BRPI0718183A2 - Proteínas h5, moléculas de ácido nucleico e vetores codificando aqueles, e seu uso medicinal. - Google Patents

Proteínas h5, moléculas de ácido nucleico e vetores codificando aqueles, e seu uso medicinal. Download PDF

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS H5, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO E VETORES CODIFICANDO AQUELES, E SEU USO MEDICINAL".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo de medicina, preferi-
velmente ao campo de doenças infecciosas. Em particular a presente inven- ção refere-se a proteínas influenza, moléculas de ácido nucleico e vetores codificando aquelas proteínas, e vacinas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao uso de quaisquer tais proteínas, moléculas de ácidos nucleicos, vetores ou vacinas para o tratamento e prevenção de infecções influenza, além disso, para a prevenção de transmissão intra- e inter- espécies de vírus influenza. Antecedentes da Invenção
Infecção influenza permanece uma importante infecção em ani- mais e seres humanos. Influenza é causada por vírus que sofrem contínuas mudanças / modificações antigênicas e que possuem um reservatório ani- mal. Assim novas epidemias e pandemias podem ocorrer no futuro, e erradi- cação da doença será difícil de obter. Vírus influenza são bem-conhecidos na técnica e descritos em mais detalhes, por exemplo, por P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, no. 12, pp. S 82 a S 86 of December 2004, com ainda re- ferências. Resumidamente, o genoma do vírus influenza A consiste em oito segmentos de fita simples, e as partículas virais têm duas principais glicopro- teínas sobre sua superfície: hemaglutinina (H) e neuraminidase (N). Com pelo menos 16 diferentes subtipos de hemaglutinina (H1 a H16) e 9 diferen- tes subtipos de neuraminidase (N1 a N9), existe uma considerável variação antigênica entre vírus influenza.
Vírus influenza de tipo vírus H5N1 Fowl Plague foi demonstrado infectar aves domésticas, porcos e homem. O vírus também pode ser direta- mente transmitido a partir de espécies de aves para seres humanos (Claas et al„ Lancet 1998, 351:472; Suarez et al„ J. Virol. 1998, 72:6678; Subbarao et al., Science 1998, 279:393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Suppl. 1): S26-S29). Mor- talidade em casos clínicos humanos conhecidos a aproximadamente cerca de 50%.
No último século porcos foram um importante vetor para pande- mias de influenza. Porcos, camelos, e focas, preferivelmente porcos, podem servir como uma 'câmara de mistura' para vírus influenza de aves, e pelo que representam um potencial fator de risco para superação de obstáculos de espécies de aves domésticas, o reservatório natural de vírus influenza, para mamíferos. Isto ocorre normalmente através de infecções duplas dos animais susceptíveis, por exemplo, porco, com ambos, um mamífero (suíno) estabelecido, assim como um vírus influenza de ave. Esta infecção dupla pode criar novos vírus recombinantes que podem ser a causa de pandemias humanas ou suínas. Recente evidência pode, entretanto, indicar que uma recombinação de linhagens H5 de ave atual com vírus influenza de mamífe- ro não resultará em recombinantes altamente virulentos. Por outro lado, ví- rus influenza de ave podem infectar porcos e através de mutações espontâ- neas podem se tornar adaptados a porcos. O obstáculo crítico será superar tão logo o vírus que possa causar infecções horizontais dentro de uma popu- lação de porcos (ou outro mamífero).
Ainda, uma maior parte de porcos de Sudeste Asiático foi infec- tada com linhagens de vírus influenza (H5) de aves originando-se de criação de aves domésticas vizinhas. Na medida em que aquelas infecções têm sido até agora subclínicas, elas somente podem ser diagnosticadas através de processos de laboratório e assim são freqüentemente omitidas. Há um alto risco de que aqueles porcos infectados subclinicamente sirvam como uma oportunidade para o vírus adaptar-se ao sistema mamífero, disseminar den- tro de população suína, e também infectar seres humanos.
Atuais vacinas de influenza incluem uma vacina de subunidade (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10): 1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080); vaci- na atenuada (Horimoto et al., Vaccine 2004, 22(17-18):2244-2247), vacina de ADN (Watabe et al., Vaccine 2001, 19(31):4434-4444) e vacina influenza inativada (Cao et al., Vaccine 1992, 10(4):238-242), com a última sendo a mais amplamente usada em uma escala comercial (Lipatov et al., J Virol. 2004, 78(17):8951-8959).
Vacinas de subunidades, hemaglutinina recombinante e neura- minidase (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al„ Vaceine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al., Vaeeine 1999, 17(15-16): 2073-2080) podem ser uma alternativa atraente à vacina inativada, embora nenhuma esteja atualmente em uso como vacinas comerciais. A preparação de tais vacinas é obviamente mais segura que para uma vacina inativada. Além dis- so, vacinas de subunidades não geram respostas de anticorpos para proteínas virais influenza internas e assim permitem distinção entre animais vacinados e infectados (Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274).
Proteína hemaglutinina é a glicoproteína de fusão de membrana e ligação de receptor de vírus influenza e o alvo para anticorpos de neutrali- zação de infectividade. A inteira proteína hemaglutinina (HA) do H5N1 é composta por 568 aminoácidos, com um peso molecular de 56 kDa. A molé- cuia de HA consiste em subunidades HA1 e HA2, com a subunidade HA1 mediando contato inicial com a membrana de célula e HA2 sendo responsá- vel por fusão com membrana (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63(1-2):129-136).
Sistemas de célula de inseto / baculovírus têm sido usados para expressão de genes hemaglutinina isolados de subtipos de influenza de aves (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080); Nwe et al., BMC microbiology 2006, 6(16):doi: 10.1186/1471-2180-6-16). Entretan- to, aquelas proteínas recombinantes parecem não ser protetoras em qual- quer caso, ou somente menos eficazes pelo menos para algumas espécies (Treanor et al., Vaccine 2001, 19:1732-1737).
Assim, há uma necessidade de aumento de disponibilidade de vacinas aperfeiçoadas e novas abordagens de vacinação para provimento de melhores abordagens para controle de infecções influenza e para ter um impacto positivo sobre carga de doença. Descrição da Invenção
Antes das concretizações da presente invenção deve ser notado que como aqui usadas e nas reivindicações apostas, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem referência plural a menos que o contexto dite cla- ramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "uma preparação" inclui uma pluralidade de tais preparações; referência ao "veículo" é uma referência a um ou mais veículos e seus equivalentes conhecidos por aque- les versados na técnica, e assim por diante. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as faixas e valores dados podem variar por 1 a 5% a menos que de outro modo indicado ou de outro modo conheci- do por aqueles versados na técnica, por isso, o termo "cerca" foi omitido da descrição. Embora quaisquer processos e materiais similares ou equivalen- tes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da pre- sente invenção, os processos preferidos, dispositivos e materiais são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para o propósito de descrição e amostra de substâncias, exci- pientes, veículos, e metodologias como reportadas nas publicações que po- dem ser usadas em conexão com a invenção. Nada aqui é para ser constru- ído como uma admissão de que a invenção não é intitulada para antecipar tal exposição em virtude da invenção anterior.
A solução do problema técnico acima é obtida através da descri- ção e as realizações caracterizadas nas reivindicações. Proteínas influenza e moléculas de ácidos nucleicos codificando as mesmas A presente invenção refere-se a uma proteína H5 de vírus influ- enza, onde a proteína H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteí- na H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida. Preferivelmente, tal proteína H5 e ainda qualquer proteína H5 de acordo com a invenção é uma proteína H5 isolada. Foi surpreendentemente verificado que proteínas H5, tendo as mo- dificações descritas acima, são altamente antigênicas comparadas a proteí- nas H5 que não têm os correspondentes aminoácidos em posição 223 e 328/329.
O termo "hemaglutinina 5 (H5" ou Ή5 de vírus influenza de a- ves" ou "proteína H5" como aqui usado significa, mas não é limitado a qual- quer proteína H5 ocorrendo naturalmente e quaisquer formas modificadas de proteína H5, incluindo qualquer mutante de supressão, substituição e/ou in- serção de proteína H5, onde aquelas proteínas H5 têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+.
A numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 co- mo aqui usada refere-se à posição de aminoácidos como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1. A SEQ ID NO: 1 representa a seqüência amino da hemaglutinina de linhagem de pato/China/E319-2/03 mas carecendo de pep- tídeo sinal de terminal amino. Em outras palavras, se é feita referência ao aminoácido na posição 223 (aminoácido 223), o resíduo de aminoácido é pretendido que corresponde ao aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1. Entretan- to, isto não significa que as proteínas H5 de acordo com a invenção tenham a idêntica seqüência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1. Isto somente diz, que os correspondentes aminoácidos das proteínas H5 de acordo com a invenção codificam o resíduo de aminoácido, como explicitamente mencio- nado. No caso atual, o aminoácido 223 pode ser serina (S). Os termos "223N" ou "155N" significam exemplarmente que o aminoácido em posições 223 e 155, respectivamente - numeração de acordo com posições de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1 - devem codificar o aminoácido asparagina (N). Em outras palavras, se é feita referência à "proteína H5 tendo o aminoácido 223N", uma molécula de aminoácido H5 que normalmente codifica serina em posição de amino ácido 223 - numeração de acordo com as posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 - este aminoácido deve ser substituído por uma asparagina (Ν). O termo "328K+" ou "modificação 328K+" significa, que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 - numeração de acordo com as posições de SEQ ID NO: 1 -, uma segunda Iisina (K+) é inserida. Em ca- sos onde seqüências de aminoácidos em posições 328 e 329 codificam na- turalmente Iisina - lisina, ainda nenhuma Iisina (K) deve ser inserida. Entre- tanto, maioria de seqüências H5 conhecidas codificam em posições de ami- noácidos 328 e 329 Iisina - arginina. Em tais casos, o termo modificação 328K+ significa, que uma segunda Iisina (K) deve ser inserida entre Iisina em posição 328 e arginina em posição 329. A seqüência modificada pode ser lida então Iisina - Iisina - arginina (KKR).
Assim, a presente invenção refere-se a proteína H5 e quaisquer formas modificadas de proteína H5, incluindo qualquer mutante de supres- são, substituição e/ou inserção de proteína H5, onde aquelas proteínas H5 têm o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posi- ções de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido co- mo exemplarmente dada em SE ID NO: 1 onde a modificação 328k+ signifi- ca que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida. É autoexplanatório que qualquer uma das proteínas H5 co- mo aqui providas são antigênicas, o que significa que elas mostram proprie- dades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina para vírus influenza.
Ainda de acordo com uma concretização, a presente invenção também refere-se a qualquer parte da proteína H5, o que significa qualquer peptídeo - fragmento que mostre propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, tendo pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde a numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida. Uma proteína H5 mostra propriedades antigênicas se ela inibe
hemaglutinação em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, por exem- plo, como descrito no Exemplo 2. Normalmente a dita parte antigênica de prote- ína H5 compreende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 ou mais preferi- velmente 105 aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidos que co- difica a proteína H5 como mencionado acima, modificada ou não-modificada, que mostra propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito no Exemplo 2. Um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina, por exemplo, também é descrito em Stephenson et al., Vírus Research vol. 103, pp. 91-95 (2004) com ainda referências. Entretanto, o ensaio Hl como descrito no exemplo 2 deve ser entendido ser o ensaio referência relevante em conexão com todos os aspectos da invenção como aqui descrita.
Em resumo, ensaio Hl foi realizado para detectar a presença de anticorpos específicos de HÁ. Um vírus H5N2 heterólogo, A/galinha/méxico/ 232/94, foi usado em uma concentração de quatro unidades hemaglutinina [4 unidades HA] no ensaio Hl. Em placas de microtitulação de fundo em U diluições de soro de duas vezes seriais em PBS foram subseqüentemente misturadas com iguais volumes (25 μΙ_) contendo 4 unidades HA de vírus, e incubadas em temperatura ambiente (cerca de 25°C) por 30 minutos. Célu- las vermelhas de sangue de galinha, em uma concentração de 0,5% em PBS, foram adicionadas às cavidades contendo soro - vírus e incubadas por 40 minutos em temperatura ambiente. Os títulos Hl foram determinados co- mo recíprocas das diluições de soro mais altas nas quais foi observada inibi- ção de hemaglutinina.
De nota, Haesebrouck and Pensaert (1986) verificaram "que po- de haver uma correlação entre os títulos de Hl contra o vírus desafio e pro- teção a partir do desafio". Haesebrouck and Pensaert (1986) também deter- minaram que porcos com títulos Hl de > 40 foram "completamente resisten- tes a desafio e nenhuma replicação dos vírus ocorreu no trato respiratóriono desafio". Assim, o desenvolvimento de títulos Hl > 40 no suíno vacinado pode correlacionar a proteção (F. Haesebrouck and M.B. Pensaert, 1986). Efeito de desafio intratraqueal de porcos engordando previamente imunizados com uma vacina H1N1 influenza inativada (Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239-249. Tem de se assumir que títulos de Hl H5 equivalentes ou pelo me- nos aproximadamente equivalentes também resultarão em uma completa proteção imuno de suínos contra vírus influenza de aves. Menores títulos, pelo menos resultam em uma soroconversão dos animais vacinados e resul- ta em proteção imune parcial daqueles animais, o que também pode reduzir dramaticamente o risco de uma pandemia. Além disso, uma parte antigênica da proteína H5 de acordo com a invenção inclui, mas não está limitado a, mutantes de supressão de proteí- na H5, que compreendem:
i.pelo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, ou mais preferi- velmente 8 aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidos que cir- cunda e inclui o aminoácido 223N; e
ii. pelo menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, ou mais preferi- velmente 8 aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidos que cir- cunda e inclui a modificação de aminoácido 328K+, e
iii. onde qualquer uma de tal parte antigênica de proteína H5
mostra inibição de hemaglutinina em um ensaio padrão de inibição de he- maglutinina como descrito no Exemplo 2.
Preferivelmente, aqueles circundando aminoácidos de aminoáci- do 223N e/ou 328K+ são codificados por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.
Além disso proteínas H5 preferidas de acordo com a invenção
são:
i. qualquer uma daquelas mencionadas acima tendo o aminoáci- do 223N e a modificação 328K+;
ii. qualquer uma daquelas mencionadas acima tendo o aminoá-
cido 94N/223N e a modificação 328K+;
iii. qualquer proteína H5 de origem aviárias tendo o aminoácido 223N, e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves do- mésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou
iv. qualquer proteína H5de origem aviária tendo os aminoácidos
94N / 223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a se- qüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou
v. qualquer proteína H5 de origem aviária tendo os aminoácidos
155N/223N e a modificação 328K+, onde de origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou vi. qualquer proteína H5 de origem aviária tendo o aminoácido 120N/155N/223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou vii. qualquer proteína H5 tendo as modificações 94N/223N e a
modificação 328K+; ou
viii. qualquer proteína H5 tendo as modificações 94N/155N/223N e a modificação 328K+; ou,
ix. qualquer proteína H5 tendo as modificações 94N/120N/ 155N/223N e a modificação 328K+; ou
x. qualquer proteína H5 tendo a modificação 223N, a modifica- ção 328K+, e um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos sele- cionados do grupo consistindo em:
a. aa 93-95: GNF
b. aa 123-125
c. aa 128-130
d. aa 138-140
e. aa 226-228
f. aa 270-272 g: aa 309-311
SDH SSG GSS MDF EVE NKL; ou
xi. qualquer proteína H5 tendo o aminoácido 223N, e a modifica- ção 328K+, e um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos sele- cionados do grupo consistindo em:
a. aa 93-95: GNF
b. aa 128-130: SSG
c. aa 138-140 GSS; ou
xii. qualquer proteína H5 tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Além disso, proteínas H5 preferidas como aqui providas incluem as proteínas H5 como descritas por Hoffmann et al. PNAS, vol. 106, no. 36, pp. 12915-12920 de 6 de setembro de 2005, onde aquelas proteínas H5 in- cluem uma ou mais das modificações como descrito acima, pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde a numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ signifi- ca que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida. A exposição desta referência deve ser inteiramente aqui in- cluída por referência.
Além disso, proteínas H5 preferidas como aqui providas incluem proteínas H5 que compreendem um peptídeo que compreende o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida, e:
i. As seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 ou
6 ou;
ii. qualquer peptídeo que tenha pelo menos 85% de homologia
de seqüência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de ho- mologia de seqüência, mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de homologia de seqüência, ainda mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de homologia de seqüência, e mesmo mais preferivel- mente pelo menos cerca de 99% de homologia de seqüência ao polipeptídeo de i) que compreende inibição de hemaglutinina em uma inibição padrão de hemaglutinina; ou
iii. qualquer parte do polipeptídeo de i) ou ii) compreendendo pelo menos 35, 30, 25, 20, 18,15, 13, 10, 9, ou mais preferivelmente 8 ami- noácidos contíguos de qualquer um dos peptídeos de i) ou ii).
iv. quaisquer peptídeos de i), ii) ou iii) tendo os aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, ou 120N/155N.
v. qualquer peptídeo de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos
seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93-95: GNF b. aa 123-125: SDH c. aa 128-130: SSG d. aa 138-140: GSS e. aa 226-228: MDF f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL;
vi. qualquer peptídeo de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
a. aa 93-95: GNF b. aa 128-130: SSG c. aa 138-140 GSS
"Homologia de seqüência", como aqui usado, refere-se a um processo de determinação de relação de duas seqüências. Para determinar homologia de seqüência, duas ou mais seqüências são otimamente alinha- das, e folgas são introduzidas se necessário. Em contraste, a identidade de seqüência, substituições conservativas de aminoácidos são contadas como um emparelhamento quando determinando homologia de seqüência. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo ou polinucleotídeo tendo 95% de homologia de seqüência com uma seqüência referência, 85%, preferivel- mente 90%, mesmo mais preferivelmente 95% dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos na seqüência referência têm de emparelhar ou compreender uma substituição conservativa com um outro aminoácido ou nucleotídeo, ou um número de aminoácidos ou nucleotídeos até 15%, preferivelmente até 10%, mesmo mais preferivelmente até 5% dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos totais, não incluindo substituições conservativas, na seqüência referência podem ser inseridas na seqüência referência. Preferivelmente a seqüência homóloga compreende pelo menos um estiramento de 50, mes- mo mais preferido de 100, mesmo mais preferido de 250, mesmo mais prefe- rido de 500 nucleotídeos. Com tal alinhamento, homologia de seqüência é determinada em uma base posição-por-posição, por exemplo, as seqüências são "homólogas" em uma particular posição se nesta posição, os nucleotí- deos ou resíduos de aminoácidos são idênticos. O número total de tais iden- tidades de posições é então dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos na seqüência referência para render % de homolo- gia de seqüência. Homologia de seqüência pode ser facilmente calculada através de processos conhecidos, incluindo mas não limitado àqueles descri- tos em Computational Molecular Biology, Lesk1 A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); ComputerAnaIysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994): Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Deve- reux, J., eds., M. Stockton Press,, New York (1991); e Carillo, H. and Lip- man, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988), os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referência. Processos preferidos para determinar a homologia de seqüência são projetados para renderem o maior empare- Ihamento entre as seqüências testadas. Processos para determinar homolo- gia de seqüências são codificados em programas de computador publica- mente disponíveis que determinam identidade de seqüência entre dadas seqüências. Exemplos de tais programas incluem, mas não são limitados a, pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mo- lec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BIastX é disponível publicamente de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH1 Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referência). Estes programas alinham otimamente seqüências usando pesos de folga padrão de modo a produzirem o mais alto nível de homologia de seqüência entre as seqüências dadas e referências. Além disso, proteínas H5 preferidas que compreendem a modifi-
cação 3328K+ como mencionado acima, e a seqüência de aminoácidos pro- vida na Tabela 1, ou qualquer sua parte imunogênica. LD
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O - significa que os aminoácidos nestas posições são variáveis comparados à seqüência referência.
Além disso, a presente invenção também refere-se a proteínas H5 tendo pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328k+, onde nu- meração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modi- ficação 328k+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida, e compreende:
i. um peptídeo tendo as seqüências de NCBI Accession No. AAT6520®. CAJ32556,
A8C476Se, CAF21874, CAF21370. AAC58998, AAC5W97, AAC5®996, AAC 58 994, AAS45134 AAN17285 AAN172S9 AAA43082 ΒΑΕ4#ββ4 BAE486Í7
mcnm
AAP719m
AAC 58993, AAC58992, AACSflWI, AAC58990, AAC5Ã995,
AAN17270, AAN172SÔ, AAN17268, AANI7261, AAN17266,
AAM172!Wfc ΑΑΝΪ72Θ3, AAM17262, AAN17261, AANI7200,
AAIS117257, AAN172S6, AAN17255, AAN172S4, ΑΑΜ30β3,
AAS19079, 6Α£4ΘΘ5». ΘΑΕ4ββ93. SAE*M*6. ΒΑΕ4Φ895,
8Α£48β92, 8Α£4βθ91, BAE4889Q, 8ΑΕ4Θ68», ΒΑΕ48ββ8,
ΒΑΕ48686, 8AE4B6Ô5, ΘΑΕ48604, 0ΑΕ48ββ3, AACS8389,
AAVSi 149, ΑΑΡΤ1993, ΑΑΡ71982, ΑΑΡ71991, AAP7199Q.
ΑΑΡ72011, ΑΑΡ72010, ΑΑΡ72009, ΑΑΡ 72006. ΑΑΡ 72007,
ΑΑΡ72006, ΑΑΡ72005, ΑΑΡ72004, ΑΑΡ72003, ΑΑΡ72002, ΑΑΡ72001.
ΑΑΡ72000. ΑΑΡ?199β, ΑΑΡ71898, ΑΑΡ71Β97, ΑΑΡ71096, AAP7199S,
ΑΑΡ71994, AAF9971B, ABF58847, AAG38S34, AAC32102, AAC320&
AAL7S647, AAC32101, AAC32096. AAC32Ü8a, AAC32078, AAR99528,
AAC 32100, AAM495S5. AAL75643, AAL7M39, AAÜ13S73, AAOl 3S68,
AAF04720, AAF04719. AAC 34263. AAR10155, AAOI3574. AAD13570.
AA013575, ΑΑ013572, AAD13569. AAD13567, AAOI3SM, AAKÒ7M»,
AAC301225, AAG01215, ΑΑ00130&, AAGQittSl ou Λβοβ»ΐ3 modificado em uma ma- neira descrita acima, que significa que aquelas seqüências incluem as modi- ficações mencionadas acima 223N e 328K+ que não são parte das seqüên- cias tipo selvagem; ou
ii. qualquer peptídeo que tenha pelo menos 85% de homologia de seqüência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia de seqüência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de ho- mologia de seqüência, mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de homologia de seqüência, ainda mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de homologia de seqüência, e mesmo mais preferível- mente pelo menos cerca de 99% de homologia de seqüência ao polipeptídeo de i) e que mostra inibição de hemaglutinina em uma inibição padrão de he- maglutinina como descrito acima;
iii. qualquer um dos peptídeos de i) ou ii) tendo os aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T, ou 120N/155N; ou
iv. qualquer um dos peptídeos tais como i), ii), ou iii) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
a. aa 93-95: GNF b. aa 123-125: SDH c. aa 128-130: SSG d. aa 138-140: GSS e. aa 226-228: MDF f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL;
v. qualquer peptídeoi de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
aa 93-95: GNF aa 128-130: SSG aa 138-140 GSS.
De acordo com ainda uma concretização, a presente invenção também refere-se a moléculas de ácidos nucleicos, que codificam qualquer uma das proteínas H5 como descrito supra. Preferivelmente, aquelas molé- culas de ácido nucleico são ARN1 ADN, ou cópias de moléculas de ADN(c). Assim, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico, pre- ferivelmente uma molécula de ADNc codificando uma proteína H5 ou quais- quer formas modificadas de proteína H5, incluindo qualquer mutante de su- pressão, substituição e/ou inserção de proteína H5, onde aquelas proteínas H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácidos como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida.
De acordo com ainda uma concretização, a presente invenção também refere-se a uma molécula de ácido nucleico, preferivelmente uma molécula de ADNc codificando qualquer parte da proteína H5, o que significa codificando qualquer fragmento - peptídeo que mostre propriedades antigê- nicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito su- pra, e tendo pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modi- ficação 328K+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida. Normalmente tais moléculas de ácidos nucleicos, que codificam uma parte antigênica de proteína H5, compreen- dem 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330, ou mais preferivelmente 315 nucleotídeos contíguos da seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína H5 como mencionado acima, modificada ou não-modificada, e que mostra propriedades antigênicas em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como aqui descrito.
Ainda concretizações de partes antigênicas da proteína H5 são descritas supra. Está no conhecimento comum daqueles versados na técni- ca construir quaisquer tais moléculas de ácido nucleico, preferivelmente mo- léculas de ADNc que codificam a parte antigênica da proteína H5 como des- crito supra. Isto também inclui mas não está limitado à construção de molé- culas de ácido nucleico, preferivelmente moléculas de ADNc, que codificam partes antigênicas da proteína H5 como mencionado acima incluindo mutan- tes de supressão de proteína H5, que compreendem:
i. pelo menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, ou mais preferi- velmente 24 amino nucleotídeos contíguos da seqüência de nucleotídeos que circunda e inclui a seqüência codificante que codifica aminoácido 223N; e
ii. pelo menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, ou mais prefe- rivelmente 24 amino nucleotídeos contíguos da seqüência de nucleotídeos que circunda e inclui a seqüência codificante que codifica a modificação 328K+, e
iii. onde qualquer de tal parte antigênica de proteína H5 mostra inibição de hemaglutinina em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina como descrito no Exemplo 2.
Preferivelmente, aqueles nucleotídeos circundantes dos nucleo- tídeos, que codificam aminoácidos 223N e/ou 328K+, codificando SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4.
Além disso, moléculas de ácidos nucleicos preferidas codifican- do a proteína H5 de acordo com a invenção são:
i. qualquer uma daquelas mencionadas supra codificando o ami- noácido 223N e a modificação 328K+;
ii. qualquer uma daquelas mencionadas supra codificando o a- minoácido 94N/223N e a modificação 328K+;
iii. quaisquer moléculas de ácidos nucleicos de origem aviária codificando o aminoácido 223N, e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi origi- nalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza de aves tipo 5; ou
iv. quaisquer moléculas de ácido nucleico de origem aviária codi- ficando os aminoácidos 94N/223N e a modificação 328K+, onde de origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza aviário tipo 5; ou
v. quaisquer moléculas de ácidos nucleicos de origem aviária codificando os aminoácidos 155N/223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um isolado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza aviário tipo 5; ou
vi. qualquer molécula de ácido nucleico codificando a proteína H5 de origem aviária tendo o aminoácido 120N/155N/223N e a modificação 328K+, onde origem aviária significa que a seqüência H5 derivou de um iso- lado de vírus que foi originalmente isolado de aves domésticas infectadas com vírus influenza aviário tipo 5; ou
vii. qualquer molécula de ácido nucleico codificando proteína H5 tendo as modificações 94N/223N e a modificação 328K+; ou
viii. qualquer molécula de ácido nucleico codificando proteína H5 tendo as modificações 94N/155N/223N e a modificação 328K+; ou
ix. qualquer molécula de ácido nucleico codificando proteína H5 tendo as modificações 94N/120N/155N/223N e a modificação 328K+; ou
x. qualquer molécula de ácido nucleico codificando proteína H5 tendo as modificações 223N, a modificação 328K+, e um ou mais dos se- guintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
a. aa 93-95: GNF b. aa 123-125: SDH c. aa 128-130: SSG d. aa 138-140: GSS e. aa 226-228: MDF f. aa 270-272: EVE g: aa 309-311: NKL; ou
xi. qualquer molécula de ácido nucleico codificando proteína H5 tendo o aminoácido 223N, a modificação 328K+, e um ou mais dos seguin- tes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
a. aa 93-95: GNF b. aa 128-130: SSG c. aa 138-140 GSS, ou
xii. qualquer molécula de ácido nucleico codificando proteína H5 tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
Além disso, proteínas H5 preferidas como aqui providas incluem as proteínas H5 como descritas por Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, n- 36, pp. 12915-12920 de 6 de setembro de 2005, onde esta proteína H5 inclui uma ou mais das modificações como descrito acima, e pelo menos o amino- ácido 223N e a modificação 328K+, onde a numeração das posições de a- minoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácidos como exem- plarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida. A exposição desta referência deve ser inteiramente aqui incluída por referência. Assim, de acordo ainda com realizações, a presente invenção também refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico, preferivelmente uma molécula de ADNc codificando qualquer uma de tais proteínas descritas por Hoffmann et al., PNAS, vol. 106, 36, pp. 12915-12920 de 6 de setem- bro de 2005, onde estas proteínas H5 incluem uma ou mais das modifica- ções como descrito acima, pelo menos o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das posições de aminoácidos da proteína H5 refe- re-se à posição de aminoácido como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação K3328+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida.
Processos, de como introduzir qualquer uma das modificações mencionadas acima dentro de seqüência de nucleotídeos, incluindo a se- qüência codificante da proteína H5 de um vírus influenza, são bem- conhecidos na técnica. A seqüência genômica do inteiro vírus influenza pode ser modificada de acordo com a invenção, por exemplo, de acordo com pro- cessos descritos na patente US 6 951 754, com ainda referências.
Além disso, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, e ADN recombinante dentro do conheci- mento da técnica para modificar uma seqüência de ácidos nucleicos codifi- cando um antígeno como aqui descrito. Tais técnicas são inteiramente expli- cadas na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.: DNA Cloning: A Practical Approach, Volu- mes I e Il (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); NucIeicAcid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Ani- mal Cell Culture [R.l. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide to MolecuIarCIoning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wi- Iey & Sons, Inc. 1994).
Ainda de acordo com uma concretização, a presente invenção também refere-se a um vetor que compreende qualquer uma de tais molécu- las de ácidos nucleicos como descrito supra. Em outras palavras, a presente invenção refere-se a um vetor, que inclui a seqüência codificante de qual- quer tal proteína H5, ou sua parte como descrito supra. Preferivelmente, o dito vetor é um vetor de expressão, que permite a expressão de qualquer tal proteína H5 ou sua parte como descrito supra. Vetores de acordo com a in- venção são aqueles que são apropriados para a transfecção ou infecção de células de bactérias, levedura ou animal, in vitro ou in vitro.
Vetores e processos para fabricação e/ou uso de vetores (ou recombinantes) para expressão pode ser através de ou análogos aos pro- cessos mostrados em: patentes US 4 603 112, 4 769 330, 5 174 993, 5 505 941, 5 338 683, 5 494 807, 4 722 848, 5 942 235, 5 364 773, 5 762 938, 5 770 212, 5 942 235, 382 425, publicações PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Application of pox virus vectors to vacci- nation: An update, "PNAS USA 93:11349-11353, outubro de 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vacci- nation, and safety", PNAS USA 93: 11341-11348, outubro de 1996, Smith et al., patente US 4 745 051, (baculovírus recombinante), Richardson, C.D. (E- ditor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cel- Iular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, N2 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, Na 3, p. 399-406; EPAO 370 573, pedido de patente U.S. 920 197, deposita- do em 16 de outubro de 1986, publicação de patente EP 265785, patente US 4 769 331 (vírus recombinante de herpes), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PNAS USA 93:11307-11312, outubro de 1996, Andreansky et al., "The ap- plication of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 11313-11318, outubro de 1996, Ro- bertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, outubro 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications", PNAS USA 93: 11371- 11377, outubro 1996, Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patentes US N-s 5 591 439, 5 552 143, WO 98/00166, pedidos de patente US permiti- dos 08/675 556, e 08/675 566, ambos depositados em 3 de julho de 1996 (adenovírus recombinante), Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors", seminars in Virology (Vo. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, Vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen. Virol. 70,42434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 e MecCIements et al., "Immunization with DNA Vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93:11414-11420, outubro 1996, e patentes US Nss 5 591 639, 5 589 466, e 5 580 859 assim como WO 90/11092, W093/19183, W094/21797, W095/11307, W095/20660, Tang et al., Nature and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expres- sion vectors, inter alia. Vide também WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41:736-739, 1998 (sistema de expressão lentiviral); Sanford et al., patente US Nq 4 945 050; Fischbach et al., (INtracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology, vol. 9, pp. 271-283 (1997), (sistemas vetores de AND); Szoka et al., patente US No. (processo de inserção de AND em célu- las vivas); McCormick et al., patente US N- 5 677 178 (uso de vírus citopáti- co); e patente US N9 5 928 913 (vetores para liberação de gene), assim co- mo outros documentos aqui citados.
Um vetor viral, por exemplo, selecionado de vírus de herpes de porco, tal como vírus de doença de Aujeszky, vírus de varíola, especialmen- te vírus vaccinia, vírus avipox, vírus canarypox, e vírus de varíola suína, as- sim como vetores ADN (plasmídeos ADN) são vantajosamente empregados na prática da invenção. Processos de produção de proteínas H5 de acordo com a presente invenção De acordo com um outro aspecto, a presente invenção provê processos de produção e/ou recuperação de altas quantidades de proteína H5 recombinante: i) através de permissão de infecção de células suscetíveis em cultura com um vetor viral recombinante contendo ADN H5 codificando seqüências, onde proteína H5 é expressa pelo vetor viral recombinante, e ii) a seguir recuperando a proteína H5 de cultura de células. Altas quantidades de proteína H5 significa, mas não são limitadas a, mais que cerca de 20 μg/mL de cultura de células, preferivelmente mais que cerca de 25 μg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 30 μg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 40 μg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 50 μg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 60 μg/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 80 μg/mL, mesmo mais preferido mais que cer- ca de 100 ug/mL, mesmo mais preferido mais que cerca de 150 μg/mL, mais preferido mais que cerca de 190 μg/mL
De acordo com uma concretização preferida, a proteína H5 é recuperada através de colheita de células SF+ inteiras (isto é, intactas) ex- pressando a proteína H5.
Células preferidas são aquelas suscetíveis a infecção com apro- priado vetor viral recombinante, contendo um ADN H5 e expressando a pro- teína H5. Preferivelmente as células são células de inseto, e mais preferi- velmente, elas incluem células de insetos comercializadas sob a marca re- gistrada células de inseto SF+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Culturas de células preferidas têm uma contagem de células entre cerca de 0,3 - 2,0 χ 106 células / mL, mais preferivelmente de cerca de 0,35 - 1,9 χ 106 células / mL, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,4 - 1,8 χ 106 cé- lulas / mL, mesmo mais preferivelmente de cerca de 0,45-1,7x10® célu- las/mL, e mais preferivelmente de cerca de 0,5-1,5x10® células/mL.
Vetores virais preferidos incluem baculovírus como BacuIoGoId (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), em particular contanto que as células de produção sejam células de insetos. Embora o sistema de expres- são de baculovírus seja preferido, é entendido por aqueles versados na téc- nica que outros sistemas de expressão funcionarão para os propósitos da presente invenção, por exemplo a expressão de H5 no sobrenadante de uma cultura de células. Tais outros sistemas de expressão podem requerer o uso de uma seqüência sinal de modo a causar expressão de H5 nos meios.
Apropriados meios de crescimento também serão determináveis
por aqueles versados na técnica com os meios de crescimento preferidos sendo meios de células de insetos livres de soro como Excell 420 (JRH Bi- osciences, Inc., Lenexa, KS) e similares.
O vetor viral recombinante contendo as seqüências de ADN H5 tem uma preferida multiplicidade de infecção (MOI) de entre cerca de 0,03- 1,5, mais preferivelmente de entre cerca de 0,05-1,3, ainda mais preferivel- mente de cerca de 0,09-1,1, e mais preferivelmente de cerca de 0,1-1,0, quando usado para a infecção das células suscetíveis. Preferivelmente as MOIs mencionadas acima referem-se a um ml_ de fluido de cultura de célu- Ias. Preferivelmente, o processo aqui descrito compreende a infecção de 0,35-1,9x10® células/mL, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,4-1,8x10® células/mL, mesmo mais preferivelmente de cerca de 0,45-1,7x10® célu- las/mL, e mais preferivelmente de cerca de 0,5-1,5x10® células/mL com um vetor viral recombinante contendo um ADN H5 e expressando a proteína H5 tendo uma MOI (multiplicidade de infecção) de entre cerca de 0,03-1,5, mais preferivelmente de cerca de 0,05-1,3, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,09-1,1, e mais preferivelmente de cerca de 0,1-1,0.
As células infectadas são então incubadas sobre um período de até dez dias, mais preferivelmente de cerca de dois dias a cerca de dez dias, ainda mais preferivelmente de cerca de quatro dias a cerca de nove dias, e mais preferivelmente de cerca de cinco dias a cerca de oito dias.
Condições de incubação incluem uma temperatura entre cerca de 22-32°C, mais preferivelmente de cerca de 24-30°C, ainda mais preferi- velmente de cerca de 25-29°C, mesmo mais preferivelmente de cerca de 26- 28°C, e mais preferivelmente cerca de 27°C. Preferivelmente, as células SF+ são observadas seguindo inoculação para características alterações induzi- das por baculovírus. Tal observação pode incluir monitoramento de tendên- cias de densidade de células e a diminuição em viabilidade durante o perío- do de pós-infecção. Foi verificado que pico de título viral é observado 3-5 dias após infecção e pico de expressão de proteína H5 nas células é obtido entre dias 5 e 8, e/ou quando viabilidade de célula diminui para menos que 10%.
Assim, um aspecto da presente invenção provê um processo de produção e/ou recuperação de proteína H5 recombinante, preferivelmente em quantidades descritas acima, através de i) permissão de infecção de um número de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI como definida acima, ii) expressão de proteína H5 pelo vetor viral recombinante, e iii) a seguir recuperação de proteína H5 das células obtidas entre dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição de viabili- dade de células para menos que 10%. Preferivelmente, o vetor viral recom- binante é um baculovírus recombinante contendo ADN H5 codificando se- quências e as células são células SF+. Adicionalmente, é preferido que a cultura seja periodicamente examinada para evidência macroscópica e mi- croscópica de contaminação ou para mudanças atípicas em morfologia de célula durante o período de pós-infecção. Qualquer cultura exibindo qualquer contaminação deve ser descartada. Para recuperação de proteína H5 que será usada em uma com-
posição imunogênica ou imunológica tal como uma vacina, a inclusão de uma etapa de inativação é preferida de modo a inativar o vetor viral.
Uma "composição imunogênica ou imunológica" refere-se a uma composição de matéria que compreende pelo menos um antígeno que elicita uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imunomediada por anticorpo e/ou celular à composição ou vacina de interesse. Usualmente, uma "resposta imunológica" inclui mas não é limitada a um ou mais dos se- guintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células T gama - delta, direcionada especificamente a um antígeno ou antígenos in- cluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedei- ro mostrará uma resposta imunológica protetora ou terapêutica de modo que resistência à nova infecção será aperfeiçoada e/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada por uma redução ou falta de sintomas normalmente mostrados por um hospedeiro infectado, um tem- po de recuperação mais rápido e/ou um título viral diminuído no hospedeiro infectado.
Assim, a presente invenção também refere-se a um processo de produção e/ou recuperação de proteína H5 recombinante, preferivelmente em quantidades descritas acima, através de i) permissão de infecção de um número de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI como definida acima, ii) expressão de proteína H5 pelo vetor viral recombinante, iii) a seguir recuperação de proteína H5 das células obtidas entre dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição de viabili- dade de células para menos que 10% , e iv) inativação de vetor viral recom- binante.
Preferivelmente, esta inativação é feita justo antes ou justo após
a etapa de filtração, com após a etapa de filtração sendo o momento preferi- do para inativação. Qualquer processo de inativação convencional pode ser usado para propósitos da presente invenção. Assim, inativação pode ser realizada através de tratamentos químicos e/ou físicos. Em formas preferi- das, o volume de fluidos colhidos é determinado e a temperatura é levada para entre cerca de 32-42°C, mais preferivelmente entre cerca de 34-40°C, e mais preferivelmente entre cerca de 35-39°C. Processos de inativação prefe- ridos incluem a adição de etilenimina binária ciclizada (BEI), preferivelmente em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM, mais preferivelmente de cerca de 5 nM. Por exemplo, a inativação inclui a adição de uma solução de bromo-hidrato de 2-bromo etileno amina, preferi- velmente de cerca de 0,4 M, que foi ciclizada para etilenimina binária (BEI) 0,2 M em NaOH 0,3N, aos fluidos para render uma concentração final de cerca de BEI 5 mM. Preferivelmente, os fluidos são então continuamente agitados por 72-96 horas e os fluidos colhidos inativados podem ser estoca- dos congelados a -40°C ou abaixo ou entre cerca de 1-7°C. Após inativação ser completa uma solução de tiossulfato de sódio, preferivelmente em 1,0 M é adicionada para neutralizar qualquer BEI residual. Preferivelmente, o tios- sulfato de sódio é adicionado em quantidade equivalente comparado à BEI adicionada antes para inativação. Por exemplo, no caso de BEI ser adicio- nada para uma concentração final de 5 mM, uma solução de tiossulfato de sódio 1,0 M é adicionada para uma concentração mínima final de 5 mM para neutralizar qualquer BEI residual.
Assim, ainda um aspecto da presente invenção refere-se a um processo de produção de proteína H5 recombinante, preferivelmente em quantidades descritas acima, através de i) permissão de infecção de um número de células suscetíveis (vide acima) em cultura com um vetor viral recombinante com uma MOI como definida acima, ii) expressão de proteína H5 pelo vetor viral recombinante, e iii) a seguir recuperação de proteína H5 das células obtidas entre dias 5 e 8 após infecção e/ou diminuição de viabili- dade de células para menos que 10%, e iv) inativação de vetor viral recom- binante. Preferivelmente, o vetor viral recombinante é um baculovírus con- tendo ADN H5 codificando seqüências e as células são células SF+. Etapas de inativação preferidas são aquelas descritas acima. Preferivelmente, inati- vação é realizada entre cerca de 35-39°C e na presença de BEI 2 a 8 mM, ainda mais preferido na presença de BEI cerca de 5 mM.
Ainda de acordo com um aspecto da presente invenção, o pro- cesso descrito acima também inclui uma etapa de neutralização após a eta- pa iv). Esta etapa v) compreende adição de uma quantidade equivalente de um agente que neutraliza o agente de inativação dentro de solução. Preferi- velmente, se o agente de inativação é BEI, adição de tiossulfato de sódio em uma quantidade equivalente é preferida. Assim, de acordo com ainda um aspecto, a etapa v) compreende adição de uma solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 20 mM, preferi- velmente de cerca de 2 a cerca de 10 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 8 mM, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 7 mM mais preferivelmente de cerca de 5 mM, quando o agente de inativação é BEI.
Em formas preferidas e especialmente em formas que usarão a proteína H5 recombinante em uma composição imunogênica tal como uma vacina, cada lote de proteína H5 colhido será testado para inativação através de passagem nas células de inseto suscetíveis de baculovírus, dependentes de ancoragem, tais como células Sf9. Em uma forma preferida deste teste, 150 cm2 de apropriada monocamada de cultura de células são inoculados com 1,0 ml_ de fluidos H5 inativados e mantidos a 25-29°C por 14 dias com pelo menos duas passagens. No fim do período de manutenção, as mono- camadas de células são examinadas para efeito citopatogênico (CPE) típico de baculovírus H5. Preferivelmente, controles vírus positivos também são usados. Tais controles podem consistir em uma cultura de células Sf9 inocu- Iadas com um baculovírus H5 referência não-inativado e um frasco de célu- las Sf9 que permanecem não-inoculadas. Após incubação e passagem, a ausência de células infectadas com vírus nos fluidos virais tratados com BEI pode constituir um teste de inativação satisfatório. As células controles ino- culadas com o vírus referência devem exibir CPE típico de baculovírus H5 e o frasco não-inoculado não deve exibir qualquer evidência de CPE de bacu- lovírus H5. Alternativamente, no fim do período de manutenção, as amostras de sobrenadante podem ser coletadas e inoculadas sobre uma placa de 96 cavidades de Sf9, que foi carregada com células Sf9, e então mantida a 25- 29°C por 5-6 dias. A placa é então fixada e manchada com anticorpo anti-H5 conjugado a FITC ou qualquer anticorpo marcado direcionado para proteínas específicas de baculovírus (isto é, gp64). A ausência de CPE, expressão de H5, ou expressão de proteínas específicas de baculovírus (isto é, gp64) nos fluidos virais tratados com BEI constitui um satisfatório teste de inativação. As células controles inoculadas com o vírus referência devem exibir CPE e atividade IFA e o frasco não-inoculado não deve exibir qualquer evidência de CPE de baculovírus H5 e não conter atividade IFA. Assim, ainda um aspecto aqui descrito refere-se a um teste de
inativação para determinação de eficácia da inativação do vetor viral de re- combinação expressando proteína H5, compreende as etapas de: i) contato de pelo menos uma porção do fluido de cultura contendo o vetor viral re- combinante com um agente de inativação, preferivelmente como descrito acima, ii) adição de um agente de neutralização para neutralizar o agente de inativação, preferivelmente como descrito acima, e iii) determinação de infec- tividade residual através de ensaios como descrito acima.
Após inativação, a relativa quantidade de proteína H5 recombi- nante em uma amostra pode ser determinada em um número de maneiras. Processos preferidos de quantificação incluem densitometria SDS-PAGE, ELISA, e estudos de vacinação animal que correlacionam quantidades co- nhecidas de vacina com resultados clínicos (sorologia, etc.), Quando SDS- PAGE é utilizada para quantificação, o material amostra contendo uma quantidade desconhecida de proteína H5 recombinante é corrido sobre um gel, junto com amostras que contêm diferentes quantidades conhecidas de proteína H5 recombinante. Uma curva padrão então pode ser produzida so- bre as amostras conhecidas e a quantidade de H5 recombinante na amostra desconhecida pode ser determinada através de comparação com esta curva padrão. Devido ELISAs serem geralmente reconhecidos como o padrão de indústria para quantificação de antígeno, eles são preferidos para quantifica- ção.
Vacinas compreendendo proteínas H5 ou moléculas de ácidos nucleicos ou vetores codificando as mesmas
Ainda de acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a vacinas ou composições farmacêuticas em geral, que compreendem, i. uma ou mais das proteínas H5 como aqui descritas; ii. uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos como aqui
descritas, codificando qualquer uma de tais proteínas H5; e/ou
iii. um ou mais dos vetores como aqui descritos, incluindo quais- quer tais moléculas de ácido nucleico e codificando quaisquer tais proteínas H5 como aqui descritas; e iv. um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
O termo "composição farmacêutica", "composição farmacêutica / vacina" como aqui descrito, inclui mas não é limitado a, vacinas para a redu- ção ou prevenção de uma infecção ou a uma composição de matéria para o tratamento e diminuição de uma infecção.
A preparação de vacinas baseadas em ácido nucleico, preferi- velmente vacinas de ADNc, codificando hemaglutinina influenza é descrita, por exemplo, em Deck et al„ Vaccine 1997; 15(1):71-78; Ulmer et al„ Scien- ce 1993; 259-:1745-1749; Ulmer et al„ Vaccine 1994:12(16):1541-1544. Qualquer um destes processos pode ser usado para a produção de vacinas baseadas em ácido nucleico, preferivelmente vacinas ADNc, codificando uma proteína H5 influenza como aqui descrito.
Além disso, uma vacina, que compreende proteína H5 ou suas partes como aqui descrito, pode ser produzida através de abordagens con- vencionais, por exemplo, através de técnicas de expressão recombinante ou através de purificação bioquímica e técnicas de separação. Técnicas de ex- pressão recombinante, incluindo a expressão em células de insetos, são bem-conhecidas na técnica, e descritas, por exemplo, em Sambrook et al„ Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e Il (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.l. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley & Sons, Inc. 1994). Ainda exemplos de sistemas de expres- são recombinante bem-estabelecidos são sistemas de expressão bacteriana tais como E. coli ou B. subtilis, sistemas de expressão baseados em levedu- ra como S.cerevisiae ou S. pombe, ou sistemas de expressão em célula mamífera como os sistemas de expressão baseados em BHK, CHO e/ou NSO. Tais sistemas são bem-conhecidos na técnica e geralmente disponí- veis, por exemplo, comercialmente através de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, Califórnia 94303-4607, USA. Ainda estratégias de expressão são, por exemplo, descritas em Luschow et al., Vaccine N0 19 (2001), pp. 4249-4259, ou Veit et al. PNAS vol. 103 (2006), pp. 8197-8202. Além disso, sistemas de vírus associado-adeno recombinantes são bem- estabelecidos e, por exemplo, descritos em US 5 436 146 ou W0200203872 com ainda referências. Além disso, sistemas de expressão baseados em vírus vacínia (varíola), por exemplo, como descrito em US 6 265 183 com ainda referências, também são bem-estabelecidos e apropriados para pro- dução de antigeno(s) recombinante, composição(ões) antigênicas como u- sadas de acordo com a invenção. Ainda sistemas de expressão apropriados fazem uso de vírus popova recombinante, como SV40, vírus de epitelioma contagioso, vírus de pseudo-raiva e retrovírus.
As composições farmacêuticas / vacinas relevantes como aqui descritas, também podem compreender vírus inativados que compreendem proteína H5 como aqui descrito, uma versão apatogênica de um vírus vivo compreendendo proteína H5 como aqui descrita, preparação e/ou fragmen- tos de um vírus, onde a dita preparação e/ou fragmento compreende a prote- ína H5 como aqui descrita.
Aqueles versados na técnica conhecem componentes adicionais que podem ser compreendidos nas ditas composições / vacinas junto com antígeno (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed. Mack Publ., Easton). O especialista pode usar conhecidas soluções estéreis fisiologicamente aceitáveis, injetáveis. Para preparação de uma so- lução pronta-para-uso, soluções isotônicas aquosas, tais como, por exemplo, solução salina ou correspondentes soluções de proteína de plasma são fa- cilmente disponíveis. A composição farmacêutica / vacina pode ser apresen- tada como preparações Iiofilizadas ou secas, que podem ser reconstituídas com uma solução injetável conhecida diretamente antes de uso sob condi- ções estéreis, por exemplo, como um kit de partes.
Em adição as composições farmacêuticas / vacinas da presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinários aceitáveis. Como aqui usado, "um veículo veterinário aceitável" inclui mas não é limitado a quaisquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizadores, diluentes, preservativos, agentes antibacterianos e antifungos, agentes isotônicos, agentes de retardo de adsorção, e similares.
Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dex- trose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizadores incluem al- bumina e sais alcalinos de ácido etileno diamino tetra-acético, entre outros.
Um preservativo como aqui usado, refere-se a um agente ativo antimicrobiológico, tal como, por exemplo, gentamicina, mertiolate, e simila- res. Em particular adição de um preservativo é mais preferida para a prepa- ração de uma composição multidoses. Aqueles agentes ativos antimicrobio- lógicos são adicionados em concentrações eficaz para evitar que a composi- ção de interesse seja contaminada microbiologicamente ou para inibição de qualquer crescimento microbiológico dentro da composição de interesse.
"Adjuvantes" como aqui usados, podem incluir hidróxido de alu- mínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo, Quil A, QS-21 (Cam- bridge Biotech., Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham1AL), emulsão água-em-óleo, emulsão óleo-em-água, emul- são água-em-óleo-em-água.
A emulsão pode ser baseada em particular em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia); óleo isoprenóide como esqualano ou esqualeno; óleo resultante da oligomerização de alquenos, em particular de iso- buteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmente óleos de plantas, oleato de etila, di-(caprilato / ca- prato) de propileno glicol, tri-(caprilato / caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos graxos ramificados ou álcoois, em particu- lar ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emul- sificantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferivelmente ten- soativos não-iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manita (por e- xemplo, oleato de anidro manitol), de glicol, de poliglicerol, de propileno gli- col e de ácido oléico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxi esteárico, que são opcionalmente etoxilados, e copolímeros de bloco de polioxipropileno - poli- oxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Vide Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart- Tulll D.Ε.S.), John Wiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) e Todd et al„ Vacci- ne 15:564-570 (1997). Exemplos de apropriadas emulsões de oleo-em-água são adjuvantes baseados em Emulsigen®, tais como EMULSIGEN, EMUL- SIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, USA). Foi surpreendentemente verificado que composições farmacêuticas / vacina que compreendem proteína H5, preferivelmente pro- teína H5 recombinante como aqui descrita, receberam eficazmente adju- vantes emulsões óleo-em-água, preferivelmente tais adjuvantes baseados em Emulsigen, mais preferivelmente com EMULSIGEN® e EMULSIGEN-D®.
Além disso, é possível usar a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão de MF59 des- crita na página 183 deste mesmo livro.
Ainda um exemplo de um adjuvante é um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros de anidrido maleico e derivado alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são os po- límeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmente com polialquenila éteres de açúcares ou poli álcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbomero (Phameuropa Vol. 8, N2 2, junho de 1996). Aqueles versados na técnica também podem se referir a patente US 2 909 462 que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um compos- to poli-hidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, preferivelmente não mais que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos com radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insatura- dos. Os radicais insaturados podem eles próprios conter outros substituintes, como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, O- hio, USA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados com uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre eles, podem ser mencionados Carbopol 974P, 934P e 971P. É mais preferido o uso de Carbopol 971P. En- tre os copolímeros de anidrido maleico e derivado de alquenila, os copolíme- ros EMA (Monsanto) que são copolímeros de anidrido maleico e etileno. A dissolução destes polímeros em água conduz a uma solução ácida que será neutralizada, preferivelmente para pH fisiológico, de modo a render a solu- ção adjuvante na qual a própria composição imunogênica, imunológica, ou vacina será incorporada.
Ainda adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados a, o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), Block co-polymer (CytRx, Atlanta, GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), mono fosforil lipídeo A, adjuvante lipídeo - amina Avridina, enterotoxina termoinstável de E. coli (recombinante ou outro modo)toxina de cólera, ou dipeptídeo muramila entre muitos outros
Preferivelmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 μg a cerca de 10 mg por dose. Mesmo mais preferido o ad- juvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 μg a cerca de 10 mg por dose. Mesmo mais preferido, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 500 μg a cerca de 5 mg por dose. Mesmo mais pre- ferido o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 750 μg a cerca de 2,5 mg por dose. Mais preferido, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.
As composições farmacêuticas / vacinas ainda podem incluir um ou mais outros agentes imunomoduladores tais como, por exemplo, interleu- cinas, interferons, ou outras citocinas. As composições farmacêuticas / vaci- nas também podem incluir gentamicina e mertiolate. Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente in- venção possam ser facilmente determinadas por aqueles versados, a pre- sente invenção contempla composições compreendendo de cerca de 50 μg a cerca de 2000 μg de adjuvante e preferivelmente cerca de 250 μg/1 mL de dose da composição de vacina. Em uma outra realização preferida, a pre- sente invenção contempla composições de vacina compreendendo de cerca de 1 μg/mL a cerca de 60 μg/mL de antibióticos, e mais preferivelmente me- nos que cerca de 30 μg/mL de antibióticos.
Assim, de acordo com ainda uma realização, a presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica / vacina compreendendo i. uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das proteínas H5 de vírus influenza como aqui descritas, onde a proteína H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, onde numeração das po- sições de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido
como exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e onde a modificação 328K+ significa que na posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida; e
ii. um adjuvante farmaceuticamente aceitável como descrito acima.
Preferivelmente, o adjuvante é selecionado do grupo consistindo
em:
a) EMULSIGEN®, uma emulsão de óleo-em-água (o/w);
b) EMULSIGEN-D®, uma óleo-em-água (o/w) com brometo de dimetil diocta decil amônio (DDA);
c) um Polygen1 um copolímero
d) EMULSIGEN-P®, uma óleo-em-água (o/w) com um estimu-
lante imuno proprietário
e) Carbigen é um polímero reticulado
f) EMULSIGEN-75®, um adjuvante duplo compreendendo uma óleo-em-água (o/w) com um polímero reticulado
g) ISA 70 é uma água-em-óleo (w/o)
Mais preferivelmente, o adjuvante é uma emulsão de óleo-em- água tal como um adjuvante baseado em emulsigen selecionado do grupo con- sistindo em EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN- 75®, EMULSIGEN® e EMULSIGEN-P®. Mais preferivelmente EMULSIGEN® e
EMULSIGEN-P® são usados na formulação da presente invenção.
Ainda de acordo com um aspecto, as composições farmacêuti- cas / vacinas como aqui providas, compreendem um ou mais antígenos. Pre- ferivelmente, este ainda antígeno é um antígeno de uma ave doméstica ou patógeno mamífero. Ainda de acordo com concretizações, este antígeno
adicional é ainda um antígeno influenza tal como hemaglutinina H3, H7, H9, ou qualquer outra hemaglutinina de vírus influenza. O antígeno(s) adicional pode ser adicionado em uma forma purificada, como parte de uma prepara- ção antigênica, em forma de um microorganismo morto ou em forma de um microorganismo vivo modificado.
O termo "antígeno", como aqui usado significa, mas não é limi- tado a, peptídeos, polipeptídeos, glicopeptídeos, ou polissacarídeos que são capazes de interação específica com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imuno, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou re- ceptor de antígeno de célula T de modo a elicitar, ativar ou estimular uma resposta imunodirecionada ao dito antígeno em um hospedeiro ao qual o dito antígeno é administrado. O termo "antígeno" também refere-se a molé- cuias de ácidos nucleicos, preferivelmente moléculas de ADN ou ARN, cada uma das quais codifica e expressa um peptídeo, polipeptídeo, ou glicopeptí- deo que é capaz de interagir especificamente com uma molécula de reco- nhecimento de antígeno do sistema imune, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T de modo a elicitar, ativar ou estimular uma resposta imune contra o antígeno que é codificado pela molé- cula de ácido nucleico. O antígeno usado para a preparação da composição farmacêutica que é usada de acordo com a invenção é um microorganismo ou uma parte antigênica e/ou preparação do dito microorganismo. Neste sentido, o termo "imunização", como usado aqui, significa mas não está Iimi- tado a, qualquer causa ou aperfeiçoamento de uma resposta imune. O termo "resposta imune" já está descrito acima.
Estratégias de administração para vacinas influenza são bem- conhecidas na técnica. Estratégias de vacinação em mucosa para vacinas de vírus atenuado ou inativado são contempladas. Na medida em que a mu- cosa pode ser alvejada através de liberação local de uma vacina, várias es- tratégias foram empregadas para liberar proteínas imunogênicas para a mu- cosa.
Em uma concretização específica, a vacina pode ser administra- da em uma mistura com, ou como um conjugado ou proteína de fusão qui- mérica com, toxina de cólera, tal como toxina B de cólera ou uma quimera de toxina A/B de cólera (Hajishengallis, J. Immunol., 154:4322-32, 1995; Jo- bling and Holmes, Infect. Immun. 60:4915-24, 1992). Vacinas de mucosas baseadas no uso da subunidade de toxina B de cólera foram descritas (Le- bens and Holmgren, Dev Biol Stand 82:215-27, 1994). Em uma outra concre- tização, uma mistura com enterotoxina instável termicamente (LT) pode ser preparada para vacina em mucosa.
Outras estratégias de imunização em mucosa incluem encapsu- lação de vírus em microcápsulas (US 5 075 109, US 5 820 883, e US 5 853 763) e uso de um veículo membranoso de potencialização imune (WO 98/0558). Imunogenicidade de imunógenos administrados oralmente pode ser aperfeiçoada através do uso de células vermelhas do sangue (rbc) ou fantasmas rbc (US 5 643 577), ou através de uso de antígeno língua azul (US 5 690 938).
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para preparação de uma composição farmacêutica / vacina como descrito acima, preferivelmente um processo para produção de uma vacina que compreende uma proteína H5 expressa em baculovírus, recom- binante como descrito supra. Geralmente, este processo inclui as etapas de transfecção de uma construção em um vírus, onde a construção compreen- de i) ADNc H5 recombinante como aqui descrito, ii) infecção de células em meios de crescimento com o vírus transfectado, iii) fazer com que o vírus expresse a proteína H5 recombinante como aqui descrita, iv) recuperação de proteína H5 expressa a partir da cultura, v) e preparação de composição a- través de combinação de proteína H5 expressa com um adjuvante apropria- do e/ou outro veículo farmaceuticamente aceitável.
Adjuvantes preferidos são aqueles descritos acima. Assim, de acordo com ainda um aspecto, o processo para preparação de uma compo- sição antigênica, tal como, por exemplo, uma vacina, para evocar uma res- posta imune contra infecções influenza compreende i) preparação e recupe- ração de proteína H5, e ii) mistura desta com adjuvantes apropriados.
Em adição, a composição de vacina da presente invenção tam- bém pode incluir diluentes, agentes isotônicos, estabilizadores e/ou preser- vativos. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glice- rol, e similares. Agentes isotônicos podem incluir sais inorgânicos ou orgâni- cos, por exemplo, cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, sa- carídeos, trealose, manitol, sacarose, entre outros. Estabilizadores incluem albumina e sais alcalinos de ácido etileno diamino tetra-acético, entre outros. Apropriados adjuvantes, são aqueles descritos acima. Uso medicinal de quaisquer de tais proteínas H5. moléculas de ácidos nucle- icos, vetores e vacinas
As proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer tais proteínas H5, os vetores compreenden- do quaisquer tais moléculas de ácido nucleico codificando quaisquer tais proteínas H5 como aqui descritas, e qualquer composição farmacêutica / vacina compreendendo qualquer tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor podem ser usados como um medicamento, preferivelmente para o tratamento e profilaxia de infecções, causadas por vírus influenza, mais pre- ferivelmente por vírus influenza A. As proteínas H5 aqui providas, as molécu- las de ácido nucleico codificando tais proteínas H5, os vetores compreen- dendo quaisquer de tais moléculas de ácidos nucleicos codificando quais- quer proteínas H5 como aqui descritas, e qualquer composição farmacêutica / vacina compreendendo qualquer uma de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor, como aqui descrito, podem ser usados para o tratamento ou profilaxia de seres humanos assim como em medicina veterinária. Quan- do usado em medicina veterinária, o tratamento de aves domésticas, preferi- velmente, pássaro, galinha, pato, peru, e similares assim como mamíferos, preferivelmente porcos, gado, cavalos, focas, camelos, cães, gatos, hams- ters, camundongos e similares, é preferido.
Assim, de acordo com um outro aspecto a presente invenção refere-se ao uso de proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de áci- dos nucleicos codificando tais proteínas H5, os vetores compreendendo quaisquer tais moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer tais pro- teínas H5 como aqui descritas e quaisquer composições farmacêuticas / va- cinas compreendendo qualquer um de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor como aqui descrito, pode ser usado como um medicamen- to, preferivelmente como um medicamento para seres humanos e/ou como medicamento veterinário.
Além disso, proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucleicos codificando quaisquer tais proteínas H5, os vetores com- preendendo quaisquer tais moléculas de ácidos nucleicos codificando qual- quer tal proteína H5, como aqui descrita, pode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica como aqui descrita, para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por influenza viral. Como mencionado acima, aquelas composições farmacêuticas / composições de vacinas po- dem ser usadas para o tratamento e/ou profilaxia de seres humanos assim como para o tratamento e/ou profilaxia de animais, como aves domésticas, preferivelmente pássaro, galinha, pato, peru, e similares, assim como mamí- feros, preferivelmente porcos, gado, cavalos, focas, camelos, cães, gatos, hamsters, camundongos, e similares.
Proteínas H5 como aqui providas, as moléculas de ácidos nucle- icos codificando tais proteínas H5, os vetores compreendendo tais moléculas de ácidos nucleicos codificando tais proteínas H5, como aqui descritas, po- dem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica, como aqui descrita, são apropriados para o tratamento e profilaxia de infecção in- fluenza viral, que preferivelmente é causada por vírus influenza de ave, suí- no ou humano ou qualquer sua combinação ou híbrido.
Ainda de acordo com um aspecto, a presente invenção também refere-se a um processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de ví- rus influenza, onde o processo compreende administração de uma quantida- de terapeuticamente eficaz da proteína H5 como aqui descrita, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento. Além disso, a presente invenção tam- bém refere-se a um processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, onde o processo compreende administração de uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de qualquer molécula de ácido nucleico H5 ou vetor como aqui descrito, que codifica qualquer proteína H5 como aqui des- crita, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento. Além disso, a pre- sente invenção também refere-se a um processo para o tratamento ou profi- laxia de infecções de vírus influenza, onde o processo compreende adminis- tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina compreenden- do qualquer tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor, como aqui descrito, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento. O sujeito em sua necessidade pode ser um ser humano assim como um animal, preferi- velmente aves domésticas, mesmo mais preferivelmente pássaro, galinha, pato, peru, ou um mamífero, preferivelmente porco, gado, cavalo, foca, ca- melo, cão, gato, hamster, camundongo e similares.
Preferivelmente, quando galinhas são vacinadas, a proteína H5 como aqui descrita pode ser usada para vacinação no dia 1 de idade ou de- pois, por exemplo, no dia 10, ou nos dias 1 a 10, ou no dia 10 ou depois.
Preferivelmente a infecção influenza que pode ser tratada através de administração de qualquer proteína H5, a molécula de ácido nucleico ou vetor codificando qualquer tal proteína H5, ou quaisquer composições farma- cêuticas / vacinas como aqui descritas, é causada por vírus influenza de aves, suínos ou seres humanos ou qualquer combinação ou híbrido das mesmas.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit de partes, que compreende i) qualquer uma proteína H5 como aqui descrita, a molécula de ácido nucleico ou vetor codificando qualquer tal pro- teína H5, ou qualquer composição farmacêutica / vacina compreendendo qualquer tal proteína H5, molécula de ácido nucleico ou vetor como aqui descrito, e ii) um folheto de embalagem indicando o uso de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico, vetor ou vacina para o tratamento ou profilaxia de infecções causadas por vírus influenza. Quando galinhas são vacinadas, a proteína H5 como aqui descrita pode ser usada para vacinação no dia 1 de idade ou depois.
Ainda de acordo com uma concretização, este kit em partes compreende ainda pelo menos um antígeno de patógeno de aves domésti- cas ou mamífero e a indicação de informação de uso medicinal, humano ou veterinário daquele antígeno adicional. Exemplos
Os seguintes exemplos mostram materiais e procedimentos pre- feridos de acordo com a presente invenção. É para ser entendido, entretan- to, que estes exemplos são providos por meio de ilustração somente. E nada ali deve ser julgado uma limitação sobre o escopo total da invenção. Exemplo 1
Construção de um baculovírus recombinante codificando e expressando an- tíqenos H5 HA
O baculovírus recombinante contendo o antígeno HA H5 foi ge- rado como se segue: As seqüências codificantes de HA H5 (SEQ ID NO: 2) foram sintetizadas quimicamente e subclonadas no vetor de transferência ρVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). O MutK+ de HA H5 (SEQ ID NO: 4) foi gerado através do uso de iniciadores oligonucleotídeos e o QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla1 CA) e subclonado no vetor de transferência pVL1392 (BD Biosciences Pharmin- gen, San Diego, CA). Os plasmídeos pVL1392 contendo os genes codifican- do antígeno HA H5 (SEQ ID NO: 2) e MutK+ HA H5 (SEQ ID NO: 4) foram então co-transfectados com ADN baculovírus DiamondBac® (Sigma) em cé- lulas Sf9 de insetos (BD Biosciences Pharmingen) para gerar o baculovírus recombinante contendo os genes HA H5 codificando SEQ ID NO: 2 e mutK+ HA H5 codificando SEQ ID NO: 4. Os baculovírus recombinantes contendo os genes codificando HA H5 (SEQ ID NO: 2) e MutK+ HA H5 (SEQ ID NO: 4) foram purificados com placa e Vírus Semente Mestre (MSVs) foram pro- pagados sobre a linha de células SF+, feitos alíquotas, estocados a -70°C. Células de insetos infectadas com baculovírus HA H5 como descrito acima para gerar MSV ou Vírus Semente de Trabalho expressa antígeno HA H5 (SEQ ID NO: 2) e antígeno MutK+ HA H5 (SEQ ID NO: 4) como detectado por anticorpos monoclonais ou soro policlonal em um ensaio de anticorpo fluorescente indireto ou Western blot.
Após serem semeados com as apropriadas quantidades de ba- culovírus recombinante (HA H5 e MutK+ HA H5, respectivamente), frascos rotatórios contendo células SF+ (Protein Sciences, Inc., Meriden, CT) foram então incubadas a 27±2°C por 7 dias e com agitação em 100 rpm durante este tempo. Os frascos usaram tampas ventiladas para permitirem fluxo de ar. A cultura de células brutas inteira contendo células SF+ infectadas com baculoví- rus e os sobrenadantes de cultura de células de cada cultura foram colhidos. Exemplo 2
Preparação de composições farmacêuticas (vacinas) compreendendo antí- genos H5 HA
A proteína HA H5 de célula integral e proteína MutK+ HA H5 ex-
pressas em células de insetos através de sistema de expressão baseado em baculovírus foram colhidas. Baculovírus foram inativados na presença de etilenimina binária ciclizada (BEI) 5 mM (concentração final) entre cerca de 32 e 39°C por 72 a 96 horas. Após inativação ser completada, uma solução 0,3 M de tiossulfato de sódio foi adicionada para uma concentração final de mM para neutralizar qualquer BEI residual. Após neutralização vários adju- vantes foram adicionados e as seguintes composições de vacinas / farma- cêuticas foram geradas.
Vacinas
Nome genérico de produto 501 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos por um siste- ma de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendeu cé- lulas cultivadas de insetos e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve como adjuvante Emulsigen. Nome de produto genérico 502 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos por um siste- ma de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve como adjuvante Emulsigen-D Nome genérico de produto 503 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos por um siste- ma de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve como adjuvante Polygen Nome genérico de produto 504 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos através de um sistema de expressão baseado em baculo- vírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve como adjuvante Emulsigen-P. Nome genérico de produto 505 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos através de um sistema de expressão baseado em baculo- vírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve adjuvante Carbigen. Nome genérico de produto 506 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos através de um sistema de expressão baseado em baculo- vírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve adjuvante Emulsigen-75. Nome genérico de produto 507 Antígeno Proteína HA H5 de célula integral bruta ex- pressa em células de insetos por um siste- ma de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve adjuvante ISA 70. Nome genérico de produto 508 Antígeno Proteína mutK+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de insetos atra- vés de um sistema de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve adjuvante Emulsigen Nome genérico de produto 509 Antígeno Proteína mutK+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de inseto através de um sistema de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de insetos cultivadas e sobrenadan- te expressando HA H5 recombinante. A va- cina teve adjuvante Emulsigen-D. Nome genérico de produto 510 Antígeno Proteína mutK+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de insetos por um sistema de expressão baseado em ba- culovírus. Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de insetos cultivadas e sobrenadan- te expressando HA H5 recombinante. A va- cina teve adjuvante Polygen. Nome genérico de produto 511 Antígeno Proteína mutK+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de insetos por um sistema de expressão baseado em ba- culovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de insetos cultivadas e sobrenadan- te expressando HA H5 recombinante. A va- cina teve adjuvante Emulsigen-P Nome genérico de produto 512 Antígeno Proteína mutK+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de insetos atra- vés de um sistema de expressão baseado em baculovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de insetos cultivadas e sobrenadan- te expressando HA H5 recombinante. A va- cina teve adjuvante Carbigen. Nome genérico de produto 513 Antígeno Proteína mutK+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de inseto por um sistema de expressão baseado em baculo- vírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de inseto cultivadas e sobrenadante expressando HA H5 recombinante. A vacina teve adjuvante Emulsigen-75 Nome genérico de produto 514 Antígeno Proteína K+ HA H5 de célula integral bruta expressa em células de insetos através de um sistema de expressão baseado em ba- culovírus Formulação Uma vacina experimental compreendida por células de insetos cultivadas e sobrenadan- te expressando HA H5. A vacina teve adju- vante ISA 70. Exemplo 3
Vacinação de suínos (porcos) contra influenza de aves 1. Introdução
O propósito deste estudo foi determinar a habilidade de vacinas experimentais contendo um extrato bruto de antígeno hemaglutinina (HA) H5 recombinante para induzir inibição de títulos de hemaglutinação (HI) em suí- nos. Vários adjuvantes foram avaliados com os antígenos HA H5.
Os protótipos H5 HA avaliados neste estudo contiveram antíge- no a partir de HA H5 convencional ou MutK+ HA H5. HA H5 convencional foi derivada de A/pato/China/E319-2/03, enquanto mutK+ HA H5 consiste em HA H5 convencional que foi engenheirada para conter três específicas alte- rações de aminoácidos em S120N, D150N, S223N e 328mutK+. Ela também contém aminoácido 94N. As particulares mudanças de aminoácidos em MutK+ HA H5 resultam em uma HA H5 que parece mais de perto a HA de A/H K/213/03. A composição de aminoácidos da HA H5 de A/HK/213/03 é correntemente pensada auxiliarem reconhecimento de anticorpo da HA H5. ο ■σ
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IO Os porquinhos foram de 3 semanas +/- 5 dias de idade no início do estudo. Os porquinhos foram clinicamente saudáveis no início do estudo. A- mostras de sangue foram obtidas nos dias de estudo O, 21, e 35.
Todos os animais de estudo foram observados diariamente nos dias de estudo 1 até 35 em relação ao estado de saúde geral. Por sete dias seguindo cada vacinação, sítios de injeção foram investigados diariamente e reações visíveis foram anotadas. Na conclusão da fase animal do estudo no dia de estudo 35, todos os animais sofreram eutanásia.
3. Vacinas
Vacinas 501 a 514 como descritas no EXEMPLO 2 foram usa-
das para o estudo de vacinação de porcos.
4. Ensaio de Inibição de Hemaglutinina
Suínos foram vacinados com os protótipos contendo HA H5 nos dias 0 e 21. Soros de suínos foram coletados para avaliação através de en- saio de inibição de hemaglutinação nos dias 0, 21, 35. O ensaio Hl foi reali- zado para detectar a presença de anticorpos específicos HA. Um vírus H5N2 heterólogo, A/galinha/México/232/94, foi usado em uma concentração de quatro unidades hemaglutinantes [4 unidades HA] no ensaio Hl. Diluições de soro de duas vezes seriais em placas de microtitulação de fundo U em PBS foram subseqüentemente misturadas com iguais volumes (25 μι.) contendo 4 unidades HÁ de vírus, e incubadas em temperatura ambiente (cerca de 25°C) por 30 minutos. Células vermelhas de sangue de galinha, em uma concentração de 0,5% em PBS, foram adicionadas às cavidades contendo vírus - soro e incubadas por 40 minutos em temperatura ambiente. Os títu- Ios de Hl foram determinados como recíprocas das mais altas diluições de soro nas quais inibição de hemaglutinação foi observada.
5. Resultados
Teste Hl usou o antígeno H5N1 oficial do governo Mexicano (A/galinha/México/232/94) [4 unidades HA]. Regime de vacinação de 1x1 mL nos dias Oe 21. Títulos de Hl Dia 0 Dia 21 Dia 35 501 H5 - Emulsigen 0 0 4 502 H5 - Emulsigen-D 0 0 4 503 H5 - Polygen 0 0 0 504 H5 - Emulsigen-P 0 0 2 505 H5 - Carbigen 0 0 4 506 H5- Emulsigen-75 0 0 16 507 H5 ISA 70 0 0 16 508 H5 K+ - Emulsigen 0 0 128 509 H5 K+ - Emulsigen-D 0 0 64 510 H5 K+ - Polygen 0 0 16 511 H5 K+ - Emulsigen -P 0 0 0 512 H5 K+ - Carbigen 0 0 0 513 H5 K+ - Emulsigen - 75 0 0 16 514 H5 k+-ISA 70 0 4 32 Controle Nenhum 0 0 0
BIV Η5 (derivada de vírus influenza A (A/pato/China/E319-2/03 (H5N1))
BIV H5 K+ (BIV H5 mutante para incluir S120N, D155N, S223N, e 328K+ adicionado)
Os resultados demonstram que maioria das composições de va- cina elicitam uma resposta imune nos porcos vacinados. Em particular, mai- oria das composições de vacina resultam em uma soroconversão, que signi- fica que maioria dos porcos vacinados desenvolveu específicos anticorpos contra o vírus influenza de aves usado no ensaio Hl. No total, os resultados clara e indubitavelmente provam que a idéia inventiva reivindicada funciona muito bem. O risco de infecção pandêmica de porcos (animal de uma se- gunda espécie), com vírus influenza de aves (patógeno de uma primeira es- pécie) pode ser dramaticamente reduzido através de vacinação de porcos com um antígeno relevante de vírus influenza de aves. Isto foi claramente demonstrado. Além disso, através de deste conceito de vacinação, a trans- missão e adaptação de vírus influenza de aves para mamíferos, incluindo seres humanos são dramaticamente reduzidos. Porcos são um dos reserva- tórios mais importantes para patógenos de aves, incluindo vírus influenza de aves. Se a replicação de vírus em porcos e por isso o risco de adaptação de influenza de aves para porcos é dramaticamente reduzida e controlada, o risco para qualquer adaptação de vírus influenza de aves a seres humanos é também dramaticamente reduzido. No caso, onde a administração de antí- geno resulta em menor título Hl, que significa título menor que 30, ainda re- forços com antígeno serão requeridos para ainda aperfeiçoar o título Hl e para aperfeiçoar a proteção imune nos porcos vacinados. Por isso, baixo título não significa que nenhuma proteção pode ser obtida, somente ensina que ainda reforços parecem ser requeridos para aperfeiçoar a resposta imu- ne. O fato de que uma resposta imune pode ser medida em porcos vacina- dos demonstra que a idéia inventiva subjacente à presente invenção funcio- na muito bem. Em outras palavras, os experimentos aqui providos clara e indubitavelmente proporcionam evidência de que a idéia inventiva da pre- sente invenção funciona. Exemplo 4
Vacinação de pássaros contra influenza de aves 1. Introdução
O propósito deste estudo foi determinar a habilidade de vacinas experimentais contendo um extrato bruto de antígeno mutK+ H5 recombi- nante + hemaglutinina (H5 HA mutK+) para induzir títulos de inibição de he- maglutinação (HI) em galinhas. Em adição, um antígeno H5 recombinante convencional (HA H5) assim como a vacina inativada Volvac® Al (Boehringer Ingelheim Vetmedica, México) foram usados para controle. Além disso, vá- rios adjuvantes foram avaliados com os antígenos HA H5. 2. Projeto de Estudo:
Pássaros SPF (15-25) foram vacinados independentemente com diferentes vacinas experimentais em 1 ou 10 dias de idade através de via subcutânea com 0,5 ml_ na parte de trás do pescoço; todos os pássaros fo- ram mantidos em isoladores durante o experimento. Alimento e água foram providos ad libitum. Desafio foi conduzido 31 ou 32 dias após vacinação com linhagem influenza de aves altamente patogênica H5N2.
Amostras de soro foram obtidas através de sangramento de pássaros a partir de veia jugular em 15, e 30 dias após vacinação. Os soros obtidos foram estocados a 4°C até corrida de teste de inibição de hemagluti- nação (HI)1 como descrito no Exemplo 3, para obter os títulos de anticorpos.
3. Vacinas e Vírus de Desafio
Quatro diferentes formulações foram avaliadas independente- mente.
1. Convencional emulsão em óleo de Mut K+ HA H5: antígeno mutK+ HA H5 foi formulado em emulsão de óleo baseado (adjuvante incom- pleto Freund) em procedimentos de Boehringer Ingelheim Vetmedica.
2. MutK+ HA H5 Seppic: antígeno mutK+ HA H5 formulado com um adjuvante não-convencional (ISA 206, W/O/W, de Seppic) baseado na recomendação do fornecedor.
3. emulsão em óleo convencional HAH5: antígeno HA H5 foi for- mulado em emulsão em óleo baseado em procedimentos de Boehringer In- gelheim Vetmedica (adjuvante incompleto de Freund)
4. HAH5 Seppic: antígeno HA H5 formulado com um adjuvante não-convencional (ISA 206, W/O/W, de Seppic) baseado nas recomenda- ções do fornecedor.
Uma vacina de emulsão em óleo de Boehringer Ingelheim Vet- medica de influenza de aves foi usada como controle, Volvac® Al (Boehrin- ger Ingelheim Vetmedica, México).
Desafios foram conduzidos em galinhas vacinadas e não- vacinadas através de inoculação pela via intranasal com 0,2 mL contendo 106'7 CEID por pássaro do vírus desafio H5N2. Após o desafio, sinais e mor- talidade foram anotados. Dez dias após inoculação todas as galinhas sobre- viventes sofreram eutanásia de acordo com procedimentos de laboratórios para animais.
4. Resultados:
Resultados são descritos nas tabelas que se seguem: Vacinação em 1 dia de idade Formulação Desafio 31 dias após vacinação # Morte % Mortalidade MutK+ HA H5 Seppic 8/25 32% Mut K+ HAH5 emulsão em óleo con- vencional o/24 0% HAH5 Seppic 17/25 68% HAH5 emulsão em óleo convencional 4/25 16% Volvac Al KV Controle negativo 10/10 100%
Vacinação em 10 dias de idade Desafio 32 dias após vacinação # Morte % Mortalidade 0/20 0% o/20 0% 7/19 36,8% 2/20 10% 0/14 0% 14/14 100%
Vacinação em 1 dia de idade (0,5 mL) Formulação vacina Títulos Hl 30 dias após vacinação (MG Log2) % de proteção após desafio Mut K+ HAH5 Seppic 0,56 68 Mut K+ HAH5 emulsão em óleo convencional 2,59 100 HAH5 Seppic 0,18 32 HAH5 emulsão em óleo con- vencional 0,7 84 Volvac Al KV Controle negativo Vacinação em 10 dias de idade (0,5 m L) Títulos Hl 30 dias após vacinação (MG Log2) % de proteção após desafio 2,5 100 4,3 100 1,3 63,2 1,6 100 8,8 100 0 0
Título de soro positivo é considerado Iog2 4 de acordo com pa- drões ΟΙΕ. Baseado nestes critérios resultados sorológicos foram negativos, mas alguns valores positivos foram observados quando comparados com a linha base. Os melhores títulos sorológicos são observados na vacina formu- Iada com adjuvante óleo e com o antígeno Mut K+ HAH5, em pássaros vaci- nados em 1 dia de idade ou 10 dias de idade. Os títulos sorológicos mais baixos foram observados no protótipo formulado com Seppic e o antígeno HAH5. No estudo de desafio foi observado, que protótipos de vacinas confe- rem proteção, particularmente com a vacina de emulsão em óleo convencio- nal formulada com o antígeno Mut K+ HAH5. A proteção mais baixa no estu- do de desafio foi observada com a HAH5 Seppic com 68% de mortalidade. Em contraste, o título sorológico mais alto foi observado em pássaros vaci- nados em 10 dias comparado com pássaros vacinados em um dia de idade. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
<120> PROTEÍNAS H5, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO E VETORES CODIFICANDO AQUELES, E SEU USO MEDICINAL
<130> Caso 1-2150
<150> 60/863142 <151> 27-10-2006
<160> 6
<170> Versão de Patente 3.3
<210> 1 <211> 551 <212> PRT
<213> vírus Influenza Aviário <4Q0> 1
ASD Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn ser Thr Glu Gln vai 10 15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp lie 25 30
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly vai Lys 40 45
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110
Lys Ile Gln lie Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125
Ser Gly Val ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly ser Ser ser Phe Phe 130 135 140
Arq Asn Val Val Trp Leu lie Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160
Lys Arq Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 180
185
190
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205
Leu vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255
vai Lys Lys Gly Asp ser Ala Ile Met Lys ser Glu Val Glu Tyr Gly 260 265 270
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn ser Ser 275 280 285
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300
Tyr vai Lys ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arq Asn Ser 305 310 315 320
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 325 330 335
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met vai Asp Gly Trp Tyr Gly 340 345 350
Tyr His His ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 355 360 365
ser Thr Gln Lys Ala lie Asp Gly Val Thr Asn Lys vai Asn Ser Ile 370 375 380
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala vai Gly Arg Glu Phe Asn 385 390 395 400
Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 405 410 415
Phe Leu Asp vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu vai Leu Met Glu 420 425 430
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp ser Asn VaT Lys Asn Leu Tyr 435 440 445
Asp Lys vai Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 450 455 460
Gly Cys Phe GTu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 465 470 475 480
vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr ser Glu Glu Ala Arg 485 490 495
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu ser Ile Gly Thr 500 505 510
Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu 515 520 525
Ala Ile Met vai Ala Gly Leu ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly ser 530 535 540
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550
<210> 2 <211> 567 <212> PRT
<213> Vírus Influenza de Patos <400> 2
Met Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Ala Ile vai Ser Leu Val Lys Ser 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn vai Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly vai Lys 50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile vai 85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125
Lys lie Gln lie Ile Pro Lys ser ser Trp Ser Asp His Glu Ala ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser ser Phe Phe 145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190
Gly ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220
Leu vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys vai Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270
vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu vai Glu Tyr Gly 275 280 285
Asn cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn ser Ser 290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 340. 345 350
Gly Phe lie Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met vai Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 370 375 380
Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys vai Asn ser Ile 385 390 395 400
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala vai Gly Arg Glu Phe Asn 405 410 415 Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 420 425 430
Phe Leu Asp vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu vai Leu Met Glu 435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp ser Asn vai Lys Asn Leu Tyr 450 455 460
Asp Lys vai Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 465 470 475 480
Glv Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu ser 485 490 495
Val Arq Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 515 520 525
Tyr Gln Ile Leu ser lie Tyr ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu 530 535 540
Ala Ile Met vai Ala Gly Leu ser Leu Trp Met Cys ser Asn Gly ser 545 550 555 560
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565
<210> 3 <211> 568 <212> PRT
<213> Vírus Influenza de Patos <400> 3
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile vai ser Leu Val Lys Ser 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60
pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg lie Asn His Phe Glu 115 120 125
Lys lie Gln Ile Ile Pro Lys Asn ser Trp ser ser His Glu Ala ser 130 135 140
Leu Gly vai ser ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys ser ser Phe Phe 145 150 155 160
Arg Asn Val vai Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175
Lys Arg ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile ser Val Gly Thr ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220
Leu vai Pro Lys lie Ala Thr Arg ser Lys vai Asn Gly Gln Asn Gly 225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie 260 265 270
vai Lys Lys Gly Asp ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn ser Ser 290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met vai Asp Gly Trp Tyr 355 360 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380
Glu ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430
Gly Phe Leu Asp vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495
Ser vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510
Arq Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly vai Lys Leu Glu ser Ile Gly 515 520 525
Thr Tyr Gln Ile Leu ser Ile Tyr Ser Thr vai Ala ser Ser Leu Ala 530 535 540
Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys ser Asn Gly 545 550 555 560
ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys lie 565
<210> 4 <211> 568 <212> PRT
<213> vírus Influenza Aviário <400> 4
Met Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Ala Ile vai Ser Leu vai Lys Ser 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn vai Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60
Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp ser Asp His Glu Ala ser 130 135 140
ser Gly Val ser ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly ser Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160
Arg Asn vai vai Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190
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Leu vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys vai Asn Gly Gln Asn Gly 225 230 235 240
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270
vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu vai Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser ser 290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320
Tyr vai Lys Ser Asn Lys Leu vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335
Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380
Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn ser 385 390 395 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430
Gly Phe Leu Asp vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu vai Leu Met 435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460
Tyr Asp Lys vai Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495
ser vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr ser Glu Glu Ala 500 505 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525
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Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys ser Asn Gly 545 550 555 560 ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys lie 565
<210> 5 <211> 263 <212> PRT
<213> Vírus Influenza Aviário <400> 5
His Ala Asn Asn Trp Thr Glu Gln vai Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn 10 15
vai Thr vai Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly 25 30
Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly vai Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys 40 45
Ser vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 50 55 60
Asn vai Pro Glu Trp ser Tyr Ile vai Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn 65 70 75 80
Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His 85 90 95
Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 100 105 110
Asn Ser Trp ser ser His Glu Ala ser Leu Gly vai ser ser Ala Cys 115 120 125
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Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg ser Tyr Asn Asn Thr 145 150 155 160
Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp 165 170 175
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Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile vai Lys Lys Gly Asp ser Ala 245 250 255
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<210> 6 <211> 290 <212> PRT
<213> vírus Influenza de Patos <400> 6
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Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys ser vai Ala Gly Trp 65 70 75 80
Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp 85 90 95
Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro 100 105 110
Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu ser Arq Il e 115 120 125
Asn His Phe Glu Lys Ile Gln lie Ile Pro Lys Ser ser Trp ser Asp 130 135 140
His Glu Ala ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly ser 145 150 155 160
Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala 165 170 175
Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu 180 185 190
Leu vai Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr 195 200 205 Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser vai Gly Thr ser Thr 210 215 220
Leu Asn Gln Arg Leu vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn 225 230 235 240
Gly Gln ser Gly Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn 245 250 255
Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr 260 265 270
Ala Tyr Lys Ile vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu 275 280 285
Val Glu 290

Claims (35)

1. Proteína H5 de vírus influenza, em que a proteína H5 tendo o aminoácido 223N e a modificação 328K+, em que a numeração das posi- ções de aminoácidos da proteína H5 refere-se à posição de aminoácido co- mo exemplarmente dada em SEQ ID NO: 1 e em que a modificação 328K+ significa que em posição de aminoácido 328 de proteína H5 uma segunda Iisina (K+) é inserida.
2. Proteína H5 de acordo com a reivindicação 1, em que tal pro- teína H5 tem o aminoácido 94N.
3. Proteína H5 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que tal proteína H5 tem o aminoácido 120N.
4. Proteína H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que tal proteína H5 tem o aminoácido 155N.
5. Proteína H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que tal proteína H5 tem um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93 - 95: GNF b. aa 123 - 125: SDH c. aa 128 - 130: SSG d. aa 138 - 140: GSS e. aa 226 -228: MDF f. aa 270 -272: EVE g- aa 309 -311: NKL
6. Proteína H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que tal proteína H5 compreende um peptídeo que compreende: i. as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 4, 5 ou 6; ou ii. qualquer peptídeo que tenha pelo menos 85% de homologia de seqüência ao polipeptídeo de i) e que compreende inibição de hemagluti- nina em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina; ou iii. qualquer parte dos polipeptídeos de i) ou ii) compreendendo pelo menos 8 aminoácidos contíguos de quaisquer de tais peptídeos de i) ou ii) e onde qualquer um de tais peptídeos compreende inibição de hemaglutinina em um ensaio padrão de inibição de hemaglutinina; ou iv.qualquer peptídeo de i), ii) ou iii) tendo um dos aminoácidos36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120S, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, .212K, 212R, 212E, 263A ou 263T; ou v. qualquer peptídeo de i), ii), iii) ou iv) tendo um ou mais dos seguintes grupamentos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: a. aa 93- ■95: GNF b. aa 123 - 125: SDH c. aa 128 - 130: SSG d. aa 138 -140: GSS e. aa 226 -228: MDF f. aa 270 -272: EVE g- aa 309 -311: NKL
7. Proteína H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 6, em que tal proteína H5 é originada de um vírus influenza de aves.
8. Proteína H5 de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 7, em que tal proteína H5 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
9. Molécula de ácido nucleico, codificando a proteína H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 9.
11. Vacina compreendendo a. a proteína H5 como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 9, ou o vetor como definido na reivindicação 10, e b. um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, em que o excipi- ente é um ou mais adjuvantes.
13. Vacina de acordo com a reivindicação 12, em que o adjuvan- te é um adjuvante baseado em Emulsigen.
14. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 13, em que a vacina compreende um ou mais antígenos.
15. Vacina de acordo com a reivindicação 14, em que o dito an- tígeno é um antígeno de um patógeno de aves domésticas ou mamíferos.
16. Vacina de acordo com a reivindicação 15, em que o dito an- tígeno é H3, H7 ou H9 de vírus influenza.
17. Processo para produção de proteína H5 como definida em qualquer uma de reivindicações 1 a 8, em que o dito processo compreende as etapas de: a. isolamento ou amplificação de ácido nucleico que codifica tal proteína H5; b. clonagem de ácido nucleico codificando H5 em um vetor de expressão; c. expressão de proteína H5
18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o vetor de expressão é um baculovírus recombinante.
19. Processo de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que a proteína H5 é expressa em células de insetos.
20. Processo para produção de vacina compreendendo uma pro- teína H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o dito processo compreende as etapas de: a. obtenção de uma proteína H5 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; mistura de proteína H5 de etapa a) com um veículo e/ou excipi- ente farmacêutico aceitável.
21. Processo para produção de vacina compreendendo um áci- do nucleico H5 como definido na reivindicação 9 ou um vetor como definido na reivindicação 10, em que o dito processo compreende as etapas de: a. obtenção de molécula de ácido nucleico H5 como definido na reivindicação 9 ou o vetor como definido na reivindicação 10; b. mistura de molécula de ácido nucleico H5 ou vetor de etapa a) com um veículo e/ou excipiente farmacêutico aceitável.
22. Uso da proteína H5 como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, como um medicamento.
23. Uso da molécula de ácido nucleico como definido na reivin- dicação 9, como um medicamento.
24. Uso do vetor como definido na reivindicação 10 como um medicamento.
25. Uso da vacina como definido em qualquer uma das reivindi- cações 11 a 16, como um medicamento.
26. Uso da proteína H5 como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, para a preparação de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por influenza viral.
27. Uso da molécula de ácido nucleico como definido na reivin- dicação 9, para a preparação de uma composição farmacêutica para a profi- laxia ou tratamento de infecções causadas por influenza viral.
28. Uso do vetor como definido na reivindicação 10, para a pre- paração de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecções causadas por influenza viral.
29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a28, em que a infecção influenza viral é causada por vírus influenza de aves, suínos ou seres humanos ou qualquer combinação ou híbrido dos mesmos.
30. Processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, em que o processo compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína H5 como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 8, a um sujeito em necessidade de um tal tratamento.
31. Processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, em que o processo compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido nucleico H5 como definido na reivindicação 9 ou o vetor como definido na reivindicação 10 a um sujeito em necessidade de um tal tratamento.
32. Processo para o tratamento ou profilaxia de infecções de vírus influenza, em que o processo compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina de proteína H5 como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 16 a um sujeito em necessidade de um tal tratamento.
33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, em que a infecção influenza é causada por vírus influenza de aves, suínos ou seres humanos ou qualquer sua combinação ou híbrido.
34. Kit de partes compreendendo: a. a proteína H5 como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 9, o vetor como definido na reivindicação 10, ou a vacina como definida em qual- quer uma das reivindicações 11 a 16; e b. um folheto de embalagem indicando o uso de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico, vetor ou vacina de a) para o tratamento ou profi- Iaxia de infecções causadas por vírus influenza.
35. Kit de acordo com a reivindicação 34, em que tal kit compre- ende pelo menos ainda um antígeno de patógeno de aves domésticas ou mamíferos.
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