: cL · cLcL 93 - 95: GNF b. aa 123 -125 : SDH c. aa 128 - 130 : SSG d. aa 138 - 140 : GSS e. aa 226 - 228 : MDF f. aa 270 - 272 : EVE g. aa 309 - 311 : NKL; iv) que tem um ou de aminoácidos qualquer péptido de i), ii), iii) ou mais dos seguintes aglomerados seleccionados do grupo consistindo de:

a. aa 93 9 5: GNF 14

b. aa 128 - 130: SSG c. aa 138 - 140: GSS. "Homologia de sequência", como aqui utilizado, refere-se a um método de determinação do parentesco de duas sequências. Para determinar a homologia de sequência, duas ou mais sequências são alinhadas, de modo óptimo e, se necessário, são introduzidas lacunas. Em contraste com identidade de sequência, quando se determina a homologia de sequência, as substituições conservativas de aminoácidos são contadas como uma correspondência. Por outras palavras, para se obter um polipéptido ou polinucleótido que tem 95% de homologia de sequência com uma sequência de referência, 85%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido, 95% dos resíduos de aminoácidos ou nucleótidos na sequência de referência devem corresponder ou compreender uma substituição conservativa com outro aminoácido ou nucleótido, ou um número de aminoácidos ou nucleótidos até 15%, de um modo preferido, até 10%, de um modo ainda mais preferido, até 5% dos resíduos de aminoácidos ou nucleótidos totais, não incluindo substituições conservativas, na sequência de referência podem ser inseridos dentro da sequência de referência. De um modo preferido, a sequência homóloga compreende, pelo menos, um segmento de 50, de um modo ainda mais preferido, de 100, de um modo ainda mais preferido, de 250, de um modo ainda mais preferido, de 500 nucleótidos. Após esse alinhamento, a homologia de sequência é averiguada numa base de posição-a-posição, e. g.r as sequências são "homólogas" numa posição particular se, nessa posição, os nucleótidos ou resíduos de aminoácidos forem idênticos. O número total dessas identidades de posição é, depois, dividido pelo número total de nucleótidos ou resíduos de aminoácidos na sequência de referência, para dar a % de homologia de sequência. A homologia de sequência pode ser facilmente calculada por 15 métodos conhecidos, incluindo mas não limitados aos descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. e Griffin, H. G., ed., Humana Press, Nova Jérsia (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M. Stockton Press, Nova Iorque (1991); e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a homologia de sequência são concebidos para proporcionarem a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a homologia de sequência são codificados em programas de computador publicamente disponíveis, que determinam a identidade de sequência entre sequências dadas. Exemplos desses programas incluem mas não estão limitados ao pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et ai., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está publicamente disponível a partir da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Estes programas alinham sequências, de um modo óptimo, utilizando ponderações predefinidas de lacuna, de modo a produzir o nível de homologia de sequência mais elevado entre as sequências dadas e de referência.

Além disso, as proteínas H5 preferidas, como aqui divulgado, incluem proteínas H5 que compreendem a modificação 328K+ como mencionada acima e a sequência de aminoácidos proporcionada na TABELA 1, ou qualquer sua parte imunogénica: 16 TABELA 1 antigénios de H5

Nome de sequência Sequência básica Posições de aminoácido# 36 83 86 120 155 156 189 212 223 263 223N/328K+ qualquer HA H5 N 36T/223N/328K+ qualquer HA H5 T N 36K/223N/328k+ qualquer HA H5 K N 83A/223N/328k+ qualquer HA H5 A N 83T/223N/328k+ qualquer HA H5 ' T ' ' ' ' ' ' N ' 83D/223N/328k+ qualquer HA H5 ' D ' ' ' ' ' ' N ' 86A/223N/328k+ qualquer HA H5 A N 86V/223N/328k+ qualquer HA H5 V N 120N/223N/328k+ qualquer HA H5 " ' " N ' ' ' ' N ' 120S/223N/328k+ qualquer HA H5 ' ' ' S ' ' ' ' N ' 155N/223N/328k+ qualquer HA H5 N N 155S/223N/328k+ qualquer HA H5 S N 17 (continuação)

Nome de sequência Sequência básica Posições de aminoácido* 36 83 86 120 155 156 189 212 223 263 156A/223N/328k+ qualquer HA H5 A N 156T/223N/328k+ qualquer HA H5 ' ' ' ' ' T ' ' N ' 189R/223N/328k+ qualquer HA H5 ' ' ' ' ' ' R ' N ' 189K/223N/328k+ qualquer HA H5 K N 212K/223N/328k+ qualquer HA H5 ' ' ' ' ' ' K N ' 212R/223N/328k+ qualquer HA H5 ' ' ' ' ' ' ' R N ' 212E/223N/328k+ qualquer HA H5 E N 223N/263A/328k+ qualquer HA H5 N A 223N/263T/328k+ qualquer HA H5 N T 120N/155N/223N/328k+ qualquer HA H5 ' N N ' ' ' N ' A/pato/China/E319-2/ 03/328k+ AAR99628 T A A S D A R K N A A/pato/China/E319-2/03 223N/328k+ AAR99628 T A A S D A R K N A A/pato/China/E319-2/03 120N/223N/328k+ AAR99628 T A A N D A R K N A A/pato/China/E319-2/03 155N/223N/328k+ AAR99628 T A A S N A R K N A 18 (continuação)

Nome de sequência Sequência Posições de aminoácido* básica 36 83 86 120 155 156 189 212 223 263 A/pato/China/E319-2/ 03_120N/155N/223N/32 8k + AAR99628 T A A S N N R K N A HA/HK/213/03/328k+ AY518362 T A A N N A R K N A HA/Vietname/1203/04 K T V S S T K R N T HA/Vietname/1203/04 223N/328k+ K T V S S T K R N T HA//Vietname/3046/04 223N/328k+ T A V S S T K R N T HA/Vietname/3062/04 223N/328k+ T A V S S T K R N T HA/galinha/Vietname/ 39/04 223N/328k+ T A V S s T K R N T HA/falcão/HK-D0028/04 223N/328k+ T A A s s A K E N A HA/pato/Singapura/3/97 223N/328k+ T D V s N A K E N A HA/HK/156/97/328k+ T A A s S A K E N T # as posições de aminoácido dadas na TABELA 1 referem-se às posições como definidas, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1. Por outras palavras, o aminoácido 223 da TABELA 1 refere-se ao aminoácido 223 da sequência da SEQ ID N°: 1. - significa que os aminoácidos nestas posições são variáveis, em comparação com a sequência de referência.

Além disso, a presente divulgação também se refere a proteínas H5 que têm, pelo menos, o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido 19 da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+) e compreende:

i. um péptido que tem as sequências de Acesso NCBI N° AAT65209 , CAJ32556, ABC47656, CAF 218 74, CAF 218 70, AAC58998, AAC58997, AAC58996, AAC58994, AAC58993, AAC58992, , AAC58991, AAC58990, AAC58995, AAS45134, AAN 17270, AAN 17269, AAN 17268, AAN 17267, AAN 17266, AAN17265, AAN17264, AAN17263, AAN17262, AAN17261, AAN17260, AAN17259, AAN17257, AAN17256, AAN17255, AAN17254, AAA43083, AAA43082, AAB19079, BAE 48696, BAE48693, BAE48696, BAE48695, BAE 48694, BAE 486 92, BAE48691, BAE48690, BAE48689, BAE 48688, BAE 4868 7, BAE48686, BAE48685, BAE48684, BAE 48683, AAC58999, ABC72 0 82, AAV 9114 9, AAP71993, AAP71992, AAP71991, AAP71990, AAP71989, AAP72011, AAP72010, AAP72009, AAP72008, AAP72007, AAP72006, AAP72005, AAP72004, AAP72003, AAP72002, AAP72001, AAP72000, AAP71999, AAP71998, AAP71997, AAP71996, AAP71995, AAP71994, AAF99718, ABF58847, AAG38534, AAC32102, AAC32099, AAL 75 8 4 7, AAC32101, AAC32098, AAC32088, AAC32078, AAR99628, AAC32100, AAM49555, AAL 75 8 43, AAL 75 83 9, AAD13573, AAD13568, AAF04720, AAF04719, AAC34263, AAR16155, AAD13574, AAD13570, AAD13575, AAD13572, AAD13569, AAD13567, AAD13566, AAK5 7506, AAG01225, AAG01215, AAG01205, AAG01195 ou ABD83813 modificadas num modo descrito acima, o que significa que essas sequências incluem as modificações 223N e 328 K+ acima mencionadas que não são parte das sequências de tipo selvagem; ou 20 ii. qualquer péptido que tenha, pelo menos, 85% de homologia de sequência, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de homologia de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de homologia de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 9 7% de homologia de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 98% de homologia de sequência e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de homologia de sequência com o polipéptido de i) e que mostra inibição de hemaglutinina numa inibição de hemaglutinina padrão, como descrito acima; ii. qualquer dos péptidos de i) ou ii) que tem os aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T ou 120N/155N; ou iv. qualquer desses péptidos de i) , ii) ou iii) que tem um ou mais dos seguintes aglomerados de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de:

a. aa 93 - 95: GNF b. aa 123 - 125 SDH c. aa 128 - 130 : SSG d. aa 138 - 140 : GSS e. aa 226 - 228 : MDF f. aa 270 - 272 : EVE g· aa 309 - 311 : NKL iv) que tem um ou de aminoácidos v. qualquer péptido de i), ii), iii) ou mais dos seguintes aglomerados seleccionados do grupo consistindo de:

a. aa 93 - 95: GNF 21

b. aa 128 - 130: SSG

c. aa 138 - 140: GSS

De acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere a moléculas de ácido nucleico que codificam para qualquer das proteínas H5, como descrito supra. De um modo preferido, essas moléculas de ácido nucleico são moléculas de ARN, ADN ou ADN(c) de cópia. Deste modo, a presente divulgação refere-se a uma molécula de ácido nucleico, de um modo preferido, uma molécula de ADNc, codificando para uma proteína H5 ou quaisquer formas modificadas da proteína H5, incluindo qualquer mutante de deleção, substituição e/ou inserção da proteína H5, em que as proteínas H5 que têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+).

De acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere a uma molécula de ácido nucleico, de um modo preferido, uma molécula de ADNc, codificando para qualquer parte da proteína H5, o que significa codificar para qualquer fragmento peptídico que mostra propriedades antigénicas num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, como descrito supra e que tem, pelo menos, o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplif icativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+) . Normalmente, essas moléculas de ácido nucleico que codificam para uma parte antigénica da 22 proteína H5, compreendem 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 ou, de um modo muito preferido, 315 nucleótidos contíguos da sequência nucleotidica que codifica para a proteína H5, como mencionada acima, modificada ou não modificada, e que mostra propriedades antigénicas num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, como aqui descrito.

Formas de realização adicionais de partes antigénicas da proteína H5 são descritas supra. É do conhecimento comum de uma pessoa com conhecimentos da técnica, construir qualquer dessas moléculas de ácido nucleico, de um modo preferido, moléculas de ADNc que codificam para a parte antigénica da proteína H5, como descrito supra. Isto também inclui mas não está limitado à construção de moléculas de ácido nucleico, de um modo preferido, de moléculas de ADNc que codificam para partes antigénicas da proteína H5, como mencionado acima, incluindo mutantes de deleção da proteína H5, que compreendem: i. pelo menos, 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 ou, de um modo muito preferido, 24 aminonucleótidos contíguos da sequência nucleotidica que circunda e inclui a sequência codificante que codifica para o aminoácido 223N; e ii. pelo menos, 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 ou, de um modo muito preferido, 24 aminonucleótidos contíguos da sequência nucleotidica que circunda e inclui a sequência codificante que codifica para a modificação 328K+, e iii. em que qualquer dessa parte antigénica da proteína H5 mostra inibição de hemaglutinina num ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, como descrito no Exemplo 2. 23

De um modo preferido, os nucleótidos circundantes dos nucleótidos que codificam para os aminoácidos 223N e/ou 328K+, codificando para a SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 4.

Além disso, as moléculas de ácido nucleico preferidas, como aqui divulgadas, codificando para a proteína H5, de acordo com a divulgação, são: i. qualquer das mencionadas supra codificando para o aminoácido 223N e a modificação 328K+; ii. qualquer das mencionadas supra codificando para o aminoácido 94N/223N e a modificação 328K+; iii. quaisquer moléculas de ácido nucleico de origem aviária codificando para o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou iv. quaisquer moléculas de ácido nucleico de origem aviária codificando para os aminoácidos 94N/223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou v. quaisquer moléculas de ácido nucleico de origem aviária codificando para os aminoácidos 155N/223N e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou vi. qualquer molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 de origem aviária que tem o aminoácido 24 120Ν/155Ν/223Ν e a modificação 328K+, em que a origem aviária significa que a sequência de H5 derivada de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de ave doméstica infectada com o vírus da gripe aviária de tipo 5; ou vii. qualquer molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 que tem as modificações 94N/223N e a modificação 328K+; ou viii. qualquer molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 que tem as modificações 94N/155N/223N e a modificação 328K+; ou; ix. qualquer molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 que tem as modificações 94N/120N/155N/223N e a modificação 328K+; ou x. qualquer molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 que tem as modificações 223N, a modificação 328K+ e um ou mais dos seguintes aglomerados de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de: a. aa 93 - 95: GNF b. aa 123 - 125 : SDH c. aa 128 - 130 : SSG d. aa 138 - 140 : GSS e. aa 226 - 228 : MDF f. aa 270 - 272 : EVE g. aa 309 - 311 : NKL; ou qualquer molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 que tem o aminoácido 223N, a modificação 328K+ e um ou mais dos seguintes aglomerados de aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de: 25

a. 3.6. 93 - 95: GNF b. 33 128 - 130 : SSG c. 33 138 - 140 : GSS xii. molécula de ácido nucleico codificando para a proteína H5 que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4.

Além disso, as proteínas H5 preferidas, como aqui proporcionadas, incluem as proteínas H5 como descritas por Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n° 36, p. 12915-12920 de 6 de

Setembro de 2005, em que essas proteínas H5 incluem uma ou mais das modificações como descritas acima, pelo menos, o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+) . Deste modo, de acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere a qualquer molécula de ácido nucleico, de um modo preferido, uma molécula de ADNc, codificando para qualquer dessas proteínas descritas por

Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n° 36, p. 12915-12920 de 6 de

Setembro de 2005, em que essas proteínas H5 incluem uma ou mais das modificações como descritas acima, pelo menos, o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se refere à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificativo, na SEQ ID N°: 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+).

Os métodos de como introduzir qualquer das modificações mencionadas acima na sequência nucleotídica, incluindo a 26 sequência codificante da proteína H5 de um vírus da gripe, são bem conhecidos na técnica. A sequência genómica do vírus da gripe integral pode ser modificada de acordo com a divulgação, por exemplo, de acordo com os métodos descritos no documento US 6951754, com referências adicionais.

Além disso, podem ser empregues técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e ADN recombinante dentro do conhecimento da técnica para modificar uma sequência de ácidos nucleicos codificando para um antigénio como aqui descrito. Essas técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, e. g., Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.; DNA Cloning: A Practical Approach,

Volumes I e II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins ed. (1985)], Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, ed. (1984)]; Animal

Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (ed.) , Current

Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994).

De acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere a um vector que compreende qualquer dessas moléculas de ácido nucleico, como descrito supra. Por outras palavras, a presente divulgação refere-se a um vector que inclui a sequência codificante de qualquer dessas proteínas H5, ou uma sua parte, como descrito supra. De um modo preferido, o referido vector é um vector de expressão que permite a expressão de qualquer dessas proteínas H5, ou uma sua parte, como descrito supra. Os vectores de acordo com a invenção são aqueles que são 27 adequados para a transfecção ou infecçao de células bacterianas, de levedura ou animais, in vitro ou in vivo.

Os vectores e métodos para preparação e/ou utilização de vectores (ou recombinantes) para expressão, podem ser pelos métodos ou análogos aos métodos divulgados em: Patentes U.S. N° 4603112, 4769330, 5174993, 5505941, 5338683, 5494807, 4722848, 5942235, 5364773, 5762938, 5770212, 5942235, 382425, publicações PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Aplicações de vectores de poxvírus a vacinação: Uma actualização, "PNAS USA 93: 11349-11353, Outubro de 1996, Moss, "Poxvírus geneticamente manipulados para expressão génica recombinante, vacinação e segurança," PNAS USA 93: 11341-11348,

Outubro de 1996, Smith et ai., Patente U.S. N° 4745051, (baculovírus recombinante), Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Protocolos de Expressão de Baculovírus" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Produção de Interferão Beta Humano em Células de Insecto Infectadas com um Vector de Expressão de Baculovírus", Molecular and Cellular Biology, Dez. de 1983, Vol. 3, N° 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Expressão Forte e Regulada de B-Galactosidase de

Escherichia coli em Células Infectadas com um Vector de Baculovírus, "Molecular and Cellular Biology, Mar. de 1984, Vol. 4, N° 3, p. 399-406; documento EPA0370573, Pedido U. S. N° 920197, apresentado em 16 de Outubro de 1986, Publicação de Patente EP N° 265785, Patente U.S. N° 4769331 (herpesvírus recombinante) , Roizman, "A função dos genes do vírus herpes simplex: Um iniciador para manipulação genética de novos vectores", PNAS USA 93:11307-11312, Outubro de 1996, Andreansky et al., "A aplicação de vírus herpes simplex geneticamente manipulados no tratamento de tumores cerebrais experimentais", PNAS USA 93: 11313-11318, Outubro de 1996, Robertson et al. 28 "Vectores do vírus de Epstein-Barr para distribuição génica a linfócitos B", PNAS USA 93: 11334-11340, Outubro de 1996, Frolov et ai., "Vectores de expressão baseados em alfavírus: Estratégias e aplicações", PNAS USA 93: 11371-11377, Outubro de 1996, Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; Patentes U. S. N° 5591439, 5552143, WO 98/00166, pedidos U. S. concedidos com os N° de Série 08/675556 e 08/675566, ambos apresentados a 3 de Julho de 1996 (adenovírus recombinante), Grunhaus et ai., 1992, "Adenovírus como vectores de clonagem", Seminars in

Virology (Vol. 3) P· 237-52, 1993, Ballay et al . EMBO Journal, vol. 4, p. 3861- -65, Graham, Tibtech 8, 85-87, Abril de 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434, documento PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994) , J. Biol. Chem. 269,2550- 2561, Science, 259: 1745-49,1993 e McClements et ai. , "A imunização com vacinas de ADN codificando glicoproteína D ou glicoproteina B, isoladamente ou em combinação, induz imunidade protectora em modelos animais de doença do vírus herpes simplex 2", PNAS USA 93: 11414-11420, Outubro de 1996, e Patentes U. S. N° 5591639, 5589466 e 5580859, assim como os documentos WO 90/11092, W093/19183, W094/21797, WO95/11307, W095/20660, Tang et al., Nature e Furth et al. Analytical Biochemistry, referente a vectores de expressão de ADN, inter alia. Ver também o documento WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expressão lentiviral); Sanford et al. , Patente U.S. N° 4945050; Fischbach et al. (Intracel), documento WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, p. 271-283 (1997), (sistemas vectores de ADN); Szoka et ai., Patente U.S. N° (método de inserção de ADN dentro de células vivas); McCormick et ai., Patente U.S. N° 5677178 (utilização de vírus citopáticos); e Patente U.S. N° 5928913 (vectores para distribuição génica), assim como outros documentos aqui citados. 29

Um vector virai, por exemplo, seleccionado de vírus de herpes de porco, tais como vírus da doença de Aujeszky, adenovírus porcino, poxvírus, especialmente vírus vaccinia, vírus da varíola aviária, vírus da varíola dos canários e vírus da varíola suína, assim como vectores de ADN (plasmídeos de ADN) são empregues, de um modo vantajoso, na prática da invenção. Métodos de produção das proteínas H5 de acordo com a presente invenção

De acordo com outro aspecto, a presente divulgação proporciona métodos de produção e/ou recuperação de elevadas quantidades de proteína H5 recombinante: i) pela permissão da infecção de células susceptíveis em cultura com um vector virai recombinante contendo sequências codificantes de ADN de H5, em que a proteína H5 é expressa pelo vector virai recombinante e ii) recuperação subsequentemente da proteína H5 a partir da cultura celular. Elevadas quantidades de proteína H5 significam mas não estão limitadas, a mais do que cerca de 20 pg/mL de cultura celular , de um modo preferido, mais do que cerca de 25 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 30 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 40 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 50 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 60 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 80 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 100 pg/mL , de um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 150 pg/mL , de um modo muito preferido, mais do que cerca de 190 pg/mL. 30

De acordo com uma forma de realização preferida, a proteína H5 é recuperada pela recolha das células SF+ integrais (i. e., intactas) expressando a proteína H5.

As células preferidas são as susceptíveis para infecção com um vector virai recombinante apropriado, contendo um ADN de H5 e expressando a proteína H5. De um modo preferido, as células são células de insecto e, de um modo mais preferido, incluem as células de insecto comercializadas sob a marca registada SF+ insect cells (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). As culturas celulares preferidas têm uma contagem celular entre cerca de 0,3 - 2,0 x 106 células/mL, de um modo mais preferido, de cerca de 0,35 - 1, 9 x 106 células/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,4 - 1,8 x 106 células/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,45 - 1, 7 x 106 células/mL e, de um modo muito preferido, desde cerca de 0,5 - 1,5 x 106 células/mL.

Os vectores virais preferidos incluem baculovírus, tal como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) , em particular desde que as células de produção sejam células de insecto. Embora o sistema de expressão de baculovírus seja preferido, é compreendido pelos especialistas na técnica que, para efeitos da presente invenção, nomeadamente a expressão de H5 para o sobrenadante de uma cultura celular, outros sistemas de expressão irão funcionar. Esses outros sistemas de expressão podem requerer a utilização de uma sequência sinal, de modo a causar a expressão de H5 para os meios.

Os meios de crescimento apropriados também serão determinados pelos especialistas na técnica, com os meios de crescimento preferidos sendo os meios de células de insecto 31 isentas de soro, tal como Exceli 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) e semelhantes.

O vector virai recombinante contendo as sequências de ADN de H5 tem uma multiplicidade de infecção (MOI) preferida compreendida entre cerca de 0 ,03 - 1,5, de um modo mais preferido, desde cerca de 0,05 - - 1,3, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,09 -1,1 e, de um modo muito preferido, desde cerca de 0,1 - 1,0, quando utilizado para a infecção das células susceptiveis. De um modo preferido, as MOI mencionadas acima referem-se a um mL de fluido de cultura de celular. De um modo preferido, o método aqui descrito compreende a infecção de 0,35 - 1,9 x 106 células/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,4 - 1,8 x 106 células/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,45 - 1, 7 x 106 células/mL e, de um modo muito preferido, desde cerca de 0,5 - 1,5 x 106 células/mL, com um vector virai recombinante contendo um ADN de H5 e expressando a proteina H5 que tem uma MOI (multiplicidade de infecção) compreendida entre cerca de 0,03 - 1,5, de um modo mais preferido, desde cerca de 0,05 - 1,3, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,09 - 1,1 e, de um modo muito preferido, desde cerca de 0,1 - 1,0.

As células infectadas são, depois, incubadas ao longo de um período de até dez dias, de um modo mais preferido, desde cerca de dois dias a cerca de dez dias, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de quatro dias a cerca de nove dias e, de um modo muito preferido, desde cerca de cinco dias a cerca de oito dias. As condições de incubação preferidas incluem uma temperatura entre cerca de 22 - 32 °c, de um modo mais preferido, desde cerca de 24 - 30 °c, de um modo ainda mais 32 preferido, desde cerca de 25 - 29 °C, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 26 - 28 °C e, de um modo muito preferido, cerca de 27 °C. De um modo preferido, após inoculação, as células SF+ são observadas para alterações características induzidas por baculovirus. Essa observação pode incluir a monitorização de tendências de densidade celular e a diminuição em viabilidade durante o período de pós-infecção. Verificou-se que o pico do título virai é observado 3-5 dias após infecção e o pico de expressão da proteína H5 nas células é obtido entre os dias 5 e 8 e/ou quando a viabilidade celular diminui para menos de 10%.

Deste modo, um aspecto da presente divulgação proporciona um método de produção e/ou recuperação da proteína H5 recombinante, de um modo preferido, nas quantidades descritas acima, i) pela permissão da infecção de um número de células susceptíveis (ver acima) em cultura com um vector virai recombinante, com uma MOI como definida acima, ii) expressão da proteína H5 pelo vector virai recombinante e iii) recuperação subsequentemente da proteína H5 a partir das células obtidas entre os dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição da viabilidade celular para menos de 10%. De um modo preferido, o vector virai recombinante é um baculovirus recombinante contendo sequências codificantes de ADN de H5 e as células, são células SF+. Além disso, prefere-se que, durante o período de pós-infecção, a cultura seja periodicamente examinada para evidência macroscópica e microscópica de contaminação ou para alterações atípicas na morfologia celular. Qualquer cultura exibindo qualquer contaminação deve ser descartada.

Para recuperação da proteína H5 que será utilizada numa composição imunogénica ou imunológica, tal como uma vacina, 33 prefere-se a inclusão de uma etapa de inactivação, de modo a inactivar o vector virai.

Uma "composição imunogénica ou imunológica" refere-se a uma composição de matéria que compreende, pelo menos, um antigénio que deduz uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imunitária de mediação celular e/ou de anticorpo para a composição ou vacina de interesse. Habitualmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou activação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T gama-delta, dirigidos especificamente a um antigénio ou antigénios incluídos na composição ou vacina de interesse. De um modo preferido, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protectora, de modo a que a resistência a nova infecção seja melhorada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Essa protecção será demonstrada por uma redução ou ausência de sintomas normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título virai diminuído no hospedeiro infectado.

Deste modo, a presente divulgação também se refere a um método de produção e/ou recuperação da proteína H5 recombinante, de um modo preferido, nas quantidades descritas acima, i) pela permissão da infecção de um número de células susceptíveis (ver acima) em cultura com um vector virai recombinante, com uma MOI como definida acima, ii) expressão da proteína H5 pelo vector virai recombinante, iii) recuperação da H5 expressa em células obtidas entre os dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição da viabilidade celular para menos de 10% e iv) inactivação do vector virai recombinante. 34

De um modo preferido, esta inactivação é realizada imediatamente antes ou imediatamente após a etapa de filtração, sendo o tempo preferido, para inactivação após a etapa de filtração. Para efeitos da presente invenção, qualquer método de inactivação convencional pode ser utilizado. Deste modo, a inactivação pode ser realizada por tratamentos químicos e/ou físicos. Em formas preferidas, o volume de fluidos de recolha é determinado e a temperatura é ajustada para entre cerca de 32 - 42 °C, de um modo mais preferido, entre cerca de 34 - 40 °C e, de um modo muito preferido, entre cerca de 35 - 39 °C. Os métodos de inactivação preferidos incluem a adição de etilenimina binária ciclizada (BEI), de um modo preferido, numa concentração de cerca de 1 a cerca de 20 mM, de um modo preferido, de cerca de 2 a cerca de 10 mM, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 2 a cerca de 8 mM, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 3 a cerca de 7 mM, de um modo muito preferido, de cerca de 5 mM. Por exemplo a inactivação inclui a adição de uma solução de bromidrato de 2-bromoetilenoamina, de um modo preferido, de cerca de 0,4 M, que tenha sido ciclizada em etilenimina binária (BEI) a 0,2 M em NaOH a 0,3 N, aos fluidos para dar uma concentração final de BEI de cerca de 5 mM. De um modo preferido, os fluidos são, depois, continuamente agitados, durante 72 - 96 horas e os fluidos de recolha inactivados podem ser armazenados congelados a -40 °C, ou menos, ou entre cerca de 1 - 7 °C. Depois de completada a inactivação, é adicionada uma solução de tiossulfato de sódio, de um modo preferido, a 1,0 M, para neutralizar qualquer BEI residual. De um modo preferido, o tiossulfato de sódio é adicionado em quantidade equivalente em comparação com a BEI adicionada antes, para inactivação. Por exemplo, no caso da BEI ser adicionada para uma concentração final de 5 mM, é adicionada uma solução de 35 tiossulfato de sódio a 1,0 M, para dar uma concentração mínima final de 5 mM, para neutralizar qualquer BEI residual.

Deste modo, um aspecto adicional da presente divulgação refere-se a um método de produção de proteína H5 recombinante, de um modo preferido, nas quantidades descritas acima, i) pela permissão da infecção de um número de células susceptíveis (ver acima) em cultura com um vector virai recombinante, com uma MOI como definida acima, ii) expressão da proteína H5 pelo vector virai recombinante, iii) recuperação da H5 expressa em células obtidas entre os dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição da viabilidade celular para menos de 10% e iv) inactivação do vector virai recombinante. De um modo preferido, o vector virai recombinante é um baculovírus contendo sequências codificantes de ADN de H5 e as células são células SF+. As etapas de inactivação preferidas são as descritas acima. De um modo preferido, a inactivação é realizada entre cerca de 35 - 39 °C e na presença de 2 a 8 mM de BEI, de um modo ainda mais preferido, na presença de cerca de 5 mM de BEI.

De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, 0 método descrito acima também inclui uma etapa de neutralização após a etapa iv) . Esta etapa v) compreende a adição de uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inactivação na solução. De um modo preferido, se o agente de inactivação for BEI, é preferida a adição de tiossulfato de sódio a uma quantidade equivalente. Deste modo, de acordo com um aspecto adicional, a etapa v) compreende a adição de uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, de um modo preferido, de cerca de 2 a cerca de 10 mM, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 2 a cerca de 8 mM, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 3 a cerca 36 de 7 mM, de um modo muito preferido, de cerca de 5 mM, quando o agente de inactivação for BEI.

Em formas preferidas e, especialmente, em formas que irão utilizar a proteína H5 recombinante numa composição imunogénica, tal como uma vacina, cada lote de proteína H5 recolhida será testado para inactivação por passagem nas células de insecto dependentes de ancoragem, susceptíveis a baculovírus, tal como células Sf9. Numa forma preferida deste teste, 150 cm2 de monocamada de cultura celular apropriada são inoculados com 1,0 mL de fluidos de H5 inactivada e mantidos a 25-29 °C durante 14 dias com, pelo menos, duas passagens. No fim do período de manutenção, as monocamadas celulares são examinadas para efeito citopatogénico (CPE) típico de H5 de baculovírus. De um modo preferido, também são utilizados controlos positivos de vírus. Esses controlos podem consistir numa cultura de células Sf9

inoculadas com uma H5 de baculovírus de referência não inactivado e um frasco de células Sf9 que permanecem não inoculadas. Após incubação e passagem, a ausência de células infectadas por vírus nos fluidos virais tratados com BEI constituiria um teste de inactivação satisfatório. As células de controlo inoculadas com o vírus de referência devem exibir CPE típico de H5 de baculovírus e o frasco não inoculado não deve exibir qualquer evidência de CPE de H5 de baculovírus. Alternativamente, no fim do período de manutenção, as amostras de sobrenadante poderiam ser recolhidas e inoculadas numa placa de 96 poços de Sf9, que foi carregada com células Sf9 e, depois, mantida a 25-29 °C, durante 5-6 dias. A placa é, depois, fixa e corada com anticorpo anti-H5 conjugado a FITC ou qualquer anticorpo marcado dirigido para proteínas específicas de baculovírus (i. e., gp64) . A ausência de CPE, expressão de H5 ou expressão de proteínas específicas de baculovírus (i. e., gp64) 37 nos fluidos virais tratados com BEI constitui um teste de inactivação satisfatório. As células de controlo inoculadas com o vírus de referência devem exibir CPE e actividade de IFA e o frasco não inoculado não deve exibir qualquer evidência de CPE de H5 de baculovírus e não conter actividade de IFA.

Deste modo, um aspecto adicional aqui descrito refere-se a um teste de inactivação para determinar a eficácia da inactivação do vector virai de recombinação expressando proteína H5, compreende as etapas: i) colocação em contacto de, pelo menos, uma porção do fluido de cultura contendo o vector virai recombinante com um agente de inactivação, de um modo preferido, como descrito acima, ii) adição de um agente de neutralização para neutralizar o agente de inactivação, de um modo preferido, como descrito acima e iii) determinação da infecciosidade residual pelos ensaios, como descrito acima.

Após inactivação, a quantidade relativa de proteína H5 recombinante numa amostra pode ser determinada de vários modos. Os métodos preferidos de quantificação incluem estudos de densitometria de SDS-PAGE, ELISA e vacinação animal que correlacionam quantidades conhecidas de vacina com resultados clínicos (serologia, etc.). Quando o SDS-PAGE é utilizado para quantificação, o material de amostra contendo uma quantidade desconhecida de proteína H5 recombinante é corrido num gel, juntamente com amostras que contêm quantidades conhecidas diferentes de proteína H5 recombinante. Uma curva-padrão pode ser, depois, produzida com base nas amostras conhecidas e a quantidade de H5 recombinante na amostra desconhecida pode ser determinada por comparação com esta curva-padrão. Devido aos ELISA serem, em geral, reconhecidos como o padrão da indústria 38 para quantificação antigénica, sao preferidos para quantificação.

Vacinas compreendendo proteínas H5 ou moléculas de ácido nucleico ou vectores que as codificam

De acordo com um aspecto adicional, a presente divulgação refere-se em geral a vacinas ou composições farmacêuticas que compreendem, i. uma ou mais das proteínas H5 como aqui descritas; ii. uma ou mais das moléculas de ácido nucleico, como aqui descrito, codificando para qualquer dessas proteínas H5; e/ou iii. um ou mais dos vectores, como aqui descritos, incluindo qualquer dessas moléculas de ácido nucleico e codificando para qualquer dessas proteínas H5, como aqui descritas; e iv. um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável. 0 termo "composição farmacêutica", "Composição farmacêutica/de vacina", como aqui descrito, inclui mas não está limitado a vacinas para a redução ou prevenção de uma infecção ou a uma composição de matéria para o tratamento e diminuição de uma infecção. A preparação de vacinas à base de ácido nucleico, de um modo preferido, vacinas de ADNc, codificando para hemaglutinina da gripe é descrita, por exemplo, em Deck et al., Vaccine 1997; 15(1):71-78/ Ulmer et al., Science 1993; 259:1745-1749; Ulmer et al. , Vaccine 1994; 12 (16):1541-1544. Qualquer desses métodos pode ser utilizado para a produção de vacinas à base de ácido 39 nucleico, de um modo preferido, vacinas de ADNc, codificando para uma proteína H5 da gripe, como aqui descrito.

Além disso, uma vacina que compreende proteína H5, ou as suas partes, como aqui descrito, pode ser produzida por abordagens convencionais, e. g., por técnicas de expressão recombinante ou por técnicas bioquímicas de purificação e separação. As técnicas de expressão recombinante, incluindo a expressão em células de insecto, são bem conhecidas na matéria e descritas, por exemplo, em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D. N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins ed. (1985)],

Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, ed. (1984)]} Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)];

Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984,); F. M. Ausubel et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994). São exemplos adicionais de sistemas de expressão recombinante bem estabelecidos, sistemas de expressão bacteriana, tais como E. coli ou B. subtilis, sistemas de expressão baseados em levedura, tais como S. cerevisiae ou S. pombe, ou sistemas de expressão de células de mamífero, tais como os sistemas de expressão baseados em BHK-, CHO- e/ou NSO. Esses sistemas são bem conhecidos na técnica e, em geral, disponíveis, e. g., comercialmente através da Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Paio Alto, Califórnia 94303-4607, EUA. Estratégias de expressão adicionais são, por exemplo, descritas em Luschow et al., Vaccine n° 19 (2001), p. 4249-4259, ou Veit et al., PNAS vol. 103 (2006), 40 ρ. 8197-8202. Além disso, os sistemas recombinantes de vírus adeno-associado estão bem estabelecidos e, por exemplo, descritos nos documentos US 5436146 ou W0200203872, com referências adicionais. Além disso, os sistemas de expressão baseados em vírus vaccinia (varíola) , por exemplo como descritos no documento US 6265183, com referências adicionais, também estão bem estabelecidos e adequados para produzir antigénio(s) recombinante(s) , composição ou composições antigénica(s), como utilizado de acordo com a invenção. Os sistemas de expressão adequados adicionais fazem utilização de popovavírus recombinantes, tais como SV40, vírus da varíola aviária, vírus da pseudo-raiva e retrovírus.

As composições farmacêuticas/de vacina relevantes, como aqui descrito, também podem compreender vírus inactivado que compreende a proteína H5, como aqui descrito, uma versão apatogénica de um vírus vivo compreendendo a proteína H5, como aqui descrito, preparação e/ou fragmentos de um vírus, em que a referida preparação e/ou fragmento compreende a proteína H5, como aqui descrito. 0 especialista conhece componentes adicionais que podem estar compreendidos nas referidas composições/vacinas, juntamente com antigénio (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ., Easton). 0 especialista pode utilizar soluções estéreis injectáveis, fisiologicamente aceitáveis, conhecidas. Para a preparação de uma solução pronta-a-utilizar, estão facilmente disponíveis soluções aquosas isotónicas, tais como, e. g., solução salina ou soluções proteicas plasmáticas correspondentes. A composição farmacêutica/de vacina pode estar presente como liofilizados ou preparações secas, que podem ser reconstituídos com uma solução 41 injectável conhecida directamente antes da utilização sob condições estéreis, e. g., como um kit de componentes.

Além disso, as composições farmacêuticas/de vacina da presente divulgação podem incluir um ou mais veículos veterinariamente aceitáveis. Como aqui utilizado, "um veículo veterinariamente aceitável", inclui mas não está limitado a, todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes da adsorção e semelhantes.

Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e semelhantes. Os agentes isotónicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetracético, entre outros.

Um conservante, como aqui utilizado, refere-se a um agente activo antimicrobiológico, tais como, por exemplo, Gentamicina, Mertiolato e semelhantes. Em particular, a adição de um conservante é muito preferida para a preparação de uma composição multidose. Os agentes activos antimicrobiológicos são adicionados em concentrações eficazes para prevenir a composição de interesse de qualquer contaminação microbiológica ou para inibição de qualquer crescimento microbiológico na composição de interesse. "Adjuvantes", como aqui utilizado, pode incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, e. g., Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica 42

Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão de água-em-óleo, emulsão de óleo-em-água, emulsão de água-em-óleo-em-água.

Em particular a emulsão pode ser baseada em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopeia Europeia); óleo isoprenóide, tais como esqualano ou escaleno; óleo resultante da oligomerização de alcenos, em particular, de isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquilo linear, de um modo mais particular óleos vegetais, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenoglicol, gliceril-tri-(caprilato/caprato) ou dioleato de propilenoglicol; ésteres de ácidos gordos ramificados ou álcoois, em particular ésteres de ácido isoesteárico. 0 óleo é utilizado em combinação com emulsíonantes para formar a emulsão. Os emulsionantes são, de um modo preferido, surfactantes não iónicos, em particular ésteres de sorbitano, de manida (e. g., oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenoglicol e de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxisteárico que são, opcionalmente, etoxilados e copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NI, p. 51-94 (1995) e Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). São exemplos de emulsões de óleo-em-água adequadas adjuvantes baseados em Emulsigen, tais como EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, EUA) . Verificou-se, surpreendentemente, que as composições farmacêuticas/de vacina que compreendem a proteína H5, de um modo preferido, proteína H5 recombinante, como aqui descrito, foram eficazmente adjuvanteadas com emulsões de óleo-em-água, de um modo preferido, com esses adjuvantes 43 baseados em Emulsigen, de um modo mais preferido, com EMULSIGEN® e EMULSIGEN-D®.

Além disso, é possível utilizar a emulsão SPT, descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", editado por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995 e a emulsão MF59 descrita na página 183 deste mesmo livro. É um exemplo adicional de um adjuvante, um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros de anidrido maleico e derivado alcenilo. São compostos adjuvantes vantajosos, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmente com éteres de polialcenilo de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbómero (Phameuropa Vol. 8, N° 2, Junho de 1996). Os especialistas na técnica também podem reportar-se à Patente U.S. N° 2909462, que descreve esses polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hidroxilado que tem, pelo menos, 3 grupos hidroxilo, de um modo preferido, não mais de 8, os átomos de hidrogénio de, pelo menos, três hidroxilos sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados que têm, pelo menos, 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são os que contêm desde 2 a 4 átomos de carbono, e. g., vinilos, alilos e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem conter, eles mesmos, outros substituintes, tal como metilo. Os produtos comercializados com o nome Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. São reticulados com uma sacarose alílica ou com pentaeritritol alílico. De entre estes, podem mencionar-se Carbopol 974P, 934P e 971P. É muito preferida a utilização de Carbopol 971P. De entre os copolímeros de anidrido maleico e derivado alcenilo, os copolímeros EMA (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maleico e etileno. A dissolução destes polímeros em água conduz a uma solução ácida 44 que será neutralizada, de um modo preferido, para pH fisiológico, de modo a dar a solução de adjuvante, dentro da qual será incorporada a própria composição imunogénica, imunológica ou de vacina.

Adjuvantes adequados adicionais incluem mas não estão limitados ao sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), Copolímero em bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil-lipido A, adjuvante de lípido-amina Avridine, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante ou outra), toxina da cólera ou dipéptido muramilo, entre muitos outros.

De um modo preferido, o adjuvante é adicionado numa quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. De um modo ainda mais preferido, o adjuvante é adicionado numa quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. De um modo ainda mais preferido, o adjuvante é adicionado numa quantidade de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose. De um modo ainda mais preferido, o adjuvante é adicionado numa quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose. De um modo muito preferido, o adjuvante é adicionado numa quantidade de cerca de 1 mg por dose.

As composições farmacêuticas/de vacina podem ainda incluir um ou mais outros agentes imunomodulatórios, tais como, e. g., interleucinas, interferões ou outras citocinas. As composições farmacêuticas/de vacina também podem incluir Gentamicina e Mertiolato. Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção possam ser facilmente determinadas pelo especialista, a presente divulgação contempla composições compreendendo desde cerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante e, de um modo preferido, cerca de 45 250 pg/1 mL de dose da composição de vacina. Noutra forma de realização preferida, a presente divulgação contempla composições de vacina compreendendo desde cerca de 1 pg/mL a cerca de 60 pg/mL de antibióticos e, de um modo mais preferido, menos de cerca de 30 pg/mL de antibióticos.

Deste modo, de acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo i. uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das proteínas H5 do vírus da gripe, como aqui descrito, em que a proteína H5 que tem o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posições de aminoácido da proteína H5 se referem à posição de aminoácido como dada, de modo exemplificaiivo, na SEQ ID N° : 1 e em que a modificação 328K+ significa que na posição 328 de aminoácido da proteína H5, é inserida uma segunda Lisina (K+); e ii. adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, como descrito acima.

De um modo preferido, o adjuvante é seleccionado do grupo consistindo de: a) EMULSIGEN®, uma emulsão de óleo-em-água (o/a); b) EMULSIGEN-D®, uma óleo-em-água (o/a) com brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA); c) um Polygen, um copolímero d) EMULSIGEN-P®, uma óleo-em-água (o/a) com um imunoestimulante proprietário e) Carbigen é um polímero reticulado 46 f) EMULSIGEN-7 5®, adjuvantes duplos compostos por uma óleo-em-água (o/a) com um polímero reticulado g) ISA 70 é uma água-em-óleo (a/o)

De um modo muito preferido, os adjuvantes são uma emulsão de óleo-em-água, tal como um adjuvante baseado em emulsigen, seleccionado do grupo consistindo de EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75®, EMULSIGEN® e EMULSIGEN-P®. De um modo muito preferido, EMULSIGEN® e EMULSIGEN-P® são utilizados na formulação da divulgação actual.

De acordo com um aspecto adicional, as composições farmacêuticas/de vacina, como aqui proporcionadas, compreendem um ou mais antigénios. De um modo preferido, esse antigénio adicional é um antigénio de um patogénio de ave doméstica ou mamífero. De acordo com formas de realização adicionais, esse antigénio adicional é um antigénio da gripe adicional, tais como hemaglutinina H3, H7, H9 ou qualquer outra hemaglutinina do vírus da gripe. 0(s) antigénio(s) adicional ou adicionais podem ser adicionado(s) numa forma purificada, como parte de uma preparação antigénica, na forma de um microorganismo morto ou na forma de um microorganismo vivo modificado. O termo "antigénio", como aqui utilizado, significa mas não está limitado a péptidos, polipéptidos, glicopéptidos ou polissacáridos que são capazes de interagirem, de modo específico, com uma molécula de reconhecimento antigénico do sistema imunitário, tal como um receptor antigénico de imunoglobulina (anticorpo) ou célula T, de modo a deduzir, activar ou estimular uma resposta imunitária dirigida ao referido antigénio num hospedeiro ao qual o referido antigénio é administrado. O termo "antigénio" também se refere a moléculas de ácido nucleico, de um modo preferido, moléculas de ADN ou ARN, cada qual codifica e expressa um péptido, polipéptido ou glicopéptido que é capaz de interagir, de modo especifico, com uma molécula de reconhecimento antigénico do sistema imunitário, tal como um receptor antigénico de imunoglobulina (anticorpo) ou célula T, de modo a deduzir, activar ou estimular uma resposta imunitária contra o antigénio que é codificado pela molécula de ácido nucleico. 0 antigénio utilizado para a preparação da composição farmacêutica que é utilizada de acordo com a divulgação é um microorganismo ou uma parte antigénica e/ou preparação do referido microorganismo. A este respeito, o termo "imunização", como aqui utilizado, significa mas não está limitado a qualquer causa ou estimulação de uma resposta imunitária. 0 termo "resposta imunitária" já está descrito supra.

As estratégias de administração para vacinas da gripe são bem conhecidas na técnica. As estratégias de vacinação mucosal para vacinas de vírus inactivados e atenuados estão contempladas. Embora a mucosa possa ser visada por distribuição local de uma vacina, diversas estratégias têm sido empregues para distribuir proteínas imunogénicas na mucosa.

Numa forma de realização específica, a vacina pode ser administrada numa mistura ou como um conjugado ou proteína de fusão quimérica com toxina da cólera, tais como toxina B da cólera ou uma quimera da toxina A/B da cólera (Hajishengallis, J Immunol., 154:4322-32, 1995/ Jobling e Holmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992). As vacinas mucosais baseadas na utilização da subunidade B da toxina da cólera foram descritas (Lebens e Holmgren, Dev Blol Stand 82:215-27, 1994). Noutra forma de 48 realizaçao, uma mistura com enterotoxina termolábil (LT) pode ser preparada para vacinação mucosal.

Outras estratégias de imunização mucosal incluem encapsulamento do vírus em microcápsulas (documentos US 5075109, US 5820883 e US 5853763) e utilizando um veículo membranoso de imunopotenciação (documento WO 98/0558). A imunogenicidade de imunogénios oralmente administrados pode ser melhorada pela utilização de glóbulos vermelhos (rbc) ou espectros de rbc (documento US 5643577) ou pela utilização de antigénio da língua azul (documento US 5690938).

De acordo com outro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a preparação de uma composição farmacêutica/de vacina, como descrito acima, de um modo preferido, um método para produção de uma vacina que compreende uma proteína H5 recombinante, expressa em baculovírus, como descrito supra. Em geral, este método inclui as etapas de transfecção de uma construção para dentro de um vírus, em que a construção compreende i) ADNc de H5 recombinante, como aqui descrito, ii) infecção de células em meios de crescimento com o vírus transfectado, iii) causar a expressão da proteína H5 recombinante pelo vírus, como aqui descrito, iv) recuperação da proteína H5 expressa a partir da cultura v) e preparação da composição pela mistura com a proteína H5 expressa com um adjuvante adequado e/ou outro veículo farmaceuticamente aceitável. São adjuvantes preferidos os descritos acima. Deste modo, de acordo com um aspecto adicional, o método para preparação de uma composição antigénica, tal como, por exemplo, uma vacina, para invocação de uma resposta imunitária contra infecções 49 gripais compreende i) a preparação e recuperação da proteína H5 e ii) a mistura desta com adjuvantes adequados.

Além disso, a composição de vacina da presente divulgação também pode incluir diluentes, agentes isotónicos, estabilizantes e/ou conservantes. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e semelhantes. Os agentes isotónicos podem incluir sais inorgânicos ou orgânicos, e. g., cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, sacáridos, trealose, manitol, sacarose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetracético, entre outros. São adjuvantes adequados os descritos acima.

Utilização medicinal de qualquer dessas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico, vectores e vacinas

As proteínas H5, como aqui proporcionadas, as moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, os vectores compreendendo qualquer dessas moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, como aqui descrito e qualquer composição farmacêutica/de vacina compreendendo qualquer dessas proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vector podem ser utilizados como um medicamento, de um modo preferido, para o tratamento e profilaxia de infecções, causadas pelo vírus da gripe, de um modo muito preferido, pelo vírus da gripe A. As proteínas H5, como aqui proporcionadas, as moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, os vectores compreendendo qualquer dessas moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, como aqui descrito, e qualquer composição 50 farmacêutica/de vacina compreendendo qualquer dessas proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vector, como aqui descrito, podem ser utilizados para o tratamento ou profilaxia de seres humanos, assim como em medicina veterinária. Quando utilizado em medicina veterinária, prefere-se o tratamento de aves domésticas, de um modo preferido, ave, galinha, pato, peru e semelhantes, assim como mamíferos, de um modo preferido, porcos, gado vacum, cavalos, focas, camelos, cães, gatos, hámsteres, murganhos e semelhantes.

Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação refere-se à utilização das proteínas H5, como aqui proporcionadas, às moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, aos vectores compreendendo qualquer dessas moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, como aqui descrito, e quaisquer composições farmacêuticas/de vacina compreendendo qualquer dessas proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vector, como aqui descrito, podem ser utilizados como um medicamento, de um modo preferido, como um medicamento para seres humanos e/ou como medicina veterinária.

Além disso, as proteínas H5, como aqui proporcionadas, as moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, os vectores compreendendo qualquer dessas moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, como aqui descrito, podem ser utilizados para a preparação de uma composição farmacêutica, como aqui descrito, para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por gripe virai. Como mencionado acima, as composições farmacêuticas/composições de vacina podem ser utilizadas para o tratamento e/ou profilaxia de seres humanos, assim como para o 51 tratamento e/ou profilaxia de animais, tais como aves domésticas, de um modo preferido, ave, galinha, pato, peru e semelhantes, assim como mamíferos, de um modo preferido, porcos, gado vacum, cavalos, focas, camelos, cães, gatos, hámsteres, murganhos e semelhantes.

As proteínas H5, como aqui proporcionadas, as moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, os vectores compreendendo qualquer dessas moléculas de ácido nucleico codificando para qualquer dessas proteínas H5, como aqui descrito, podem ser utilizados para a preparação de uma composição farmacêutica, como aqui descrita, são adequados para o tratamento e profilaxia de infecção gripal virai que, de um modo preferido, é causada por vírus da gripe aviária, porcina ou humana ou qualquer sua combinação ou híbrido.

De acordo com um aspecto adicional, a presente divulgação também se refere a um método para o tratamento ou profilaxia de infecções por vírus da gripe, em que o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína H5, como aqui descrito, a um indivíduo que necessita desse tratamento. Além disso, a presente divulgação também se refere a um método para o tratamento ou profilaxia de infecções por vírus da gripe, em que o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer molécula de ácido nucleico ou vector de H5, como aqui descrito, que codifica para qualquer proteína H5, como aqui descrita, a um indivíduo que necessita desse tratamento. Além disso, a presente divulgação também se refere a um método para o tratamento ou profilaxia de infecções por vírus da gripe, em que o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina compreendendo qualquer dessas 52 proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vector, como aqui descrito, a um indivíduo que necessita desse tratamento. 0 indivíduo que dela necessita pode ser um ser humano, assim como um animal, de um modo preferido, ave doméstica, de um modo ainda mais preferido, ave, galinha, pato, peru ou um mamífero, de um modo preferido, porco, gado vacum, cavalo, foca, camelo, cão, gato, hámster, murganho e semelhantes.

De um modo preferido, quando se vacinam galinhas, a proteína H5, como aqui descrita, pode ser utilizada para vacinação no Io dia de idade ou mais tarde, e. g., no 10° dia, ou no Io a 10° dia, ou no 10° dia ou mais tarde.

De um modo preferido, a infecção gripal que pode ser tratada pela administração de qualquer proteína H5, a molécula de ácido nucleico ou vector codificando para qualquer dessa proteína H5, ou quaisquer composições farmacêuticas/de vacina, como aqui descrito, é causada por vírus da gripe aviária, suína ou humana ou qualquer sua combinação ou híbrido.

De acordo com outro aspecto, a presente divulgação refere-se a um kit de componentes, que compreende i) qualquer dessa proteína H5, como aqui descrita, a molécula de ácido nucleico ou vector codificando para qualquer dessa proteína H5, ou qualquer composição farmacêutica/de vacina compreendendo qualquer dessas proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vector, como aqui descrito, e ii) um folheto de embalagem indicando a utilização dessa proteína H5, molécula de ácido nucleico, vector ou vacina para o tratamento ou profilaxia de infecções causadas pelo vírus da gripe. Quando se vacinam galinhas, a proteína H5, como aqui descrita, pode ser utilizada para vacinação no dia 1 de idade ou mais tarde. 53

De acordo com uma forma de realização adicional, esse kit em componentes compreende, pelo menos, um antigénio adicional de um patogénio de ave doméstica ou mamífero e a informação de indicação da utilização medicinal, humana ou veterinária desse antigénio adicional.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos expõem materiais e processos preferidos de acordo com a presente invenção. Contudo, deve ser compreendido que estes exemplos são proporcionados apenas a título de ilustração e nada neles deve ser considerado como uma limitação do âmbito global da invenção. EXEMPLO 1

Construção de baculovírus recombinantes codificando e expressando antigénios de HA H5 0 baculovírus recombinante contendo o antigénio de H5 HA foi gerado como se segue: as sequências codificantes do H5 HA (SEQ ID N°: 2) foram quimicamente sintetizadas e subclonadas dentro do vector de transferência pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). 0 H5 HA MutK+ (SEQ ID N° : 4) foi gerado pela utilização de iniciadores oligonucleotídicos e o Kit QuikChange® Site-Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA) e subclonado dentro do vector de transferência pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) . Os plasmídeos pVL1392 contendo os genes codificando para o antigénio de H5 HA (SEQ ID N°: 2) e H5 HA MutK+ (SEQ ID N°: 4) foram, depois, 54 co-transfectados com ADN de baculovírus DiamondBac® (Sigma) para dentro de células de insecto Sf9 (BD Biosciences Pharmingen) para gerar o baculovírus recombinante contendo os genes H5 HA codificando para a SEQ ID N°: 2 e H5 HA mutK+ codificando para a SEQ ID N°: 4. Os baculovírus recombinantes contendo os genes codificando para H5 HA (SEQ ID N°: 2) e H5 HA MutK+ (SEQ ID N°: 4) foram purificados em placa e os Vírus de Sementeira Principal (MSV) foram propagados na linha celular SF+, aliguotados e armazenados a -70 °C. As células de insecto infectadas com baculovírus H5 HA, como descrito acima para gerar MSV ou Vírus de Sementeira de Trabalho, expressam o antigénio de H5 HA (SEQ ID N°: 2) e o antigénio de H5 HA MutK+ (SEQ ID N°: 4), como detectado por soro policlonal ou anticorpos monoclonais num ensaio de anticorpo fluorescente indirecto ou transferência de Western.

Depois de serem semeadas com as guantidades apropriadas de baculovírus recombinantes (H5 HA e H5 HA MutK+, respectivamente), frascos spinner contendo células SF+ (Protein Sciences, Inc., Meriden, CT) foram, depois, incubados a 27 ± 2 °C, durante 7 dias e com agitação a 100 rpm, durante esse tempo. Os frascos utilizaram tampas ventiladas para permitir a circulação do ar. A cultura de célula intacta em bruto contendo células SF+ infectadas por baculovírus e os sobrenadantes de cultura celular de cada cultura foram recolhidos. 55 EXEMPLO 2

Preparação de composições farmacêuticas (vacinas) compreendendo os antigénios de HA H5 A proteina H5 HA de célula intacta em bruto e a proteína H5 HA Mutk+, expressas em células de insecto pelo sistema de expressão baseado em baculovírus, foram recolhidas. Os baculovírus foram inactivados na presença de etilenimina binária ciclizada (BEI) a 5 mM (concentração final), entre cerca de 32 e 39 °C, durante 72 a 96 horas. Depois de completada a inactivação, foi adicionada uma solução de tiossulfato de sódio a 0,3 M, para uma concentração final de 5 mM, para neutralizar qualquer BEI residual. Após neutralização, diversos adjuvantes foram adicionados e as seguintes composições de vacina/farmacêuticas foram produzidas.

VACINAS

Nome de produto genérico 501 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen. 56

Nome de produto genérico 502 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen-D.

Nome de produto genérico 503 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Polygen.

Nome de produto genérico 504 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen-P. 57

Nome de produto genérico 505 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Carbigen.

Nome de produto genérico 506 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen-75.

Nome de produto genérico 507 Antigénio Proteína H5 HA de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante ISA 70. 58

Nome de produto genérico 508 Antigénio Proteína H5 HA mutk+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen.

Nome de produto genérico 509 Antigénio Proteína H5 HA mutK+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen-D.

Nome de produto genérico 510 Antigénio Proteína H5 HA mutK+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Polygen. 59

Nome de produto genérico 511 Antigénio Proteína H5 HA mutK+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen-P.

Nome de produto genérico 512 Antigénio Proteína H5 HA mutK+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Carbigen.

Nome de produto genérico 513 Antigénio Proteína H5 HA mutK+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante Emulsigen-75. 60

Nome de produto genérico 514 Antigénio Proteína H5 HA K+ de célula intacta em bruto, expressa em células de insecto por um sistema de expressão baseado em baculovírus. Formulação Uma vacina experimental constituída por células de insecto cultivadas e sobrenadante expressando H5 HA recombinante. A vacina tem o adjuvante ISA 70. EXEMPLO 3

Vacinação de suínos (porcos) contra a gripe aviária

1. INTRODUÇÃO 0 objectivo deste estudo foi determinar a capacidade de as vacinas experimentais, contendo um extracto em bruto de antigénio de H5 hemaglutinina (HA) recombinante, induzirem títulos de inibição de hemaglutinação (Hl) em suínos. Diversos adjuvantes foram avaliados com os antigénios de H5 HA.

Os protótipos de HA H5 avaliados neste estudo continham antigénio de H5 HA convencional ou H5 HA MutK+. 0 H5 HA convencional foi derivado de A/pato/China/E319-2 / 03, ao passo que ο H5 HA MutK+ consiste de H5 HA convencional que foi manipulado para conter três alterações de aminoácido específicas em S120N, D150N, S223N e 328mutK+. Também contém o aminoácido 94N. As alterações de aminoácido particulares em H5 HA Mut K+ resultam num H5 HA que se assemelha mais estreitamente a HA de 61 Α/ΗΚ/213/03. Pens a-se, actualmente, que a composição de aminoácido do H5 HA de A/HK/213/03 ajuda no reconhecimento de anticorpo do H5 HA. 2. CONCEPÇÃO DE ESTUDO:

Tabela 1. Visão Geral do Estudo.

Grupo Número de Porcos Protótipo de Vacina Dia 0 Dia 21 Dia 35 1 5 501 Sangrar e Vacinar Intramuscularmente (grupo braquiocefálico) por administração de 1 mL no lado ESQUERDO do pescoço.) Sangrar e Vacinar Intramuscularmente (grupo braquiocefálico) por administração de 1 mL no lado DIREITO do pescoço.) Sangrar e Terminar o Estudo 2 5 502 3 5 503 4 5 504 5 5 505 6 5 506 7 5 507 8 5 508 9 5 509 10 5 510 11 5 511 12 5 512 13 5 513 14 5 514 15 5 Nenhum Sangrar Sangrar

Os porquinhos tinham 3 semanas ± 5 dias de idade no começo do estudo. Os porquinhos eram clinicamente saudáveis no começo do estudo. As amostras sanguíneas foram obtidas nos Dias de Estudo 0, 21 e 35. 62

Todos os animais de estudo foram observados diariamente nos Dias de Estudo 1 até 35, no que respeita ao estado de saúde geral. Durante sete dias após cada vacinação, os sítios de injecção eram investigados diariamente e as reacções visíveis eram registadas. Na conclusão da fase animal do estudo no Dia de Estudo 35, todos os animais foram humanamente eutanasiados.

3. VACINAS

As vacinas 501 a 514, como descrito no EXEMPLO 2, foram utilizadas para o estudo de vacinação de porcos.

4. ENSAIO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTININA

Os suínos foram vacinados com os protótipos contendo H5 HA nos Dias 0 e 21. Os soros de suíno foram recolhidos para avaliação por ensaio de inibição de hemaglutinação (Hl) nos Dias 0, 21, 35. O ensaio de Hl foi realizado para detectar a presença de anticorpos específicos de HA. Um vírus H5N2 heterólogo, A/galinha/México/232/94, foi utilizado numa concentração de quatro unidades de hemaglutinação [4 unidades HA] no ensaio de Hl. Em placas de microtitulação de fundo em U, diluições séricas duplas, em série em PBS, foram, subsequentemente, misturadas com volumes iguais (25 pL) contendo 4 unidades HA de vírus e incubadas à temperatura ambiente (cerca de 25 °C) , durante 30 min. Glóbulos vermelhos de galinha, a uma concentração de 0,5% em PBS, foram adicionados aos poços contendo vírus em soro e incubados, durante 40 min, à temperatura ambiente. Os títulos de Hl foram determinados como inversos das diluições séricas 63 mais elevadas, nas quais foi observada a inibição de hemaglutinação.

5. RESULTADOS 0 teste de Hl utilizou o regime de Vacinação de antigénio de H5N1 oficial do governo Mexicano (A/galinha/México/232/94) [4 unidades HA] de 1 x 1 mL nos Dias 0 e 21. Títulos de Hl Dia 0 Dia 21 Dia 35 501 H5 - Emulsigen 0 0 4 502 H5 - Emulsigen-D 0 0 4 503 H5 - Polygen 0 0 0 504 H5 - Emulsigen-P 0 0 2 505 H5 - Carbigen 0 0 4 506 H5 - Emulsiqen-75 0 0 16 507 H5 ISA 70 0 0 16 508 H5 K+ - Emulsigen 0 0 128 509 H5 K+ -Emulsigen-D 0 0 64 510 H5 K+ - Polygen 0 0 16 511 H5 K+ - Emulsigen-P 0 0 0 512 H5 K+ - Carbigen 0 0 0 513 H5 K+ - Emulsigen-75 0 0 16 514 H5 K+ - ISA 70 0 4 32 Controlo Nenhum 0 0 0 BIV H5 (derivado de vírus da gripe A (A/pato/China/E319-2/03(H5N1)) BIV H5 K+ (BIV H5 mutado para incluir S120N, D155N, S223N e 328K+ adicionado) 64

Os resultados demonstram que a maioria das composições de vacina deduz uma resposta imunitária nos porcos vacinados. Em particular, a maioria das composições de vacina resulta numa seroconversão, o que significa que a maioria dos porcos vacinados desenvolveu anticorpos específicos contra o vírus da gripe aviária utilizado no ensaio de Hl. Globalmente, os resultados claramente e indubitavelmente provam que a ideia inventiva reivindicada funciona muito bem. 0 risco de infecção pandémica de porcos (animal de uma segunda espécie), com vírus da gripe aviária (patogénio de uma primeira espécie) pode ser dramaticamente reduzido pela vacinação de porcos com um antigénio relevante do vírus da gripe aviária. Tal foi claramente demonstrado. Além disso, com este conceito de vacinação, a transmissão e adaptação do vírus da gripe aviária a mamíferos, incluindo seres humanos, são dramaticamente reduzidas. Os porcos são um dos mais importantes reservatórios para patogénios aviários, incluindo o vírus da gripe aviária. Se a replicação do vírus em porcos e, por conseguinte, o risco de adaptação de gripe aviária a porcos, for dramaticamente reduzido e controlado, o risco para qualquer adaptação do vírus da gripe aviária a seres humanos também é dramaticamente reduzido. No caso onde a administração de antigénio resulte em título de Hl inferior, o que significa título inferior a 30, serão requeridos reforços adicionais com antigénio para melhorar ainda o título de Hl e para melhorar a protecção imunitária nos porcos vacinados. Por conseguinte, um título baixo não significa que não possa ser alcançada protecção, ensina apenas que, para melhorar a resposta imunitária, parecem ser requeridos reforços adicionais. 0 facto de que uma resposta imunitária poderia ser medida em porcos vacinados demonstra que a ideia inventiva subjacente à presente invenção funciona muito bem. Por outras palavras, as experiências aqui proporcionadas claramente e 65 indubitavelmente proporcionam evidência de que a ideia inventiva da presente invenção funciona. EXEMPLO 4

Vacinação de aves contra a gripe aviária 1. INTRODUÇÃO 0 objectivo deste estudo foi o de determinar a capacidade de as vacinas experimentais, contendo um extracto em bruto de antigénio de H5mutk+ hemaglutinina (H5 HA mutk+) recombinante, induzirem títulos de inibição de hemaglutinação (Hl) em galinhas. Além disso, um antigénio de H5 recombinante (H5 HA) convencional, assim como a vacina inactivada Volvac® AI (Boehringer Ingelheim Vetmedica, México) foram utilizados para controlo. Além disso, diversos adjuvantes foram avaliados com os antigénios H5 HA. 2. CONCEPÇÃO DO ESTUDO:

Aves SPF (15-25) foram vacinadas, independentemente, com diferentes vacinas experimentais, a 1 ou 10 dias de idade, por via subcutânea, com 0,5 mL na parte de trás do pescoço; durante a experiência, todas as aves foram mantidas em isoladores. Alimentação e água foram proporcionadas ad libitum. A provocação foi conduzida 31 ou 32 dias após vacinação com a estirpe da gripe aviária altamente patogénica H5N2. 66

As amostras séricas foram obtidas pelo sangramento das aves a partir da veia jugular a 15 e 30 dias pós-vacinação. Os soros obtidos foram armazenados, a 4 °C, até à realização do teste de Inibição de Hemaglutinação (Hl), como descrito no Exemplo 3, para se obterem os títulos de anticorpos. 3. VACINAS E VÍRUS DE PROVOCAÇÃO:

Quatro formulações diferentes foram avaliadas independentemente: 1. Emulsão H5HA Mut k+ oleosa convencional: O antigénio de H5 HA mutk+ foi formulado em emulsão oleosa, com base (adjuvante incompleto de Freund) nos processos da Boehringer Ingelheim Vetmedica. 2. H5HA Mut k+ da Seppic: Antigénio de H5 HA mutk+ formulado com um adjuvante não convencional (ISA 206. W/O/W, da Seppic), com base na recomendação do fornecedor. 3. Emulsão oleosa convencional de H5HA: O antigénio de H5 HA foi formulado em emulsão oleosa, com base nos processos da Boehringer Ingelheim Vetmedica (adjuvante incompleto de Freund) 4. H5HA da Seppic: Antigénio de H5 HA formulado com um adjuvante não convencional (ISA 206, W/O/W, da Seppic), com base na recomendação do fornecedor.

Uma vacina de emulsão oleosa de Gripe Aviária da Boehringer Ingelheim Vetmedica foi utilizada como controlo Volvac® AI (Boehringer Ingelheim Vetmedica, México). 67 A provocação foi conduzida em galinhas vacinadas e não vacinadas por inoculação por via intranasal, com 0,2 mL, contendo 106'7 CEID por ave, do vírus de provocação H5N2. Após a provocação, sinais e mortalidade foram registados. Dez dias pós-inoculação, todas as galinhas sobreviventes foram eutanasiadas de acordo com processos para animais de laboratório. 4. RESULTADOS:

Os resultados são descritos nas seguintes tabelas:

Vacinação, 10 dias de idade Provocação 32 dias após vacinação N° De % De mortos mortalidade 0/20 0% 0/20 0% 7/19 36,8% 2/20 10% 0/14 0% 14/14 100%

Vacinação, 1 dia de idade Formulação Provocação 31 dias após vacinação N° De mortos % De mortalidade H5HA Mut k+ da Seppic 8/25 32% Emulsão H5HA Mut k+ oleosa convencional 0/24 0% H5HA da Seppic 17/25 68% Emulsão oleosa convencional de H5HA 4/25 16% Volvac AI KV Controlo negativo 10/10 100% 68

Vacinação, 1 dia de idade (0,5 mL) Formulação De vacina Títulos de Hl 30 dias após vacinação (MG Log2) % De protecção após Provocação H5HA Mut k+ da Seppic 0, 56 68 Emulsão H5HA Mut k+ oleosa convencional 2 59 100 H5HA da Seppic 0,18 32 Emulsão oleosa convencional de H5HA 07 84 Volvac AI KV Controlo negativo

Vacinação, 10 dias de idade (0,5 mL) Títulos de Hl 30 dias após vacinação (MG Log2) % De protecção após Provocação 2, 5 100 4,3 100 1 3 63,2 kO I-1 100 co co 100 0 0 0 título sérico positivo é considerado log2 4, de acordo com padrões da OIE. Com base neste critério, os resultados serológicos foram negativos, mas foram observados alguns valores positivos quando comparados com a linha de base. Os melhores títulos serológicos são observados na vacina formulada com adjuvante de óleo e com o antigénio de H5HA Mut k+, em aves vacinadas com 1 dia de idade ou 10 dias de idade. Os títulos serológicos mais baixos foram observados no protótipo formulado com o antigénio de Seppic e de H5HA. No estudo de provocação foi observado que os protótipos de vacinas conferem protecção, particularmente com a vacina de emulsão oleosa convencional 69 formulada com o antigénio de H5HA Mut k+. A protecção mais baixa no estudo de provocação foi observada com ο H5HA da Seppic, com 68% de mortalidade. Em contraste, o titulo serológico mais elevado foi observado em aves vacinadas com 10 dias, em comparação com aves vacinadas com um dia de idade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> NOVAS PROTEÍNAS H5, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO E

VECTORES QUE AS CODIFICAM E SUA UTILIZAÇÃO MEDICINAL <13 0> Caso 1-2150 <16 0> 6 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 551 <212> PRT <213> vírus da gripe aviária <400> 1

Asp Gin Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Vai 15 10 15

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ala Gin Asp Ile 20 25 30 70

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Vai Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Vai 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gin Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Vai Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Ser Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Vai Vai Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Vai Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gin 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Vai Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 195 200 205 Leu Vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Vai Asn Gly Gin Ser Gly 210 215 220 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240 71

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile 245

Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 250 255

Vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile 260

Met Lys Ser Glu Vai Glu Tyr Gly 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr 275 280

Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro 290 295

Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 300

Tyr Vai Lys Ser Asn Lys Leu Vai 305 310

Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 315 320

Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys 325

Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 330 335

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gin 340

Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr Gly 345 350

Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly 355 360

Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 365

Ser Thr Gin Lys Ala Ile Asp Gly 370 375

Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser Ile 380

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe 385 390

Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe Asn 395 400

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn 405

Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 410 415

Phe Leu Asp Vai Trp Thr Tyr Asn 420

Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met Glu 425 430

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His 435 440

Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr 445

Asp Lys Vai Arg Leu Gin Leu Arg 450 455

Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 460 72

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 465 470 475 480

Glu Glu Ala Arg 495

Vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser 485 490

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 500 505 510

Tyr Gin Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala Leu 515 520 525

Ala Ile Met Vai Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 530 535 540

Leu Gin Cys Arg Ile Cys Ile 545 550

<210> 2 <211> 567 <212> PRT <213> vírus da gripe de pato <400> 2

Met Glu Lys Thr Vai Leu Leu Leu Ala Ile Vai Ser Leu Vai Lys Ser 15 10 15

Asp Gin Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Vai 20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ala Gin Asp Ile 35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Vai Lys 50 55 60 73

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Vai 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gin Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Vai Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Ser Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Vai Vai Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Vai Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gin 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Vai Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 210 215 220 Leu Vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Vai Asn Gly Gin Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 74

Vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Vai Glu Tyr Gly 275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320

Tyr Vai Lys Ser Asn Lys Leu Vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335

Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 370 375 380

Ser Thr Gin Lys Ala Ile Asp Gly Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser Ile 385 390 395 400

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe Asn 405 410 415

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 420 425 430

Phe Leu Asp Vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met Glu 435 440 445

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr 450 455 460

Asp Lys Vai Arg Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 465 470 475 480 75

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 485 490 495

Vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 500 505 510

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 515 520 525

Tyr Gin Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala Leu 530 535 540

Ala Ile Met Vai Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 545 550 555 560

Leu Gin Cys Arg Ile Cys Ile 565

<210> 3 <211> 568 <212> PRT <213> vírus da gripe de pato <400> 3

Met Glu Lys Ile Vai Leu Leu Phe Ala Ile Vai Ser Leu Vai Lys Ser 15 10 15

Asp Gin Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Vai 20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ala Gin Asp Ile 35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Vai Lys 50 55 60 76

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gin Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Vai Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Vai Vai Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gin 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Vai Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 210 215 220 Leu Vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gin Asn Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 77

Vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Vai Lys Ser Asn Arg Leu Vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gin Lys Ala Ile Asp Gly Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Vai Arg Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 78

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495

Ser Vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525

Thr Tyr Gin Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540

Leu Ala Ile Met Vai Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560

Ser Leu Gin Cys Arg Ile Cys Ile 565

<210> 4 <211> 568 <212> PRT <213> vírus da gripe aviária <400> 4

Met Glu Lys Thr Vai Leu Leu Leu Ala Ile Vai Ser Leu Vai Lys Ser 15 10 15

Asp Gin Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Vai 20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ala Gin Asp Ile 35 40 45

Leu Glu Lys 50

Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp 55

Leu Asp Gly Vai 60

Lys 79

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Vai 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gin Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Vai Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Ser Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Vai Vai Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Vai Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gin 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Vai Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 210 215 220 Leu Vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Vai Asn Gly Gin Asn Gly 225 230 235 240 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 80

Vai Lys

Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Vai Glu Tyr Gly 275 280 285

Asn Cys Asn Thr 290

Lys

Cys Gin 295

Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 300

Cys Pro Lys 320

Met Pro Phe His Asn Ile His 305 310

Pro Leu Thr Ile Gly Glu 315

Tyr Vai Lys Ser Asn Lys Leu Vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335

Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr 355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380

Glu Ser Thr Gin Lys Ala Ile Asp Gly Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser 385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe 405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430

Gly Phe Leu Asp Vai 435

Trp Thr

Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr 450

Leu Asp 455

Phe His Asp Ser Asn Vai 460

Lys Asn Leu

Tyr Asp Lys Vai Arg 465

Leu Gin 470

Leu Arg Asp Asn Ala Lys 475

Glu Leu Gly 480 81

Asn Gly Cys Phe Glu Phe 485 Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 490 495 Ser Vai Arg Asn Gly Thr 500 Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu 515 Ile Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser Ile Gly 520 525 Thr Tyr Gin Ile Leu Ser 530 Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala 535 540 Leu Ala Ile Met Vai Ala 545 550 Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 555 560 Ser Leu Gin Cys Arg Ile 565 Cys Ile

<210> 5 <211> 263 <212> PRT <213> Vírus da gripe aviária <400> 5

His Ala Asn Asn Trp Thr 1 5 Glu Gin Vai Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn 10 15 Vai Thr Vai Thr His Ala 20 Gin Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly 25 30 Lys Leu Cys Asp Leu Asp 35 Gly Vai Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys 40 45 Ser Vai Ala Gly Trp Leu 50 Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 55 60 82

Asn Vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile 65 70

Vai Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn 75 80

Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 85

Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His 90 95

Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe 100

Glu Lys Ile Gin Ile Ile Pro Lys 105 110

Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala 115 120

Ser Leu Gly Vai Ser Ser Ala Cys 125

Pro Tyr Gin Gly Lys Ser Ser Phe 130 135

Phe Arg Asn Vai Vai Trp Leu Ile 140

Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr 145 150

Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 155 160

Asn Gin Glu Asp Leu Leu Vai Leu 165

Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp 170 175

Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr 180

Gin Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser 185 190

Vai Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin 195 200

Arg Leu Vai Pro Lys Ile Ala Thr 205

Arg Ser Lys Vai Asn Gly Gin Asn 210 215

Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr 220

Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe 225 230 235 240

Ile Ala Pro Glu

Tyr Ala Tyr Lys Ile Vai 245 250

Lys Lys Gly Asp Ser Ala 255

Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu 260 83 <210> 6

<211> 290 <212> PRT <213> vírus da gripe de pato <400> 6

Gly Ser Ala Thr Met Glu Lys Thr 1 5

Vai Leu Leu Leu Ala Ile Vai Ser 10 15

Leu Vai Lys Ser Asp Gin Ile Cys 20

Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser 25 30

Thr Glu Gin Vai Asp Thr Ile Met 35 40

Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His 45

Ala Gin Asp Ile Leu Glu Lys Thr 50 55

His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu 60

Asp Gly Vai Lys Pro Leu Ile Leu 65 70

Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp 75 80

Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp 85

Glu Phe Ile Asn Vai Pro Glu Trp 90 95

Ser Tyr Ile Vai Glu Lys Ala Asn 100

Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro 105 110

Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu 115 120

Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile 125

Asn His Phe Glu Lys Ile Gin Ile 130 135

Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp 140

His Glu Ala Ser Ser Gly Vai Ser 145 150

Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Ser 155 160 84

Ser Ser Phe Phe Arg Asn Vai 165

Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser 180

Leu Vai Leu Trp Gly Ile His 195

Arg Leu Tyr Gin Asn Pro Thr 210 215

Leu Asn Gin Arg Leu Vai Pro 225 230

Gly Gin Ser Gly Arg Met Asp 245

Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser 260

Ala Tyr Lys Ile Vai Lys Lys 275

Vai Glu 290

Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala 170 175 Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu 185 190 Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr 205 Tyr Ile Ser Vai Gly Thr Ser Thr 220 Ile Ala Thr Arg Ser Lys Vai Asn 235 240 Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn 250 255 Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr 265 270 Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu 285

Lisboa, 2

Outubro de 2012 85

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Proteína hemaglutinina H5 do vírus da gripe compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, em que a Serina na posição 223 da SEQ ID N°: 1 é substituída por uma Asparagina e na posição 328 de aminoácido é inserida uma segunda Lisina.
2. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1, em que essa proteína hemaglut inina H5 tem a sequência da SEQ ID N°: 4.
3. Molécula de ácido nucleico, em que essa molécula de ácido nucleico codifica para a proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
4. Vacina compreendendo a. a proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, e b. um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
5. Vacina de acordo com a reivindicação 4, em que a vacina compreende, como um antigénio adicional, a proteína hemaglutinina H3, H7 ou H9 do vírus da gripe.
6. Método para a produção da proteína hemaglutinina H5 da reivindicação 1 ou 2, em que o referido método compreende as etapas: 1 a. isolamento ou amplificação do ácido nucleico que codifica para essa proteína hemaglutinina H5; b. clonagem do ácido nucleico codificando a hemaglutinina H5 num vector de expressão; c. expressão da proteína hemaglutinina H5.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o vector de expressão é um baculovírus recombinante.
8. Método para a produção da vacina compreendendo uma proteína hemaglut inina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido método compreende as etapas: a. obtenção de uma proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2; b. mistura da proteína hemaglutinina H5 da etapa a) com um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
9. Método para a produção da vacina compreendendo um ácido nucleico de hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 3, em que o referido método compreende as etapas: a. obtenção da molécula de ácido nucleico de hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 3; b. mistura da molécula de ácido nucleico de hemaglutinina H5 da etapa a) com um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
10. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, para utilização como um medicamento. 2
11. Proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, para utilização para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por gripe virai.
12. Kit de componentes, que compreende a. a proteína hemaglutinina H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, ou a vacina de acordo com a reivindicação 4 ou 5; e b. um folheto informativo, indicando a utilização dessa proteína hemaglutinina H5, molécula de ácido nucleico, vector ou vacina de a) , para o tratamento ou profilaxia de infecções causadas pelo vírus da gripe. Lisboa, 2 de Outubro de 2012 3