CN102406932A

CN102406932A - 用于治疗/预防流感病原体在物种间传播的疫苗的用途

Info

Publication number: CN102406932A
Application number: CN2011103839490A
Authority: CN
Inventors: 于尔根.戴姆根; 埃里克.M.沃恩
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2012-04-11
Also published as: US8883123B2; WO2007053446A3; BRPI0617952A2; AU2006309007A1; AU2006309007A8; EP1942924B1; TW200731986A; CN101300023A; US20070207168A1; KR20080065680A; EP1942924A2; JP2009513667A; CA2626866A1; ATE543512T1; AR056733A1; WO2007053446A2

Abstract

本发明涉及用于治疗/预防流感病原体在物种间传播的疫苗的用途。本发明涉及预防第一物种动物的病原体传播至第二物种动物的方法，其特征在于将第一物种动物的病原体抗原用于免疫接种第二物种动物，以对抗该第一物种动物的该病原体，其中施用该抗原使得该第一物种动物的病原体在该第二物种动物中的繁殖降低或消失。

Description

用于治疗/预防流感病原体在物种间传播的疫苗的用途

本申请是申请日为2006年10月27日、中国申请号为200680040045.5、发明名称为“用于治疗/预防流感病原体在物种间传播的疫苗的用途”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及医药领域，优选涉及传染病领域。特别的，本发明涉及接种第一物种的动物的疫苗以预防病原体的种内转播(“水平传播”)以及种间传播(“垂直传播”)。更具体地说，本发明是关于流感疫苗及其用于治疗及预防流感感染、此外用于预防流感的种内传播及种间传播的用途。

背景技术

流感感染在动物及人类中仍为重要的感染。流感是由经历连续抗原改变/修饰且具有动物保虫宿主的病毒引起。因此未来可发生新的流行及大流行，且会难以实现该疾病的根除。流感病毒在本领域中是熟知的且(例如)由2004年12月的P.Palese，Nature Medicine，第10卷，第12期，第S 82至S 86页及其他参考文献进行更详细描述。简言之，A型流感病毒的基因组由八个单链片段组成，且病毒粒子在其表面上具有两种主要糖蛋白：血球凝集素(H)及神经氨酸酶(N)。由于有至少15种不同的血球凝集素(H1至H15)及9种不同的神经氨酸酶(N1至N9)亚型，因此在流感病毒中存在相当多的抗原变异。

H5N1型鸡瘟病毒的流感病毒已经证实感染猪及人类。这些病毒也可直接自禽类传递至人类(Claas等人，Lancet 1998，351：472；Suarez等人，J.Virol.1998，72：6678；Subbarao等人，Science 1998，279：393；Shortridge，Vaccine1999，17(增刊1)：S26-S29)。在已知人类临床病例中死亡率接近约50％。

在上个世纪中，猪为流感大流行的重要载体。猪、骆驼及海豹，优选猪，可充当禽流感病毒的“混合室”，且因此代表克服从家禽(流感病毒的天然保虫宿主)至哺乳动物的物种障碍的潜在风险因子。其通常藉由易感动物(例如猪)被已承认的哺乳动物(猪)流感病毒和禽流感病毒双重感染而发生。此双重感染可产生新的重组病毒，这种重组病毒可以是人类或猪大流行的病因。然而，最新证据可表明目前的禽类H5病毒株与哺乳动物流感病毒的重组并不会产生高毒性重组体。另一方面，禽流感病毒可感染猪，且藉由自发性突变可变得适应于猪。一旦病毒可在猪(或其他哺乳动物)种群中造成水平感染，就会克服关键障碍。

然而，大部分东南亚猪已感染源自毗邻的家禽饲养业的禽类(H5)流感病毒株。由于目前这种感染为无症状性感染，所以其仅可由实验室方法诊断且因此常被忽视。存在这种无症状性感染的猪为病毒提供适应哺乳动物系统、在猪种群中传播、和感染人类的机会的高风险。

因为预期猪与人类之间的物种障碍较低，所以变异“猪”流感病毒在人类中水平感染的风险急剧增大。目前可用的抗A型流感感染的疫苗为含有流感H1、H2及H3亚型的变体的灭活病毒疫苗制剂。这种疫苗的使用限于人类的疫苗接种，以预防人至人的传播。因此这种疫苗，包括目前预防人至人传染的疫苗接种策略在内，对于非哺乳动物流感病毒向哺乳动物的传播及适应不具预防性。这些疫苗，包括目前疫苗接种策略在内，未充分考虑到非哺乳动物流感病毒(例如禽流感病毒)能感染诸如猪、骆驼、海豹等的非人类哺乳动物，且能在那些非人类哺乳动物中与哺乳动物流感病毒重组的事实。

因此，需要更能得到新的高效疫苗及新的疫苗接种方法，以提供控制流感感染的更佳方法且对疾病负担产生积极影响。

附图说明

图1展示在本文中提供的本发明的构思。使第二物种的动物(例如猪)对第一物种的动物(家禽)的病原体(例如流感H5N1)免疫，预防或至少降低第一物种的病原体向相同物种的另一动物(例如猪至猪)或向第三物种(例如猪至人)的传播。

图2展示两个H5多肽的氨基酸序列。

发明内容

本发明涉及下述各项。

1.预防第一物种动物的病原体传播至第二物种动物的方法，其特征在于将第一物种动物的病原体抗原用于免疫接种第二物种动物，以对抗该第一物种动物的该病原体，其中施用该抗原使得该第一物种动物的病原体在该第二物种动物中的繁殖降低或消失。

2.如项1所述的方法，其特征在于该第一物种为家禽。

3.如项2所述的方法，其特征在于该第二物种为哺乳动物。

4.如项1所述的方法，其特征在于该抗原为微生物或该微生物的抗原性部分。

5.如项4所述的方法，其特征在于该微生物为病毒。

6.如项5所述的方法，其特征在于该病毒为禽流感病毒。

7.如项6所述的方法，其特征在于该病原体为H1、H3、H5、H7、H9亚型或其组合的禽流感病毒。

8.如项1所述的方法，其特征在于该抗原为重组抗原。

9.如项8所述的方法，其特征在于该重组抗原由重组杆状病毒产生。

10.如项9所述的方法，其特征在于该重组杆状病毒表达禽流感病毒的H1、H3、H5、H7和/或H9抗原。

11.预防第一物种动物的病原体传播至人的方法，其特征在于将第一物种动物的病原体抗原用于免疫接种除了人之外的第二物种动物，其中施用该抗原使得该第一物种动物的病原体在该第二物种动物中的繁殖降低或消失，并且降低/预防该病原体进一步传播给人类。

12.如项11所述的方法，其特征在于该第一物种为家禽。

13.如项11所述的方法，其特征在于该第二物种为除了人之外的哺乳动物。

14.如项11所述的方法，其特征在于该抗原为微生物或该微生物的抗原性部分。

15.如项14所述的方法，其特征在于该微生物为病毒。

16.如项15所述的方法，其特征在于该病毒为禽流感病毒。

17.如项16所述的方法，其特征在于该病原体为H1、H3、H5、H7、H9亚型或其组合的禽流感病毒。

18.如项11所述的方法，其特征在于该抗原为重组抗原。

19.如项18所述的方法，其特征在于该重组抗原由重组杆状病毒产生。

20.如项19所述的方法，其特征在于该重组杆状病毒表达禽流感病毒的H1、H3、H5、H7和/或H9抗原。

21.预防或降低第一物种动物的病原体和第二物种动物的病原体在动物中重组的方法，其中使用包含第一物种动物的病原体抗原的药物组合物来免疫接种第二物种动物，以对抗该第一物种动物的该病原体。

22.如项21所述的方法，其特征在于施用该抗原使得该第一物种动物的病原体在该第二物种动物中的繁殖降低或消失。

23.如项21所述的方法，其特征在于所述该第一病原体为禽流感病毒，该第二病原体为哺乳动物流感病毒。

24.如项23所述的方法，其特征在于所述药物组合物包含H1、H3、H5、H7、H9或其组合的禽流感病毒抗原。

已令人惊讶地发现猪可有效经接种以抵抗禽流感病毒(参见实施例2，结果)。通过用包含禽流感病毒抗原的适合疫苗接种猪，所述禽流感病毒抗原优选H1、H3、H5、H7和/或H9，更优选H5和/或H7，可降低或完全消除产生对猪适应的变异流感病毒株的风险。因此，由于消除在流感病毒的天然哺乳动物保虫宿主内的病毒。可降低或完全消除禽流感病毒对人类的适应。因此本发明的一个方面是关于产生疫苗，优选重组疫苗，所述疫苗基于禽流感血球凝集素1、3、5、7和/或9亚型(亦即H1、H3、H5、H7和/或H9)，用于猪的接种，从而当感染禽流感病毒(所述禽流感病毒包含相同抗原或展示与用于疫苗接种的一种或多种抗原的交叉反应性的抗原)时，预防或降低禽流感病毒在猪中的繁殖。

如本文中使用的术语“繁殖”，包括(但不限于)病毒基因组和/或粒子组合体的复制。如本文中使用的术语“降低”或“繁殖降低”意指经接种的动物中的复制率在统计学上显著低于在未接种动物中的复制率。换言之，在用感染性流感病毒攻击的猪中禽流感病毒的效价的算术平均值低于在攻毒之前未经接种的猪中的效价。术语“算术平均值较低”意指降低大于20％、优选大于40％、甚至更优选大于50％、甚至更优选大于80％、甚至更优选大于100％。就此而论，术语“消除”意指在攻击的第10天后、优选第9天后、更优选第8天后、甚至更优选第7天后、甚至更优选第6天后、甚至更优选第5天后、甚至更优选第4天后、甚至更优选第6天后、甚至更优选第3天后、甚至更优选第2天后、最优选第1天后，在用感染性流感病毒攻击的经接种的猪中检测不到病毒复制。

根据一个更通常的方面，本发明是关于包含第一物种动物的病原体抗原的抗原性组合物用于制备用于使第二物种的动物免疫的药物组合物的用途，其中当施用至该第二物种的动物时，该药物组合物使得当该第二物种的动物感染该第一物种动物的感染性病原体时，在第二物种的动物中对第一物种的动物有感染性的病原体的繁殖降低或消失，优选条件是该药物组合物的抗原性组合物的抗原是存在于该感染性病原体之中或其上。

第一物种及第二物种可为相同物种或不同物种。优选第一物种与第二物种不同，甚至更优选第一物种为例如鸟、鸡、鸭、火鸡等的家禽，且第二物种为哺乳动物，优选为猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠、人，最优选为猪。

因此，根据另一方面，本发明是关于包含家禽的病原体的抗原的抗原性组合物用于制备用于使哺乳动物免疫的药物组合物的用途，其中当施用至该哺乳动物时，该药物组合物使得当用该家禽的感染性病原体感染哺乳动物时，在该哺乳动物中对家禽有感染性的病原体的繁殖降低或消失，条件是该药物组合物的抗原性组合物的抗原是存在于该感染性病原体之中或其上。

如本文中描述的术语“药物组合物”包括(但不限于)用于降低或预防感染的疫苗或用于治疗及减轻感染的物质组合物。

如所使用的术语“病原体”包括(但不限于)通常对其宿主造成疾病或病患，或至少破坏其宿主的正常生理的微生物或其任何病原部分。例如，家禽的病原体为禽流感病毒。

因此根据本发明的另一方面，根据本发明的对家禽有感染性的病原体为流感病毒、优选为禽流感病毒。根据本发明的另一方面，对家禽有感染性的病原体为H1、H3、H5、H7或H9亚型的禽流感病毒，更优选为H5或H7亚型的禽流感病毒，最优选为H5N1亚型的禽流感病毒。

如本文中使用的术语“抗原性组合物”意指包含一或多种抗原的物质组合物。

如本文中使用的术语“抗原”意指(但不限于)肽、多肽、糖肽或多糖，能够与免疫系统的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性互相作用，以在施用该抗原的宿主中引起、活化或激发针对该抗原的免疫反应。术语“抗原”亦指核酸分子，优选DNA或RNA分子，其每一种编码和表达肽、多肽或糖肽，所述肽、多肽或糖肽能够与免疫系统的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性相互作用，以引起、活化或激发针对该核酸分子编码的该抗原的免疫反应。用于制备根据本发明使用的药物组合物的抗原为微生物或该微生物的抗原性部分和/或制剂。就此而言，如本文中所使用的术语“免疫”意指(但不限于)免疫反应的任何起因或免疫反应的增强。

如所使用的术语“免疫反应”意指(但不限于)细胞和/或抗体介导的针对所关注的组合物或疫苗的免疫反应。通常，“免疫反应”包括(但不限于)以下效应中的一种或多种：产生或活化特异性针对抗原或包括于所关注的组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒素T细胞和/或yd T细胞。较优选宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，以使得对新感染的抵抗力增强，和/或疾病的临床严重性降低。该保护作用将由与如以上描述的宿主感染相关的症状的减少或缺乏来证实。

如在本文中使用的术语“其抗原性部分和/或制剂”意指该部分和/或制剂的至少一个分子为抗原性的或具有抗原特性。微生物的抗原性部分和/或制剂包括(但不限于)具有抗原特性的、包括其任何片段的肽、多肽、糖肽和/或多糖。

当分子能够与免疫系统的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性相互作用时，则该分子为“抗原性的”或具有“抗原特性”。抗原性多肽(例如)含有至少约五个、且较优选至少约10个氨基酸的表位。在本文中亦被称作“表位”的多肽的抗原性部分可为对于抗体或T细胞受体识别具有免疫优势的多肽的那一部分，或其可为通过使抗原性部分与用于免疫的载体多肽接合，来产生针对该分子的抗体的多肽的一部分。具有抗原性的分子无需本身具有免疫原性；免疫原性即能够无需载体而引起免疫反应。换言之，抗原性部分亦包括(但不限于)需要与载体接合以具有免疫原性的半抗原。

如上所述，抗原可为微生物或其抗原性部分和/或制剂。较优选该微生物为病毒或其抗原性部分和/或制剂，且最优选为流感病毒或其抗原性部分和/或制剂。根据本发明的另一方面，用于制备药物组合物的抗原为禽流感病毒或其抗原性部分和/或制剂。

根据本发明的另一方面，用于制备药物组合物的抗原为流感病毒的血球凝集素(H)和/或神经氨酸酶(N)。较优选该抗原为该禽流感病毒的H1、H3、H5、H7和/或H9。在此上下文中，术语“和/或”意指单一抗原或上述抗原的任何组合可用于制备药物组合物。与目前存在于猪种群中的H1或H3病毒株相比，H5及很可能H7似乎更保守。因此，交叉保护的可能性似乎更有利。因此，将禽流感病毒的H5和/或H7、最优选H5用作用于制备药物组合物的抗原。

如本文中使用的术语“血球凝集素5(H5)”或“禽流感病毒的H5”意指(但不限于)任何天然产生的H5及任何修饰形式的H5，该修饰形式包括H5的任何缺失、取代和/或插入突变体。此外其意指H5的任何抗原性部分，其意指在标准血球凝集素抑制作用测定中展示抗原特性的任何肽片段。通常H5的该抗原性部分包含编码H5的氨基酸序列的35、30、25、20、18、15、13、10、9或最优选8个连续氨基酸，其为修饰或未经修饰的，在标准血球凝集素抑制作用测定中展示抗原特性。标准血球凝集素抑制作用测定例如是描述于Stephenson等人，Virus Research第103卷，第91-95页(2004)及其他参考文献中，或描述于实施例中。在结果可疑的情况下，如在实施例2中所描述的HI测定应被理解为与如本文中所描述的本发明的所有方面有关的相关参照测定。

根据本发明可使用的较优选H5抗原包括与未经修饰H5相比展示更高抗原特性的任何经修饰的H5抗原，其中该抗原特性是在例如如实施例2中所描述的标准血球凝集素抑制作用测定中测量的。简言之，进行HI测定以检测HA-特异性抗体的存在。在HI测定中以四个血球凝集单位[4HA单位]的浓度使用异种H5N1病毒A/鸡/墨西哥/232/94。随后在U形底微量滴定盘中将于PBS中的连续两倍血清稀释物与含有4HA单位的病毒的等体积(25μl)混合，且在37℃下温育一小时。将于PBS中浓度为0.5％的鸡红血球添加至含血清-病毒的孔中，且在室温下温育40分钟。将HI效价测定为观测到血细胞凝集的抑制作用的最高血清稀释物的倒数。

众所周知，Haesebrouck及Pensaert(1986)发现“在抵抗攻击病毒的HI效价与保护不受攻击的保护作用之间可存在相关性”。Haesebrouck及Pensaert(1986)亦测定HI效价≥40的猪“完全抵抗攻击，且在攻毒时呼吸道中没有病毒繁殖发生”。因此，在经接种的猪中HI效价≥40的产生会与保护作用相关。(F.Haesebrouck及M.B.Pensaert.1986.Effect of intratrachealchallenge of fattening pigs previously immunised with an inactivated influenzaH1N1vaccine(Veterinary Microbiology，11(1986)239-249239)9。必须假定相等或至少几乎相等的H5HI效价亦会产生猪抵抗禽流感病毒的完全免疫保护。较低效价至少产生经接种动物的血清转化，且导致这些动物的部分免疫保护，这也可急剧降低大流行的风险。

更优选地，根据本发明使用的H5抗原包括与由SEQ ID NO：2的序列编码的H5抗原相比展示增大的抗原特性的经修饰H5抗原，其中该抗原特性是在例如如Lüschow等人，Vaccine 19(2001)，第4249-4259页及其他参考文献中所述的标准血球凝集素抑制测定中测量的。如在本文中使用的术语“更高或增大的抗原特性”是指比参照H5抗原(亦即未经修饰的H5抗原或具有SEQ ID NO：2的序列的H5抗原)高至少20％、较优选至少50％、更优选至少75％、甚至更优选至少100％的血球凝集素抑制作用。

此外根据本发明可使用的较优选H5抗原包括包含肽的H5抗原，其中该肽包含：

i.SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或；

ii包含如上所述的标准血球凝集素抑制作用中的血球凝集素抑制作用的与i)的多肽具有至少85％序列同源性、更优选至少约90％序列同源性、仍更优选至少约95％序列同源性、甚至更优选至少约97％序列同源性、仍甚至更优选至少约98％序列同源性且甚至更优选至少约99％序列同源性的任何肽；或

iii.包含i)或ii)的任一肽的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9或最优选8个连续氨基酸的i)或ii)的多肽的任何抗原性部分。

iv.具有氨基酸223N、36T/223N、36K/223N、83A/223N、83T/223N、83D/223N、86A/223N、86V/223N、120N/223N、120S/223N、155N/223N、155S/223N、156A/223N、156T/223N、189R/223N、189K/223N、212K/223N、212R/223N、212E/223N、223N/263A、223N/263T或120N/155N/223N的i)、ii)或iii)的任何肽。

v.具有氨基酸223N及选自由以下组成的组的以下氨基酸簇的一个或多个的i)、ii)、iii)或iv)的任何肽：

a.aa 93-95：GNF

b.aa123-125：SDH

c.aa 128-130：SSG

d.aa 138-140：GSS

e.aa 226-228：MDF

f.aa 270-272：EVE

g.aa 309-311：NKL；或

vi.具有氨基酸223N及选自由以下组成的组的以下氨基酸簇的一个或多个的i)、ii)、iii)或iv)的任何肽：

a.aa 93-95：GNF

b.aa 128-130：SSG

c.aa 138-140：GSS。

此外根据本发明可使用的较优选H5抗原包括包含表1中提供的肽或其任何免疫原性部分的H5抗原：

表1H5抗原

#表1中给出的氨基酸位置是指如在SEQ ID NO：1中例示性限定的位置。换言之，表1的氨基酸223是指SEQ ID NO：1的序列的氨基酸223。

-意指与参照序列相比，在此位置的氨基酸为可变的。

此外根据本发明可使用的较优选H5抗原包括包含以下的H5抗原：

i.具有NCBI保藏编号AAT65209、CAJ32556、ABC47656、CAF21874、CAF21870、AAC58998、AAC58997、AAC58996、AAC58994、AAC58993、AAC58992、AAC58991、AAC58990、AAC58995、AAS45134、AAN17270、AAN17269、AAN17268、AAN17267、AAN17266、AAN17265、AAN17264、AAN17263、AAN17262、AAN17261、AAN17260、AAN17259、AAN17257、AAN17256、AAN17255、AAN17254、AAA43083、AAA43082、AAB19079、BAE48696、BAE48693、BAE48696、BAE48695、BAE48694、BAE48692、BAE48691、BAE48690、BAE48689、BAE48688、BAE48687、BAE48686、BAE48685、BAE48684、BAE48683、AAC58999、ABC72082、AAV91149、AAP71993、AAP71992、AAP71991、AAP71990、AAP71989、AAP72011、AAP72010、AAP72009、AAP72008、AAP72007、AAP72006、AAP72005、AAP72004、AAP72003、AAP72002、AAP72001、AAP72000、AAP71999、AAP71998、AAP71997、AAP71996、AAP71995、AAP71994、AAF99718、ABF58847、AAG38534、AAC32102、AAC32099、AAL75847、AAC32101、AAC32098、AAC32088、AAC32078、AAR99628、AAC32100、AAM49555、AAL75843、AAL75839、AAD13573、AAD13568、AAF04720、AAF04719、AAC34263、AAR16155、AAD13574、AAD13570、AAD13575、AAD13572、AAD13569、AAD13567、AAD13566、AAK57506、AAG01225、AAG01215、AAG01205、AAG01195或ABD83813的序列的肽，或

ii与i)的肽具有至少85％序列同源性，更优选者至少约90％序列同源性，仍更优选者至少约95％序列同源性，甚至更优选至少约97％序列同源性，仍甚至更优选至少约98％序列同源性及甚至更优选至少约99％序列同源性，且在如上所述的标准血球凝集素抑制作用中显示出血球凝集素抑制作用的任何肽；

iii.i)或ii)的任一肽，其具有氨基酸223N、36T/223N、36K/223N、83A/223N、83T/223N、83D/223N、86A/223N、86V/223N、120N/223N、120S/223N、155N/223N、155S/223N、156A/223N、156T/223N、189R/223N、189K/223N、212K/223N、212R/223N、212E/223N、223N/263A、223N/263T或120N/155N/223N；或

iv.i)、ii)的肽的任何抗原性部分，其包括i)、ii)或iii)的这种肽中任一的至少35、30、25、20、18、15、13、10、9或最优选8个连续氨基酸；或

v.iv)的这种抗原性部分中的任一个，其中这些抗原性部分包含H5的氨基酸223；或

vi.v)的这种抗原性部分中的任一个，其中这种抗原性部分包含氨基酸223N；或

vii.i)、ii)、iii)、iv)、v)或vi)的任一肽，其具有氨基酸223N和一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸簇：

h.aa 93-95：GNF

i.aa 123-125：SDH

j.aa 128-130：SSG

k.aa 138-140：GSS

l.aa 226-228：MDF

m.aa 270-272：EVE

n.aa 309-311：NKL；或

viii.i)、ii)、iii)或iv)的任一肽，其具有氨基酸223N及一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸簇：

d.aa 93-95：GNF

e.aa 128-130：SSG

f.aa 138-140：GSS。

如本文中使用的“序列同源性”是指一种测定两个序列的相关性的方法。为测定序列同源性，将两个或两个以上的序列最佳比对，且(若需要)引入间隙。与序列同源性相比，当测定序列同源性时将保守氨基酸取代计为匹配。换言之，为获得与参照序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参照序列中的85％、较优选90％、甚至更优选95％的氨基酸残基或核苷酸应匹配或包含经另一氨基酸或核苷酸的保守取代，或在参照序列中不包括保守取代的高达15％、较优选高达10％、甚至更优选高达5％的总氨基酸残基或核苷酸的多个氨基酸或核苷酸可插入参照序列中。同源序列较优选包含至少一段50、甚至更优选100、甚至更优选250、甚至更优选500个核苷酸。在该比对后，基于逐位法来确定序列同源性，例如，若在特定位置上核苷酸或氨基酸残基相同，则序列在该位置上“同源”。该位置同一性的总数随后除以参照序列中核苷酸或氨基酸残基的总数，得到％序列同源性。藉由已知方法可易于计算序列同源性，该等方法包括(但不限于)那些描述于ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.N，编，Oxford University Press，New York(1998)、Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W，编，AcademicPress，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.及Griffin，H.G.，编，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.及Devereux，J，编，M.Stockton Press，New York(1991)；及Carillo，H，及Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中的方法，其教导以引用的方式并入本文中。设计测定序列同源性的较优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。测定序列同源性的方法是经编码为测定给定序列之间的序列同源性的公众可用的电脑程序。这种程式的实例包括(但不限于)GCG程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990))。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLASTManual，Altschul，S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，其教导以引用的方式并入本文中)。这些程序使用预设间隙加权最佳比对序列，以产生给定序列与参照序列之间最高程度的序列同源性。

此外根据本发明可使用的较优选H5抗原为：

i.那些具有氨基酸223N及修饰328K+的前述提及抗原中的任一个；

ii.那些具有氨基酸94N/223N及修饰328K+的前述提及抗原中的任一个；

iii.具有氨基酸223N及修饰328K+的禽类起源的任何H5抗原，其中禽类起源意指该H5序列是得自最初自感染5型禽流感病毒的家禽分离的病毒分离株；或

iv.具有氨基酸94N/223N及修饰328K+的禽类起源的任何H5抗原，其中禽类起源意指该H5序列是得自最初自感染5型禽流感病毒的家禽分离的病毒分离株；或

v.具有氨基酸155N/223N及修饰328K+的禽类起源的任何H5抗原，其中禽类起源意指该H5序列是得自最初自感染5型禽流感病毒的家禽分离的病毒分离株；或

vi.具有氨基酸120N/155N/223N及修饰328K+的禽类起源的任何H5抗原，其中禽类起源意指该H5序列是得自最初自感染5型禽流感病毒的家禽分离的病毒分离株；或

vii.具有修饰94N/223N及修饰328K+的任何H5抗原；或

viii.具有修饰94N/155N/223N及修饰328K+的任何H5抗原；或

ix.具有修饰94N/120N/155N/223N及修饰328K+的任何H5抗原；或

x.具有修饰223N、修饰328K+及选自由以下组成的组的以下氨基酸簇中的一个或多个的任何H5：

a.aa 93-95：GNF

b.aa 123-125：SDH

c.aa 128-130：SSG

d.aa 138-140：GSS

e.aa 226-228：MDF

f.aa 270-272：EVE

g.aa 309-311：NKL；或

xi.具有氨基酸223N及修饰328K+及选自由以下组成的组的以下氨基酸簇的一个或多个的任何H5抗原：

a.aa 93-95：GNF

b.aa 128-130：SSG

c.aa 138-140：GSS；或

xii.具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的任何H5抗原。

此外，根据本发明可使用的较优选H5抗原包括如由2005年9月6日的Hoffmann等人，PNAS，第106卷，第36期，第12915-12920页所描述的H5抗原。此参考文献的公开内容以引用的方式全部包括于本文中。

如在本文中使用的H5蛋白的氨基酸位置的编号是指如SEQ ID NO：1中例示性给出的氨基酸位置。SEQ ID NO：1表示缺乏信号肽的病毒株鸭/中国/E319-2/03的血球凝集素的氨基酸序列。换言之，若提及在位置223处的氨基酸(氨基酸223)，则氨基酸残基意指对应于SEQ ID NO：1的氨基酸223。在此情况下，氨基酸223会为丝氨酸(S)。术语“223N”或“155N”例示性地意指分别在氨基酸位置223及155处(根据SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号)应编码氨基酸天冬酰胺(N)。换言之，若提及“具有氨基酸223N的H5抗原”，则通常在氨基酸位置223处编码丝氨酸(根据SEQ ID NO：1的氨基酸位置编号)的H5氨基酸分子，该氨基酸应由天冬酰胺(N)取代。术语“328K+”或“修饰328K+”意指在H5抗原的氨基酸位置328处(根据SEQID NO：1的氨基酸位置编号)插入第二个赖氨酸(K+)。在位置328及329处的氨基酸序列天然编码赖氨酸-赖氨酸的情况下，不再插入其他赖氨酸(K)。然而，大多数已知H5序列在氨基酸位置328及329处编码赖氨酸-精氨酸。在任何这种情况下，术语328K+修饰意指应在位置328处的赖氨酸及在位置329处的精氨酸之间插入第二个赖氨酸(K)。随后经修饰的序列将读做赖氨酸-赖氨酸-精氨酸(KKR)。

在本发明的含义中，可以经修饰或未经修饰的形式使用任何其他抗原(尤其任何H及N抗原)。如关于H5抗原所提及，与未经修饰的抗原相比在标准血球凝集素抑制测定中展示高抗原特性的经修饰的抗原最优选。

如何在流感病毒的核苷酸序列中引入上述修饰中任一个的方法在此项技术中是为熟知的。整个流感病毒的基因组序列可根据本发明加以修饰，例如根据在进一步引用的US 6,951,754中描述的方法。

此外，可使用本领域常规的分子生物学、微生物学及重组DNA技术，对编码如本文中所描述的抗原的核酸序列加以修饰。这种技术充分说明于文献中。参见(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；DNA Cloning：A Practical Approach，卷I及II(D.N.Glover编1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames与S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames及S.J.Higgins，编(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编)，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley与Sons，Inc.1994)。

在经接种动物中的针对例如H5的血球凝集素抗原的免疫反应可通过例如在实施例2中所述的本领域熟知的标准方法加以测量。简言之，主要由血球凝集素抑制作用(HI)和/或病毒中和测定确定的那些血清抗体效价是公认的免疫保护替代测量法。标准HI及病毒中和测定可在如Palmer等人，1975，Advanced Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis，U.S.Department ofHealth，Education and Welfare，Washington，DC和/或Kida等人，1982，Virology，第122卷，第38-47页中所述的Madin Darby犬肾细胞中进行。关于本发明使用的参照测试是描述于进一步引用的Lüschow等人，Vaccine19(2001)，第4249-4259页中。如上所述，在结果可疑的情况下，应了解，如实施例2中所述的HI测定应理解为与本文中所描述的本发明所有方面有关的相关参照测定。

根据另一通常方面，本发明是关于包含第一物种的动物的病原体的抗原的抗原性组合物用于制备用于使第二物种的动物免疫的药物组合物的用途，其特征在于向第二物种的动物施用包含第一物种的动物的病原体的抗原的药物组合物导致当该第二物种的动物感染该第一物种的动物的感染性病原体时，在第二物种的动物中对第一物种的动物有感染性的病原体的复制降低或消失，其限制条件为药物组合物的抗原性组合物的抗原是存在于感染性病原体之中或其上。如在本文中使用的术语“复制”意指其中，病原体的基因组的加倍/倍增。术语复制降低的含义是在前文描述。

根据另一通常方面，本发明是关于包含第一物种的动物的病原体的抗原的抗原性组合物用于制备用于使第二物种的动物免疫的药物组合物的用途，其特征在于向第二物种的动物施用包含第一物种的动物的病原体的抗原的药物组合物导致当该第二物种的动物感染该第一物种的动物的感染性病原体时，预防第一物种的动物的感染性的病原体对第二物种的动物适应。如在本文中所使用的术语“适应”意指其中，病原体适于在新物种中复制，其意指病原体已克服物种障碍。若病原体垂直传播，其意指相同物种的动物至动物(亦被称作：种间传播或垂直传播)，则认为物种障碍被克服。

根据另一方面，本发明是关于禽流感病毒的血球凝集素H1、H3、H5、H7和/或H9用于制备用于向猪施用的药物组合物的用途，其中当施用至猪时，该药物组合物使得当感染该H1、H3、H5、H7或H9亚型的感染性禽流感病毒时，在猪中该H1、H3、H5、H7或H9亚型的感染性禽流感病毒的繁殖降低或消失。使用抗原H5和/或H7最优选。

根据另一方面，本发明是关于禽流感病毒的血球凝集素H1、H3、H5、H7和/或H9用于制备药物组合物的用途，当向猪施用时，其使得当感染该H1、H3、H5、H7或H9亚型的感染性禽流感病毒时，防止亚型5的感染性禽流感病毒自禽类向猪的适应。使用抗原H5和/或H7最优选。根据另一方面，甚至更优选禽流感病毒的血球凝集素H5和/或H7用于制备该药物组合物的用途。

根据另一方面，本发明是关于包含H1、H3、H5、H7和/或H9亚型的禽流感病毒的抗原的药物组合物用于制备用于治疗和/或预防动物抵抗禽流感的疫苗的用途。较优选地，欲使用的抗原为禽流感病毒的H1、H3、H5、H7和/或H9。更优选欲使用的抗原为禽流感病毒的H5和/或H7。根据该实施例的另一方面，欲治疗的动物为家禽，例如鸟、鸭或鹅。根据本发明的另一方面，欲治疗的动物为哺乳动物，较优选猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠或人类。

根据另一方面，本发明是关于用于预防第一物种的动物的病原体向第二物种的动物传播的方法，其特征在于使用第一物种的动物的病原体的抗原用于使第二物种的动物对该第一物种的动物的病原体免疫，其中施用该抗原使得在该第二物种的动物中该第一物种的动物的病原体的繁殖降低或消失。

根据先前描述的方法的另一实施例，第一物种为家禽。根据该方法的另一方面，第二物种的动物为哺乳动物，较优选为猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠或人类，更优选为猪。根据此方法的抗原为先前描述的那些抗原。较优选该抗原为微生物或该微生物的抗原性部分和/或制剂。更优选该微生物为病毒来源，甚至更优选该微生物为禽流感病毒。

第一物种的动物的病原体较优选为先前提及的那些病原体。简言之，该病原体为禽流感病毒。根据另一方面，该病原体为H1、H3、H5、H7或H9亚型的禽流感病毒。更优选该病原体为H5N1亚型的禽流感病毒。

根据另一方面，本发明是关于预防第一物种的动物的病原体向第二物种的动物传染的方法，其特征在于使用第一物种的动物的病原体的抗原用于使第二物种的动物对该第一物种的动物的病原体免疫，其中施用该抗原使得在该第二物种的动物中第一物种的动物的病原体的繁殖降低或消失，其中该抗原为流感病毒的血球凝集素(H)和/或神经氨酸酶(N)，较优选为禽类来源的流感病毒的血球凝集素(H)和/或神经氨酸酶(N)。根据该方法的另一方面，抗原为禽流感病毒的H1、H3、H5、H7和/或H9，而H5和/或H7更优选。那些抗原的更详细描述可见于前文。

根据另一重要方面，本发明是关于预防第一物种的动物的病原体向人类传播的方法，其特征在于使用第一物种的动物的病原体的抗原用于使并非抵抗第一物种的动物的病原体的第二物种除人类之外的动物免疫，其中施用该抗原使得在该第二物种的动物中第一物种的动物的病原体的繁殖降低或消失。较优选第一物种为家禽，例如鸟、鸡、鸭等，且第二物种的动物为除人类之外的哺乳动物，较优选为猪、牛、马、海豹、骆驼、犬、猫、仓鼠、小鼠，最优选为猪。

根据另一方面，本发明是关于预防第一物种的动物的病原体向人类传播的方法，其特征在于使用第一物种的动物的病原体的抗原用于使第二物种物种的动物对该第一物种的动物的病原体免疫，其中施用该抗原使得在该第二物种的动物中第一物种的动物的病原体的繁殖降低或消失，其中抗原为流感病毒的血球凝集素(H)和/或神经氨酸酶(N)，较优选为禽类来源的流感病毒的血球凝集素(H)和/或神经氨酸酶(N)。根据该方法的另一方面，抗原为禽流感病毒的H1、H3、H5、H7和/或H9，而H5和/或H7更优选。那些抗原的更详细描述可见于前文。

本发明的另一方面是关于预防或降低第一物种的动物的病原体在动物中与第二物种的动物的病原体之间发生重组的方法，其中使用包含第一物种的动物的病原体的抗原的药物组合物用于使第二物种的动物对该第一物种的动物的病原体免疫。重组事件通常为克服物种障碍的原因。降低或预防该等重组事件会降低克服物种障碍的风险。若病原体垂直传播，其意指相同物种的动物至动物(亦被称作：种间传播或垂直传播)，则认为物种障碍被克服。

较优选该等病原体处于同一科或属中。更优选那些病原体为病毒，较优选为流感病毒。根据此方法的另一实施例，第一病原体为禽流感病毒且第二病原体为哺乳动物流感病毒。此外，若第一病原体为禽流感病毒且第二病原体为哺乳动物流感病毒，则较优选药物组合物包含禽流感病毒H1、H3、H5、H7和/或H9、甚至更优选H5和/或H7的抗原。

根据另一方面，本发明是关于降低或预防第一物种的动物的病原体与第二物种的动物的病原体在动物中发生重组的方法，其中使用包含第一物种的动物的病原体的抗原的药物组合物用于使第二物种的动物对该第一物种的动物的病原体免疫，且其中施用该抗原使得在第二物种的动物中第一物种的动物的病原体的繁殖降低或消失。较优选那些病原体处于同一科或属。更优选那些病原体为病毒，较优选为流感病毒。此外，若第一病原体为禽流感病毒且第二病原体为哺乳动物流感病毒，则较优选药物组合物包含禽流感病毒H1、H3、H5、H7和/或H9、甚至更优选H5和/或H7的抗原。

例如通过使用昆虫细胞中的杆状病毒表达系统，如根据本发明使用的一种或多种抗原、一种或多种抗原性组合物可以重组方式制造。成功建立的重组表达系统的其他实例为诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌(B.subtilis)的细菌表达系统、诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)的以酵母为基础的表达系统，或诸如以BHK-、CHO-和/或NS0为基础的表达系统的哺乳动物细胞表达系统。这样的系统在本领域中是熟知的，且通常可购得，例如商业上经由Clontech Laboratories，Inc.4030Fabian Way，Palo Alto，California 94303-4607，USA购得。其他表达策略是例如描述于Lüschow等人，Vaccine第19期(2001)，第4249-4259页或Veit等人，PNAS第103卷(2006)，第8197-8202页中。此外，重组腺相关病毒系统已成功建立，且例如描述于进一步提及的US 5,436,146或WO 200203872中。此外，例如如进一步提及的US 6,265,183中描述的基于痘苗(痘)病毒的表达系统也已成功建立，且适于产生如根据本发明所使用的一种或多种重组抗原、一种或多种抗原性组合物。其他适合的表达系统使用诸如SV40、禽痘病毒、假性狂犬病病毒及反转录病毒的重组popova病毒。

根据本发明的另一较优选方面，一个或多个抗原或至少一种抗原是通过使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中产生。更优选重组杆状病毒编码且产生该抗原。因此，根据本发明的另一方面，禽流感病毒的抗原H1、H3、H5、H7和/或H9是由重组杆状病毒编码且产生。

然而，相关的一种或多种抗原、一种或多种抗原性组合物亦可为包含抗原的灭活病毒、包含抗原的活病毒的非致病形式、病毒的制剂和/或片段，其中该制剂和/或片段包含一种或多种抗原。

本发明的另一重要方面为诸如疫苗的药物组合物的制剂，其包含至少一种如上所述的病原体的抗原。本领域技术人员已知可与抗原一起包含于该组合物/疫苗中的额外组份(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences.(1990).第18版Mack Publ.，Easton)。专家可使用已知可注射、生理上可接受的无菌溶液。为制备即用溶液，易于使用诸如生理盐水或相应血浆蛋白质溶液的等渗水溶液。药物组合物/疫苗可呈现为冻干物或干燥制剂，其可直接在使用之前在无菌条件下用例如作为试剂盒的一部分的已知可注射溶液复原。

另外，本发明药物/疫苗组合物可包括一种或多种兽医学上可接受的载体。如本文中所使用，“兽医学上可接受的载体”包括(但不限于)任何及所有溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂及其类似物。

稀释剂可包括水、生理盐水、右旋糖、乙醇、甘油及其类似物。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖及其他。稳定剂包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐及其他。

如本文中所使用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)的皂素、油包水乳液、水包油乳液、水/油/水双重乳液。

该乳液是以下列物质为基础物质：尤其是轻质液体石蜡油(EuropeanPharmacopea型)；类异戊二烯油(诸如角鲨烷或角鲨烯)；由烯烃(尤其是异丁烯或癸烯)的低聚合所产生的油；含有直链烷基的酸的酯或醇的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、三(辛酸/癸酸)甘油酯或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯、尤其异硬脂酸酯。该油是与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其是脱水山梨糖醇的酯、二缩甘露醇的酯(例如去水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯，其任选经乙氧基化，及聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物嵌段，尤其Pluronic产品(特别是L121)。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(编Stewart-Tull，D.E.S.).John Wiley and Sons，NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15：564-570(1997)。适合水包油乳液的实例为诸如

(MVP Laboratories，Inc.Omaha，NE，USA)的以Emulsigen为基础的佐剂。已令人惊讶地发现，以水包油乳液(较优选那些以Emulsigen为基础的佐剂，更优选者

及

可有效地增加包含H5抗原(较优选重组H5抗原)的药物/疫苗组合物的功效。

此外，亦有可能使用描述于由M.Powell及M.Newman编，Plenum Press，1995的“Waccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上的SPT乳液，及描述于此同一书的第183页上的乳液MF59。

佐剂的另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及顺丁烯二酸酐及烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物为尤其与糖或多醇的聚烯基酯交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物由术语卡波姆(carbomer)已知(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参看美国专利第2,909,462号，其描述与聚羟基化化合物交联的这种丙烯酸聚合物，其中该聚羟基化化合物具有至少3个羟基、较优选不超过8个羟基，该至少三个羟基的氢原子经具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团置换。这些较优选基团为例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团的那些含有2至4个碳原子的基团。不饱和基团可自身含有诸如甲基的其他取代基。以名称Carbopol；(BF Goodrich，Ohio，USA)销售的该等产品为尤其合适的。其是与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选使用Carbopol 971P。在顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生可被中和的酸溶液，较优选至生理pH值，以得到其中掺入免疫原性组合物、免疫组合物或疫苗组合物自身的佐剂溶液。

其他适合佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂A、Avridine脂-胺佐剂、大肠杆菌热不稳定肠毒素(重组或其他)、霍乱毒素或胞壁酰二肽及其他多种佐剂。

佐剂较优选是以每剂量约100μg至约10mg的量添加。甚至更优选佐剂是以每剂量约100μg至约10mg的量添加。甚至更优选佐剂是以每剂量约500μg至约5mg的量添加。甚至更优选佐剂是以每剂量约750μg至约2.5mg的量添加。最优选佐剂是以每剂量约1mg的量添加。

药物/疫苗组合物可进一步包括一种或多种例如白介素、干扰素或其他细胞因子的其他免疫调节剂。药物/疫苗组合物亦可进一步包括庆大霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。虽然本领域技术人员可容易地测定适用于本发明的上下文中的佐剂及添加剂的量及浓度，但本发明涵盖每毫升剂量的疫苗组合物包含约50μg至约2000μg佐剂及较优选约250μg佐剂的组合物。在另一较优选实施例中，本发明涵盖包含约1μg/ml至约60μg/ml的抗生素、且更优选小于约30μg/ml的抗生素的疫苗组合物。

用于流感疫苗的施用策略在本领域中是熟知的。涵盖用于灭活病毒及减毒病毒疫苗的粘膜接种策略。虽然粘膜可为局部递送疫苗的靶点，但可使用多种策略向粘膜递送免疫原性蛋白质。

在一特定实施例中，疫苗可以与霍乱毒素的混杂物、或作为与霍乱毒素的接合物或嵌合融合蛋白质的形式施用，其中该霍乱毒素诸如霍乱毒素B或霍乱毒素A/B嵌合体(Hajishengallis，J Immunol.，154：4322-32，1995；Jobling及Holmes，Infect Immun.，60：4915-24，1992)。基于使用霍乱毒素B亚单位的粘膜疫苗已经描述(Lebens及Holmgren，Dev Biol Stand 82：215-27，1994)。在另一实施例中，可制备用于粘膜接种的与热不稳定肠毒素(LT)的混杂物。

其他粘膜免疫策略包括将病毒囊封于微囊中(US 5,075,109、US5,820,883及US 5,853,763)及使用免疫增强膜载体(WO 98/0558)。经口施用的免疫原的免疫原性可通过使用红血球(rbc)或rbc血影(US 5,643,577)或通过使用蓝舌病抗原(US 5,690,938)来增强。

实施例

以下实例提出根据本发明的优选材料及程序。然而，应了解这些实例是仅以说明的方式提供，且应认为其不对本发明的总范围加以任何限制。

实施例1

构建编码且表达HA H5抗原的重组杆状病毒

含有HAH5抗原的重组杆状病毒是如下产生：化学合成H5HA的编码序列(SEQ ID NO：2)且将其亚克隆入转移载体pVL1392(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)。通过使用寡聚核苷酸引物及

定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)产生H5HAMutK+(SEQ ID NO：4)，并将其亚克隆入转移载体pVL1392(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)。随后将含有编码H5HA抗原(SEQ ID NO：2)及H5HAMutK+(SEQ IDNO：4)的基因的pVL1392质粒与

(Sigma)杆状病毒DNA共转染进入Sf9昆虫细胞(BD Biosciences Pharmingen)中，以产生含有编码SEQ IDNO：2的基因H5HA及编码SEQ ID NO：4的基因H5HA mutK+的重组杆状病毒。空斑纯化含有编码H5HA(SEQ ID NO：2)及H5HAMutK+(SEQ IDNO：4)的基因的重组杆状病毒，且将种原病毒株(master seed virus，MSV)在SF9细胞系上扩增，等分，且在-70℃下储存。当在间接萤光抗体测定或Western印迹中用多克隆血清或单克隆抗体检测时，如上所述的感染H5HA杆状病毒以产生MSV或实用种毒株(Working Seed Virus)的昆虫细胞表达H5HA抗原(SEQ ID NO：2)及H5HAMutK+(SEQ ID NO：4)抗原。

在以适当量的重组杆状病毒(分别为H5HA及H5HA MutK+)接种后，随后将含有SF+细胞(Protein Sciences，Inc.，Meriden，CT)的旋转烧瓶在27±2℃下温育7天，且在该时间内同时加以搅拌100rpm。该等烧瓶使用通风盖以容许空气流动。收集含有经杆状病毒感染的SF+细胞的粗制全细胞培养物及每一培养物的细胞培养物清液层。

实施例2

制备包含HA H5抗原的药物组合物(疫苗)

收集在昆虫细胞中通过基于杆状病毒的表达系统表达的粗制全细胞H5HA蛋白及H5HA MutK+蛋白。在约32与39℃之间，在5mM环化二元亚乙基亚胺binary ethylenimine(BEI)(最终浓度)存在下将杆状病毒灭活72至96小时。灭活完成后，添加0.3M硫代硫酸钠溶液至5mM的最终浓度以中和任何残余BEI。中和后，添加各种佐剂且产生以下疫苗/药物组合物。

疫苗

实施例3

猪抗禽流感的疫苗接种

1.引言

此研究的目的在于测定含有重组H5血球凝集素(HA)抗原的粗提取物的实验疫苗在猪中诱发血球凝集抑制作用(HI)效价的能力。以H5HA抗原评估各种佐剂。

在此研究中评估的HA H5原型含有来自常规H5HA或H5HA MutK+的抗原。常规H5HA是得自A/鸭/中国/E319-2/03，而H5HAMutK+由经工程化以含有在S120N、D150N、S223N处的三种特定氨基酸改变及328MutK+的常规H5HA组成。其也含有氨基酸94N。在H5HAMutK+处的特定氨基酸改变产生更加类似A/HK/213/03的HA的H5HA。目前认为A/HK/213/03的H5HA的氨基酸组成帮助H5HA的抗体识别。

2.研究设计

表1.研究概述

在研究开始时小猪为3周±5天龄。在研究开始时小猪为临床上健康的。在研究第0天、第21天及第35天获得血液样品。

在研究第1至35天每日观察所有研究动物的一般健康状况。在每次疫苗接种后的七天，每日观察注射部位且记录可见反应。在研究第35天的动物研究阶段完成后，对所有动物人道地实施安乐死。

3.疫苗

将如实施例2中描述的疫苗501至514用于猪疫苗接种研究。

4.血球凝集抑制作用测定

在第0天及第21天以含有H5HA的原型对猪执行疫苗接种。在第0天、第21天、第35天收集猪血清用于血球凝集抑制作用(HI)测定的评估。进行HI测定以检测HA-特异性抗体的存在。在HI测定中使用四个血球凝集单位[4HA单位]的浓度的异种H5N1病毒(A/鸡/墨西哥/232/94)。随后在U形底微量滴定盘中将于PBS中的连续两倍血清稀释物与含有4HA单位病毒的等体积(25μl)混合，且在37℃下温育一小时。将于PBS中的0.5％的浓度的鸡红血球添加至含血清-病毒的孔中，且在室温下温育40分钟。将HI效价测定为其中观察到血细胞凝集的抑制作用的最高血清稀释度的倒数。

5.结果

在第0天及第21天HI测试使用1×1mL的墨西哥政府官方H5N1抗原(A/鸡/墨西哥/232/94)[4HA单位]疫苗接种方案。

BIV H5(得自A型流感病毒(A/鸭/中国/E319-2/03(H5N1)))

BIV H5K+(包括S120N、D155N、S223N及添加的328K+的突变型BIV H5)

结果证实大多数疫苗组合物在经接种的猪中引起免疫反应。特别的，大多数疫苗组合物导致血清转化，其意指大多数经接种的猪发展出针对在HI测定中使用的禽流感病毒的特异性抗体。总而言之，结果清楚且无庸置疑地证明所主张的本发明的构思很好地发挥了作用。通过用禽流感病毒的相关抗原接种猪，可急剧降低猪(第二物种的动物)广泛感染禽流感病毒(第一物种的病原体)的风险。这一点已经被清楚地证实。此外，通过这一接种概念，禽流感病毒向哺乳动物(包括人类)的传播及适应急剧降低。猪为包括禽流感病毒的禽类病原体的最重要的保虫宿主中之一。若在猪中的病毒繁殖及因此禽流感对猪的适应的风险显著降低或得以控制，则禽流感病毒对人类的任何适应的风险亦可急剧降低。万一，若抗原的施用产生较低HI效价(其意指效价低于30)，则需要利用抗原进一步加强，以进一步提高HI效价且增强经接种的猪中的免疫保护。因此，低效价并不意指着未实现保护，其仅教导似乎需要进一步加强以提高免疫反应。在经接种的猪中免疫反应可被测量的事实证实基于本发明的创新构思发挥了很好的作用。换言之，由此提供的实验清楚且无庸置疑地给出本发明的创新构思起作用的证据。