KR20150070186A - 세포주 - Google Patents

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KR20150070186A
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브룬트 마이클 반
마르셀로 마렐리
윌리엄 브래디
제프리 존슨
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Abstract

특히, PylRS와 tRNAPyl을 발현하며, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한 진핵 세포주를 안정시키는 방법으로서, tRNAPyl 발현이 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건 하에서 상기 세포주를 배양하는 단계를 포함하는, 진핵 세포주를 안정시키는 방법이 제공된다.

Description

세포주{CELL LINES}
본 발명은 비천연 아미노산을 단백질에 편입시키는 데 사용하기에 적합한, 안정적인 진핵 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 예컨대, 반감기를 연장할 수 있게 하기 위하여, 다른 단백질, 약물 또는 다른 모이어티와의 접합에 적합한, 비천연 아미노산이 편입된 단백질 및 상응하는 단백질 접합체에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 신규한 아미노산 유도체에 관한 것이다.
비천연 아미노산(non natural amino acid, nnAA)을 부위 특이적으로 표적 단백질에 도입하는 것은 비특이적인 방법보다는 기능화된 단백질 접합체 생성에 있어서 상당한 장점을 제공한다(Wang et al., 2011). 접합 화학(conjugation chemistry)을 위한 생물직교반응(bioorthogonal) 부위를 제공하는 모이어티를 함유하여 이들 부위에서 특이적인 반응이 일어날 수 있게 하는 다양한 비천연 아미노산을 이용할 수 있다. 접합 부위의 위치 조절은 활성 부위 및 필수 단백질의 기능적 도메인을 피함으로써, 생성물이 최적의 기능을 가질 수 있게 한다. 또한, 이는 기능적 특성을 향상시키는, 균일하면서도 예측 가능하게 변형된 생성물을 생산할 수 있게 하고, 이러한 생성물을 정제할 수 있게 한다.
박테리아 세포에서의 nnAA의 부위 특이적인 편입은 아미노산 치환 접근법을 통해, 그리고 nnAA으로만 동족(cognate) tRNA를 채우는 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소의 엔지니어링을 통해 이루어졌다. 표적 단백질에서 비천연 아미노산의 위치는 유전자 서열 내의 다양한 코돈에 의해 지정될 수 있지만, 대개는 그것은 앰버 코돈을 대상으로 한다. 그러나 E. 콜라이 및 다른 원핵 기반의 시스템에서 발현될 수 있는 다양한 단백질은 이러한 생물체의 단백질 접힘 기구에 의해 제한된다. (포유동물의 발현 시스템과 같은) 진핵 발현 시스템은 최적의 치료적 기능을 위해 글리코실화를 필요로 하는 것들(예컨대, G-CSF, 인슐린, 에포이틴 알파), 단백질 복합체로 존재하는 것들(예컨대, 항체), 또는 박테리아 시스템에서는 접근할 수 없는 이황화결합 형성과 같은 번역 후 변형을 필요로 하는 것들(예컨대, 심방 나트륨 이뇨인자)을 포함하는 광범위한 단백질을 발현시킬 수 있다.
포유동물 세포에 nnAA을 도입하기 위한 시스템은 시험관 내에서 채워진 tRNA의 형질감염(Hecht et al., 1978; Kohrer et al., 2001; Kohrer et al., 2003)을 통해서 또는 유전적으로 암호화된 직교성 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 이용하여(Mukai et al 2008, Liu W. et Al., 2007; Wang W., 2007; Ye, S. et Al., 2008; Sakamoto, Ket Al., 2002; Takimoto, J. et Al., 2009; Chen, P. et Al., 2009) 개발되었다. 화학적으로 아실화된 tRNA는 재아실화되지 않으므로, 시험관 내이든 생체 내이든 대규모 단백질 합성에 그것들을 이용하는 것은 매우 비싸다. 유전체적으로 암호화된 RS/tRNA 쌍은, 숙주 세포에 대해, nnAA 삽입의 특이성을 보유하기 위하여 직교성일 것이 요구된다.
직교성 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 이용하는 데 있어서, RS와 tRNA의 직교성(orthogonality)은 nnAA에 대한 특이성을 가능하게 하는 주요 부위에서 돌연변이를 통해 달성되지만, 동시에 기본적인 아미노산 및 숙주 tRNA의 인식을 감소시키거나 없앤다. 또한, tRNA는 숙주 RS에 의한 인식을 방지하기 위하여, 그리고 앰버 종결 코돈을 인식하도록 변형될 수 있다. E. 콜라이 TyrRS/B. 스테아로써모필러스 tRNAtyr(Liu, W., 2007; Ye et al., 2008; Sakamoto et al., 2002) 및 E. 콜라이 TyrRS/ E. 콜라이 tRNAtyr(Wang, W., 2007; Takimoto et al., 2009)을 포함한 몇몇 RS/tRNA 쌍이 개발된 바 있다.
아미노산 피롤리신에 대해 특이성을 나타내는 하나의 직교성 RS/tRNA 쌍이 고세균의 하위부류(메틸아민을 대사하는 메탄 생성 고세균)에서 자연적으로 진화하였음이 관찰된 바 있다. 피롤리신은 모든 다른 아미노산 및 tRNA에 대해 직교성이 되도록 자연적으로 진화된 제21의 아미노아실-tRNA 합성효소를 이용한다.
피롤리신은 천연 아미노산으로, 앰버 코돈에 의해 확실하게 지정되는 유일한 것이다. 문헌(Blight et al., 2004)은 PylRS와 tRNApyl이 E. 콜라이에서 앰버 코돈에 피롤리신을 편입시킬 수 있음을 보여주었다. 그들은 또한 야생형("WT") PyLRS는 자연적으로 무차별적이며, 리신의 유사체를 편입시킬 수 있음을 보여주었다.
Yokoyama 등(EP1911840)은 PylRS/tRNA 시스템이 진핵 세포에서 직교성을 나타냄을 증명하였고, 박테리아 세포에서 앰버 코돈에 의해 암호화된 표적 단백질 안으로 몇몇 nnAA을 편입시킬 수 있음을 보여주었다. 또한, 이들 저자는 아미노산 결합 포켓을 형성하며 다른 표준적인 아미노산에 비해 피롤리신을 선택하는 작용을 하는 pylRS 내의 핵심 아미노산 잔기들을 확인하였다. 이러한 부위에서의 돌연변이는 tRNApyl를 인식하고 AzZ-lys으로 아미노아실화할 수 있는 돌연변이를 생성했다(Yanagisawa 2008).
이러한 직교성은 박테리아 및 진핵 세포로 확대된다.
PylRS는 자연적으로 리신을 배제하도록 진화된, 자연적으로 무차별적인 합성효소이지만, 돌연변이 없이, 아지드, 알킨 및 알켄을 포함하는 리신 유사체를 편입시킬 것이다(Yanagisawa et al, 2008; Neumann et al. 2008; Mukai et al., 2008; Nguyen et al., 2009). 이러한 특이성의 기반은, 합성효소의 활성 부위에서 아미노산을 안정화시키고 올바르게 위치시키는 피롤리신의 피롤 고리와 pylRS 결합 포켓의 아미노산 잔기들의 소수성 상호 작용에 의존적이다(Kavran et al., 2007). 이러한 RS/tRNA 쌍은 박테리아, 효모 및 포유동물 세포로의 일시적인 형질감염을 통해 도입되었으며, 다수의 비천연 아미노산의 표적 단백질로의 편입에 효과적인 것으로 나타났다.
예를 들어, EP 1911840은 E.콜라이 세포에서 N--boc-리신의 표적 단백질로의 편입을 보여주었다.
진핵 세포에서 tRNA의 발현은 tRNA 코딩 서열 내에 두 개의 내부 프로모터를 필요로 한다. 그러한 프로모터의 공통 서열은 A 박스와 B 박스로 알려져 있다(Naykova et al., 2003).
일정한 원핵 유래의 tRNA는 자연적으로 내부 프로모터로 기능하는 서열을 보유하고 있으며, 변형 없이, 또는 유전자 내의 프로모터 서열을 생성하지만 tRNA의 기능이나 그 동족 RS에 의한 인식을 바꾸지는 않는 변화와 함께, 동물 세포에서 발현될 수 있지만, tRNAPyl는 그러한 프로모터를 함유하지 않는다. 나아가, A 박스와 B 박스가 정상적으로 존재하는 D 루프는 대단히 작으며, Hancock 등이 효모에서 보고하였고(2010) 포유동물 세포에서 본 발명자들이 확인한 바와 같이, 상기 A 박스와 B 박스의 도입은 그 기능을 파괴한다.
WO2007099854는 진핵 세포에서 tRNAPyl 발현을 추진하는 데에 진핵 snRNA 프로모터를 이용하는 것을 기술하고 있다. 여기에서 기술된 DNA 구성체(construct)는 tRNApyl 유전자, 상기 tRNA 유전자의 3'에 위치한 전사 종결자 서열, 및 U1 snRNA 프로모터 또는 상기 tRNApyl 유전자에 대해 5'에 위치한 U6 snRNA 프로모터와 같이, RNA 중합효소 II 또는 III에 의하여 전사를 유도하는 프로모터 서열을 포함한다.
포유류의 발현은, 도전 중이거나 현재 원핵 시스템 또는 효모 세포가 접근할 수 없는, 완전히 접힌 단백질 및 전체 길이의 항체와 같은 단백질 복합체를 생산할 수 있게 하므로 특별한 관심의 대상이다.
인간(HEK293) 및 햄스터(CHO) 세포 모두에서, 피롤리신 아미노아실 tRNA 합성효소(pylRS) 및 이의 tRNApyl을 암호화하는 유전자들의 일시적인 형질감염 실험은, 포유류 세포에서 앰버 종결 코돈에 의해 지정된 부위에서 pylRS/tRNA 쌍이 표적 단백질 안으로 nnAA을 효율적으로 편입시킴을 보여주었다(예를 들어, Mukai 2008 참조).
EP1911840은 WT PylRS를 운반하는 벡터, tRNApyl 유전자를 운반하는 벡터 및 리신 유도체가 삽입될 부위에 앰버 돌연변이가 도입되는 표적 유전자를 운반하는 벡터의 도입을 교시하고 있다. 이러한 벡터들을 도입하는 데 이용되는 유일한 기법은 일시적인 형질감염이다. 사실, 이 특허 출원의 어디에서도 안정적인 클론을 선택하는 것이 언급되어 있지 않고, 실험적으로도 적용되어 있지 않다.
WO09038195는 촉매 활성을 향상시키고, 부피가 큰 곁사슬 구조를 가지고 있는, 리신으로부터 유래된 비천연 아미노산의 편입을 가능하게 하기 위하여 돌연변이 PylRS 효소를 생성하는 것을 기술하고 있다.
특히, WO09038195는 384번 위치의 돌연변이(메타노사르시나 마제이(methanosarcina mazei) PylRS 아미노산 서열로 지칭됨)를 기술하고 있는데, 이에 의해 Tyr384가 다른 아미노산 중에서도 페닐알라닌으로 교체된다. Tyr384가 기질 아미노산, 특히 그의 주요 사슬과 상호 작용한다는 사실 때문에(Kavran 2007, Nozawa 2009), 효소의 촉매 활성은 기질과는 무관하게 증진될 가능성이 있다는 가설이 제기되고 있다.
위에서 지적한 바와 같이, PylRS와 tRNApyl 직교성 쌍을 기초로 한 발현은 지금까지 일시적으로 안정적인 진핵 세포주에서만 달성되었다. 일시적으로 안정적인 세포주는 상업적인 제품을 신뢰할 만하게 제조하기에는 적합하지 않다. 실은, 본 발명자들은 포유류 세포에서 유래된 현재 시판 중인 생물학적 제품들은 안정적인 세포주에 의해서만 독점적으로 생성된다고 믿고 있다.
따라서, 당해 기술 분야에는 PylRS 및 tRNApyl 직교성 쌍을 함유하여 nnAA을 함유하는 단백질을 상업적인 규모로 생산하는 것을 촉진하는 안정적인 진핵 세포의 생산 방법을 개발할 필요가 여전히 존재한다.
본 발명은 전술된 필요성을 해결한다.
선천적인 또는 유전적으로 발전된 PylRS에 의해 인식되고 앰버 코돈 부위에서 단백질로 편입된 아미노산 유도체로 정의된 피롤리신 유사체는 과거 몇 년 동안 개시되었으며, 예를 들어 Feckner 등(Fekner, Li, " Chan, 2010)과 Liu 등이 검토하였다. 기능기 또는 번역 후 변형을 수반하는 유사체들은 pylRS-tRNApyl 시스템을 이용하여 단백질 안으로 부위 특이적으로 편입되었다. 몇몇 연구(예컨대, Yanagisawa 등 참조)는 N6 치환기가 결합 포켓 피롤리신 내의 방향족 고리인 유사체를 수용하고자 PylRS 효소 내의 돌연변이에 초점을 두었다. 다른 연구, 예를 들어, Nguyen 등(또한 WO2010/139948)과 Li 등(또한 WO2011/044255)은 부피가 큰 N6 치환기를 가지고 있지 않은 피롤리신 유사체의 확인에 초점을 두었으며, 그 결과, 합성하기가 간단하고, 천연 pylRS/tRNApyl 쌍과 상호 작용하는 더욱 단순한 유사체를 얻었다. 추가적인 피롤리신 유사체를 개발할 필요성은 여전히 남아 있다. 현재까지 제조된 피롤리신 유사체는 리신 백본으로부터 발전된 것들로 제한되었으나, 본 발명자들은 다양한 아미노산 구조로부터 출발하는 천연 pylRS/tRNApyl 쌍을 이용하여 단백질로 성공적으로 편입된 피롤리신 유사체를 생성하였다.
매우 세포 독성이 큰 약물에 합성 링커에 의해 공유적으로 결합된 재조합 키메라, 인간화 또는 인간 항체로 이루어진 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)는 종양 세포에 대해 세포 독성 약물을 표적화하기 위하여 최근 수년 동안 개발되어 왔다. 종양 관련 항원을 표적으로 하는 항체, 강한 독소 및 적절한 접합 화학의 올바른 조합은 정상 조직에 대한 약물의 독성을 피하는 한편, 종양 세포에 직접적으로 독소를 전달하는 데에 매우 효과적일 수 있다.
현재까지 개발된 ADC는 ADC를 생성할 때 사용된 접합 화학에 따라 다른, 접합된 항체와 비접합 항체의 이질적인 혼합물이다. 특히, 가장 흔히 사용되는 접합 프로토콜의 무작위적인 속성은 항체 분자당 다양한 수의 접합된 약물(DAR)뿐만 아니라 다양한 접합 부위를 나타내는 종들의 집합을 초래한다. 일반적인 접합 화학은 리신 곁사슬을 기반으로 한 접합을 포함하는데, 이는 통상적인 항체에서 리신 잔기의 큰 이용가능성 덕분에 다양한 범위의 종들을 초래한다. 반응성 티올 기를 생성하기 위한 시스테인 잔기의 엔지니어링을 통해 더욱 부위 특이적인 접합이 얻어졌는데, 이는 거의 균질한 항체 ADC를 가져왔다.
EGFR 패밀리의 구성원인 Her2 종양 관련 항원은 항-Her 2 항체인 허셉틴(Herceptin)으로 유방암에서 성공적으로 표적화되었지만, 이러한 항체 그 자체는 한정된 환자군에서 효과적이다. 더욱 강력한 형태인 아도-트라스투주맙 엠탄신은 그것에 연결된 독소를 가지고 있는 것으로, 현재 이용 가능하다. 아도-트라스투주맙 엠탄신은 암 세포의 세포질에 독소를 전달하는 아도-트라스투주맙 엠탄신의 능력 덕분에, 허셉틴에 저항성을 나타내는 환자들을 효과적으로 치료할 수 있다. 아도-트라스투주맙 엠탄신과 브렌툭시맙 베도틴에 의해 이용되는 접합 화학은 정상적으로 이황화 결합을 형성하는 기존의 시스테인 잔기를 이용하며, 더욱 최근에는 엔지니어링된 유리 시스테인 잔기를 이용한다. 이러한 접근법은 mAb 상의 상이한 위치에서 상이한 수의 약물과 ADC의 이질적인 혼합물의 생산을 가져왔다. 이용된 링커로는 티오에테르(캐드실라(Kadcyla))뿐만 아니라, 디펩티드 링커(애드세트리스(Adcetris))도 포함하며, 후자는 리소좀 산 가수분해효소에 의해 특이적으로 분할된다. 두 가지 유형의 링커 모두 효과적으로 보이지만, 최적은 아니다. 아도-트라스투주맙 엠탄신, 브렌툭시맙 베도틴 및 겜투주맙 오조가미신의 제조에 이용된 것들과 같은, 종래의 Cys 또는 Lys을 대상으로 한 생접합(bioconjugation) 방법은 종양 세포 결합 전에 독소가 조기에 방출될 수 있게 한다. 2000년에 승인된 겜투주맙 오조가미신은 2010년 시장으로부터 회수되었는데, 이는 산에 불안정한 링커를 이용하는 것에 의한 높은 독성 때문이며, 산에 불안정한 링커는 혈액에서 ADC로부터 허용 불가능한 독소의 방출을 유발했다.
따라서, 당해 분야에는 접합 부위와 항체당 약물의 수가 잘 조절된, 고도로 균일한 ADC를 개발할 필요가 여전히 남아있다.
본 발명자들은 nnAA의 부위 특이적인 편입 및 후속적인, nnAA 부위에서의 항체의 접합을 이용하여, 균일하고 강력한 항체 약물 접합체를 생성하는 것이 가능함을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 항체의 결합의 특이성 또는 그의 생체 내에서의 약물동태학적 성질에 지장을 주지 않으면서 접합에 이용될 수 있는, IgG 불변 영역 내의 부위를 발견했다.
본 발명에 따르면, pylRS 및 tRNApyl을 발현하고, 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 발현을 가능하게 하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명은 선행 기술의 방법에 의해 제조된 세포주의 불안정성의 근원과 관련된 본 발명자들의 발견으로부터 유래한다.
앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 유전자 없이 pylRS 및 tRNApyl을 발현하는 CHO 및 HEK293 세포와 같은 종래의 진핵 세포들은 배양물에서 죽은 세포의 높은 비율, 둥근 세포 형태학, 생장 플레이트에 대한 세포의 느슨한 부착 및 감소된 세포 생장 속도를 포함하는, 세포 독성을 나타내는 표현형을 취한다는 점이 관찰될 수 있다. 본 발명자들은 표적 단백질의 발현을 가능하게 하는 상기 유전자가 나중에 발현될 때 세포의 건강이 현저히 향상되는 것으로 여겨짐을 관찰하였다. 본 발명자들에게는 이러한 독성이 nnAA 부재 시, 앰버 종결 코돈에서 종결되는, 필수적인 항존 유전자의 연장을 유도하는 다량의 tRNApyl의 시스템에서의 발현과 관련이 있는 것으로 보인다(Liebman and Sherman 1976; Liebman et al., 1976).
따라서, 이론에 얽매이지 않고, tRNApyl의 유독한 효과는 표적 단백질의 부재 시에 높은 수준의 tRNApyl이 존재할 때 발생하는 불완전한 직교성의 결과일 수 있다.
tRNApyl은 포유류 세포에서 대부분 직교성인 데 반하여, tRNApyl은 nnAA의 부재 시(천연 효소인 pylRS가 없는 경우) 숙주 RS 중 하나에 의해 비효율적으로 아미노아실화될 수 있다. 높은 수준의 tRNA를 발현하는 세포에서, 필수적인 유전자들의 불규칙한 앰버 억제를 강제하는 상당한 양의 아미노아실화된 tRNA가 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 안정적인 세포주가 tRNApyl의 명백하게 유독한 효과의 감소 또는 그것의 차폐를 나타내는 것을 목적으로 하는 방법에 의해 생성될 수 있다고 추정하였다.
따라서, 본 발명의 제1 양태로서, pylRS 및 tRNApyl을 발현하고, 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한 진핵 세포주(특히 포유류 세포주)를 안정시키는 방법으로서, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl 발현의 부정적인 효과가 감소되거나 제거되는 조건 하에서 상기 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제2 양태로서, 본 출원에 기술된 화학식 VII의 유인성(decoy) 아미노산(dnnAA)이 제공되는데, 이는 상기 안정적인 세포주를 생산 또는 유지하는 동안 배양 배지에 첨가 시, tRNApyl의 유독한 효과를 감소시키거나 가리는 장점이 있다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 본 출원에 기술된 화학식 V 및 VI의 피롤리신의 신규한 비천연 아미노산 유사체가 제공되는데, 이는 (통상적으로, 적절하게 이용될 때 생물 활성의 손실이 없이) 단백질로 용이하게 편입되고, 생접합을 위한 유용한 수단을 제공하는 데에 있어서, 제조하기가 매우 쉽다는 장점이 있다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 소정의 위치에서 비천연 아미노산의 부위 특이적인 삽입을 통해 매우 균일하고 활성이 있는 항체 약물 접합체를 획득하는 방법이 제공된다.
도 1은 플랫폼 세포주 및 후속 발현 세포주의 개발을 위해 수행된, RS/tRNA 요소의 반복적인 도입 및 선택 단계를 상세히 알려주는 도식이다.
도 2는 플랫폼 세포주를 개발하는 동안 분리된 모 세포와 분류된 세포의 기능을 비교한 것이다.
도 3은 안정적인 세포주로부터, 리신-아지드 nnAA를 함유하는 발현된 항-IL-6 IgG K274의 특성화를 나타낸다.
도 4는 어떻게 tRNA가 시스템에 대해 제한요소가 되는지 그리고 어떻게 배경 활성이 세포 증식 억제 효과를 나타내는지를 보여준다.
도 5는 항-IL-6 AzAb의 선형 20kPEG알킨과의 페길화를 나타내는 비환원 SDS-PAGE 겔(A) 및 항-IL-6-리신아지드274h의 20KPEG 시클로옥틴과의 페길화를 나타내는 비환원 SDS-PAGE 겔(B)을 나타낸다.
도 6은 항-IL-6-리신아지드274h의 31A12-20KPEG 알킨에 대한 이중특이적인 접합을 나타내는 비환원 SDS-PAGE 겔(A) 및 항-IL-6-리신아지드274h의 31A12-20KPEG 알킨에 대한 이중특이적인 접합을 나타내는 환원 SDS-PAGE 겔(B)을 나타낸다.
도 7은 R131 위치에 프로파질-리신 nnAA을 함유하는 FGF21이 효율적으로 페길화되며, 생체 내에서 기능을 보유한다는 증거이다.
도 8은 독소가 접합된 항체 및 항체 단편이 시험관 내에서 특이적인 활성을 보여준다는 증거이다.
도 9는 20K PEG 시클로-알킨과 반응하는 아지드를 함유하는 항-Her2 항체를 나타내는 비환원 겔(A) 및 20K PEG 시클로-알킨과 반응하는 아지드를 함유하는 항-Her2 항체를 나타내는 환원 겔(B)이다.
도 10은 항-Her2-리신아지드274h70l의 20K 페길화의 비환원 SDS-PAGE 겔(A) 및 4D5 AzAb-4의 20K 페길화의 환원 SDS-PAGE 겔(B)이다.
도 11은 구리 존재 시 20K PEG 말단 알킨과 반응하는 아지드를 함유하는 항-Her2 항체를 나타내는 환원 겔(A) 및 구리 존재 시 20K PEG 말단 알킨과 반응하는 아지드를 함유하는 V 항-Her2 항체를 나타내는 비환원 겔(B)이다.
도 12는 20K 선형 PEG 시클로옥틴에 접합된 리신-아지드를 편입시키는 항-PSMA scFv를 나타내는 환원 겔(A) 및 MMAF-VCP-시클로옥틴에 접합된 nnAA 리신-아지드와의 항-PSMA scFv를 나타내는 환원 겔(B)이다.
도 13은 리신 아지드와 유인성(decoy) nnAA의 경쟁의 특이성 및 기능을 시험하는 시험관 내 기능 분석을 나타낸다.
도 14는 리신 아지드와의 경쟁에서 dnnAA 기능의 효능 및 pylRS/tRNA를 함유하는 세포에서 배경(background) 앰버 억제에 미치는 dnnAA의 효과를 시험하는 시험관 내 기능 분석을 나타낸다.
도 15는 dnnAA의 존재 또는 부재 시에 생장된 pylRS/tRNA를 함유하는 세포들의 생장 속도 및 생존능 분석을 나타낸다.
도 16은 dnnAA으로 처리한 세포에서 pylRS/tRNA 기능의 집단 분석을 나타낸다.
도 17은 dnnAA으로 처리한 배양물에서 조사된 pylRS/tRNA 쌍을 함유하는 세포들의 생장 속도를 나타낸다.
도 18은 단일클론 항체를 함유하는 아지드의 페길화를 나타낸다. 1번 레인: 비처리 항체; 2번 레인: 화학식 V.1 피롤리신 유사체가 중쇄에 편입되어 페길화 조건을 거친 항체; 3번 레인: 화학식 VI.1 피롤리신 유사체가 중쇄에 편입되어 페길화 조건을 거친 항체.
도 19는 중쇄에 편입된 화학식 VI.1 피롤리신 유사체를 본래 함유하는 항체와의 4D5-아우리스타틴 F 항체 약물 접합체의 HIC 크로마토그램이다.
도 20은 페길화된 4D5 위치 돌연변이의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 21은 HIC 크로마토그래피에 의한, 다른 위치에 편입된 아지드를 가지는 4D5-AzAb에 대한 아우리스타틴 접합의 반응을 분석한 것이다.
도 22는 4D5 아지드의 위치 돌연변이로부터 유래된 ADC의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 23은 고발현 및 저발현 Her2 세포주에 대한, 4D5-2AzAb 아우리스타틴 항체 약물 접합체의 위치 변이형의, 시험관 내 세포독성 분석법에 의한, 효능 및 선택성 평가를 나타낸다.
도 24는 HIC 크로마토그래피에 의한, 4D5-2AzAb(HC274) 접합의 형광 염료에 대한 반응 분석을 나타낸다.
도 25는 H274번 위치에서 변형된 4D5의 약물동태학 및 안정성을 나타낸다.
도 26은 비접합 항체 및 아우리스타틴 시클로옥틴 유도체로 제조된 4D5-2AzAb(HC274)-아우리스타틴 F 항체 약물 접합체의 HIC 크로마토그램을 중첩시킨 것이다.
도 27은 Her2 양성 종양 세포주에 대한 4D5-2AzAb(HC274)-AF 접합체의 시험관 내 항종양 활성을 나타낸다.
도 28은 4D5-2AzAb(HC274)-AF의 생체 내 항종양 활성을 나타낸다. 각 군에 대한 평균 종양 크기(A) 생존 백분율(B)로 나타낸 종양 진행.
도 29는 이중특이적 4D5-2AzAb/FGF21의 SDS PAGE 분석을 나타낸다. 1번 레인: 분자량 마커, 2번 레인: FGF21 비처리, 3번 레인: 4D5-FGF21 이중특이적 반응, 4번 레인: 4D5-2AzAb.
도 30은 H274번 위치(항-Her2)에 nnAA을 함유하는 전체 길이의 mAb 및 IL6를 대상으로 한 scFv로 구축한 이중특이적인 항체 검출을 위한 ELISA 분석 계획 및 데이터를 나타낸다. A) 전체 길이의 mAb(4D5)의 포획 및 IL6를 이용한 이중특이성의 검출을 보여주는 ELISA. B) Her2의 세포외 도메인에 대한 전체 길이의 mAb(4D5)의 기능적 결합 및 이러한 mAb의 후속적인 검출을 보여주는 ELISA. C) Her2 세포외 도메인에 대한 mAb의 기능적 결합 및 IL6에 대한 scFv 결합을 보여주는 ELISA 분석.
도 31은 이중특이적인 4D5 AzAb-FGF21의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 32는 CuAAC 조건 및 TBTA 하에서 4D5-2AzAb(HC274)의 20 kDa 페길화의 반응 혼합물의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 33은 CuAAC와 THPTA와 함께, 4D5 AzAb에 대한 20k 페길화의 생성물에 대한 SDS PAGE 분석을 나타낸다.
도 34의 A와 B는 환원 및 비환원 조건 하에서 CuAAC/THPTA로의 4D5-2AzAb(HC274)의 2 kDa 페길화의 PAGE 분석, C는 4D5-AzAb의 2 kDa 페길화의 최종 반응 혼합물의 HIC 크로마토그램을 나타낸다.
도 35는 DAR4 4D5-AF ADC의 시험관 내 세포독성 효과를 나타낸다.
도 36은 4D5-아마니틴 ADC의 시험관 내 세포독성 효과를 나타낸다.
도 37은 CUAAC 및 SPAAC 화학을 통해 얻어진 4D5-AF ADC의 시험관 내 세포독성 효과를 나타낸다.
도 38은 CuAAC 조건 하에서 아우리스타틴 F 유도체에 대한 4D5-2AzAb(HC274) 접합의 반응 혼합물에 대한 HIC 크로마토그램을 나타낸다.
도 39는 20 KDa PEG 알킨으로 부위 특이적으로 변형된 허셉틴 AzAb 중쇄의 겔 이동성 분석을 나타낸다.
도 40은 아우리스타틴 F-시클로옥틴에 접합된 허셉틴 AzAb를 분석한 것을 나타낸다. A) 비처리 허셉틴-AzAb 및 접합 반응의 생성물의 HIC 분석. B) 환원(B) 및 비환원(C) 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 비처리 및 접합 반응의 겔 이동성 분석.
도 41은 아우리스타틴 F-알킨에 접합된 허셉틴 AzAb를 분석한 것을 나타낸다. A) 비처리 허셉틴-AzAb 및 접합 반응의 생성물의 HIC 분석. B) 환원(B) 및 비환원(C) 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 비처리 및 접합 반응의 겔 이동성 분석.
도 42는 허셉틴 ADC의 시험관 내 세포독성을 나타낸다.
서열 목록에 대한 간단한 설명
SEQ ID No 1: PylRS 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei) WT 아미노산 서열
SEQ ID No 2: PylRS 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei) Y384F 돌연변이 아미노산 서열
SEQ ID No 3: PylRS 메타노사르시나 바케리(Methanosarcina barkeri) WT 아미노산 서열
SEQ ID No 4: PylRS 디설피토박테리엄 하프니엔세(Desulfitobacterium hafniense) 아미노산 서열
SEQ ID No 5: PylRS 메타노사르시나 아세티보란(Methanosarcina acetivorans) 아미노산 서열
SEQ ID No 6: PylRS 메타노코코이데스 부르토니(Methanococcoides burtonii) 아미노산 서열
SEQ ID No 7: PylRS 메타노사르시나 써모필라(Methanosarcina thermophila) 아미노산 서열
SEQ ID No 8: PylRS 메타노살섬 질리네(Methanosalsum zhilinae) 아미노산 서열
SEQ ID No 9: PylRS 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum) 아미노산 서열
SEQ ID No 10: PylRS 메타노할로필러스 마히(Methanohalophilus mahii) 아미노산 서열
SEQ ID No 11: PylRS 디설포토마쿨룸 깁소니에(Desulfotomaculum gibsoniae) 아미노산 서열
SEQ ID No 12: PylRS 디설포스포로시누스 메리디에이(Desulfosporosinus meridiei) 아미노산 서열
SEQ ID No 13: PylRS 디설포토마쿨룸 아세톡시단스(Desulfotomaculum acetoxidans) 아미노산 서열
SEQ ID No 14: PylRS 메타노사르시나 마제이 WT 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 15: PylRS 메타노사르시나 마제이 Y384F 돌연변이 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 16: PylRS 코돈 최적화 메타노사르시나 마제이 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 17: PylRS 메타노사르시나 바케리 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 18: PylRS 디설피토박테리엄 하프니엔세 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 19: PylRS 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans) 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 20: PylRS 메타노코코이데스 부르토니 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 21: PylRS 메타노사르시나 써모필라 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 22: PylRS 메타노살룸 질리네 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 23: PylRS 메타노할로비움 에베스티가툼 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 24: PylRS 디설포토마쿨룸 깁소니에 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 25: PylRS 메타노할로필러스 마히 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 26: tRNApyl 메타노사르시나 바케리
SEQ ID No 27: tRNApyl 메타노사르시나 아세티보란스
SEQ ID No 28: tRNApyl 메타노사르시나 마제이
SEQ ID No 29: tRNApyl 메타노코코이데스 부르토니
SEQ ID No 30: tRNApyl 디설포박테리엄 하프니엔세
SEQ ID No 31: H1/TO 프로모터
SEQ ID No 32: U6 snRNA 프로모터
SEQ ID No 33:SNR52 프로모터
SEQ ID No 34: H1 프로모터
SEQ ID No 35: U6-tRNApyl 구성체(construct)
SEQ ID No 36: GFP 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 37: GFP 아미노산 서열
SEQ ID No 38: GFPY40 아미노산 서열
SEQ ID No 39: 항-IL-6 (28D2) 감마 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 40: 항-IL-6 (28D2) 감마 아미노산 서열
SEQ ID No 41: 항-IL-6 (28D2) 감마_앰버 K274 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 42: 항-IL-6 (28D2) 감마_앰버 K274 아미노산 서열
SEQ ID No 43: 항-IL-6 (28D2) 카파 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 44: 항-IL-6 (28D2) 카파 아미노산 서열
SEQ ID No 45: 항-Her2 (4D5) 감마 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 46: 항-Her2 (4D5) 감마 아미노산 서열
SEQ ID No 47: 항-Her2 (4D5) 감마_K274앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 48: 항-Her2 (4D5) 감마_K274앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 49: 항-Her2 (4D5) 감마_T359앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 50: 항-Her2 (4D5) 감마_T359앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 51: 항-Her2 (4D5)카파 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 52: 항-Her2 (4D5)카파 아미노산 서열
SEQ ID No 53: 항-Her2 (4D5)카파 D70앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 54: 항-Her2 (4D5)카파 D70앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 55: 항-Her2 (4D5)카파 E81앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 56: 항-Her2 (4D5)카파 E81앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 57: 항-PSMA scFv 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 58: 항-PSMA scFv 아미노산 서열
SEQ ID No 59: 항-PSMA scFv_117앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 60: 항-PSMA scFv_117앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 61: FGF21 WT 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 62: FGF21 WT 아미노산 서열
SEQ ID No 63: FGF21 R131앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 64: FGF21 R131앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 65: FGF21 F12앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 66: FGF21 F12앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 67: FGF21 L60앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 68: FGF21 L60앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 69: FGF21P 90앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 70: FGF21P 90앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 71: FGF21 P140앰버 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 72: FGF21 P140앰버 아미노산 서열
SEQ ID No 73: GFPY40 뉴클레오티드 서열
SEQ ID No 74: 허셉틴 뉴클레오티드 서열 중쇄
SEQ ID No 75: 허셉틴 아미노산 서열 중쇄
SEQ ID No 76: 허셉틴 H274 뉴클레오티드 서열 중쇄
SEQ ID No 77: 허셉틴 H274 아미노산 서열 중쇄
SEQ ID No 78: 허셉틴 뉴클레오티드 서열 경쇄
SEQ ID No 79: 허셉틴 아미노산 서열 경쇄
SEQ ID No 80: 3 x 플래그 태그 서열
SEQ ID No 81: 5 x Pro-6xHis 태그
SEQ ID No 82: 인간 IgG1 중쇄의 일부분(불변 영역)
SEQ ID No 83: SEQ ID No 52의 일부분(프레임워크 영역)
SEQ ID No 84: SEQ ID No 52의 일부분(프레임워크 영역)
정의
용어 "알킬"은 통상적으로 1~6개, 예컨대, 1~4개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 결합 또는 치환기를 지칭하며, 직쇄 또는 가지형일 수 있다. 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸 및 t-부틸을 포함한다.
용어 "알케닐"은 통상적으로 2~6개, 예컨대, 2~4개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 결합 또는 치환기를 지칭하며, 직쇄 또는 가지형일 수 있고, 적어도 하나의 C=C 모이어티를 함유하는 점에 있어서 불포화이다. 구체적인 예는 C=C 모이어티가 말단에 있는 말단 알켄기이다. 알케닐의 예로는 에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 및 2-메틸-프로펜-2-일을 포함한다.
용어 "알킨" 또는 "알키닐"은 통상적으로 2~6개, 예컨대, 2~4개의 탄소 원자를 함유하는 지방족 결합 또는 치환기를 지칭하며, 직쇄 또는 가지형일 수 있고, 적어도 하나의 C=C 모이어티를 함유하는 점에 있어서 불포화이다. 구체적인 예는 C=C 모이어티가 말단에 있는 말단 알킨 기이다. 알키닐 기의 예로는 -C=CH 및 -C=C-CH3을 포함한다.
용어 "아릴"은 결합의 일부분 또는 치환기의 일부분일 수 있는 방향족 고리 구조를 지칭한다. 아릴 모이어티는 하나의 고리(예컨대, 페닐) 또는 두 개의 고리(예컨대, 나프틸) 또는 셋 이상의 고리를 함유할 수 있는데, 다만, 적어도 하나의 고리는 방향족이다. 아릴 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 플루오로알킬, 할로겐, 알콕시, 니트로 및 시아노로부터 선택된 예컨대, 하나 이상(예컨대, 하나 또는 두 개, 예를 들면, 하나)의 치환기로 치환될 수 있다. 예시적인 아릴은 페닐이다.
용어 "헤테로아릴"은 결합의 일부분 또는 치환기의 일부분일 수 있는 헤테로방향족 고리 구조를 지칭한다. 헤테로방향족 고리는 O, N 및 S로부터 선택된 1~4개(더욱 일반적으로는 1~3개, 예컨대, 하나 또는 두 개)의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 하나의 고리 또는 두 개의 고리 또는 두 개를 초과하는 고리를 함유할 수 있는데, 단, 적어도 하나의 고리는 헤테로방향족이다. 하나의 6원 고리를 함유하는 예시적인 기로는 피리딘과 피리미딘을 포함한다. 하나의 5원 고리를 함유하는 예시적인 기로는 피롤, 퓨란, 티오펜, 옥사졸, 티아졸, 디아졸, 티아디아졸 및 테트라졸을 포함한다. 두 개의 고리를 함유하는 헤테로아릴 모이어티는 하나 또는 두 고리에 헤테로원자를 함유할 수 있다. 예로는 퀴놀린과 이소퀴놀린을 포함한다. 헤테로아릴기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 플루오로알킬, 할로겐, 알콕시, 니트로 및 시아노로부터 선택된, 예컨대, 하나 이상(예컨대, 하나 또는 두 개, 예를 들면 하나)의 치환기로 치환될 수 있다.
용어 "메틸" 또는 "Me"은 CH3기를 지칭한다.
용어 "OMe"은 O-CH3기를 지칭한다.
용어 "에틸" 또는 "Et"은 CH2CH3기를 지칭한다.
용어 "OEt"은 O-CH2CH3기를 지칭한다.
용어 "tBu"은 C(CH3)3기를 지칭한다.
용어 "OtBu"은 O-C(CH3)3기를 지칭한다.
용어 "OBn" 또는 "O벤질"은 O-CH2-Ph기를 지칭한다.
용어 "OFmoc" 또는 "OCH2플루오렌"은 다음 구조를 지칭한다:
Figure pct00001
용어 "페닐" 또는 "Ph"은 다음 구조의 벤젠 고리를 지칭한다:
Figure pct00002
용어 "알릴"은 CH2-CH=CH2기를 지칭한다.
용어 "염화 에틸"은 CH2CH2-Cl기를 지칭한다.
용어 "아지드" 및 "아지도"는 N=N(+)=N(-) 또는 N3 기능기를 지칭한다.
용어 "아지도알킬"은 아지도, 특히 말단 아지도에 의해 치환된 알킬을 의미한다. 예로는 n=1~4인 -(CH2)nN3를 포함한다.
용어 "할로알킬"은 하나 이상(예컨대, 1개, 2개 또는 3개, 특히 1개 또는 2개, 예를 들면 1개)의 할로겐 원자(예컨대, Cl 또는 F 원자)로 치환된 알킬을 의미한다. 예로는 -CF3 및 -CH2CH2Cl을 포함한다.
용어 "프로파질"은 말단 알킨에 부가된 메틸기를 지칭한다. 그것은 -CH2-C=C-H로 표시된다.
용어 "아미드"는 -C(=O)-NH- 결합을 지칭한다.
용어 "카바메이트"는 -O-C(=O)-NH- 결합을 지칭한다.
용어 "에스테르"는 -C-C(=O)-O-C 결합을 지칭한다.
용어 "알콕시"는 -O-알킬기를 지칭한다.
용어 "케톤"은 C-C(=O)-C 결합을 지칭한다.
용어 "피롤리신 유사체"는 자연적인 또는 유전적으로 진화된 PylRS에 의해 인식되고 넌센스 코돈 부위에서 단백질로 편입된 아미노산 유도체를 의미한다.
용어 "20개의 천연 아미노산 중 하나의 곁사슬"은 단일 글자 코드인 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y로 알려져 있는 20개의 천연 아미노산과 관련된 화학식 HOOC-CHR-NH2의 R기를 지칭한다. L 또는 S 입체화학(또는 이의 혼합물)이 의도되나, L 입체화학이 바람직하다.
용어 "세포 생존능"은 시험관 내에서 배양된 세포들의 맥락 내에서, 전체 세포 샘플을 기초로 하여, 살아 있는 (생존 가능한) 또는 죽은 세포들을 확인하는 것을 지칭한다. 세포가 성장하고 발달할 능력이 있다면 생존 가능한 것으로 간주된다. 생존능 분석법은 막 온전성(membrane integrity)과 같은 생존 가능한 세포들의 물리적 성질 또는 세포들의 대사 활성을 기초로 한다.
용어 "세포 생장"은 일정 기간에 걸친 세포 분화의 수로 측정된 세포 증식을 지칭한다. 생장은 시간이 경과함에 따른 배양물의 세포 밀도(세포/mL)를 추적하여 측정한다.
용어 "안정적인 발현"은 관심 유전자(또는 상응하는 cDNA)의, 표적 세포의 염색체로의 통합(integration)에 의해 달성되는, 단백질의 발현을 지칭한다.
따라서, 용어 "안정적인 통합"은 관심 유전자(또는 상응하는 cDNA)의, 표적 세포의 염색체로의 통합을 지칭한다. 처음에는 관심 유전자가 세포 내로 도입되어야 하고, 나중에는 핵으로, 최종적으로는 염색체 DNA로 통합되어야 한다. 안정적으로 형질감염된 세포는 다양한 방법으로 선택되고 배양될 수 있다. 예를 들어, 동일하거나 제2의 공동 형질감염된 벡터 상에서 선택 마커가 공동 발현된다. G418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 인산전달효소와 같은 항생제에 대한 내성, 디하이드로엽산 환원효소(DHFR), 또는 글루타민 합성효소를 포함하는, 형질감염된 세포를 선택하는 다양한 시스템이 존재한다. 형질감염된 세포의 배양은 저항성 세포의 혼합 집단을 얻기 위하여 벌크로, 또는 하나의 단일한 통합 사건으로부터 세포 클론들을 얻기 위하여 단일 세포 배양물을 통해 이루어질 수 있다.
용어 "표적 유전자"는 nnAA의 삽입을 통해 변형되는 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다.
본 발명에 따른 다양한 구현예
"유인성(Decoy) 아미노산" 접근법
일 구현예에 따르면, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, 세포주가 배양되는 배지에, PylRS에 대한 기질이지만((즉, 아미노아실화되고, tRNApyl 상으로 로딩되지만), 연장되는 단백질 사슬로는 편입될 수 없는 유인성(decoy) 아미노산이 존재하는 조건을 포함하는 방법이 제공된다.
따라서, 비천연 아미노산을 단백질로 편입하는 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다:
1. 동족 tRNA에 대한 직교성의 RS에 의해 용이하게 인식되고 활성화되는 유인성 아미노산을 세포 생장 배지 내로 도입한다.
2. 하나 이상의 플라스미드 상에서 RS 및 tRNA를 진핵 세포로 도입한다.
3. RS 및 tRNA 발현 카세트를 함유하는 세포를 선택한다.
4. RS 단백질 및 tRNA를 발현하는 하나 이상의 안정적인 클론을 분리하여, 플랫폼 세포주를 생성한다. 30%를 초과하는, 예를 들어, 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80%를 초과하거나 바람직하게는 90%를 초과하는 비천연 아미노산 편입 효율이 가능한 세포가 선택된다.
5. 비천연 아미노산이 편입되는 위치 또는 위치들에서 하나 이상의 앰버 코돈이 도입되도록 표적 단백질의 cDNA를 도입한다.
6. (0.5~10 pg/세포/일을 초과하는) 높은 수준의 표적 유전자 생성물을 발현하는 안정적인 클론을 분리한다.
7. 유인성 아미노산 부재 하에서, 그러나 앰버 코돈에서 편입을 가능하게 하는 비천연 아미노산의 존재 하에서 세포주를 성장시킨다.
본 구현예에 따르면, 유인성 아미노산이 PylRS 및 tRNA 합성효소 쌍을 함유하는 세포주에 존재할 때, 유인성 아미노산이 PylRS에 결합하고, tRNA를 아미노아실화시킨다. 그런 다음, 리보솜으로 넘겨지는데, 리보솜에서 tRNA는 앰버 코돈과 결합하지만, 아실화된 아미노 차단 유인물은 펩티드 결합 형성을 할 수 없게 되어, 단백질이 이 부위에서 종결된다.
일 구현예에서, 세포에서 표적 단백질의 cDNA가 일단 도입되면 이러한 유인물은 존재하지 않는다.
대안적으로, 표적 단백질을 암호화하는 cDNA가 세포 내로 도입될 때 이러한 유인성 아미노산은 배양 배지 내에 유지된다.
대안적인 구현예에서, 표적 단백질의 발현은 유인성 아미노산의 존재 하에 일어난다. 따라서, 본 구현예에 따르면, 유인성 아미노산 및 PylRS에 의해 우선적으로 이용되는, 원하는 비천연 아미노산은 모두 표적 단백질을 생산하는 동안 발효 배지에 첨가된다(또는 발효 배지에 존재한다).
PylRS에 대한 결합을 두고 유인성 아미노산이 원하는 비천연 아미노산과 어떠한 유의한 정도로 경쟁하는 경우, 유인성 아미노산을 발효 배지에 첨가하거나 유인성 아미노산이 발효 배지에 존재해서는 안 된다.
다른 구현예에서, (예컨대, 발효 배지로부터 제거한 후) 표적 단백질의 발현은 유인성 아미노산의 존재 시 일어나지 않는다. 따라서, 본 구현예에 따르면, 이러한 유인성 아미노산은 표적 단백질의 발현 중에는 발효 배지에 도입되지 않는다. 표적 단백질 생산 중에는 PylRS와 우선적으로 결합하는, 원하는 비천연 아미노산만이 발효물에 첨가된다(또는 발효물에 존재한다). 본 구현예에 따르면, 이러한 유인성 아미노산은 pylRS/tRNA를 함유하는 플랫폼 세포주의 선택 및 분리 전반에 걸쳐 배양 배지에서 이용된다. 하나 이상의 앰버 코돈을 함유하는 표적 유전자의 도입 및 선택 후에 이러한 유인성 아미노산이 제거된다.
원한다면 복수(예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 이상)의 유인성 아미노산이 이용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS 및 tRNAPyl을 발현할 수 있고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하여, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를, PylRS에 대한 기질이지만 연장되는 단백질 사슬 내로 편입될 수 없는 유인성 아미노산의 존재 하에서 배양 또는 선택하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현시킬 수 있는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl를 암호화하는 유전자를 진핵 세포주로 도입하여, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를, PylRS에 대한 기질이지만 연장되는 단백질 사슬 내로 편입될 수 없는 유인성 아미노산의 존재 하에서 배양 또는 선택하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계, (c) 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 진핵 세포주에 도입하여, 상기 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 (d) 상기 유인성 아미노산의 부재 하에서 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 전술된 양태 중 임의의 하나에 따른 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이때 세포주의 배양 또는 선택 단계는, PylRS에 대한 기질이지만, 연장되는 단백질 사슬 내로 편입될 수 없는 유인성 아미노산의 존재 하에서 이루어지며, 그에 의해 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시킨다.
"표적 우선(Target first)" 접근법
대안적인 구현예에 따르면, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되는 조건을 포함하는 방법이 제공된다.
따라서, 단백질로 비천연 아미노산을 편입시키는 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다:
1. 하나 이상의 플라스미드 상에서 비천연 아미노산이 도입되는 위치에 앰버 코돈을 함유하는 표적 유전자를 진핵 세포로 도입한다.
2. (0.5 또는 10 pg/세포/일을 초과하는) 높은 수준으로 표적 단백질을 발현시킨 세포 풀(pool) 또는 클론을 분리한다.
3. 하나 이상의 플라스미드 상에서 RS 및 tRNA를 이들 세포로 도입하고, RS 및 tRNA를 함유하는 클론을 선택한다.
4. 앰버 코돈에서 편입을 가능하게 하는 비천연 아미노산의 존재 하에서 세포주를 성장시키고, 원하는 부위에서 30%를 초과하는, 예를 들어, 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80%를 초과하거나 바람직하게는 90%를 초과하는 비천연 아미노산의 편입 효율을 나타내는 세포를 분리한다.
추가적인 구현예는 PylRS 및 tRNAPyl를 발현하고, 유도성 프로모터의 조절 하에서, 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 유인성 단백질도 발현하는 안정적인 진핵 세포주이다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS, tRNAPyl 및 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현하는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주로 도입하여, 상기 유전자가 상기 세포주에 안정적으로 통합되도록 하는 단계, (b) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl를 암호화하는 유전자를 상기 세포주에 더 도입하여, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 (c) tRNAPyl가 상기 세포주에 의해서만 발현되고, 동시에 표적 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되는 조건 하에서, 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에, 얻어진 세포주를 배양하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계를 포함한다.
" 억제성 tRNA " 접근법
대안적인 구현예에 따르면, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, tRNAPyl의 발현이 억제성 프로모터의 조절 하에서 일어나는 조건을 포함하는 방법이 제공된다.
또한, tRNAPyl의 발현이 억제성 프로모터의 조절 하에서 일어나는, PylRS 및 tRNAPyl을 발현하거나 발현할 수 있는 진핵 세포주가 제공된다.
따라서, 단백질로 비천연 아미노산을 편입시키는 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다:
1. 하나 이상의 플라스미드 상에서 RS 및 tRNA를 진핵 세포주로 도입하는데, 후자는 tRNA 발현 조절을 할 수 있게 하는, 억제성 프로모터 요소를 함유한다.
2. 억제 조건 하에서 RS 및 tRNA 발현 카세트를 함유하는 세포를 선택한다.
3. tRNA 발현을 유도하고, 높은 수준의 RS 단백질 및 tRNA를 발현하거나 리포터 유전자에서 앰버 코돈의 효율적인 억제를 나타내는 하나 이상의 안정적인 클론을 분리하여, 플랫폼 세포주를 생성한다. 30%를 초과하는, 예를 들어, 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80%를 초과하거나 바람직하게는 90%를 초과하는 비천연 아미노산 편입 효율이 가능한 세포가 선택된다.
4. 비천연 아미노산이 편입되는 위치에 앰버 코돈이 도입되도록 표적 단백질의 cDNA를 도입한다.
5. (0.5~20 pg/세포/일을 초과하는) 높은 수준의 표적 유전자 생성물을 발현하는 안정적인 클론을 분리한다.
6. 앰버 코돈에서 편입을 가능하게 하는 비천연 아미노산의 존재 하에서 세포주를 성장시킨다.
본 구현예에 따르면, 억제 tRNA의 높은 수준의 발현이 회피되고, 앰버 억제 관련 세포 독성이 방지된다.
그러한 방법에서, tRNA는 적절하게는 테트라사이클린 반응성 요소(TetO 또는 TtA)를 함유하는 H1 및 U6 프로모터와 같은 억제성 프로모터의 제어 하에서 발현된다(Herold 2008). 본 발명의 추가적인 양태는 전술된 방법 중 하나에 따라 제조된 안정화된 세포주이다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS, tRNAPyl를 발현할 수 있고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 하나 이상의 단계에서, PylRS 및 tRNAPyl를 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하는 단계로서, 이때, tRNAPyl는 억제성 프로모터의 조절 하에 있으며, PylRS 및 tRNAPyl은 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를 억제자(repressor)의 존재 하에서 배양하여 tRNAPyl의 발현이 억제되도록 하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현시킬 수 있는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하는 단계로서, 이때, tRNAPyl는 억제성 프로모터의 조절 하에 있으며, PylRS 및 tRNAPyl은 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를 억제자의 존재 하에서 배양하여 tRNAPyl의 발현이 억제되도록 하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계, (c) 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 진핵 세포주에 도입하여, 상기 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 (d) 상기 억제자의 부재 하에서 표적 단백질을 발현시켜, tRNAPyl가 발현되도록 하는 단계를 포함한다.
"유인성 단백질" 접근법
대안적인 구현예에 따르면, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 유인성 단백질도 유도성 프로모터의 조절 하에 상기 세포주에 의해 발현되는 조건을 포함하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 유인성 단백질은 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 알부민, SEAP, 액틴, b-2 마이크로글로불린, 글루타티온-s-전이효소, IgG, 또는 폴리 앰버를 함유하는 펩티드로부터 선택된다.
따라서, 단백질로 비천연 아미노산을 편입시키는 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다:
1. 앰버 코돈을 함유하는 유인성 단백질에 대한 유전자를, 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 진핵 세포 안으로 도입한다.
2. 유인성 구성체를 함유하고, 유도 시 (0.1 또는 1 pg/세포/일을 초과하는) 높은 수준으로 이러한 단백질을 발현할 수 있는 세포 풀 또는 클론을 분리한다.
3. 하나 이상의 플라스미드 상에서 RS 및 tRNA를 이들 세포로 도입하고, RS 및 tRNA를 함유하는 클론들을 선택한다.
4. 통합된 유인성 구성체를 이용하여, 비천연 아미노산의 존재 하에서, 원하는 부위에서 30%를 초과하는 비율, 예를 들어, 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80%를 초과하거나 바람직하게는 90%를 초과하는 비천연 아미노산의 편입 효율을 나타낼 수 있는 클론을 분리한다.
5. 비천연 아미노산이 편입되는 위치에 앰버 코돈을 함유하는 표적 유전자를 진핵 세포 안으로 도입한다.
6. 1 pg/세포/일을 초과하는 수준의 표적 단백질 발현이 가능한 클론을 분리한다.
7. 앰버 코돈에서 편입을 가능하게 하는 비천연 아미노산의 존재 하에서 세포주를 성장시키고, 원하는 부위에서 30%를 초과하는, 예를 들어, 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80%를 초과하거나 바람직하게는 90%를 초과하는 비천연 아미노산의 편입 효율을 나타내는 세포를 분리한다.
본 발명의 추가적인 양태는 유도성 프로모터의 조절 하에서 pylRS, tRNApyl 및 유인성 단백질을 발현하는 안정적인 진핵 세포주이다.
본 구현예에 따르면, 표적 단백질의 발현이 개시될 때, 유인성 단백질의 발현은 (예컨대, 프로모터의 유도자의 제거에 의해) 중단될 수 있다.
적절한 유도성 프로모터 시스템으로는 테트라사이클린 조절 프로모터(TetO 또는 tTA; TetOn 및 TetOFF), 독시사이클린 유도성(TRE) 프로모터, cAMP 유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 활성화 프로모터 시스템, IPTG 유도성 프로모터(lac), Cd2+ 또는 Zn2+ 유도성 프로모터(금속단백질 프로모터), 인터페론 의존성 프로모터(예컨대 쥐 MX 프로모터), HIV LTR 프로모터(Tat), DMSO 유도성 프로모터(GLVP/TAXI, 엑디손), 및 라파마이신 유도성 프로모터(CID)와 같은 조건부 활성화 프로모터 및 프로모터 시스템을 포함한다.
본 구현예에 따르면, 표적 단백질의 발현이 재조합 시스템을 이용하여 개시될 때 유인성 단백질의 발현이 (예컨대, 유전자의 제거에 의해) 중단될 수 있다.
적절한 시스템으로는 Cre/lox, phi31C 기반의 통합 시스템 및 Flp-FRT 재조합 기술과 같은 표적화 재조합 시스템 또는 삽입된 카세트의 상동 재조합에 의한 시스템을 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 유인성 단백질을 발현할 수 있고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 하나 이상의 단계에서, pylRS, tRNApyl 및 상기 유인성 단백질을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하여 pylRS, tRNApyl 및 유인성 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) tRNAPyl가 상기 세포주에 의해서만 발현되고, 동시에 유인성 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되어, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 조건 하에서, 얻어진 세포주를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 PylRS, tRNAPyl, 유인성 단백질 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현할 수 있는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로, 이는 (a) 하나 이상의 단계에서, pylRS, tRNApyl 및 유인성 단백질을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하는 단계로서, 상기 유인성 단백질은 유도성 프로모터의 조절 하에서 발현되며, PylRS, tRNAPyl 및 유인성 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) tRNAPyl가 상기 세포주에 의해서만 발현되고, 동시에 유인성 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되는 조건 하에서, 얻어진 세포주를 배양하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계, (c) 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 진핵 세포주에 도입하여, 상기 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 (d) 유인성 단백질을 발현시키지 않고 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
일반
본 발명의 추가적인 양태는 전술된 방법들 중 임의의 하나에 의해 얻어진 또는 얻어질 수 있는 안정적인 진핵 세포주이다.
본 발명의 추가적인 양태는 전술된 시스템의 변형방법들(즉, 유인성 단백질, 유인성 아미노산, 억제성 프로모터/유도성 프로모터의 이용, Pyl-tRNA의 도입 전에 넌센스 코돈을 함유하는 표적 유전자의 도입 등) 중 둘 이상을 조합한 것에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻어질 수 있는 안정적인 진핵 세포주이다.
본 발명의 추가적인 양태는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에 전술된 바와 같이 안정적인 진핵 세포주를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 전술된 바와 같이 안정적인 진핵 세포주에 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서 그리고 유인성 단백질 발현의 임의의 유도인자의 부재 하에서 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 전술된 바와 같이 안정적인 진핵 세포주에 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서 그리고 임의의 유인성 아미노산의 부재 하에서 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 전술된 바와 같이 안정적인 진핵 세포주에 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서 그리고 tRNAPyl 발현의 임의의 억제자의 부재 하에서 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 전술된 바와 같이 안정적인 진핵 세포주에 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 양태는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 제조하는 단계를 포함하는 화학적으로 변형된 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 전술된 바와 같이 안정적인 진핵 세포주에 도입하여 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계, 및 얻어진 표적 단백질을 화학적으로 변형시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 이용을 위한 세포주
본 발명은 안정적인 진핵 세포주에 관한 것이었다. 적절하게는 이러한 세포주는 포유류의 세포주이다.
더욱 바람직하게는, 이러한 세포주는 CHO 세포주이나, HEK293, PERC6, COS-1, HeLa, VERO, 또는 마우스 하이브리도마 세포주일 수도 있다. 추가적인 예는 COS-7 및 마우스 골수종 세포주이다.
CHO 및 HEK293 세포주가 특히 적절하다.
본 발명의 일부 요소들은 무세포 발현 시스템의 맥락에서 이용될 수 있는데, 이때, 숙주 세포로부터 얻어진 합성 반응 용해물은 폴리펩티드의 합성에 필요한 적어도 하나의 성분을 포함한다.
합성 반응 용해물은 박테리아 또는 진핵 세포로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 합성 반응 용해물은 진핵 세포로부터, 더욱 바람직하게는, 토끼 망상 적혈구 또는 밀 배아로부터 얻어진다.
무세포 발현 시스템은 본 발명의 WT PylRS 및 tRNAPyl을 발현시킬 수 있는데, 이때, tRNApyl은 본 발명의 DNA 구성체와의 합성 반응 용해물을 얻는 데 이용되는 세포로 도입된다.
본 발명에 이용하기에 적합한 무세포 발현 시스템은 예를 들어, 본 출원에 전체가 참조로 포함된 WO201008110, WO2010081111, WO2010083148에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 세포주에서 발현되는 pylRS
본 출원에 이용된 바와 같이, pylRS는 아미노 아실 tRNA 합성효소와 관계가 있는데, 아미노 아실 tRNA 합성효소는 적절한 tRNA 분자를 피롤리신 또는 이의 유도체로 아미노아실화할 것이다.
본 발명의 pylRS는 적절하게는 진핵 세포에서 직교성의 피롤리실-tRNA 합성효소이며, 이는 메탄생성 고세균종으로부터 유래된다. 즉, 그것은 메탄생성 고세균종에서 야생형이거나 이의 돌연변이이다.
바람직하게는, 본 발명의 pylRS는 다음 중 하나로부터 유래된 피롤리실-tRNA 합성효소이다: 메타노사르시나 마제이(SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16), 메타노사르시나 바케리(SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.17), 디설피토박테리엄 하프니엔세(SEQ ID NO.4, SEQID NO.18), 메타노사르시나 아세티보란스(SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.19), 메타노사르시나 부르토니(SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.20), 메타노사르시나 써모필라(SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.21), 메타노살섬 질리네(SEQ ID NO 8, SEQ ID NO.22), 메타노할로비움 에바스티가툼 (SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.23), 메타노할로필러스 마히(SEQ ID NO.10, SEQID NO.24), 디설포토마쿨룸 깁소니에(SEQ ID NO.11, SEQID NO.25), 디설포스포로시누스 메리디에이(Desulfosporosinus meridiei)(SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.26) 및 디설포토마쿨룸 아세톡시단스(SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO.27).
가장 바람직하게는, 본 발명의 pylRS는 메타노사르시나 마제이(SEQ ID NO. 1)로부터 유래된 피롤리실 tRNA 합성효소(pylRS)이다.
본 발명의 pylRS는 야생형 합성효소일 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 pylRS는 예컨대, 그 촉매 활성을 증가시키고/시키거나 기질 아미노산에 대한 선택성을 수정하기 위하여 하나 이상의 위치에서 돌연변이될 수 있다(Yanagisawa 2008).
바람직하게는, 본 발명의 pylRS는 SEQ ID NO. 1의 Tyr 384 또는 그것의 등가물에 상응하는 위치에서 돌연변이될 수 있다. 가장 바람직하게는, Tyr 384는 페닐알라닌으로 돌연변이된다(SEQ ID NO. 2).
일 구현예에서, 본 발명의 pylRS는 기질 특이성을 수정하고 피롤리신 유사체의 편입을 가능하게 하기 위하여(또는 향상시키기 위하여) 하나 이상의 위치에서 돌연변이될 수 있다.
추가적인 돌연변이 PylRS 효소는 WO09038195 및 WO2010114615에 기술되어 있으며, 각 문헌은 본 출원에 전체가 참조로써 포함된다.
본 발명에 따른 세포주에서 발현되는 tRNApyl
본 발명의 PylRS와 공동으로 발현되는 tRNApyl는 억제 tRNA로서 기능하기 위하여 앰버 넌센스 코돈 UAG에 상보적인 안티코돈 및 3차 구조를 나타낸다.
억제 tRNA로서 기능하기 위하여, UGA, 오팔 코돈; UAA, 오커 코돈과 같은 다른 넌센스 코돈에 상보적인 인공 tRNA가 구축될 수 있다.
따라서, 본 발명이 nnAA을 암호화하는 앰버 코돈의 이용 및 앰버 억제의 개념에 대한 논의에 관하여 실질적으로 기술되고 예시되고 있지만, 이러한 앰버 코돈은 오팔 또는 오커 코돈과 같은 또 다른 넌센스 코돈으로 교체될 수 있으며, 동일한 방식으로 작용할 것으로 예상되는 것으로 이해될 것이다.
그러나 앰버 코돈을 이용하는 것이 바람직하다.
진핵 세포주에서의 발현을 최적화하기 위하여 tRNApyl 서열의 조작하는 것은 본 출원에 참조로 포함된 WO2007099854에 기술된 바 있다.
WO2007099854는 그 중에서도, 고세균으로부터 유래되는 tRNA 유전자, 바람직하게는 tRNApyl, 상기 tRNA 유전자의 3'에 위치한 전사 종결자 서열, 상기 tRNApyl 유전자에 대해 5'에 위치한, U1 snRNA 프로모터 또는 U6 snRNA 프로모터와 같은, RNA 중합효소 II 또는 III에 의해 전사를 유도하는 프로모터 서열을 포함하는 DNA 구성체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 tRNApyl은 다음의 박테리아 균주 중 하나로부터 유래된 tRNApyl이다: 메타노사르시나 마제이(SEQ ID NO 28), 메타노사르시나 바케리(SEQ ID NO 26), 디설피토박테리엄 하프니엔세(SEQ ID NO 30), 메타노사르시나 아세티보란스(SEQ ID NO 27), 메타노사르시나 부르토니((SEQ ID NO 29), 또는 메타노사르시나 써모필라.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 tRNApyl은 메타노사르시나 마제이(SEQ ID NO 28)로부터 유래된 tRNApyl이다.
본 발명의 일 구현예에서, tRNApyl은 진핵 세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포에서 발현된다.
바람직한 구현예에서, 진핵 세포에서의 발현을 위한 프로모터 요소가 자연적으로 결여된 tRNApyl은 외부의 진핵 프로모터 하에서 발현된다.
특히 바람직한 구현예에서, 외부 프로모터는 U6 프로모터이다.
특히 바람직한 구현예에서, 외부 프로모터는 H1 프로모터이다.
추가적인 구현예에서, tRNApyl 유전자를 운반하는 플라스미드는 tRNApyl 유전자에 대한 3'의 전사 종결자 서열, tRNApyl 유전자에 대해 5'에 위치된 U6 프로모터 서열, 및 프로모터 영역에 대해 5'에 위치된 CMV 인핸서 영역을 함유한다.
특히 바람직한 구현예에서, tRNApyl 유전자를 운반하는 플라스미드의 삽입물은 SEQ ID NO 35를 가지고 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 외부 프로모터는 억제성 프로모터이다.
바람직한 구현예에서, 이러한 억제성 프로모터는, 이러한 프로모터의 억제를 가능하게 하는 요소들을 함유하는 H1(예를 들면, TetO(H1/TetO; SEQ ID NO 31)), 또는 발현 억제를 가능하게 하는 요소들을 함유하는 인간 U6 snRNA 프로모터(예컨대 U6/TetO)로부터 선택된다.
표적 유전자의 말단을 지시하는 종결 코돈이 앰버 코돈이고, nnAA을 암호화하기 위하여 앰버 코돈을 이용하고자 하는 경우, 이러한 종결 코돈은 또 다른 종결 코돈(예컨대 오커 또는 오팔)으로 변경될 것이라는 점이 이해될 것이다. nnAA을 암호화하기 위하여 또 다른 넌센스 코돈을 이용하고자 하는 경우, 필요한 변경을 가하여 동일하게 적용된다.
PylRS 및 tRNApyl을 암호화하는 유전자들이 있는 진핵 세포주의 형질전환을 위한 벡터
본 발명은 진핵 세포에서 tRNApyl의 효율적인 발현을 위한 플라스미드를 제공한다. 바람직하게는, tRNApyl 발현 플라스미드는 U6 프로모터 아래에 SEQ ID 28의 tRNA 유전자의 다중 반복을 포함한다. 더욱 바람직하게는, tRNApyl 발현 플라스미드는 U6 프로모터 아래에 SEQ ID 28의 tRNA 유전자의 일렬 반복(tandem repeat)을 포함한다.
본 발명에 따르면, Pyl tRNA 유전자와 PylRS cDNA는 동일하거나 상이한 플라스미드에 의해 운반된다.
일 구현예에서, tRNApyl 유전자와 PylRS cDNA는 동일한 플라스미드 상에 존재한다.
일 구현예에서, tRNApyl 유전자와 PylRS cDNA는 상이한 플라스미드 상에 존재한다.
표적 단백질을 암호화하는 유전자들이 있는 진핵 세포주의 형질전환을 위한 벡터
본 발명은 선택적으로, 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에 이용되는 벡터는 pJTI-Fast-DEST(라이프 테크놀로지스(Life technologies)), pSelect-Blasti 및 pSelect-Zeo 벡터(인비보젠(invivogen), pENTR P5-P2 벡터(라이프 테크놀로지스), pOptivec(라이프 테크놀로지스), pFUSE-CHIg-hG1(인비보젠) 및 pFUSE-CHLIg-hK(인비보젠)를 포함한다.
적절한 프로모터의 예로는 CMV 프로모터, SV40 대형 T 프로모터, EF1알파 프로모터, MCK 프로모터 및 LTR 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
안정적인 세포주 구축 및 안정적인 클론의 선택
본 발명자들은 부위 특이적인 nnAA 편입에 필수적인 요소들을 안정적으로 발현하는 세포주의 구축에는 시스템의 상이한 요소들(pylRS, tRNA, 및 표적)의 발현을 위한 플라스미드들의 순차적인 도입, 다음으로, 각각 높은 활성을 나타내는 안정적인 클론을 확인하기 위한 선택 단계와 분류 단계(클로닝 단계)가 필요하다는 점을 발견했다.
본 발명의 일 구현예에서, 표적 유전자의 도입 및 이후 원하는 위치에서 변형된 표적 단백질 분리를 위한 출발점으로서 작용하는, 효율적인 nnAA의 도입을 위한 모든 요소들을 발현하는 안정적인 세포가 얻어졌다.
적절하게는, 이러한 접근법은 tRNA에 대한 발현 카세트가 먼저 숙주 세포로 도입되고, 구성체들을 함유하는 세포들의 풀이 벡터에 의해 부여된 항생제 내성에 의해서 선택되는, 반복적인 선택 절차를 수반한다. 다음으로, 일시적인 형질감염에 의해 개방형 해독틀을 방해하는 앰버 종결 코돈을 함유하는 살아 남은 세포들이, 에쿼리아 빅토리아로부터 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 리포터 구성체의 도입에 의해 선택된다. 이러한 선택 절차는 앰버 억제 시, 유동 세포 분석법에 의해 형광이 정량되는 전체 길이의 GFP를 생성하는 클론들을 확인하는 것으로 이루어진다. 따라서, 이러한 집단으로부터 고기능 세포들이 형광 활성화 세포 분류를 이용하여 분리된다. 최고의 클론들을 증식시키고, 이어서 추가적인 tRNA 카피들로 형질감염시킨 다음, 위에 기술된 선택 방법을 반복하였다. 이러한 방법은 각 성분의 발현 및 시험용 앰버 억제의 최적 수준이 얻어질 때까지 pylRS 발현을 위한 카세트 및 tRNA의 다중 카피들을 함유하는 통합 발현 구성체의 도입을 계속한다.
앰버 코돈에 의해 암호화되는 비천연 아미노산의 편입
본 발명의 세포주를 이용하여 제조된 단백질에, 하나 이상의 nnAA이 편입될 수 있다. 적절하게는 하나의 nnAA이 단백질 사슬로 편입된다. 단백질이 항체인 경우, 하나의 nnAA은 경쇄 또는 중쇄 또는 둘 다로 편입될 수 있다.
다른 구현예에서, 하나 초과, 예컨대, 최대 네 개, 예컨대, 두 개(또는 아마도 세 개)의 nnAA이 단백질 사슬로 편입될 수 있다. 적절하게는 모든 편입된 nnAA은 동일하다.
표적 단백질로의 편입을 위한, 앰버 코돈에 의해 암호화될 수 있는 비천연 아미노산
모이어티를 펩티드에 접합시킬 수 있도록 하기 위하여 비천연 아미노산을 이용하는 것은 본 출원에 참조로써 포함된 WO 2007/130453에 개시되어 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이 "비천연 아미노산"은 다음의 20개의 유전적으로 암호화된 알파 아미노산, 즉 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 및 셀레노시스테인 이외의 임의의 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 지칭한다. 알파 아미노산의 일반적인 구조는 화학식 I에 의해 도시된다:
Figure pct00003
.
비천연 아미노산은 통상적으로는 화학식 I을 나타내는 임의의 구조로서, 이때, R기는 20개의 천연 아미노산에 사용된 것 이외의 임의의 치환기이다. 20개의 천연 아미노산의 구조에 대해서는 예컨대, 임의의 생화학 교재(예를 들어, Biochemistry, L. Stryer, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York)를 참조한다. 본 출원에 개시된 비천연 아미노산은 위의 20개의 알파 아미노산 이외의 자연적으로 발생하는 화합물일 수 있음을 주목해야 한다. 본 출원에 개시된 비천연 아미노산은 통상적으로 천연 아미노산과 곁사슬만 다르므로, 비천연 아미노산은 다른 아미노산, 예컨대, 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산과 아미드 결합을, 자연적으로 발생하는 단백질에서 형성되는 것과 동일한 방식으로, 형성한다. 그러나, 비천연 아미노산은 천연 아미노산과 구별되는 곁사슬기를 가지고 있다. 예를 들어, 화학식 I의 R은 선택적으로, 알킬-, 아릴-, 할로겐화 아릴, 할로겐화 비닐, 할로겐화 알킬, 아세틸, 케톤, 아지리딘, 니트릴, 니트로, 할로겐화물, 아실-, 케토-, 아지도-, 하이드록실-, 하이드라진, 시아노-, 할로-, 하이드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티오에테르, 에폭사이드, 설폰, 보론산, 보론산 에스테르, 보란, 페닐보론산, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 붕산염, 보론산염, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭-, 피리딜, 나프틸, 벤조페논, 시클로옥틴과 같은, 제한 고리와 같은 시클로알킬, 노르보넨, 트랜스시클로알켄, 시클로프로펜과 같은 시클로알켄, 테트라진, 피론, 티오에스테르, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 아미노, 카르복실산, 알파-케토 카르복실산, 알파 또는 베타 불포화 산 및 아미드, 글리옥실 아미드, 또는 유기실란기 등 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
신규한 곁사슬을 함유하는 비천연 아미노산 이외에도, 비천연 아미노산은 예컨대, 화학식 II 및 III의 구조들로 도시되는 바와 같이, 수정된 백본 구조도 선택적으로 포함한다:
Figure pct00004
이때, Z는 통상적으로 OH, NH2, SH, NH2O-, NH-R', R'NH-, R'S-, 또는 S-R'-를 포함하고; 동일하거나 상이할 수 있는 X와 Y는 통상적으로 S, N, 또는 O를 포함하고, 선택적으로 동일하거나 상이한 R과 R'은 통상적으로, 화학식 I을 가지고 있는 비천연 아미노산에 대해 위에서 기술된 R기에 대한 구성요소들의 동일한 목록뿐만 아니라, 수소 또는 (CH2)x 또는 천연 아미노산 곁사슬로부터 선택된다. 예를 들어, 본 출원에 개시된 비천연 아미노산은 선택적으로 화학식 II 및 III에 의해 도시된 바와 같이, 아미노 또는 카르복실 기에서의 치환을 포함한다. 이러한 유형의 비천연 아미노산은 예컨대, 20개의 천연 아미노산 또는 비천연 곁사슬에 상응하는 곁사슬이 있는, 알파-하이드록시산, 알파-티오산, 알파-아미노티오카르복실산염, 또는 알파-알파-이치환된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 유형의 비천연 아미노산은 또한 치환된 베타-알라닌 및 감마-아미노 부티르산과 같은 베타-아미노산 또는 감마-아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 알파-탄소에서의 치환 또는 변형은 선택적으로 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등과 같은 L 또는 D 이성질체를 포함한다. 다른 구조적인 대안으로는 프롤린 유사체뿐만 아니라, 3원, 4원, 6원, 7원, 8원, 및 9원 고리 프롤린 유사체와 같은 환형 아미노산을 포함한다. 할로겐화 아릴(p-브로모-페닐알라닌, p-요오도페닐알라닌)과 같은 일부 비천연 아미노산은 할로겐화 아릴 및 광범위한 커플링 상대 사이에 탄소-탄소, 탄소-질소 및 탄소-산소 결합의 형성을 가능하게 하는 에틴 또는 아세틸렌 반응물과의 다목적의 팔라듐 촉매 교차 커플링 반응을제공한다.
예를 들어, 많은 비천연 아미노산은 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등과 같은 천연 아미노산을 기초로 한다. 다양한 예시적인, 비제한적인 비천연 아미노산의 구조는 US 2003/0108885 A1(도면, 예컨대, 도 29, 도 30 및 도 31 참고)에 제공되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
아미노산 유사체의 다른 예로는 다음 기능기 중 하나를 포함하는 리신 또는 피롤리신 아미노산의 비천연 유사체를 포함한다(이에 한정되지는 않음): 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 니트릴, 할로, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드록실, 알케닐, 시클로알켄, 알키닐, 시클로알킨, 시클로옥틴과 같은, 제한 고리와 같은 시클로알킬, 노르보넨, 트랜스시클로알켄, 시클로프로펜과 같은 시클로알켄, 할로겐화 아릴, 할로겐화 비닐, 할로겐화 알킬, 아지리딘, 니트로, 하이드록실, 에테르, 에폭사이드, 비닐 에테르, 실릴 에놀 에테르, 티올, 티오에테르, 설폰아미드, 설포닐, 설폰, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보론산, 보론산 에스테르, 보란, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 피리딜, 나프틸, 벤조페논, 테트라진, 피론, 에논, 이민, 알데히드, 하이드록실아민, 케토, 티오에스테르, 에스테르, 티오산, 유기실란기, 아미노, 광활성화 가능한 가교제; 회전 표지 아미노산; 형광 아미노산; 또 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호 작용하는 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속 함유 아미노산; 방사성 아미노산; 광케이징된(photocaged) 아미노산; 광이성질화 아미노산; 비오틴 또는 비오틴 유사체 함유 아미노산; 글리코실화 또는 탄수화물 변형된 아미노산; 케토 함유 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 아미노산; 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 중원자 치환된 아미노산; 화학적으로 절단 가능하거나 광절단가능한 아미노산; 연장된 곁사슬이 있는 아미노산; 독성 기를 함유하는 아미노산.
또한, 본 발명의 방법에 이용하기에 적합한 비천연 아미노산은 나프틸 또는 댄실 또는 7-아미노쿠마린 또는 7-하이드록시쿠마린 곁사슬을 함유하는 것들과 같은, 형광 아미노산을 가지고 있는 것들, 아조벤젠 또는 니트로벤질 Cys, Ser 또는 Tyr 곁사슬을 함유하는 것들과 같은 광절단 가능한 또는 광이성질화 가능한 아미노산, p-카르복시-메틸-L-페닐알라닌, 호모글루타민, 2-아미노옥탄산, p-아지도페닐알라닌, p-벤조일페닐알라닌, p-아세틸페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2,4-디아미노부티르산(DAB) 등을 포함한다. 본 발명은 위의 것들의 비보호 및 아세틸화 형태를 포함한다. (또한, 예를 들어, "Remodeling and Glycoconjugation of Peptides"라는 제목의 WO 03/031464 A2; 그리고, "Saccharide Compositions, Methods and Apparatus for their synthesis"라는 제목의 미국 특허 제6,331,418호; Tang and Tirrell, J. Am. Chem. Soc. (2001) 123: 11089-11090; 및 Tang et al., Angew. Chem. Int. Ed., (2001) 40:8를 참조하되, 이들 전부는 본 출원에 전체가 참조로써 포함된다).
Figure pct00005
본 발명에서, 위의 화학식 IV의 비천연 아미노산(nnAA)은 단백질의 생산에 활용될 수 있다.
일 구현예에서, 아미도 모이어티에 부착된 X기는 알킬 아지드, 알콕시 아지드, 알콕시 에폭사이드, 알킬-알킨, 알콕시 알킨, 알콕시 알켄, 알킬-알켄, 알킬 사슬, 알킬 시클로헥센, 알킬 시클로알킨, 알콕실 시클로알켄, 알콕실 시클로알킨, 아미도 시클로알킨, 아미도 시클로알켄, 트랜스시클로알켄, 시클로프로펜, 테트라진, 피론, 노르보넨, 아릴 아지드, 아지도, 하이드록실 아민, 하이드라지드, 할로겐화 비닐, 할로겐화 아릴, 테트라진, 피론, 이민, 보론산 에스테르 또는 보론산, 시아노기, 알데히드 또는 케톤과 같은 카르보닐 기일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 위의 일반적인 구조의 비천연 아미노산(nnAA)은 아미노산 말단으로부터 반대쪽 말단의 아미도 기까지 1~12개 메틸렌기의 알킬 사슬을 가지고 있을 수 있다.
바람직하게는, 위의 일반적인 구조의 비천연 아미노산(nnAA)은 연결 구조의 일부분으로서 시클로알칸 및 방향족 고리를 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 위의 일반적인 구조의 비천연 아미노산(nnAA)은 피롤리실 tRNA 합성효소(PyRS) 및 tRNApyl과 상호 작용한다. 상기 아미노산은 (S)-2-아미노-6-((2-아지도에톡시)카르보닐아미노)헥산산(Lys-아지드), (S)-2-아미노-6-((프로프-2-이닐옥시)카르보닐아미노)헥산산(Lys-알킨), S)-2-아미노-6((2-옥소-2-페닐아세트아미드)헥산산, S)-2-아미노-6((2-옥소-2-프로판아미드)헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[(2-아지도시클로펜틸)옥시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[(2-에티닐시클로펜틸)옥시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(시클로옥트-2-인-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)에톡시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-[({비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일옥시}카르보닐)아미노]헥산산, (2S)-2-아미노-6-[({비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일메톡시}카르보닐)아미노]헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[({4-[(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)아미노]페닐}메톡시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[(4E)-시클로옥트-4-엔-1-일옥시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(시클로프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(시클로프로프-2-엔-1-일메톡시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(3-아지도프로필)카르바모일]옥시}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(부트-3-인-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-(2-아지도아세트아미도)헥산산, (2S)-2-아미노-6-(3-아지도프로판아미도)헥산산, (2S)-2-아미노-6-(5-아지도펜탄아미도)헥산산을 포함한다.
이러한 nnAA은 pylRS에 대한 기질일 것이다.
적절하게는, 본 발명의 nnAA은 리신으로부터 유래된다.
본 출원에 참조로써 포함된 WO2010139948은 본 발명을 위한, 관심 있는 몇몇 nnAA, 특히 다음의 리신 유도체를 기술하고 있다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

Figure pct00009

Figure pct00010
추가적인 nnAA은 (2S)-2-아미노-6-{[(3-아지도프로필)카르바모일]옥시}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(3-아지도프로필)카르바모일]옥시}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(부트-3-인-1-일)카르바모일]옥시}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-엔-1-일)카르바모일]옥시}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(부트-3-엔-1-일)카르바모일]옥시}헥산산을 포함한다.
적절하게는, 본 발명의 nnAA은 (2S)-2-아미노-6-하이드록시헥산산으로부터 유래된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
본 발명에 이용하기에 적합한 추가적인 비천연 아미노산 유사체는 화학식 V의 구조를 가지고 있는 피롤리신 유사체이다.
Figure pct00014
화학식 V에서,
Z = 결합, CH2, CH-NH2, CH-OH, NH, O, S 또는 CH-NH2;
b는 0 또는 1~7의 정수; 그리고
FG = 아지드, 알켄, 알킨, 케톤, 에스테르, 아릴 또는 시클로알킨이다.
화학식 V에서, FG가 아릴을 나타낼 때, 예는 방향족 할로겐화물, 예컨대, 4-요오도 페닐과 같은 4-할로 페닐이다.
모이어티 Z(CH2)bFG는 예를 들어, CO-아릴, 예컨대 CO-페닐 또는 -CO알킬, 예컨대 -COMe을 나타낼 수 있다.
화학식 V의 예시적인 화합물은 다음과 같다:
Figure pct00015

Figure pct00016
본 발명에서 비천연 아미노산으로 이용하기에 적합한 대안적인 피롤리신 유사체는 화학식 VI의 구조를 가지고 있다.
Figure pct00017
화학식 VI에서,
Z = CH2, CH-NH2, CH-OH, NH, O 또는 S;
FG = 아지드, 알켄, 알킨, 케톤, 에스테르, 아릴 또는 시클로알킨; 그리고
b = 1~4의 정수이다.
화학식 VI에서, FG가 아릴을 나타낼 때, 예는 방향족 할로겐화물, 예컨대, 4-요오도 페닐과 같은 4-할로 페닐이다.
화학식 VI의 예시적인 화합물은
(2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산
Figure pct00018
화학식 VI.1;
(2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시}헥산산
Figure pct00019
화학식 VI.2; 및
(2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-엔-1-일)카르바모일]옥시}헥산산이다.
Figure pct00020

화학식 VI.3
화학식 V 및 VI의 구조에서, FG가 알켄을 나타낼 때, 그것은 적절하게는 -CH=CH2 또는 -CH=CH-CH3, 바람직하게는 -CH=CH2를 나타낸다.
화학식 V 및 VI의 구조에서, FG가 알킨을 나타낼 때, 그것은 적절하게는 -C=CH 또는 -C=C-CH3, 바람직하게는 -C=CH를 나타낸다.
화학식 V 및 VI의 구조에서, FG가 케톤을 나타낼 때, 그것은 적절하게는 -C(=O)-CH3 또는 -C(=O)-CH2-CH3, 바람직하게는 -C(=O)-CH3를 나타낸다.
화학식 V 및 VI의 구조에서, FG가 에스테르를 나타낼 때, 그것은 적절하게는 -C(=O)-O알킬, 예컨대 -C(=O)-O메틸을 나타낸다.
화학식 V 및 VI의 구조에서, FG가 방향족 할로겐화물을 나타낼 때, 그것은 적절하게는 할로겐, 특히 요오드로 치환된 페닐(예컨대, 4-요오도-페닐)을 나타낸다.
화학식 V 및 VI의 구조에서, FG가 시클로알킨을 나타낼 때, 그것은 적절하게는 시클로옥틴, 예컨대, 시클로옥트-4,5-인을 나타낸다.
유리하게도, 본 발명의 화학식 V 및 VI의 nnAA은 GFP 분석법에 의해 증명된 바와 같이 우수한 편입을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 화학식 VI.1은 GFP 분석법 편입 분석법에서 화학식 V.1과 비슷한 수준의 번역 능력을 나타냈다. 화학식 V 및 VI 모두는 부위 선택적인 번역 후 변형에 이용될 수 있는 다양한 유용한 기능기를 편입시키기 위하여 용이하게 변형된다. 알킨과 알켄은 용이하게 편입된다. 본 출원에 개시된 피롤리신 유사체는 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 반응 조건은 일반적으로 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.
화학식 V 유사체는 클로로포르메이트, 활성화된 카르복실산 에스테르, 이소시아네이트, 활성화 탄산염과 같은 활성화된 카르보닐기 또는 설포닐 할로겐화물을 1형의 단일 보호된 디아미노 기질에 첨가하여 용이하게 제조되는데, 이때, α-아미노기는 Boc, Cbz, TFA, 아세틸 또는 Fmoc기와 같은 보호기("PG")에 의해 보호된다(경로 1 참조). 결합된 생성물 3은 원하는 기능성을 갖추기 위하여 할로겐화물을 아지도 친핵체로 대체하는 것과 같은 추가적인 변형을 거칠 수 있다. 그렇지 않으면, 중간물질 3은 탈보호화되어, 원하는 화학식 V 유사체를 얻기 위하여 α-아미노산 가리움기(masking group)를 제거한다.
경로 1:
Figure pct00021
화학식 VI 유사체는 하이드록실 아미노산 9를 카르복실산 에스테르, 이소시아네이트, 산 염화물, 활성화 탄산염과 같은 활성화 카르보닐 또는 설포닐 할로겐화물과 함께 기질에 접합시켜 제조하였다. 결합된 생성물 11은 할로겐화물 또는 활성화된 알코올과 같은 이탈기의 교체에 의해 아지드 기능기를 갖추게 하는 것과 같은, 추가적인 변형을 거칠 수 있다. 원하는 아미노산 유사체 12는 α'-아미노산 가리움기를 제거하기 위한 최종 탈보호에 의해 얻어진다. 보호기는 경로 1에 따라 이용될 수 있다. 경로 2를 참고한다:
Figure pct00022
위에 제공된 비천연 아미노산 대부분은 예컨대, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich, 미국)로부터 상업적으로 이용 가능하다. 상업적으로 이용 가능하지 않은 것들은 선택적으로, (본 출원에 참조로써 포함된) US 2004/138106 A1의 실시예에 제공된 바와 같이, 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성 기법에 대해서는, 예컨대, 문헌(Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, 1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.; Advanced Organic Chemistry, March, Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York; 및 Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg, Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York) 그리고 WO 02/085923 참고하며, 이들 전부는 본 출원에 참조로써 포함된다.
본 발명의 다른 nnAA은 공개된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, (S)-2-아미노-6((프로프-2-이닐옥시)카르보닐아미노)헥산산 및 S)-2-아미노-6((2아지도에톡시)카르보닐아미노)헥산산의 합성은 WO2010139948 및 Nguyen 등(2009)에 공개되어 있다.
S)-2-아미노-6((2-옥소-2-페닐아세트아미드)헥산산, S)-2-아미노-6((2-옥소-2-프로판아미드)헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[(2-아지도시클로펜틸)옥시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[(2-에티닐시클로펜틸)옥시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(시클로옥트-2-인-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)에톡시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-[({비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일옥시}카르보닐)아미노]헥산산, (2S)-2-아미노-6-[({비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일메톡시}카르보닐)아미노]헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[({4-[(6-메틸-1,2,4,5-테트라진-3-일)아미노]페닐}메톡시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-({[(4E)-시클로옥트-4-엔-1-일옥시]카르보닐}아미노)헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(시클로프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산, (2S)-2-아미노-6-{[(시클로프로프-2-엔-1-일메톡시)카르보닐]아미노}헥산산은 문헌(Hao, Z., Chem. Comm., 47, 4502, 2011, Schultz PG, et. al., Nat. Methods, 4, 239-244, 2007, Schultz PG, et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15, 1521-1524, 2005, Dieters A., et. al., J. Am. Chem. Soc., 125, 11782-11783, 2005, Wang, YS, et. al., J. Am. Chem. Soc., 134, 2950-2953, 2012, Fekner, T., et. al., Angew Chem Int Ed Engl 45, 1633-1635, 2009., Plass, T., et. al. Angew Chem Int Ed Engl, 51, 4166-4170, 2012, Lang, K. J. Am. Chem. Soc., 134, 10317, 2012 및 Devaraj NK, Angew Chem Int Ed Engl, 48, 7013-7016, 2009)에 개시되어 있다.
편입된 비천연 아미노산을 가지는 단백질의 용도
본 발명에 따른 방법을 이용하여 편입된 비천연 아미노산을 가지고 있는 단백질은 기능화된 단백질 접합체의 제조에 이용될 수 있다. 편입된 비천연 아미노산을 가지는 단백질에 접합될 수 있는 분자로는 (i) 다른 단백질, 예컨대, 항체, 특히 단일클론 항체, 및 (ii) 고분자, 특히 PEG기 또는 시스템에서 반감기 연장을 초래할 수 있는 기타 기를 포함한다. 게다가 이러한 변형된 단백질들은 이러한 효능이 있는 화합물들의 표적화된 전달을 위하여 약물 또는 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 따라서, 편입된 비천연 아미노산을 가지고 있는 단백질에 접합될 수 있는 추가적인 분자들에는 (iii) 세포독성제 및 (iv) 약물 모이어티가 포함된다.
일부 구현예에 대한 더욱 상세한 사항은 아래의 항체 약물 접합체에 대한 논의에서 제공된다.
비천연 아미노산은 편리하게도, 다른 아미노산과의 부반응의 위험 없이 표적화된 방식으로 접합을 허용하는 고유의 화학기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 편리하게도, 후이스겐(Huisgen) 1,3-이극성 고리첨가반응(1,3-dipolar cycloaddition reaction)을 이용하여 상응하는 알킨 또는 아지드기를 함유하는 접합될 분자와의 반응을 허용하는 아지드 또는 알킨기를 함유한다.
부위 특이적인 접합
본 발명의 추가적인 양태는 화학적으로 변형된 표적 단백질을 제조하는 방법으로, 이는 본 발명의 일 양태에 따른 방법에 따라 표적 단백질을 제조하는 단계 및 얻어진 표적 단백질을 화학적으로 변형시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 접합 화학은 20개의 천연 아미노산에 대해 직교성인 반응들을 포함한다. 그러한 반응들은 20개의 천연 아미노산과 상호작용하지 않거나, 20개의 천연 아미노산과의 부반응을 유발하지 않는다. 그것들은 이러한 반응과 관련된 기능기에 대해 특이적이다. 적절하게는, 필요한 기능기는 nnAA을 통해 표적 단백질 내로 편입된다.
또한, 상기 반응들은 단백질에 대해 파괴적이지 않은 조건 하에서, 예를 들어, 단백질에 해로운 영향을 초래하지 않는 온도에서, 단백질에 허용 가능하며 그것의 용해도를 유지시키는 pH 범위의 수성 용매 하에서 진행된다.
단백질과 링커 사이의 부착 모이어티의 안정성을 증가시키는 것은 유리할 수 있다. 종래의 방법들은 말레이미드와의 반응에 의해 시스테인의 티올기에 접합시켜 티올 에테르를 형성한다. 이러한 티올 에테르는 항체로부터 링커 약물 유도체를 방출시키는 역반응을 겪을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 아지드와 알킨 사이에 이용된 접합 화학은 유의미하게 더 안정적이고, 가역성에 취약하지 않은 방향족 트리아졸을 생성한다.
또한, 이러한 반응의 생성물, 단백질과 적재물(payload) 사이의 결합은 안정적이어야 하는데, 종래의 결합(아미드, 티올 에테르)과 관련된 안정성과 동일하거나 더 커야 한다. 접합에 걸림돌이 되지는 않더라도, 이러한 접합 반응이 자연적인 조건 하에서 이루어질 수 있다면, 이는 추가적인 재접힘 처리 단계를 없앨 것이므로, 그것은 종종 유리하다.
본 발명의 접합체 제조를 위해 바람직한 화학적 접합은 3+2 알킨-아지드 고리 첨가; 3+2 이극성 고리 첨가; 헤크(Heck) 반응을 포함한 팔라듐 기반의 커플링; 소노가시라(Sonogashira) 반응; 스즈키(Suzuki) 반응; 스틸레(Stille) 커플링; 히야마(Hiyama)/덴마크 반응; 올레핀 복분해; 디엘스-알더(Diels-alder) 반응; 하이드라진, 하이드라지드, 알콕시 아민 또는 하이드록실 아민과의 카르보닐 축합; 변형 촉진(strain promoted) 아지드 알킨 고리 첨가를 포함한 변형 촉진 고리 첨가; 금속 촉진 아지드 알킨 고리 첨가; 전자 촉진 고리 첨가; 단편 압출(fragment extrusion) 고리 첨가; 알켄 고리 첨가 후 b-제거 반응을 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에 다르면, 편입된 아미노산은 아지드 또는 알킨기를 함유하고, 화학 변형 방법은 상기 아지드 또는 알킨기를, 알킨 또는 아지드기를 포함하는 시약과 반응시키는 단계를 포함한다. 예상했던 반응은 트리아졸 결합의 생성을 초래하는 후이스겐 1,3-이극성 고리 첨가 반응이다. 알킨 또는 아지드기를 포함하는 시약은 단백질(예컨대, 항체) 또는 독소 또는 세포독성 약물 또는 선택적으로 링커를 통해 알킨 또는 아지드 기를 운반하는 반감기 연장에 적합한 물질(예컨대, PEG기)일 수 있다.
상기 반응에 사용하기 위한 알킨기는 예를 들어, 비시클로[6.1.0]논-4-인 모이어티(BCN)와 같은 시클로옥틴이다.
변이형의 반응에서, 편입된 아미노산은 아지드 또는 알켄기를 함유하며, 화학적 변형 방법은 상기 아지드 또는 알켄기를, 알켄 또는 아지드기를 포함하는 시약과 반응시키는 단계를 포함한다. 알켄 또는 아지드기를 포함하는 시약은 단백질(예컨대, 항체) 또는 독소 또는 또는 선택적으로 링커를 통해 알킨 또는 알켄기를 운반하는 반감기 연장에 적합한 물질(예컨대, PEG기)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합 화학은 항체 약물 접합체의 제조에 이용된다.
생성물의 화학적 변형
본 출원의 다른 곳에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주는 편입된 비천연 아미노산을 함유하는 단백질의 생산에 유용하다. 상기 비천연 아미노산은 추가적인 화학 반응에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태는 화학적으로 변형된 표적 단백질의 제조방법으로, 이는 본 발명의 일 양태에 따른 방법에 따라 표적 단백질을 제조하는 단계 및 얻어진 표적 단백질을 화학적으로 변형하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 접합 화학은 20개의 천연 아미노산에 대해 직교성인 반응들을 포함한다. 그러한 반응들은 20개의 천연 아미노산과 상호작용하지 않거나, 20개의 천연 아미노산과의 부반응을 유발하지 않는다. 그것들은 이러한 반응과 관련된 기능기에 대해 특이적이다.
또한, 상기 반응들은 단백질에 대해 파괴적이지 않은 조건 하에서, 예를 들어, 단백질에 해로운 영향을 초래하지 않는 온도에서, 단백질에 허용 가능하며 단백질의 용해도를 유지시키는 pH 범위의 수성 용매 하에서 진행된다.
일 구현예에 따르면, 편입된 아미노산은 아지드 또는 알킨 기를 함유하며, 화학 변형 방법은 상기 아지드 또는 알킨기를, 알킨 또는 아지드기를 포함하는 시약과 반응시키는 단계를 포함한다. 예상했던 반응은 트리아졸 결합의 생성을 초래하는 후이스겐 1,3-이극성 고리 첨가 반응이다. 알킨 또는 아지드기를 포함하는 시약은 단백질(예컨대, 항체) 또는 약물 모이어티(예컨대, 독소 또는 세포독성 약물) 또는 선택적으로 링커를 통해 알킨 또는 아지드기를 운반하는 반감기 연장에 적합한 물질(예컨대, PEG기)일 수 있다.
선택적으로, 후이스겐 1,3-이극성 고리 첨가 반응은 Cu(I) 촉매 작용의 존재 하에 수행될 수 있다.
바람직하게는, 구리 촉매화 고리 첨가 반응은 시스테인 및 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA)의 존재 하의 수성 용액 내에서 실온에서 이루어진다. 대안적으로, 구리 촉매화 고리 첨가 반응은 아스코르브산 나트륨 및 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(THPTA)의 존재 하의 수성 용액 내에서 4℃ 내지 50℃에서 이루어진다. 또한, 이러한 반응은 DMSO, DMF, 메탄올, 에탄올, t-부탄올, 트리플루오로에탄올, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 헥실렌 글리콜로 이루어지는 유기 성분들과의 혼합 수성/유기 용액에서 이루어질 수 있다.
변이형의 반응에서, 편입된 아미노산은 아지드 또는 알켄기를 함유하며, 화학적 변형 방법은 상기 아지드 또는 알켄기를, 알켄 또는 아지드기를 포함하는 시약과 반응시키는 단계를 포함한다. 알켄 또는 아지드기를 포함하는 시약은 단백질(예컨대, 항체) 또는 독소 또는 선택적으로 링커를 통해 알킨 또는 알켄기를 운반하는 반감기 연장에 적합한 물질(예컨대, PEG기)일 수 있다.
하나 초과의 nnAA이 표적 단백질(예컨대, 항체) 내로 편입될 때, 이러한 화학적 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 두 개의 nnAA이 편입되는 경우, 하나는 약물 모이어티에 접합되도록 변형될 수 있고, 하나는 PEG 모이어티에 접합되도록 변형될 수 있다.
표적 단백질
표적 단백질은 항체, 특히 단일클론 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 TROP-2, SSTR3, B7S1/B7x, PSMA, STEAP2, PSCA, PDGF, RaSL, C35D3, EpCam, TMCC1, VEGF/R, 커넥신-30, CA125(Muc16), 세마포린-5B, ENPP3, EPHB2, SLC45A3(PCANAP), ABCC4(MOAT-1), TSPAN1, PSGRD-GPCR, GD2, EGFR(Her1), TMEFF2, CD74, CD174(leY), Muc-1, CD340(Her2), Muc16, GPNMB, 크립토, EphA2, 5T4, 메소텔린, TAG-72, CA9(IX), a-v-인테그린, FAP, Tim-1, NCAM/CD56, 알파 엽산 수용체, CD44v6, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸, CD20, CA55.1, SLC44A4, RON, CD40, HM1.24, CS-1, 베타2 마이크로글로불린, CD56, CD105, CD138, 루이스 Y, GRNMP, 토모레귤린(Tomoregulin), CD33, FAP, CAIX, FasL 수용체, MMP 기질 금속 단백질 분해효소에 대한 전체 길이의 항체 및 Fab, Fab2 및 단일 사슬 항체 단편(scFv)를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 종양 표적에 대한 본 발명의 항체들은 다음으로부터 선택된 단백질 모이어티에 접합된다: 면역자극 단백질 및 프로아폽토틱 단백질, 특히 IL-1알파, IL-1베타, 기타 IL-1 패밀리 구성원, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 패밀리, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-28을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인터루킨 중 임의의 것과 같은 면역자극제 또는 B7.1 및 B7.2, TACI와 같은 공동 자극 리간드. I형 IFN 패밀리(IFN 알파 및 베타 및 람다) 또는 II형 IFN 감마 중 임의의 것과 같은 인터페론. GM-CSF와 같은 혈액형성 성장인자. CXCL-1, CXCL-2, CXCL-5, CXCL-6, CXCL-8, CXCL-9, CXCL-10 및 CXCL-11, CXCL-13, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-21, IP-10, 에오탁신, RANTES, PF4, GRO 관련 펩티드, IL-8을 포함하는 케모카인. FasL, TNF, PD-L1을 포함하는 TNF 슈퍼패밀리의 리간드 같은 프로아폽토틱 리간드. 알파 및 베타 디펜신 및 카텔리시딘 LL37/hCAP18, 히스타틴, 카텝신 G, 아주로시딘, 키마아제, 호산성 백혈구 유래 신경독소, 고이동성 군 1(high mobility group 1) 핵 단백질(HMGB1), 락토페린과 같은 항균성 펩티드. NADPH 산화효소(NOX)의 구성원, 산화질소 합성효소 NOS, INOS, 엘라스타아제 및 카텝신과 같은 단백질 분해효소를 포함하는 호중성 과립 단백질, 아주로시딘(CAP37 또는 HBP로도 알려져 있음), 미엘로퍼옥시다아제, 퍼포린, 그랜자임과 같은 ROS 및 RNS 생성 효소.
일 구현예에서, 표적 단백질은 항-Her-2 항체이다.
일 구현예에서, 표적 단백질은 항-IL-6 항체이다.
일 구현예에서, 표적 단백질은 항-PSMA 항체이다.
바람직한 구현예에서, 항-PSMA 항체는 scfv이다.
일 구현예에서, 표적 단백질은, 예를 들어 SEQ ID No 62 또는 그것과 95% 동일성(예컨대, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 나타내는 서열을 가지고 있는 FGF21이다. 서열 동일성은 전체 단백질을 비교 범위(window of comparison)로 삼아 계산된다. BLAST와 같은 통상적인 서열 비교 프로그램이 이용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, FGF21은 변형되어 R131번 위치에서 비천연 아미노산 리신-아지드 또는 프로파질 리신을 함유하며(SEQ ID No. 64 참고), 트리아졸 링커를 통해 PEG 모이어티에 접합된다.
유인성 아미노산
본 발명에 따른 방법에 사용하는 유인성 아미노산은 연장되는 단백질 내로 편입되지 않는 아미노산 유도체이다. 대안적으로는, 유인성 아미노산은 연장되는 단백질 내로 편입되지만, 단백질 연장을 저해하는 아미노산 유도체이다.
본 발명의 유인성 아미노산은 일반식 VII을 가지고 있다:
Figure pct00023
이때,
G = H, OH, -OCH3, OCH2CH3, O-C(=O)-CH3 또는 NH-K-Q;
X = 결합, CH2, S, O, NH, N-(C=O)- 또는 CH-J;
J = 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 20개의 천연 아미노산 중 하나의 곁사슬;
Y = 결합, NH, O, S, CH2;
Z = O, NH, CH2, S, CH-NH2;
K = CO 또는 SO2;
a= 0, 1, 2 또는 3;
b = 0, 1, 2 또는 3;
Q= -H, C1- 6알킬, 아릴, 헤테로아릴 -OC1- 6알킬, -OCH2아릴, -OCH2헤테로아릴, -C2-6알케닐 또는 -OC2 - 6알케닐; 및
R= C1- 6알킬, C2- 6알케닐, -CH2아릴, C2- 6알키닐, C1- 6할로알킬 또는 C1- 6아지도알킬이다.
Q의 정의 내에서 예시적인 아릴기는 페닐이다.
예시적인 R기는 -CH2CH=CH2, -CH2CH2Cl, -CH2CH2N3, -CH2Ph, -C(CH3)3, -CH2CH2CH3, -CH2CH3, -CH3, -CH(CH3)2- 및 -CH2-C=C-H를 포함한다.
Q의 정의 내에서 예시적인 아릴 기는 페닐이다.
Q에 대한 예시적인 기는 H, -CH3, -Et, Ph, -OtBu, -OFmoc, -OBn, -OMe, -OEt 및 -OCH2CH=CH2를 포함한다.
일 구현예에서, K는 CO이다. 다른 구현예에서, K는 SO2이다.
적절하게는 Y는 NH, O 또는 S를 나타내고, Z는 O, NH, CH2, S 또는 CH-NH2를 나타내거나, Y는 결합, NH, O, S 또는 CH2를 나타내고, Z는 O, NH 또는 S를 나타낸다.
적절하게는 Y는 NH, O 또는 S를 나타낸다. 적절하게는 Z는 NH, O 또는 S를 나타낸다. 적절하게는 Y는 NH, O 또는 S를 나타내고, Z는 NH, O 또는 S를 나타낸다.
일 구현예에서, Y는 NH이고, Z는 O이다. 다른 구현예에서, Y는 O 및 Z는 NH이다.
J가 20개의 천연 아미노산 중 하나의 곁사슬을 나타낼 때, 예는 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 알라닌, 페닐알라닌, 이소류신, 발린, 티로신 및 트립토판의 곁사슬을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 유인성 아미노산은 화학적으로 변형된 아민기가 있는 pylRS에 대한 아미노산 기질, 예를 들어, 화학식 VIIA의 N-아실화된 아미노산이다:
Figure pct00024
화학식 VIIA에서,
K는 CO 또는 SO2;
Q = H, C1- 6알킬, 아릴, 헤테로아릴 -OC1- 6알킬, -OCH2아릴, -OCH2헤테로아릴, -C2-6알케닐 또는 -OC2- 6알케닐이다.
유리하게도, 본 발명의 유인성 nnAA은 PyltRNA의 발현에 의해 유발된 앰버 억제의 유독한 효과를 방지할 수 있다. 유인물은 앰버 억제 tRNA의 존재 하에, 앰버 코돈에서 단백질 번역의 종결을 가능하게 하여 앰버 억제를 방지한다. 적절하게는, 화학식 VIIB에서와 같이, 폴리펩티드 합성을 전파하는 데 필요한 아미노 말단 기가 없는 화학식 VII의 유인성 아미노산:
Figure pct00025
화학식 VIIB에서,
G= H;
a= 4 또는 5; 및
R= C1- 6알킬, C2- 6알케닐, -CH2아릴, C2- 6알키닐, C1- 6할로알킬 또는 C1- 6아지도알킬이다.
Q의 정의 내에서 예시적인 아릴기는 페닐이다.
R이 C1- 6아지도알킬을 나타낼 때, 그것은 적절하게는 C2- 6아지도알킬, 예컨대 C2-4아지도알킬을 나타낸다.
예시적인 R기로는 -CH2CH=CH2, -CH2CH2Cl, -CH2CH2N3, -CH2Ph, -C(CH3)3, -CH2CH2CH3, -CH2CH3, -CH3, -CH(CH3)2 및 -CH2-C=C-H를 포함한다.
일 구현예에서, a는 4이다. 다른 구현예에서, a는 5이다.
화학식 VIIB의 예시적인 유인성 아미노산은 다음과 같다:
6-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 12의 데이터를 기초로 할 때, 유인성의 nnAA은 PyltRNA의 발현에 의해 유발된 앰버 억제의 유독한 효과를 방지할 수 있다. 유인물은 앰버 억제 tRNA의 존재 하에, 앰버 코돈에서 단백질 번역의 종결을 가능하게 하여 앰버 억제를 방지한다.
유인성 단백질
본 발명에 따른 방법에 이용하기 위한 유인성 단백질은 표적이 아닌 앰버 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 양성(benign) 단백질이다.
본 발명의 유인성 단백질은 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 알부민, SEAP, 액틴, b-2 마이크로글로불린, 글루타티온-s-전이효소 및 폴리 앰버를 함유하는 펩티드로부터 선택된다. 추가적인 예는 IgG이다.
본 발명의 유인성 단백질은 적절하게는 테트라사이클린 조절 프로모터(TetO 또는 tTA; TetOn 및 TetOFF), 독시사이클린 유도성(TRE) 프로모터, cAMP 유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 활성화 프로모터 시스템, IPTG 유도성 프로모터(lac), Cd2+ 또는 Zn2+ 유도성 프로모터(금속단백질 프로모터), 인터페론 의존성 프로모터(예컨대 쥐 MX 프로모터), HIV LTR 프로모터(Tat), DMSO 유도성 프로모터(글로빈 프로모터 글로빈 LCR), 호르몬 조절 프로모터(GLVP/TAXI, 엑디손), 및 라파마이신 유도성 프로모터(CID)와 같은 조건부 활성화 프로모터 및 프로모터 시스템으로부터 선택된 유도성 프로모터의 조절 하에 있다.
PEG 모이어티
표적 단백질은 PEG 모이어티에 접합될 수 있다. PEG 모이어티는 항체 약물 접합체 내로 편입될 수 있다. PEG 모이어티는 통상적으로 0.5 kDa 내지 40 kDa, 예컨대 5 kDa 내지 40 kDa 범위의 분자량을 나타낼 수 있다. 더욱 바람직하게는, PEG 모이어티는 약 20 kDa의 분자량을 나타낼 수 있다. 또한, PEG 모이어티는 100~2000 Da 범위의 분자량을 나타낼 수 있다. PEG는 직쇄 또는 가지형 또는 여러 팔이 있는(multi armed) 형태일 수 있다.
PEG 모이어티는 말단 알킨, 아지드, 시안화물, 시클로알킨, 알켄, 할로겐화 아릴로 기능화될 수 있다. 이러한 PEG는 단일 기능성, 동종 2기능성, 이종 2기능성 및 다중 동일 기능성이 되게 하는 방법으로 기능화될 수 있다.
항체 약물 접합체( ADC )
본 발명에 따른 세포주는 사실상 균일하고, 항체당 약물의 수(또는 다른 접합된 분자) 및 항체 상에서 그러한 약물들의 위치가 분명하게 조절되며, 그에 의해 편입된 비천연 아미노산을 함유하는 단일클론 항체가 얻어지고, 직교 화학을 통해 약물 모이어티(또는 다른 접합된 분자)를 운반하는 링커에 부위 특이적으로 접합되는 항체 약물 접합체(합성 링커에 의해 주어진 약물, 통상적으로는 세포독성 약물, 그렇지 않으면 단백질 또는 PEG기에 공유 결합된 재조합 항체)의 제조에 특히 유용하다.
적절하게는, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 ADC를 얻는 방법을 제공한다:
1. 본 발명의 안정적인 세포주에 전체 길이의 항체를 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 하나 이상의 플라스미드를 도입하여, 종결 코돈이 서열 내의 특정 위치에 도입되도록 한다.
2. 비천연 아미노산(nnAA)이 원하는 위치(들)에 자리잡게 된 변형된 항체를 정제한다.
3. 항체에 자리잡은 비천연 아미노산에 상보적인 기능기를 포함하도록 변형된 세포독소-링커 유도체를, 상보적인 반응기를 함유하는 변형된 항체와 직교 화학을 통해 반응시킨다.
4. 얻어진 ADC를 정제한다.
따라서, 본 발명은 또한 항체 성분이 변형되어 원하는 위치에 고유한 반응성 기능기를 보유하는 비천연 아미노산을 편입시키며, 그러한 기능기가 약물 모이어티(또는 단백질 또는 PEG기)에 접합될 수 있게 하는, ADC를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티들로부터 선택된 하나 이상의 모이어티(예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게는 1개 또는 2개, 특히 1개)에 접합된 항-Her-2 항체를 포함하는 항체 접합체를 제공한다.
특히, 이러한 트리아졸 모이어티는 항-Her-2 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 또는 알킨 모이어티를, 단백질, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 또는 아지드 모이어티와 반응시켜 형성될 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 트리아졸 모이어티는 Cu(I) 촉매 작용의 조건 하에서 항-Her-2 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 또는 알킨 모이어티를, 단백질, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 또는 아지드 모이어티와 반응시켜 형성된다.
Cu(I) 촉매 작용은 요오드화구리, 브롬화구리, 염화구리, 티올산 구리, 시안화 구리와 같은 자연적인 Cu(I) 공급원을 이용하여 달성된다. 또한, Cu(I) 종은 구리(II) 공급원 및 환원제를 이용하여 그 자리에서 생성될 수 있다. 구리(II) 공급원은 황산구리, 염화구리(II), 또는 아세트산구리일 수 있다. 환원제는 아스코르브산 나트륨, 디티오트레이톨, TCEP, b-메르캅토에탄올, 하이드라진, 하이드록실아민, 아황산수소나트륨, 시스타민, 시스테인일 수 있다.
적절하게는, Cu(I) 촉매화 고리 첨가는 반응 개시 시에 존재하거나 황산 나트륨과 같은 Cu(II) 공급원을 아스코르브산 나트륨으로 환원시켜 그 자리에서 생성된 Cu(I) 종을 안정화시키기 위하여, TBTA, THPTA, 페난트롤린 유도체, 피리딜메탄이민 유도체, 디에틸렌트리아민, 비피리딘 유도체, TMEDA, N,N-비스(2-피리딜메틸)아민(BPMA) 유도체, N,N,N,N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에틸렌디아민(TPEN) 유도체, 트리에틸아민, 디이소프로필 에틸아민과 같은 트리알킬아민, HEPES 및 MES를 포함하는 리간드의 존재 하에서 이루어진다.
다른 구현예에서, 항체 접합체는 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해 약물 및 PEG 모이어티들로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된 항체를 포함하는데, 이때, 이러한 트리아졸 모이어티는 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 모이어티와, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 모이어티의 반응에 의해 형성되며, 이때, 알킨 모이어티는 시클로옥틴 모이어티이다.
다른 구현예에서, 항체 접합체는 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해 약물 및 PEG 모이어티들로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된 항체를 포함하는데, 이때, 이러한 트리아졸 모이어티는 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 알킨 모이어티와, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 아지드 모이어티의 반응에 의해 형성되며, 이때, 알킨 모이어티는 시클로옥틴 모이어티이다.
이러한 시클로옥틴 모이어티는 예를 들어, 비시클로[6.1.0]논-4-인 모이어티일 수 있다.
항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산은 적절하게는 PylRS에 대한 비천연 아미노산 기질, 특히, (S)-2-아미노-6((2-아지도에톡시)카르보닐아미노)헥산산과 같은 비천연 리신 유사체이다.
항체
본 발명에서, ADC는 전체 길이의 항체뿐만 아니라, 이에 제한되지는 않으나 Fab, Fab2 및 단일 사슬 항체 단편과 같은 항체 단편을 이용하는 것을 포함한다.
세포 독소에 접합시키기에 적절한 항체는 항-Her2, 항-IL-6, TROP-2, SSTR3, B7S1/B7x, PSMA, STEAP2, PSCA, PDGF, RaSL, C35D3, EpCam, TMCC1, VEGF/R, 커넥신-30, CA125(Muc16), 세마포린-5B, ENPP3, EPHB2, SLC45A3(PCANAP), ABCC4(MOAT-1), TSPAN1, PSGRD-GPCR, GD2, EGFR(Her1), TMEFF2, CD74, CD174(leY), Muc-1, CD340(Her2), Muc16, GPNMB, 크립토, EphA2, 5T4, 메소텔린, TAG-72, CA9(IX), a-v-인테그린, FAP, Tim-1, NCAM/CD56, 알파 엽산 수용체, CD44v6, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸, CD20, CA55.1, SLC44A4, RON, CD40, HM1.24, CS-1, 베타2 마이크로글로불린, CD56, CD105, CD138, 루이스 Y, GRNMP, 토모레귤린, CD33, FAP, CAIX, FasL 수용체, MMP 기질 금속 단백질 분해효소에 대해 표적화된 것들을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG 유형이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 이러한 항체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형되며, 그러한 비천연 아미노산의 위치는 IgG 면역글로불린 중에서도 보존되며, SEQ ID No 82의 K157 위치(IgG에 대한 중쇄의 보존된 불변 영역을 나타내며, SEQ ID No 46 및 75의 항-Her 2 항체의 274번 위치에 상응함), 그리고 SEQ ID No 46 및 75의 항-Her 2 항체의 359번 위치에 상응하는 SEQ ID 82의 T242번 위치, 그리고 카바트 넘버링(Kabat numbering)에 따르고 SEQ ID No 52 및 79의 D70 및 L81에 상응하는, IgG의 경쇄의 프레임워크 영역 내의 D70 및 L81번 위치로부터 선택된다. 명확성을 위해, D70은 아미노산 맥락 sgsrsgtdftltisslq에서 발견되고, E81은 아미노산 맥락 sslqpedfatyycqq에서 발견된다.
하나의 특별한 관심 항체는 항-Her-2 항체이다.
이러한 항-Her2-항체는 예를 들어, SEQ ID No 52의 경쇄 서열 또는 그에 대해 95%(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%) 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체 및 SEQ ID No 46의 중쇄 서열 또는 그에 대해 95%(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%) 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체를 가지고 있을 수 있다. 이러한 서열 동일성은 전체 항체를 비교 범위(window of comparison)로 측정하여 산출되나, CDR은 제외한다. BLAST와 같은 통상적인 서열 비교 프로그램이 이용될 수 있다. 본 문헌에 기술된 mAb 서열은 허셉틴의 서열과 높은 유사성을 나타낸다. 여기서 활용된 mAb 서열은 허셉틴에서 발견된 항원 결합 자리 서열을 생식계열 IgG1에 위치시켜 생성되었다. Her2의 세포외 도메인에 대한 마우스 항체 4D5의 가변 영역을 오버래핑 올리고머(overlapping oligomer)를 이용한 유전자 합성에 의해 생성하고, 셔틀 벡터로 클로닝하였다. 그런 다음, 가변 영역을 pFUSE-CHIg-hG1 및 pFUSE-CHLIg-hK(인비보젠)에 의해 암호화된 인간 프레임워크 상으로 접합시켜 마우스-인간 하이브리드를 생성하였다. 서열 비교 결과, 구축된 항체는 허셉틴에 대해 여섯 개의 아미노산 치환을 나타냈다. 이는 5개의 중쇄 위치 및 하나의 경쇄 부위에 해당하였다. 이들 부위 중 어느 것도 CDR 영역 또는 CDR에 인접한 부위에 해당하지 않는다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 중쇄 서열의 274번 위치에 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 경쇄 서열의 70번 위치에 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 중쇄 서열의 274번 위치에 있고, 상기 항-Her2-항체의 각 경쇄의 경쇄 서열의 70번 위치에도 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 중쇄 서열의 359번 위치에 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 경쇄 서열의 81번 위치에 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 중쇄 서열의 274번 위치에 있고, 상기 항-Her2-항체의 각 경쇄의 경쇄 서열의 81번 위치에도 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 중쇄 서열의 359번 위치에 있고, 상기 항-Her2-항체의 각 경쇄의 경쇄 서열의 70번 위치에도 있다.
일 구현예에 따르면, 접합에 이용되는 비천연 아미노산은 상기 항-Her2-항체의 각 중쇄의 중쇄 서열의 359번 위치에 있고, 상기 항-Her2-항체의 각 경쇄의 경쇄 서열의 81번 위치에도 있다.
또 다른 특별한 관심 항체는 항-PSMA 항체, 특히 scfv이다. 항-PSMA 항체는 예를 들어, SEQ ID No 58의 scfv 서열 또는 이에 대해 95%(예컨대, 96, 97, 98 또는 99%) 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체를 가지고 있을 수 있다. 이러한 서열 동일성은 비교 범위로 전체 항체를 측정하여 산출되나, CDR은 제외한다. BLAST와 같은 통상적인 서열 비교 프로그램이 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 항-PSMA scfv는 117번 위치에 비천연 아미노산 리신-아지드를 함유하도록 변형된다(SEQ ID 60). 상기 scfv는 예를 들어, MMAF-발린-시트룰린-p-아미노-벤조일-카보네이트-시클로알킨 유도체에 접합될 수 있다.
ADC 생산을 위한 항체의 부위 특이적인 변형
본 발명에서, 비천연 아미노산의 항체로의 편입을 위한 접합 부위의 선택은 다음 단계들을 포함하였다:
초기 부위 선택은 항체의 3차원적인 구조, 이의 기능적 도메인 및 항체의 구조 또는 기능에 역할을 하는 중요한 아미노산 잔기를 고려한 인실리코(in silico) 예측 방법을 이용하여 수행하였다. 선택된 부위를, 그런 다음, 그들의 물리화학 성질 및 안정성에 대하여 스크리닝하였다.
적절하게는, 최적의 접합 부위 선택을 위한 기준은 다음을 포함하였다:
바람직한 부위는, 항체의 결합 부위에서 먼 쪽의 잔기; (접합체 형성에의 접근을 증진시키기 위해, 그리고 효율적인 접합체 형성을 가능하게 하기 위하여) 표면/용매 노출된 잔기; 실험적으로 효율적인 앰버 억제를 가능하게 하는 것으로 밝혀진 부위; 경험적으로 발현된 단백질 및 접합체의 안정성을 보유하는 것으로 밝혀진 부위이다.
피한 부위는, 기능(예컨대, FcRN 결합, Fc감마 상호작용)에 중요한 잔기, 접힘 또는 구조에 중요하다고 알려진 아미노산 잔기(예컨대, Cys, 프롤린)이다.
인간 IgG1의 여섯 개 부위가 위에 설명한 기준에 따라 확인되었다. 이들은 네 개의 중쇄 위치(T114, K274, K288 및 T359)와 두 개의 경쇄 부위(D70 및 E81)를 포함한다. HC K274, K288 및 T359; 그리고 LC D70, E81은 효율적으로 nnAA을 편입시키고 접합체 형성을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다.
링커
본 발명에 따르면, 표적 단백질 또는 항체는 단백질 또는 약물 모이어티 또는 PEG 모이어티에 직접적으로 연결될 수 있거나, 그렇지 않으면 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 링커는 절단 가능할 수 있거나 절단 불가능할 수 있다.
따라서, 본 발명은 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커가 링커 내 절단 부위를 함유하는 스페이서의 존재에 의하여 절단 가능한 링커인, 항체 접합체를 제공한다. 절단 부위는 효소적으로 불안정한 절단 부위일 수 있다. 효소적으로 불안정한 절단 부위의 예는 효소 카텝신 B에 의해 인식되고, 시트룰린 C 말단에서 펩티드를 절단하는 발린-시트룰린 펩티드의 편입이다. 일 구현예에서, 항체 접합체의 링커는 절단 가능한 링커가 아닌 트리아졸 모이어티를 포함한다.
절단 가능한 링커의 이용은 세포 독소가 표적 내에서 변경되지 않은 상태로 방출될 필요에 의한 것이다. 이는 모노메틸아우리스테이트(monomethylauristate) E와 같은 세포 독소에 의해 예시된다(Pettit 1997, Senter 2003). 절단 가능한 링커에서 방출 기전은 산 불안정성과 같은 화학적 기전, 또는 링커 내에 절단 가능한 펩티드의 포함에 의한 효소적인 기전일 수 있다. 또한, 이러한 기전은 빛 또는 기타 방사선 공급원 또는 불화물과 같은 화학적 촉발인자에 의해 외부적으로 촉발될 수 있다.
절단 불가능한 링커는 치료 중에 원하는 효능 또는 세포 살상 효과를 달성하기 위하여 세포 독소로부터 제거될 필요가 없다. 따라서, 항체는 리소좀에 내재화되고 아미노산 성분들로 바뀌며, 약물-링커가 방출된다. 효능을 나타내기 위하여 추가적인 방출을 필요로 하지 않는 것이 바로 이러한 화합물이다. 절단 불가능한 링커는 온전한 세포 독소를 방출하기 위한 내부 기전을 가지고 있지 않으며, 대신 그것들은 세포 독소 프레임워크 상에서 그것들을 포함시키는 것의 무해함(benign-ness)을 필요로 한다. 절단 불가능한 링커들은 상대적으로 단순한 것에서부터 더욱 복잡한 개체까지 다양한 구조를 나타낼 수 있다.
나아가, 링커는 그것들이 세포 독소 및 항체에 부착되는 방식에 의해 정의된다. 통상적인 접근법의 경우, 이것은 시스테인 티올(말레이미드) 또는 리신 아민(활성산)에 부착되는 화학을 포함한다. 본 발명의 링커는 알킨 또는 아지드기를 편입시킨다.
적절하게는, 본 발명의 절단 불가능한 링커는 하나의 말단에 항체에 부착시키기 위한 기능적 핸들(Y), ADC의 두 구성성분들을 이어주며 항체 및 약물에 부착시키는 데 필요한 기능기를 제공하는 스페이서 및 약물에 커플링시키기 위한 상보적인 기능기(X)를 포함한다.
Figure pct00028
적절하게는, 바람직한 기능적 핸들은 표적 단백질 내에 위치한 비천연 아미노산 상의 기능기에 대해 상보적인 반응성 상대인 화학적 모이어티이다. 이러한 분자의 스페이서 부분은 항체 및 약물에 부착시키는 데 필요한 두 개의 상보적인 기능기를 함유하는 비기능적인 화학적 다리이다. 링커의 이러한 구현예에서, 이러한 스페이서는 어떠한 절단 부위도 가지고 있지 않다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 기능적 핸들(Y)은 알킨기를 포함한다.
Figure pct00029
바람직하게는, 이러한 알킨은 말단 알킨, 내부 알킨, 고리형 알킨 및 실릴 보호 알킨일 수 있다.
바람직하게는, 내부 알킨은 알킨에 인접한 전자 끄는 기를 함유한다. 바람직하게는, 고리형 알킨은 7원, 8원, 또는 9원 고리 내에 함유된 알킨이다.
이러한 전자 끄는 기로는 불소, 브롬, 염소 및 요오드와 같은 할로겐을 포함한다. 추가적인 전자 끄는 기로는 하이드록실, 에테르, 아세탈, 케탈, 케톤, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 니트릴, 니트로, 아미드를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 이러한 고리는, 예를 들어, 본 출원에 참조로써 포함된 문헌(van Delft, F., Angew. Chem. Int. Ed, 49, 1~5, 2012; M. D. Best, Biochemistry 2009, 48, 6571~6584; E. M.Sletten, C. R. Bertozzi, Angew. Chem. 2009, 121, 7108~7133; Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974~6998.; J. A. Prescher, C. R. Bertozzi, Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 13~21. J. A. Codelli, J. M. Baskin, N. J. Agard, C. R. Bertozzi, J. Am.Chem. Soc. 2008, 130, 11486~11493)에 기술된 바와 같이, 8원 고리가 3, 4, 5, 또는 6 개의 원자의 또 다른 고리에 융합된 2환 고리 시스템에 포함된다.
특히 바람직한 환형 알킨은 본 출원에 참조로써 포함된 US7,807,619 및 USSN12/049,034에 기술되어 있다.
특히 바람직한 2환 알킨은 (본 출원에 참조로써 포함된) WO2011/136645에 기술된 비시클로노닌이다.
Figure pct00030

일 구현예에서, 본 발명의 절단 불가능한 링커는 항체 부착 부위에 기능적 핸들(Y)로서 알켄을 함유할 수 있다.
적절하게는, 이러한 알켄은 단일 치환, 이치환, 삼치환 또는 사치환될 수 있다.
적절하게는, 이러한 알켄은 고리의 일부분으로서 편입될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이러한 알켄은 3~12원 고리의 일부분일 수 있다.
더욱 바람직한 구현예에서, 알켄은 노르보넨, 2환 퓨란 또는 2환 피롤 시스템과 같은 2환 고리 시스템의 일부분일 수 있다.
Figure pct00031
바람직하게는, 항체 부착 부위의 기능적 핸들(Y)은 할로겐화 비닐을 포함한다.
바람직하게는, 이러한 할로겐화 비닐은 Z 또는 Y 위치 또는 둘 다에 불소, 염소, 브롬 또는 요오드와 같은 할라이드를 포함한다. 또한, 이러한 할로겐화 비닐은 R기가 수소인 말단일 수 있다. 또한, 할로겐화 비닐 기는 R 위치에 알킬 및 아릴기, 카르보닐기를 포함한, 추가적인 치환을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 이러한 할로겐화 비닐은 환형 화합물의 일부분이다.
더욱 바람직하게는, 이러한 할로겐화 비닐은 3개, 4개 및 5개 원자를 가지는 고리의 일부분이다.
일 구현예에서, 항체 부착 부위의 기능적 핸들(Y)은 실릴기로 치환된 반응성 방향족 고리와 LG 위치에 할로겐화물 또는 트리플레이트, 토실레이트 또는 메실레이트를 포함한다.
Figure pct00032
추가적인 구현예에서, 항체 부착 부위의 기능적 핸들(Y)은 말단에 반응성 아지드기를 포함한다.
Figure pct00033
적절하게는, 본 발명의 절단 가능한 링커는 하나의 말단에 항체에 부착시키기 위한 기능적 핸들(Y), 스페이서 및 약물에 커플링시키기 위한 상보적인 기능기(X)를 포함한다.
Figure pct00034
적절하게는, 본 발명의 ADC의 절단 가능한 링커는 절단 부위를 포함한다.
적절하게는, 이러한 절단 부위는 효소적으로, 화학적으로, 또는 외부적으로 촉발될 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 절단 부위는 약물 부착 부위에 위치한다.
대안적인 구현예에서, 이러한 절단 부위는 약물 부착 부위에 있다.
Figure pct00035
일 구현예에서, 절단 가능한 링커는 알킨이 있는 항체 부착 부위에 기능적 핸들(Y)을 포함한다.
바람직하게는, 이러한 알킨은 말단 알킨, 내부 알킨, 환형 알킨 및 실릴 보호된 알킨일 수 있다.
바람직하게는, 이러한 내부 알킨은 알킨과 인접한 전자 끄는 기를 함유한다. 이러한 전자 끄는 기는 불소, 브롬, 염소 및 요오드와 같은 할로겐을 포함한다. 추가적인 전자 끄는 기로는 하이드록실, 에테르, 아세탈, 케탈, 케톤, 알데히드, 카르복실산, 에스테르, 니트릴, 니트로, 아미드를 포함한다.
바람직하게는, 환형 알킨은 7원, 8원 또는 9원 고리 내에 함유된 알킨일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 이러한 고리는 8원 고리가 3, 4, 5, 또는 6개 원자의 또 다른 고리에 융합된 2환 고리 시스템에 포함된다.
Figure pct00036
대안적인 구현예에서, 절단 부위 및 스페이서는 절단 부위가 약물 부착 부위에 있는 순서로 역전된다.
일 구현예에서, 본 발명의 절단 가능한 링커는 항체 부착 부위에 기능적 핸들(Y)로서 알켄을 함유할 수 있다.
적절하게는, 이러한 알켄은 단일 치환, 이치환, 삼치환 또는 사치환될 수 있다.
적절하게는, 이러한 알켄은 고리의 일부분으로서 편입될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이러한 알켄은 3~12원 고리의 일부분일 수 있다.
더욱 바람직한 구현예에서, 알켄은 노르보넨, 2환 퓨란 또는 2환 피롤 시스템과 같은 2환 고리 시스템의 일부분일 수 있다.
바람직하게는, 항체 부착 부위의 기능적 핸들(Y)은 할로겐화 비닐을 포함한다.
Figure pct00037
바람직하게는, 이러한 할로겐화 비닐은 Z 또는 Y 위치 또는 둘 다에 불소, 염소, 브롬 또는 요오드와 같은 할라이드를 포함한다. 또한, 이러한 할로겐화 비닐은 R기가 수소인 말단일 수 있다. 또한, 할로겐화 비닐 기는 R 위치에 알킬 및 아릴기, 카르보닐기를 포함한, 추가적인 치환을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 이러한 할로겐화 비닐은 환형 화합물의 일부분이다.
더욱 바람직하게는, 이러한 할로겐화 비닐은 3개, 4개 및 5개 원자를 가지는 고리의 일부분이다.
대안적인 구현예에서, 절단 부위 및 스페이서는 절단 부위가 약물 부착 부위에 있는 순서로 역전된다.
일 구현예에서, 항체 부착 부위의 기능적 핸들(Y)은 실릴기로 치환된 반응성 방향족 고리와 LG 위치에 할로겐화물 또는 트리플레이트, 토실레이트 또는 메실레이트를 포함한다.
Figure pct00038
대안적인 구현예에서, 절단 부위 및 스페이서는 절단 부위가 약물 부착 부위에 있는 순서로 역전된다.
Figure pct00039
추가적인 구현예에서, 항체 부착 부위의 기능적 핸들(Y)은 말단에 반응성 아지드기를 포함한다.
대안적인 구현예에서, 절단 부위 및 스페이서는 절단 부위가 약물 부착 부위에 있는 순서로 역전된다.
본 발명의 일 구현예에서, 절단 가능한 링커와 절단 불가능한 링커의 스페이서 부분은 구조적으로 다양할 수 있고, 알킬 사슬, 알킬 고리, 방향족 고리, p-아미노-벤조일 카보네이트를 포함하는 아닐린 유도체, 알켄, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자를 포함한다.
Figure pct00040
본 발명의 바람직한 구현예에서, 링커는 아지드-알킨 고리 첨가를 통해 항체에 부착하기 위한 하나의 말단에서 시클로알킨으로 이루어진다. 시클로알킨에 탄소 사슬이 부착되고, 이는 그 다음, 발린-시트룰린 펩티드에 부착된다. 시트룰린의 C 말단은 p-아미노-벤조일 카바메이트(PABC)에 커플링된다. 이는 결국 MMAF의 N 말단에 연결된다. 이러한 발린-시트룰린 펩티드는 카텝신 B 효소에 의해 인식되며, 이 효소는 시트룰린 c 말단에서 펩티드를 절단한다. 절단 후, p-아미노벤조일은 제거 반응을 거쳐 CO2 및 MMAF 기를 밀어낸다. 따라서, 전체 시클로알킨-val-cit-PABC 조합은 절단 가능한 링커이다.
본 발명의 일 구현예에서, 링커는 촉발인자에 의해 ADC로부터 약물을 방출한다.
적절하게는, 촉발인자는 표적 세포 근처 또는 내부에서 발견될 수 있다.
바람직하게는, 링커는 세포 내에서 발견된다. 적절하게는 세포 내 촉발인자는 효소적 촉발인자를 포함한다.
적절하게는, 효소적 절단 부위로는 세포 내 효소에 의해 특이적으로 인식되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 효소적 절단 부위는 카텝신(발린-시트룰린) 및 퓨린(Arg-N-Arg-Arg)이다.
대안적으로, 화학적 촉발인자가 표적 세포 내에서 발견된다.
적절하게는, 화학적 촉발인자는 에스테르, 아미드, 아세탈, 케탈, 니트릴, 에테르 절단, 카바메이트, 요소, 설폰아미드, 설포닐, 설페닐, 포스핀아미드, 포스포라미데이트, 엔아민, 이민, 실릴 에테르, 오르토 에스테르, 보론산염을 포함하는 화학적 모이어티의 산 가수분해물을 포함한다.
대안적으로, 화학적 촉발인자는 이황화물을 포함한 화학적 모이어티의 환원, 실릴기에 불화물 첨가, 역 고리 첨가 및 역 마이클 첨가도 포함할 수 있다.
대안적으로, 링커로부터 약물의 방출은 특정 파장의 방사선에의 노출과 같은 세포 외 자극에 의해 달성될 수 있다.
약물 모이어티
세포 독소 약물 모이어티와 같은, 본 발명의 약물 모이어티는 소분자, 자연적인 생성물, 합성적으로 유래된 약물, 면역 독소와 같은 단백질 및 방사성 핵종을 포함한다.
일 구현예에서, 약물 모이어티는 아우리스타틴 모이어티, 예컨대, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)(베도틴) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 아우리스타틴 F(AF)와 같은 아우리스타틴 또는 이의 유도체, 아마니틴, 파클리탁셀 및 독소루비신이다.
다른 약물 모이어티는 메이탄신, 파클리탁셀, 독소루비신 그리고 외독소 또는 보우가닌과 같은 면역 독소뿐만 아니라, 요오드-131, 이트륨-90, 사마륨-135 및 스트론튬-89와 같은 방사성 핵종을 포함하며, 이는 유기 분자로 편입될 수도 있다(예를 들어, MMAE: Senter, PE, et. al, BLOOD, 102, 1458-1465. MMAF: Senter, PE, et. al., Bioconj. Chem. 2006, 17, 114-124. 메이탄신: Lewis-Phillips GD, Cancer Res., 63, 9280-9290, 2008. 보우가닌: MacDonald GC, et. al, J. Immunotherapy, 32 574-84, 2009 참조).
가장 적절하게는, 이러한 약물 모이어티는 독소루비신, 파클리탁셀 및 아우리스타틴 모이어티로부터 선택된 모이어티이다.
염
본 출원에 기술된 아미노산, 아미노산 유도체, 유인성 아미노산 및 피롤리신 유사체는 선택적으로 염의 형태로 이용될 수 있다. 임의의 그러한 염은 본 발명의 일 양태를 형성한다. 카르복실산의 염으로는 1족 및 2족 금속과 형성된 염, 특히 나트륨 및 칼륨 염과 같은 가용성 염을 포함할 수 있다. 아민 염은 HCl, HBr 또는 아세트산과 같은 약산 및 강산과 형성된 염을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 안정적인 세포주의 생성
nnAA의 표적 단백질로의 부위 특이적인 통합을 할 수 있는 플랫폼 세포주의 생성은 pylRS 및 pyltRNA을 안정적으로 발현하는 세포주의 단계별 구축을 필요로 했다. 이는 pylRS/tRNA 발현 요소들의 순차적인 도입 및 고기능 세포를 확인하는 반복적인 선택 단계에 의해 달성되었다(도 1).
U6-pyltRNA 발현 카세트 9개 카피뿐만 아니라, 인간 INF
Figure pct00041
기질 부착 영역(U6가 SEQ ID 32에서 정의되고, tRNA 서열이 Seq ID 28에서 정의되는 pSB-9xtRNA-MARS)을 암호화하는 서열, 핵에서 크로마틴의 구조화를 매개하고 유전자 발현의 조절에 역할을 하며, 복제를 통해 이러한 요소들의 안정성을 증진시키는 서열 요소(Klar 2005; Heng 2004; Piechaczek 1999)를 함유하는 플라스미드로 DG44-CHO 세포를 형질감염시키고, 0.1 mM 하이포잔틴 및 0.016 mM 티미딘을 함유하는 HT 보충물, 8 mM 글루타민, 5 ug/mL 블라스티시딘으로 보충한 ProCHO4 배지(ProCHO4-C)에서 선택하였다. 그런 다음, GFP 리포터 분석법 및 세포 분류를 이용하여 tRNA 기능에 대해 세포들을 선택하였다. 간략하게, 세포들을 FLAG 태그를 붙인 pylRS를 암호화하는 pJTI-R4 PylRS eGFPY40(SEQ ID 2)와 40번 위치에서 티로신을 암호화하는 코돈 대신 앰버 코돈을 함유하는 리포터 eGFP(eGFPY40, SEQ ID 38)로 형질감염시키고, 세포들을 2 mM nnAA ALOC(N-알릴옥시카르보닐-L-리신)에 14시간 동안 노출시켰다. 최고 수준의 형광을 나타내는 30,000개의 세포들을 BD FACS Aria II 세포 분류기를 이용하여 새로운 ProCHO4-C 배지에 수집하고 팽창시켰다. 이러한 세포 집단은 pyltRNA 활성을 함유하는 분류된 풀(sorted pool)을 나타낸다. 이 분류된 풀이 사전 분류된 모(parent)풀에 비해 향상된 기능을 나타내는지 시험하기 위하여, 두 집단을 pJTI-R4 PylRS eGFPY40, 야생형 eGFP(SEQ ID 37)을 암호화하는 GFP 대조군(pTracer EF/HisA; 라이프 테크놀로지스, F64L 및 S65T 돌연변이를 함유하도록 변형됨)으로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 2mM ALOC를 함유하는 ProCHO4-C 배지에서 24시간 동안 성장시키고, Accuri 유세포 분석기를 이용하여 분석하고, 이들 세포 및 대조군 세포에서 형광 수준을 정량하였다(도 2의 A). 이러한 데이터는 모계통 또는 형질감염시키지 않은 대조군과 비교할 때, 분류된 세포 집단이 nnAA의 존재 시, 더 높은 앰버 억제 효능을 나타냄을 보여준다. 이러한 중간의 세포 집단을 DG44-CHO-191이라 지칭한다. DG44-CHO-191 세포들은 앰버 억제를 할 수 있었지만, 그 효능은 제한적이어서, GFPY40에 대하여 43% 미만의 앰버 억제를 나타냈다. tRNA의 수준이 앰버 억제의 효능에서 제한 요소인 것으로 나타났다. 따라서, 분류된 DG44-CHO-191 세포들을 pSZ-9xtRNA로 형질감염시키고, DMEM-BZ(DMEM(라이프 테크놀로지스), 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(깁코(Gibco) CAT-11140-050), 10% 우태아 혈청, HT 보충물, 5 ug/ml 블라스티시딘, 0.5 mg/mL 제오신)에서 세포들을 선택하였다. DG44-CHO-200-12 및 DG44-CHO-191 세포들로 지칭되는 살아 있는 세포 풀을 pJTI-R4 PylRS eGFPY40 또는 pTracer로 형질감염시켰다. 추가적인 tRNA 발현 카세트 카피를 함유하는 세포들은 증가된 eGFPY40 의존성 형광 및 그에 따른 앰버 억제 효능을 보여주었다(도 2의 B). 이러한 데이터는 단계별, 반복적인 선택 및 세포 분류 방법이 향상된 기능을 나타내는 세포들의 확인으로 이어짐을 보여준다. tRNA가 시스템의 제한 요소라는 이해와 함께, pyltRNA의 발현 수준 및 그에 따른 이러한 세포 집단의 앰버 억제의 효율을 더 증가시키기 위하여, DG44-CHO-200-12 세포들을 세포 분류시켜, 높은 앰버 억제 능력을 나타내는 세포들을 분리하였다. 여기서, (pSB-9x-MARS 및 pSZ-9x을 함유하는) DG44-CHO-200-12 세포들을 pJTI-R4-pylRS-eGFPY40으로 일시적으로 형질감염시키고, 세포들을 2 mM ALOC를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 최고 1%의 형광 수준을 나타내는 7,000개의 세포들을 BD FACS Aria II 세포 분류기를 이용하여 분리하고, DMEM-BZ에서 번식시켰다. 이로써 DG44-CHO-208-2라 지칭되는 세포 풀이 얻어졌다.
플랫폼 세포주의 완성에는 pyrlRS의 발현을 위한 카세트의 안정적인 도입이 필요했다. 따라서, 208-2 세포들을 SEQ ID No 2(Y384F 돌연변이) 또는 SEQ ID 1(WT)의 pylRS를 암호화하는 cDNA 서열을 운반하는 pMOAV2 또는 pMOAV2-puro로 형질감염시키고, 형질전환주를 0.5 mg/mL 하이그로마이신을 함유하는 DMEM-BSD-Zeo(DMEM-HBZ) 또는 7.5 ug/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM-BZ(DMEM-PBZ)에서 선택하여 DG44-CHO-211-1(하이그로) 또는 DG44-CHO-211-2(퓨로)라 불리는 선택된 세포 풀을 생성하였다. 항생제 내성 세포들을 배양하고, eGFP 리포터 구성체를 암호화하는 pENTR-P5-P2 eGFPY40로 형질감염시키고, 세포들을 1시간 20분 동안 2 mM ALOC의 존재 하에서 배양하고, 이어서, 높은 형광 수준을 나타내는 세포들을 세포 분류를 이용하여 분리하였다. 여기서, (1,712,332개의 이벤트로부터) 1331개의 211-1 세포와 1169개의 211-2 세포를 분리하였다. DG44-CHO-223-1 또는 DG44-CHO-223-2라 불리는 분리된 집단을 DMEM-HBZ 또는 DMEM-PBZ에서 배양하였다.
pylRS를 함유하는 집단의 분류가 앰버 억제의 효율을 향상시켰는지를 결정하기 위하여, 개방형 해독틀을 방해하는 앰버 코돈을 함유하는 GFP를 암호화하는 리포터 플라스미드(P2-P5, eGFPY40), eTracer로 DG44-CHO-223-1 및 이의 모세포주 DG44-CHO-211-1의 일시적인 형질감염을 수행하거나, 형질감염시키지 않았다. 형질감염된 세포들을 2 mM ALOC로 28시간 동안 배양하고, Accuri 유세포 분석기를 활용하여 유동 세포 분석법으로 형광을 정량하였다(도 2의 C). DG44-CHO-211-1와 DG44-CHO-223-1는 동등한 형질감염성을 나타냈지만(eTracer 대조군), DG44-CHO-223-1은 모세포주보다 5배를 초과하는 eGFPY40 의존성 형광을 나타냈다. 이러한 결과는 세포 분류가 매우 활성이 있는 앰버 억제 세포의 분리 및 효율적인 플랫폼 세포주의 분리를 가능하게 함을 나타낸다.
다음으로, 이러한 플랫폼 세포주를, nnAA로 변형되는 단백질을 암호화하는, 안정적으로 통합된 유전자 표적을 함유하는 발현 세포주를 개발하는 데에 이용하였다.
DG44-CHO-223-2 세포주를 중쇄 cDNA의 K274번 위치에 앰버 코돈이 있는 인간 IL-6에 대한 IgG를 발현시키기 위한 유전자를 함유하는 pOtivec-28D2amb274 플라스미드로 형질감염시켰다. 이를 위해, 본 출원에 전체가 참조로써 포함된 WO2012032181에 기술된 바와 같이, 인간 사이토카인 IL-6에 대한 토끼 항체의 가변 영역을 PCR 증폭에 의해 인간 프레임워크 상으로 접합시키고, pFUSE-CHIg-hG1(중쇄, SEQ ID 40) 및 pFUSE-CHLIg-hK(경쇄, SEQ ID 44)(인비보젠) 벡터들로 클로닝하여 토끼-인간 하이브리드를 생성하여, 인간 사이토카인 IL-6에 대한 항체를 생성하였다. 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 중쇄 불변 영역의 K274번 위치에 앰버 코돈을 도입하였다(SEQ ID 42). 앰버 코돈을 함유하는 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 통합 구성체를 생성하기 위하여, 이 IgG, 프로모터들, 중쇄에 대한 ORF를 PCR로 증폭시키고, 제한 효소 절단 및 pOptivec(라이프 테크놀로지스)에 라이게이션하여 클로닝하였다. 경쇄 및 tRNA의 단일 카피를 오버래핑 올리고머를 이용하여 2단계의 PCR 방법으로 연결시키고, 중쇄를 함유하는 pOptivec 플라스미드 내의 이용 가능한 부위로 클로닝하였다. 얻어진 벡터를 플랫폼 세포주 DG44-CHO-223-2 내로 형질감염에 의해 도입하고, 세포들을 하이포잔틴과 티미딘이 결여된 성장 배지인 DMEM-HT(DMEM, 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 투석된 우태아 혈청, 5 ug/ml 블라스티시딘, 0.5 mg/mL 제오신, 0.75 ug/mL 퓨로마이신)에서 배양물의 성장에 의해 선택하였다. Optivec 벡터는 디하이드로엽산 환원효소(DHFR)에 대한 유전자도 함유하는데, 이는 HT 보충물이 결여된 배지 내에서, 그리고 메토트렉세이트의 존재 하에서 DG44 CHO 세포의 성장을 가능하게 한다. 세포들을 DMEM-HT가 결여되고, 10 nM, 50 nM 및 100 nM 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지에서 추가로 선택하였다. 살아 있는 세포를 수확하고, 이전에 설명했던 사용 항생제 농도의 절반이 들어있는 동일한 배지 내에, 96웰 트레이에 웰당 50개 세포로 배분하였다. 성장 배지 내에 nnAA이 없을 때, pylRS/tRNA 쌍은 불활성을 나타내고, 앰버 억제는 일어나지 않는다. 따라서, 절단된 IgG 중쇄가 발현되어, 성장 배지로 분비된다. 10~12일 후, 성장에 대해 웰을 모니터링하고, 높은 수준의 절단된 IgG를 발현하는 콜로니를 함유하는 웰을 확인하고자 ELISA 분석을 이용하였다. 이를 위하여, ELISA 플레이트를 1시간 동안 또는 4C에서 밤새 인산 완충 식염수(PBS) 내의 1 ug/mL 3xFLAG-IL-6-Avi로 코팅하였다. 물에 세척하고, 1% BSA를 함유하는 PBS에서 블로킹한 후, 15 ul의 발현 배지를 0.1% 탈지 우유를 함유하는 PBS 35 ul로 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 웰을 물에 여러 차례 세척하고, 실온에서 1시간 동안 호스 래디쉬 퍼록시다아제에 접합시킨 2차 항체(항-인간 H+L-HRP; 잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories))의 1:10,000배 희석액 50 ul로 세척하였다. 그 다음, 웰을 세척하고, 50ul의 슈어블루 리저브 TMB(Sureblue Reserve TMB, KPL)를 각 웰에 첨가하였다. 5~10분 후, 0.1N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nM 파장에서 플레이트 판독기를 이용하여 발색을 정량하였다. 높은 수준의 절단된 IgG를 발현시킨 세포를 함유하는 웰을 증식 확장시켰다. 이러한 분석법은 높은 절단 IgG 발현을 나타내는 일곱 개의 클론의 확인으로 이어졌다. 분리된 클론들이 효율적인 앰버 억제를 나타내는지를 확인하기 위하여, 클론들을 2 mM ALOC에 노출시키고, 전체 길이의 IgG의 발현 수준을 ELISA로 측정하였다. 간략하게는, 염소 인간 항-FC 항체(잭슨 랩)를 전체 길이의 IgG를 특이적으로 포획하고, 절단된 IgG는 포획하지 않는 데에 이용하였다. 시험했던 일곱 개의 클론들 가운데, 하나가 높은 수준의 전체 길이 발현을 나타냈다(3F2, SEQ ID 42). 앰버 억제의 효율을 증명하기 위하여, 3F2 클론을 IgG의 발현 및 정제에 활용하였다. 3F2 클론을 50nM MTX를 함유하는 배지 내에서 조직 배양 플라스크에 90% 포화(confluence)까지 배양하고, 세포들을 발현 배지(DMEM, 2mM 글루타맥스, 1mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 저IgG 우태아 혈청, 5 ug/ml 블라스티시딘, 0.5 mg/mL 제오신, 0.75 ug/mL 퓨로마이신) 내에서 2mM 리신-아지드(nnAA)와 배양하였다. 7일 동안 세포들이 항체를 발현하도록 하고, 배지를 수집하였다. 발현 상층액으로부터 항체를 단백질 A 컬럼으로 포획하고, PBS로 세척하였다. 결합된 단백질을 50mM 글리신(pH3.0)으로 용리시키고, IgG를 함유하는 피크 분획을 PBS에 투석시켰다. 리신-아지드 nnAA를 함유하는 정제된 항체를 AzAb라 지칭한다. 대표적인 샘플들을 SDS-PAGE 로딩 완충액에 재현탁시키고, 0.5 ug 및 1 ug 각각을 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분해하고, 쿠마시 블루로 염색하였다(도 3의 A). 발현된 생성물이 nnAA(리신-아지드)를 함유하였음을 증명하기 위하여, 발현된 단백질을 100배를 초과하는, 환형 알킨 기능기를 함유하는 20 KDa-PEG와 실온에서 4시간 동안 배양하였다. 동일한 양의 출발물질 및 PEG-IgG 접합체를 SDS-PAGE로 분해하고, 쿠마시 염색으로 시각화하였다(도 3의 B). PEG는 접합체의 분자량을 바꾸어, 겔 이동성 지연을 가져온다. 반응 혼합물을 변성 및 환원 조건 하에서 분해하였을 때, (274번 위치에) 비천연 아미노산 통합 부위를 함유하도록 설계된 IgG의 중쇄만이 겔 이동성 변화를 보여줌이 관찰되었다. 대조적으로, 경쇄는 접합 반응에 의해 변경되는 것으로 보이지 않는다. 이러한 데이터는 발현된 단백질이 특이적으로 변형되는 모이어티를 함유하고 있다는 점과 접합 조건이 중쇄에 특이적이라는 점을 보여준다. 접합체에서 관찰된 이동성 변화가 IgG항-IL-6 AzAb의 페길화를 나타낸다는 점을 추가로 증명하고자, 접합 반응의 출발 물질인 대조군 IgG 및 접합된 IgG를 단백질 A에 결합시켰다. 결합된 물질을 PBS로 세척하여 접합되지 않은 PEG를 제거하고, 단백질을 2% SDS로 용리시켰다. 그런 다음, 이러한 물질을 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분해하고, 단백질을 쿠마시 블루 염색으로 시각화하고, PEG를 시각화하기 위하여 요오드 염색을 하였고, 항-인간 FC 특이적 항체(잭슨 랩)를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여 중쇄를 검출하였다(도 3의 C). 이러한 데이터는 접합체가 중쇄에서 특이적으로 형성되며, 분자량 증가가 PEG와의 접합체 형성 때문임을 보여준다.
her2/neu(3E9, SEQ ID 48)에 대한 항체에 대해 위에 나타낸 바와 같이, 위에 기술된 동일한 위치(K274, SEQ ID 48)에서 중쇄에 암호화된 앰버 코돈을 함유하는 클론을 생성하는 것과 동시에, IL-6에 대한 항체를 발현하는 제2의 클론을 확인하고 특성을 분석하였다(7B1, SEQ ID 42). 이들 세포주의 발현 수준을 정량하고, 세포당 생산량을 리신-아지드의 존재 하에 발현 배지 내에서 확인하였다(도 3의 D). 이러한 데이터는 nnAA을 함유하는 상이한 항체들의 발현에 대한 본 방법의 적용 가능성을 보여준다.
실시예 2: 앰버 억제 관련 독성
플랫폼 세포주 분리 과정 중에 본 발명자들은 시스템의 효율을 향상시키기 위하여 증가하는 양의 pylRS/tRNApyl를 도입함에 따라 세포의 생존능이 저하됨을 관찰하였다. 특히, tRNApyl 수준 증가가 앰버 억제 효능에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이것은 pJTI-R4-pylRS-eGFPY40 및 상이한 수의 U6-tRNA 발현 카세트를 암호화하는 벡터들로 일시적으로 형질감염시킨 세포들에서 관찰되었으며, 평균 형광을 Accuri 유세포 분석기를 이용하여 결정하였다(도 4의 A). 본 발명자들은 tRNA 발현 카세트가 결여된 세포 또는 ALOC의 부재 하에 성장시킨 세포들은 유의미한 GFP 신호를 나타내지 않음을 관찰하였다. 그러나, GFP의 발현 수준은 tRNA 유전자 카피의 수와 함께 증가하였으며, 이는 tRNA가 앰버 억제 시스템의 중요한 성분임을 나타낸다. 앰버 억제에서 tRNA 수준의 영향을 더 상세히 구별하기 위하여, 본 발명자들은 pylRS 또는 tRNA 유전자들을 암호화하는 벡터들을 이용하여 상이한 양으로 일시적으로 형질감염시키고, 2 mM ALOC의 존재 하에 앰버 종결 코돈을 함유하는 표적 단백질에 미치는 앰버 억제의 효능을 측정하였다. 인간 사이토카인을 암호화하는 발현 구성체인, 아미노산 잔기 131번에 앰버 코돈을 함유하는 FGF21(여기서 개시자 메티오닌은 1임-SEQ ID 63, SEQ ID 64)를 pylRS 및, U6-tRNA 카세트의 6개의 유전자 카피와 함께 공동으로 형질감염시켰을 때, 본 발명자들은 대략 50%가 절단형이 전체 길이의 FGF21로 전환됨을 관찰하였다(도 4의 B). 형질감염에서 pylRS 벡터의 양을 두 배로 하는 것은 절단형 및 전체 길이의 FGF21 사이의 비율을 유의미하게 바꾸지 않았다(2xpylRS). 그러나 tRNA 카세트의 추가적인 카피를 도입하자(15x U6-tRNA) 전체 길이의 FGF21의 상대적인 발현에 유의미한 증가로 이어졌다. 이는 tRNA 수준이 앰버 억제에 대해 가장 큰 제한 인자임을 나타낸 것이다.
따라서, 효율적인 앰버 억제 성질을 나타내는 세포주의 생성은 높은 수준의 tRNA 발현을 필요로 한다. 그러나 본 발명자들은 특히 tRNA 플라스미드의 발현이 세포 성장에 해롭다는 점을 발견했다. tRNA 발현 카세트의 고유의 독성은 모세포주와 비교할 때, 관찰 가능한 형태적 변화 및 고기능의 플랫폼 세포의 감소된 성장 속도에 반영되었다.
플랫폼 세포주의 효능은 tRNA 수준에 의해 직접적으로 영향을 받지만, 높은 수준의 tRNApyl은 세포 독성 효과를 초래하였다. 본 발명자들은 많은 수의 U6-tRNA 유전자 도입이 nnAA 및 pylRS의 존재 하에서 앰버 억제를 향상시켰지만 높은 수준의 tRNA는 세포 독성도 초래한다는 점을 관찰하였다. 이러한 효과가 tRNA 발현과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, pSB-9xtRNA의 존재에 대해 선택된 CHO 세포주(DG44-CHO-191)를 eGFPY40를 암호화하는 벡터를 단독으로(P5-P2 eGFPY40) 또는 CMV 프로모터의 조절 하에 pylRS를 암호화하는 벡터(pCEP4-pylRS) 또는 pOriP 요소도 함유하는 플라스미드 내에 U6-tRNA의 9개 카피를 함유하는 벡터(pOriP-9xtRNA)와 조합하여 일시적으로 형질감염하고, EBNA-1를 발현하는 세포에서 이러한 플라스미드의 장기간 보유를 가능하게 하고(본 출원에 전체가 참조로써 포함된 Shan 2006 및 EP1992698), 이러한 세포들을 37C에서 48시간 동안 배양하였다. 유세포 분석기를 이용하여 형광 수준을 정량하였다(도 4의 C). pyltRNA를 발현하는 세포의 배경에서 pylRS 발현 카세트의 첨가는 nnAA의 부재 하에 앰버 억제 수준의 증가를 초래하였지만, 이러한 효과는 tRNA의 추가적인 카피로 형질 감염시킨 세포에서 증폭되었다. 이러한 데이터는 높은 수준의 tRNApyl이 야생형 세포보다 훨씬 더 높은 배경 앰버 억제 수준을 유도함을 시사한다. 앰버 억제와 관련된 독성은 다양한 시스템에 대한 문헌에서 보고되어 있으며, 주로 정상적으로 앰버 코돈에서 종결되는 필수적인 유전자의 연장에서 기인한 것으로 여겨진다(Liebman 및 Sherman 1976; Liebman et al., 1976). 자연적인 정지를 넘어선 이러한 유전자들의 연장이 이러한 단백질들의 기능을 변경하거나, 감소시키거나 제거할 수 있다는 것이 요즘의 견해이다. 마지막으로, 앰버 억제가 세포 증식 억제 효과를 초래하는지 결정하기 위하여, 1000개의 HEK293 c18 세포들을 96웰 플레이트에 플레이팅하고 pCEP4-pylRS 및 pOriP-9xtRNA 구성체로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포들을 5 mM부터 시작하여 0.08 mM까지의 적정값의 nnAA을 함유하는 DMEM-C 배지(ALOC)에서 성장시켰다. 형질감염시 및 5일 성장 후, 세포 생존능을 MTS 비색 분석을 이용하여 분석하였다(도 4의 D). 이러한 데이터는 매우 적은 농도의 nnAA이라도 세포 증식 억제 효과를 초래함을 보여준다. 현재 가설을 토대로, 앰버 억제와 관련된 독성은 시스템에 고유한 것이며, 피할 수 없다. 따라서, tRNApyl 및 PrylRS를 함유하는 플랫폼 세포주는 세포당 생산된 단백질의 양으로 측정되는 높은 생산성을 필요로 하는 단백질 기반 약물의 제조에는 적절하지 않다.
그러나, 앰버 코돈을 함유하는 표적 단백질의 형질 감염 및 이후의 선택 시, 본 발명자들은 세포들이 형질감염되지 않은 세포들의 특징인 방추체 형상 및 납작한 외관을 회복하며 향상된 성장 속도를 나타냄을 관찰하였다(도 4의 E).
이는 앰버 코돈을 함유하는 높은 수준의 메시지의 존재가 배경 앰버 억제를 흡수하고, 필수적인 유전자에 미치는 영향을 제한한다는 것을 시사한다. 따라서, 세포주의 구축은 앰버 코돈을 함유하는 기존의, 그리고 높이 발현하는 표적을 필요로 할 수 있으며, 이는 매우 고기능의 앰버 억제 세포의 분리를 가능하게 한다.
실시예 3 - 앰버 억제 관련 독성을 완화시키는 기법
앰버 억제와 관련된 독성은 본 발명자들로 하여금 발현 세포주를 개발하는 데 있어서 매우 활성이 높은 앰버 억제 세포의 분리를 가능하게 하는 한편, 이러한 독성을 완화시킬 대안적인 접근법을 구상하게 하였다.
"표적 우선" 접근법
안정적인 발현 세포주를 개발하는 데 있어서 매우 활성이 높은 앰버 억제 세포의 분리를 가능하게 하는 한편, 이러한 독성을 완화시키는 한 가지 접근법은 pylRS 및 pyltRNA를 도입하기 전에 앰버 코돈을 함유하는, 높게 발현된 표적 유전자의 도입을 필요로 한다. 이러한 유전자로부터의 높은 수준의 메시지는 세포에서 이용 가능한 활성화된 pyltRNA에 대한 내인성 유전자 발현과 효과적으로 경쟁하여, 세포의 기능적 기구에 대한 영향력을 감소시킨다. 이를 위하여, 진핵 발현 숙주 세포를, 발현을 목적으로 하고, pOptivec 벡터(라이프 테크놀로지스)로 클로닝된 IgG와 같이, 하나 이상의 앰버 종결 코돈을 함유하는 유전자로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포들을 HT가 결여된 배지 및 HT가 결여되고 10nM, 50nM 또는 100nM MTX가 보충된 배지에서 저항성 및 성장 능력에 의해 선택한다. 1~50개의 세포들을 96웰 플레이트의 각 웰로 옮겨 웰에 거주하게 함으로써 살아 있는 세포들을 클로닝한다. 그런 다음, 웰을 ELISA에 의해 분석하여, 높은 역가의 절단된 항체를 함유하는 웰을 확인한다. 이를 위하여, ELISA 플레이트를 1시간 동안 또는 4C에서 밤새 인산 완충 식염수(PBS)에서 항원(예를 들어, 1 ug 3xFLAG-IL-6-Avor 0.5 ug/mL Her2 세포외 도메인)으로 코팅한다. 10% 염소 혈청 또는 1% BSA를 함유하는 PBS에서 세척 및 블로킹한 후, 10% 염소 혈청 또는 35ul의 1% 탈지 우유를 함유하는 40 ul의 PBS 및 10ul의 발현 배지를 적당한 웰에 실온에서 1시간 동안 첨가한다. 웰을 물에 여러 차례 세척하고, 실온에서 1시간 동안 호스 래디쉬 퍼록시다아제에 접합시킨 2차 항체(항-인간 카파-HRP)(잭슨 랩)의 1:4,000배 희석액 50 ul를 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 웰을 세척하고, 50ul의 슈어블루 리저브 TMB(KPL)를 각 웰에 첨가한다. 5~10분 후, 0.1 N H2SO4를 첨가하여 발색을 정지시키고, 450 nM 파장에서 플레이트 판독기를 이용하여 발색을 정량한다. 기지의 농도의 대조군 IgG를 표준 곡선을 확립하는 데 이용한다. 높은 수준의 절단된 IgG를 발현시킨 세포를 함유하는 웰을 증식 확장시킨다.
nnAA의 도입을 위한 기능적 요소들이 도입되고, 순차적으로 또는 동시에 선택된다. 일 예에서, 표적 유전자를 높이 발현하는 세포들을 pylRS 및 pyltRNA에 대한 유전자들을 함유하는, pMOAV2 또는 pMOAV2puro로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포들을 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 우태아 혈청, 및 0.5 mg/mL 하이그로마이신 또는 7.5 ug/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM에서 선택한다. 살아 있는 세포들을 증식시키고, 이러한 집단으로부터 1~50개의 세포들을 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩한다. 세포들이 팽창하여 콜로니가 형성되면, 세포들을 2 mM의 nnAA에 노출시키고, ELISA 분석법을 이용하여 기능적으로 분석하여 40% 또는 50%를 초과하는, 또는 바람직하게는 60 또는 80% 또는 90%를 초과하는 앰버 억제 효율을 나타내는 클론을 확인한다. 전체 길이의 IgG 발현을 정량하기 위하여, ELISA 플레이트를 1시간 동안 또는 4C에서 밤새 인산 완충 식염수(PBS) 내의 1 ug/mL 항-인간 FC(잭슨 랩) 항체로 코팅한다. 10% 염소 혈청을 함유하는 PBS에서 세척 및 블로킹한 후, 10% 염소 혈청을 함유하는 40 ul의 PBS 및 10ul의 발현 배지를 적당한 웰에 실온에서 1시간 동안 첨가한다. 웰을 물에 여러 차례 세척하고, 실온에서 1시간 동안 호스 래디쉬 퍼록시다아제에 접합시킨 2차 항체(항-인간 H+L-HRP)(잭슨 랩)의 1:10,000배 희석액 50 ul를 각 웰에 실온에서 1시간 동안 첨가한다. 그 다음, 웰을 세척하고, 50 ul의 슈어블루 리저브 TMB(KPL)를 각 웰에 첨가한다. 5~10분 후, 0.1 N H2SO4를 첨가하여 발색을 정지시키고, 450 nM 파장에서 플레이트 판독기를 이용하여 발색을 정량한다. 기지의 농도의 대조군 IgG를 표준 곡선을 확립하는 데 이용한다. 이러한 분석법은 전체 길이의 IgG의 발현 수준을 결정할 것이다. 절단형 IgG 수준을 결정하기 위하여, ELISA 플레이트를 항원, 예를 들어, 인산 완충 식염수(PBS) 내의 1 ug/mL 3xFLAG-IL-6-Avor 0.5 ug/mL Her2 세포외 도메인으로 1시간 동안 또는 밤새 4C에서 코팅한다. 1% BSA를 함유하는 PBS에서 세척 및 블로킹한 후, 0.1% 탈지 우유를 함유하는 PBS 35ul 및 15ul의 발현 배지를 적당한 웰에 실온에서 1시간 동안 첨가한다. 웰을 물에 여러 차례 세척하고, 실온에서 1시간 동안 호스 래디쉬 퍼록시다아제에 접합시킨 2차 항체(항-인간 카파-HRP)(잭슨 랩)의 1:10,000배 희석액 50 ul를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 웰을 세척할 것이고, 50 ul의 슈어블루 리저브 TMB(KPL)를 각 웰에 첨가한다. 5~10분 후, 0.1 N H2SO4를 첨가하여 발색을 정지시키고, 450 nM 파장에서 플레이트 판독기를 이용하여 발색을 정량한다. 기지의 농도의 대조군 IgG를 표준 곡선을 확립하는 데 이용한다. 각 웰에서 전체 길이의 IgG에 대한 절단형의 비율을 결정하고, 전체 길이의 IgG 수준이 총 생산된 IgG의 적어도 25 또는 50%, 바람직하게는 40~60% 또는 80~90% 이상인 높은 앰버 억제 활성을 나타내는 웰을 증식시킨다.
필요한 경우, 앰버 억제의 효능을 더욱 향상시키기 위하여 추가적인 tRNA 유전자가 이러한 선택된 세포 풀로 도입될 것이다. 이를 위하여, pSB-9xtRNA-MARS 발현 카세트를 이러한 세포들에 형질감염시키고, 형질감염체들을 5 ug/mL 블라스티시딘을 함유하는, 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 우태아 혈청, 그리고 0.5 mg/mL 하이그로마이신 또는 7.5 ug/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM(DMEM-BSD) 또는 대안적으로 ProCHO4(Lonza) 또는 8mM 글루타민, 0.5 mg/mL 하이그로마이신 또는 7.5 ug/ml 퓨로마이신 및 5 ug/mL 블라스티시딘을 함유하는 등가 배지(ProCHO4-BSD)에서 항생제 내성에 의해 선택한다. 가장 높은 tRNA 활성을 나타내는 세포들을 위에서 기술된 ELISA 분석법을 이용하여 선택하여, nnAA에 노출시킨 세포에서 전체 길이 및 절단형 IgG 생산 수율을 결정한다. 모세포에 비해 절단형 IgG에 대한 향상된 전체 길이 IgG 비율을 나타내는 세포들을 증식시킨다. 추가적인 tRNA 유전자 삽입이 필요한 경우, 이러한 방법을 위에서 기술된 바와 같이 pSZ-9xtRNA로 반복하고, 5 ug/mL 제오신을 함유하는 배지에서 세포들을 선택하고, 이어서 기능적 선택 스크린을 한다.
"유인성 단백질" 접근법
안정적인 발현 세포주를 개발하는 데 있어서 매우 활성이 높은 앰버 억제 세포의 분리를 가능하게 하는 한편, 관찰된 독성을 완화시키는 대안적인 접근법은 높은 수준으로 발현된 앰버 코돈을 함유하는 대리(surrogate) 유전자의 도입을 수반하는데, 이때, 발현은 유도성 프로모터에 의해 추진되어 표적 유전자의 발현 중에 그의 발현을 하향 조절할 수 있게 한다. 이것은 PylRS/tRNApyl 직교성 기구를 발현하는 안정적인 세포주를 생성하여 다중 표적들을 변형시키는 데에 이용할 수 있다는 장점이 있다. 이를 위하여, CHO 세포와 같은 진핵 발현 숙주 세포를, 발현을 목적으로 하고, 바람직하게는 Tet-On 3G(클론테크(Clonthech), T-Rex(라이프 테크놀로지스), 엑디손 유도성, 또는 스테로이드 유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터 내로 클로닝된, GFP, eGFP, 적색 형광 단백질, 글루타티온-S-전이효소, b-마이크로글로불린, 또는 B-갈락토사이드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않은, 하나 이상의 앰버 종결 코돈을 함유하는 유전자로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포들을 저항성 및 적절한 항생제를 함유하는 배지에서의 성장 능력에 의해 선택한다. 1~50개의 세포들을 96웰 플레이트의 각 웰로 옮겨 웰에 거주하게 함으로써 살아 있는 세포들을 클로닝한다. 그런 다음, 높은 역가의 절단된 단백질을 함유하는 웰을 확인하기 위해 웰을 ELISA로 분석할 것이다. 하나 이상의 앰버 코돈을 함유하는 높게 발현된 대리 단백질은 앰버 억제 활성을 흡수하는 앰버 싱크로서 기능하고, 앰버 억제의 해로운 효과로부터 세포를 보호할 것이다. nnAA의 도입을 위한, U6-tRNA 카세트 및 pylRS 유전자와 같은 기능적 요소들은 숙주 세포에 도입되고, 순차적으로 또는 동시에 선택된다. 일 예에서, 대리 표적 유전자를 높이 발현하는 세포들을 pylRS 및 pyltRNA에 대한 유전자들을 함유하는, pMOAV2 또는 pMOAV2puro로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포들을 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 우태아 혈청, 및 0.5 mg/mL 하이그로마이신 또는 7.5 ug/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM에서 선택한다. 살아 있는 세포들을 증식시키고, 이러한 집단으로부터 1~50개의 세포들을 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩한다. 세포들이 팽창하여 콜로니가 형성되면, 세포들을 2 mM의 nnAA에 노출시키고, ELISA 분석법을 이용하여 기능적으로 분석하여 리포터 단백질(eGFPY40) 또는 대리 표적 단백질을 이용하여 40% 또는 50%, 또는 바람직하게는 40~60%를 초과하는, 또는 80% 또는 90%를 초과하는 앰버 억제 효율을 나타내는 클론을 확인한다. 고기능 클론들을 제한 희석 클로닝 또는 세포 분류에 의해 분리한다. 그런 다음, 단백질 치료제를 암호화하는 유전자가 이러한 세포들로 도입되고 선택될 것이다. 높게 발현하는 클론들을 분리하고, ELISA 분석법을 이용하여 확인한다. 그런 다음, 높게 발현하는 클론들을 앰버 억제 효능에 대해 스크리닝할 것이다. 각 웰에서 전체 길이 단백질에 대한 절단형의 비율을 결정하고, 높은 앰버 억제 활성을 나타내는 웰, nnAA을 함유하는 전체 길이 단백질의, 적어도 40% 또는 50%, 그러나 바람직하게는 40~60% 또는 80~90% 이상의 앰버 억제 수준을 나타내는 클론이 증식된다.
필요한 경우, 바로 위에서 논의된 바와 같이, 앰버 억제의 효능을 더욱 향상시키기 위하여 추가적인 tRNA 유전자가 이러한 선택된 세포 풀로 도입될 것이다.
" 억제성 tRNA " 접근법
tRNA 발현 수준을 조절하고, tRNA 관련된 세포 독성을 완화하기 위하여 대안적인 전략이 세워졌다. 이를 위하여, tRNA에 발현에 필수적인 U6 또는 H1과 같은 프로모터 요소들을 변형시켜, TetO 억제 요소와 같은 유전자 발현의 억제를 가능하게 하는 서열 요소들을 포함하도록 한다. 이는 성장기 중 tRNA 발현의 하향 조절 및 표적 유전자의 발현 중 tRNA 발현의 유도를 가능하게 한다.
"유인성 아미노산" 접근법
pylRS에 의해 인식되고, tRNApyl로 활성화되나, 펩티드 결합 형성을 허용하지 않도록 변형되는 아미노산 유사체를 도입하여 배경 앰버 억제의 효과를 조작하기 위한 대안적인 전략이 세워졌다. 이러한 유인성 아미노산의 tRNApyl로의 활성화는 숙주 RS 또는 pylRS에 의한 천연 아미노산 활성화와 효과적으로 경쟁하여, 유인성 아미노산에 의해 활성화된 tRNA의 세포 풀을 생성할 것이다. 또한, 이러한 풀은 앰버 코돈에 대해 잘못 아실화된 tRNApyl과도 경쟁할 것이다. 따라서, 유인성 아미노산에 의해 활성화된 tRNA의 풀은 앰버 종결 코돈에서 단백질 합성을 정상적으로 종결할 수 있게 할 것이다. 플랫폼 세포주 구축 과정 중에, DG44 CHO 세포와 같은 세포들을 유인성 아미노산 및 이러한 세포들로 안정적으로 통합된 tRNA 및 pylRS를 암호화하는 유전자들을 함유하는 배지에서 성장시킨다. 형질감염된 세포들을 적절한 항생제를 함유하는 배지에서의 성장에 의해 선택하고, 살아 있는 세포들을 확장시킨다. 이러한 풀을 일시적으로 eGFPY40을 암호화하는 벡터로 형질 감염시키고, 세포들을 앰버 코돈 번역초과를 가능하게 하는 펩티드 결합 형성을 허용하는 nnAA을 함유하며, 유인성 아미노산이 결여된 배지에서 성장시킨다. 그런 다음, 고기능 세포들을 eGFPY40 리포터의 발현 수준에 의해 확인할 것이고, 세포들을 BD FACS Aria II를 이용하여 유동 세포 분석법으로 분리한다. 분류된 세포들을 확장시키고, 이러한 분류된 풀에서의 앰버 억제의 효능을 이용 가능한 리포터(예컨대 eGFPY40 또는 FGF21-131amb)를 이용하여 측정한다. 필요한 경우, 앰버 억제의 효율을 증진시키기 위하여 tRNA 또는 pylRS 유전자의 반복적인 추가 및 유동 세포 분석법을 이용한 선택이 수행될 수 있다. 그런 다음, 플랫폼 세포를, 유전자 발현 선택을 허용 하기 위한 Optivec 플라스미드(라이프 테크놀로지스)와 같은 DHFR 유전자를 함유하는 벡터 또는 글루타민 합성효소 유전자를 함유하는 플라스미드(Lonza)에서, 앰버 코돈을 함유하는, 원하는 항원에 대한 IgG와 같은 표적 유전자로 형질 감염시킬 것이다. 높은 수준의 절단형 단백질을 발현하는 세포들을, 높이 발현하는 세포를 선택하기 위한 적절한 선택, 각각 메토트렉세이트 또는 메티오닌 설폭시민 하에서 성장시킨다. 제한 세포 희석을 이용하여 클론을 분리하고, 효율적인 앰버 억제를 할 수 있고 높은 발현 수율을 나타낼 수 있는 세포들을 ELISA 분석법을 이용하여 확인한다.
실시예 4: nnAA 편입을 가능하도록 하는 표적 단백질의 변경
GFPY40 리포터 구성체를 생성하기 위한 벡터 pTracer His EF/HISA(라이프 테크놀로지스)의 녹색 형광 단백질-블라스티시딘 융합의 ORF로 앰버 코돈을 도입하였다. 간략하게 말하자면, 부위 특이적인 돌연변이 유도를 이용하여 GFP ORF의 +120번(여기서, +1은 개시코돈의 A이다) 위치의 단일 뉴클레오티드를 시토신에서 구아닌으로 변경하여, 프레임 내 앰버 종결 코돈을 생성하였다.
(dykdhdgdykdhdidykddddks를 암호화하는) 추가적인 아미노 말단 3x Flag 태그를 함유하는, SEQ ID61 뉴클레오티드 서열; SEQ ID62 아미노산 서열에 나타낸 바와 같은, 인간 FGF21에 대한 서열(3xFLAG-FGF21, SEQ ID 80)을 재생성하기 위하여 오버래핑 올리고머와 PCR을 이용하는 유전자 합성에 의해 FGF21 ORF를 생성하였다. 이러한 구성체를 pJ201 셔틀 벡터로 클로닝하고, HinDIII 및 XhoI을 이용한 제한 효소 절단 및 pCEP4(라이프 테크놀로지스)로의 라이게이션에 의해 전달하였다. 얻어진 구성체를 FGF21의 ORF의 하류에 위치시키고, 포유류 세포에서의 발현을 위해 CMV 프로모터의 제어 하에 두었다. FGF21 ORF의 F12(SEQ ID 66), L66(SEQ ID68), P90(SEQ ID70), R131(SEQ ID64), 및 P140(SEQ ID71) 위치에 부위 특이적인 돌연변이 유도에 의해 앰버 코돈을 도입하였다. 오버래핑 올리고머를 이용하여 3xFLAG 태그를 6xHis 태그로 교체하는 데에 2단계의 PCR 증폭 계획을 이용하였다. 간략하게는, 두 번의 PCR 반응을 설정하는데, 하나는 CMV 프로모터를 증폭시키기 위한 것, 두 번째는 FGF21 ORF를 5' 6xHis 태그와 프레임 내로 증폭시키기 위한 것이다. 그런 다음, CMV 프로모터를 6xHis-FGF21 구성체에 연결시키기 위하여 플랭킹 올리고머를 제3의 PCR 반응에 이용하였다. 6xHIS-FGF21 wt 및 6xHIS-FGF21 R131 둘 다를 생성하기 위한 pDONR 221 P4r-P3r 벡터에 이러한 생성물을 게이트웨이에 의해 클로닝하였다.
IL-6에 대한 항체를 변형시켜 nnAA의 통합 및 후속적인 접합을 가능하게 하였다. 이러한 분자를 생성하기 위하여, 인간 사이토카인 IL-6에 대한 토끼 항체의 가변 영역을 PCR 증폭에 의해 인간 프레임워크 상으로 접합시키고(WO12032181 참조), pFUSE-CHIg-hG1(중쇄) 및 pFUSE-CHLIg-hK(경쇄)(인비보젠) 벡터에 클로닝하여 토끼-인간 하이브리드를 생성하였다. 항체를 인간화하기 위하여 IL-6 CDR에 인접하여 추가적인 돌연변이도 편입시켰다. 얻어진 벡터 쌍인 pFuse-28D2감마 및 pFUSE-28D2카파는 공동 형질 감염 및 일시적인 형질 감염에 의한 항-IL-6 IgG의 발현에 이용된다. nnAA 편입을 위한 부위를, 부위 특이적인 돌연변이 유도에 의해 원하는 부위에 앰버 코돈을 도입함으로써 생성하였고, 돌연변이체를 시퀀싱에 의해 스크리닝했다. 이는 274번 부위에 앰버 코돈을 함유하는 중쇄 클론을 가져왔다(pFuse-28D2감마_K274am)(SEQ ID 41). 중쇄 구성체 및 경쇄 구성체의 공동 형질 감염은 항-IL-6 항체의 발현을 가능하게 한다. (K274 위치에 앰버를 함유하는) 항-IL-6 IgG 중쇄를 함유하는 통합 구성체를 TOPO 클로닝에 의해 pOptivec으로 클로닝하였다. 프로모터 및 폴리 A 서열을 포함하는, 경쇄 발현 구성체를 PCR로 증폭시키고, tRNA의 단일 카피를 오버래핑 올리고머를 이용한 2단계 PCR 방법에 의해 연결시키고, 중쇄를 함유하는 pOptivec 플라스미드(pOtivec-28D2-GKt) 내의 이용 가능한 부위로 클로닝하였다. 이러한 항체들의 일시적인 발현 및 안정적인 발현을 수행하여 리신-아지드, ALOC, 프로파질-리신 및 리신-염화물 nnAA을 통합하였다.
발현 및 정제
모든 실험을 위해, 안정적인 세포주로부터 단백질을 분리하였다(실시예 1). 대안적으로, 일시적으로 형질감염된 세포주를 활용하였다. CHO 또는 HEK293 세포를 대략 90% 포화까지 플레이팅하고, 37C에서 성장시켰다. 다음날, 플레이팅된 세포들을 특정 제조업체의 설명서에 따라, 친유성 시약(리포펙타민 2000, 293 펙틴(인비트로젠(Invitrogen))으로 이전에 처리된 적절한 DNA와 함께 배양하였다. nnAA, ALOC, 리신-아지드, 프로파질 리신 또는 Lys-염화물의 존재 하에서 2~5일 성장시킨 후, 성장 배지를 수집하고, 직접적으로 이용하거나, 적절한 방법에 의해 발현된 단백질을 정제하였다. IgG의 발현을 위해, 세포들을 저 IgG 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 성장시켰다. 안정적으로 형질감염된 세포주를 플라스크에 부착시켜 90% 포화까지 성장시키고, 5~7일 동안 (ALOC(N-알릴옥시카르보닐-L-리신), 리신 아지드, 프로파질 리신, (2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산(화학식 VI.1)으로부터 선택된) nnAA에 노출시킨 다음, 성장 배지를 수집하여 직접적으로 이용하거나 발현된 단백질을 적절한 방법에 의해 정제하였다. IgG의 발현을 위해, 세포들을 저 IgG 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 성장시켰다.
진핵 세포의 안정적인 또는 일시적인 발현 후에 발현된 IgG, scFv, 또는 본 출원에 기술된 FGF21를 성장 배지로부터 정제하였다. 각각의 경우에, 0.1 부피의 10x PBS를 발현 상층액에 첨가하여 염 및 샘플의 pH를 평형화시켰다. 6xHis 태그를 붙인 단백질의 정제를 위하여, 상층액을 4℃에서 16시간 동안 PBS로 투석시켰다. 단백질을 배치 결합 또는 중력 유동에 의해 니켈-NTA 비드에 결합시키고, 세척 완충액으로 집중적으로 세척하였다(레시피). 결합된 물질을 (50 mM 인산 나트륨 pH 7.4, 300 mM NaCl, 250~500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 확인하였다. 피크 분획을 모으고, 추가로 이용하기 전에 PBS에 대해 투석시켰다.
IgG를 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 간략하게 말하자면, 발현 상층액을 0.1 부피의 10xPBS로 보충하고, 1 mL 또는 5 mL 단백질 A 세파로오스 고속 유량 컬럼(GE)을 통과시켰다. 결합된 물질을 5~10 컬럼 부피의 PBS로 세척하고, 3~5 부피의 0.1 M 글리신 pH3.0으로 용리하였다. 이어서 분획들을 0.05 부피의 20xPBS를 첨가하여 중화시켜, 중성 pH에 이르게 하였다. 용리 분획들을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석하고, 피크 단백질 분획을 수집하고, 4℃에서 16시간 동안 PBS로 투석시켰다.
이 방법을 이용하여 항-IL-6-리신아지드274h, 131번 위치에서 NNAA (S)-2-아미노-6((프로프-2-이닐옥시)카르보닐아미노)헥산산(Lys-알킨)을 포함하도록 변형된 FGF21을 제조하였다.
실시예 5: nnAA를 함유하는 단백질의 접합
Figure pct00042
NNAA 리신-아지드가 중쇄의 274번 위치에 편입된 항-IL-6 항체의 20KPEG 말단 알킨을 이용한 페길화 (항-IL-6- 리신아지드274h )
작은 마그네틱 교반기가 있는 8x30 mm 유리 바이알에 TBTA의 디클로로메탄 용액(80 mM, 3.75 mL)을 넣고, 튜브에 조심스럽게 질소를 날려 용매를 증발시켰다. 여기에 인산 완충액(125 mM, pH=7.4, 53 uL) 및 20KPEG 알킨 수용액(3 mM, 33 uL)을 첨가하였다. 항-IL-6-리신아지드274h 용액(0.4 mg/mL, 6.26 uL)을 첨가한 후 시스테인(100 mM, 2 uL) 및 황산 구리(80 mM, 1.9 uL) 용액을 첨가하였다. 바이알을 아르곤으로 덮고, 뚜껑을 덮어, 4시간 동안 조심스럽게 혼합하였다.
반응 혼합물의 일부분을 덜어내고(15 uL) 비환원 겔 로딩 완충액(4X, 뉴페이지(NuPage), 인비트로젠, 7.5 uL)과 혼합하였다. 분석을 위해 전체 부피를 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다(도 5의 A). SDS-PAGE는 이러한 구리 조건이 모노페길화 및 비스페길화 항체종들의 혼합물을 제공하였음을 나타냈다. PDSi 밀도측정법은 모노페길화 종이 대략 1:1 비율임을 나타내었다(모노=47%, 비스=53%). 아지드가 없는 항체는 비슷한 조건 하에서 반응하는 데 실패하여, 아지드에 대한 특이성의 증거를 보여주었다.
Figure pct00043
NNAA 리신-아지드가 중쇄의 274번 위치에 편입된 항-IL-6 항체(항-IL-6- 리신아지드274h )의 20KPEG 시클로옥틴(비시클로[6.1.0] 논-4-인-연결 PEG)을 이용한 페길화
작은 마그네틱 교반기가 있는 8x30 mm 유리 바이알에 인산 완충액(125 mM, pH=7.4, 60 uL) 및 20KPEG 시클로옥틴(비사이클릭노닌) 수용액(3 mM, 33 uL)을 넣었다. 항-IL-6-리신아지드274h 용액(0.4 mg/mL, 6.26 uL)을 첨가하고, 바이알의 뚜껑을 덮어, 4시간 동안 조심스럽게 혼합하였다.
반응 혼합물의 일부분을 덜어내고(15 uL) 비환원 겔 로딩 완충액(4X, 뉴페이지, 인비트로젠, 7.5 uL)과 혼합하였다. 분석을 위해 전체 부피를 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다.
SDS-PAGE 겔 분석(도 5의 B: 1번 레인: 20KPEG 시클로옥틴으로 처리한 (항-IL-6-리신아지드274h), 2번 레인: 20K PEG 시클로옥틴으로 처리된, 아지드가 없는 항체, 3번 레인: 비처리 항체)은 모노페길화 및 비스페길화 항체종들의 혼합물을 나타냈다. 얻어진 겔의 밀도측정법은 모노페길화(10%) 및 비스페길화 항체(76%)의 혼합물을 나타냈고, 출발물질은 소비되었다. 아지드를 함유하는 항체가 반응하는 유일한 종이었다.
IL-6에 대한 항체의 활성을 시험하고, 이러한 항체의 변경이 이 항체의 결합 성질을 바꾸는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 시험관 내 IL-6 중화 분석법을 확립하였다. 이를 위하여, IL-6 의존성 쥐의 B 세포 하이브리도마 세포(B9)를 50 pg/mL의 IL-6를 함유하는 배지의 96웰 플레이트에 시딩하였다. 상이한 농도의 항-IL-6 항체 및 대조군을 일련의 웰에 첨가하고, 3일 동안 37℃에서 성장시켰다. 그런 다음, 세포의 건강을 정량적으로 측정할 수 있게 하는 알라마 블루 비색 분석을 이용하여 세포의 생존능을 결정하였다. 간략하게는, 25 uL의 시약을 각 웰에 첨가하고, 세포들을 8~16시간 동안 계속하여 성장하게 하였다. 배양 후, 570 nm 및 600 nm 파장에서 패널들을 분광 분석으로 판독한다. 측정 흡광도를 상응하는 항체 농도에 대해 그래프로 그린다. 이러한 데이터는 원래의 비변형 항체와 비교할 때 항-IL-6 항체의 부위 특이적인 페길화는 항체의 기능적 특성을 감소시키지 않음을 나타낸다.
IL-6 저해 분석법(도 8의 C). IL-6에 대한 항체의 활성을 시험하기 위하여, IL-6 중화 분석법을 이용하였다. IL-6 의존성 B9 세포를 50 pg/mL의 IL-6를 함유하는 배지의 96웰 플레이트에 시딩하였다. 상이한 농도의 항-IL-6 항체 및 대조군을 일련의 웰에 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 성장시켰다. 세포의 생존능을 알라마 블루를 이용하여 결정하였다. 간략하게는, 25 uL의 시약을 각 웰에 첨가하고, 세포들을 8~16시간 동안 계속하여 성장하게 하였다. 배양 후, 570 nm 및 600 nm 파장에서 패널들을 분광 분석으로 판독한다. 측정 흡광도를 상응하는 항체 농도에 대해 그래프로 그린다.
Figure pct00044
항-IL-6(항체)-항 IL-23( scFv -PEG) 이중특이체의 제조
원하는 부위에 아지도-호모알라닌의 부위 특이적인 편입을 가능하게 하는 E. 콜라이 발현 시스템을 이용하여 인간 사이토카인 IL23에 대한 scFv를 생성하였다. 간략하게는, scFv를 암호화하는 발현 플라스미드로 E. 콜라이의 메티오닌 영양요구성 균주(B834)를 hIL23으로 형질전환시켰다(본 출원에 참조로써 포함된 WO2012/032181). scFv 유전자는 오로지 두 개의 메티오닌, 번역 후에 절단되는 개시자 메티오닌과 분자의 c 말단에 있는 메티오닌을 암호화한다. 형질전환된 세포를 영양분이 있는 배지에서 발효시키고, 배양물을 성장 정체기에 이르도록 성장시켰다. 이 지점에서, 세포들을 IPTG로 유도하여 scFv의 발현을 활성화시키고, 배지에 AHA를 보충하였다. 그런 다음, 세포들을 추가적으로 네 시간 동안 성장하도록 하였고, 이러한 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. 발현된 scFv를 봉입체(inclusion body)로부터 정제하고 시험관 내에서 접히게 하였다. 발현된 scFv는 알킨을 함유하는 모이어티와 접합할 수 있게 하는 아지드를 함유하는 아미노산을 함유한다. 이중특이적인 항체 구성체를 생성하기 위하여, 항-IL-6-리신아지드274h를 비스-알킨 PEG 모이어티로 항-IL23 scFv에 라이게이션시켰다(본 출원에 참조로써 포함된 WO2012/032181). 이를 위하여, 작은 마그네틱 교반기가 있는 8x30 mm 유리 바이알에 인산 완충액(20 mM, pH=7.4, 80 uL)을 넣었다. 항-IL-6-리신아지드274h 용액(0.4 mg/mL, 6.3 uL)을 첨가한 다음, 이전에 -20KPEG 알킨에 접합시킨 항-IL23 scFv 용액(1 mg/mL, 2.1 uL)을 첨가하였다. 이러한 용액에 BME 용액(100 mM, 3 uL) 및 황산구리 용액(80 mM, 2.81 uL)을 첨가하였다. 이러한 혼합물을 4시간 동안 교반하도록 하였다.
반응 혼합물의 일부분을 덜어내고(15 uL) 비환원 겔 로딩 완충액(4X, 뉴페이지, 인비트로젠, 7.5 uL)과 혼합하였다. 분석을 위해 전체 부피를 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 항체 밴드 위의 새로운 더 높은 분자 밴드에 의해 증명되는 바와 같이 매우 소량의 이중특이체(bispecific)가 생산되었다(도 6의 A).
환원 겔의 경우, 반응 혼합물의 일부분을 덜어내고(15 uL) 환원 겔 로딩 완충액(4X, 뉴페이지, 인비트로젠, 30% BME, 7.5 uL)과 혼합하였다. 분석을 위해 전체 부피를 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 예상했던 MW 변화와 일치하는, 중쇄 밴드 위의 새로운 더 높은 분자 밴드에 의해 증명되는 바와 같이 매우 소량의 이중특이체가 생산되었다(도 6의 B).
( NNAA Lys - 알킨을 포함하도록 변형된) FGF -21의 20K 선형 PEG 비스 아지드를 이용한 페길화
모든 실험에 대해 표준적인 형질 감염 조건이 이용되었다. 간략히 말하자면, 이전에 안정적인 pylRS 발현에 대해 선택된 293 세포들의 클론을 대략 90% 포화까지 플레이팅하여, 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 다음날, 플레이팅된 세포들을 특정 제조업체의 설명서에 따라 사전에 친유성 시약(리포펙타민 2000, 293 펙틴(인비트로젠))과 조합한 6xHIS-FGF21 R131로 처리하였다. 그런 다음, 세포들을 2 mM 프로파질-리신 nnAA을 함유하는 DMEM 완전 배지(DMEM, 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산, 10% 송아지 태아혈청)에서 5~7일 동안 성장시켰다. 성장 배지를 수집하고, 5 mL 사전 충전된 니켈-NTA 컬럼(GE) 상에서 FGF21을 친화 크로마토그래피로 정제하였다.
발현된 6xHIS-FGF21를 성장 배지로부터 정제하였다. 여기서, 0.1 부피의 10x PBS를 발현 상층액에 첨가하여 염 및 샘플의 pH를 평형화시키고, 배지를 4℃에서 16시간 동안 PBS로 투석시켰다. 발현된 FGF21를 배치 결합 또는 중력 유동에 의해 니켈-NTA 비드(GE)에 결합시키고, 세척 완충액(50 mM 인산 나트륨 pH 7.4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)으로 집중적으로 세척하였다. 결합된 물질을 NiNTA 용리 완충액(50 mM 인산 나트륨 pH 7.4, 300 mM NaCl, 250~500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 확인하였다. 피크 분획을 모으고, 추가 이용하기 전에 PBS에 대해 투석시켰다.
마그네틱 교반기가 있는 20 mL 바이알에 131번 위치에 NNAA (S)-2-아미노-6((프로프-2-이닐옥시)카르보닐아미노)헥산산(Lys-알킨)을 함유하도록 변형된 FGF21(SEQ ID64) 용액(20 ug/mL, 0.001 mM, 5000 uL)을 넣었다. 여기에 20K 선형 PEG 비스-아지드 용액(60 mg/mL, 1.67 mL)을 첨가하였다. SDS 용액(20%, 250 uL) 및 DTT 용액(250 mM, 60 uL)을 첨가하였다. TBTA의 DMSO 용액(80 mM, 7.96 uL) 및 황산구리 수용액(80 mM, 94 uL). 바이알 뚜껑을 덮고, 반응액을 밤새 교반하도록 하였다. 혼합물을 원심분리(10000 g, 15분)하고, 상층액을 보존하였다. 반응 혼합물을 SDS-PAGE로 평가하였고, 폴리펩티드에 대한 20 kDa PEG의 접합과 일치하는 분명한 분자량 변화가 관찰되었다(도 7의 A).
페길화 FGF21 구성체의 효능을 평가하기 위하여, 비만인 db/db 마우스를 0.25 mg/Kg FGF21 또는 20K PEG-FGF21로 매일 처리하고, 소형 글루코오스 모니터를 이용하여 3회 처리 후 복용된 쥐에서 글루코오스 수준을 측정하였다(도 7의 B).
동형 접합성 db/db 마우스(B6.BKS(D)-Leprdb/j, 잭슨 랩)는 당뇨에 대해 특성화가 잘된 동물 모델로서, 3~4주령 후에 비만이 된다. 이 동물은 상승된 혈장 인슐린, 혈당 및 상처 치유 지연도 나타낸다. 본 연구에서, 7~8주령의 수컷 db/db 마우스에 Lab Diet 5053 Rodent Diet 20을 자유식으로 먹였다. 7일 동안 마우스를 적응시키고, 이후, 페길화 FGF21, 비변형 FGF21 및 용제(PBS)를 11일 동안 매일 피하 투여하였다.
각 마우스는 3일 동안 매일 0.25 mg/Kg의 PEG-FGF21 또는 비변형 FGF21를 투여 받았다. 3일차에 화합물을 투여하고 1시간 후에 꼬리 클립 채혈로 공급된 혈당 수준을 결정하고, 소형 글루코오스 측정기(베이어(Bayer))로 글루코오스 수준을 측정하였다. 이러한 데이터는 아미노산 잔기 131번에서의 FGF21의 페길화는 야생형 FGF21와 동일한 효능을 가지고 있으며, 위약 대조군과 비교할 때, 향상된 글루코오스 수준 유지를 나타냄을 보여주었다.
실시예 6: 아미노산 및 유인성 아미노산의 제조
2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}-6-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산(화학식 VIIA.4, BaChem), 2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-6-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산(화학식 VIIA.5, BaChem), 6-{[(tert-부톡시)카르보닐]아미노}헥산산(화학식 VIIB.4)을 상업적 제조업체로부터 구입하였다.
화학식 VIIA의 유인성 nnAA의 제조
Figure pct00045
출발 아미노산의 α-아미노기를 활성화된 친전자체로 아실화하여 화학식 VII 유사체를 용이하게 제조한다. 이는 출발물질을 산 염화물, 활성화된 에스테르, 무수물 또는 염화설포닐로 처리하여 이루어진다. 그런 다음, 이러한 생성물을 세포주 개발에 활용할 수 있다.
화학식 VIIB의 유인성 아미노산의 제조:
Figure pct00046
6- { [( 프로프 -2-엔-1- 일옥시 )카르보닐]아미노} 헥산산(화학식 VIIB.1)의 제조.
마그네틱 교반기가 있는 20 mL 바이알에 6-아미노카프로산(280 mg), 수산화나트륨(1 M, 5.3 mL) 및 디옥산(2 mL)을 넣었다. 알릴 클로로포르메이트(228 uL)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. pH가 산성이 될 때까지 혼합물을 1M 시트르산으로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고(x3) 유기층을 보유하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 215.1 (M+H)+, 발견값 216.1.
6- {[(2-클로로에톡시)카르보닐]아미노}헥산산(화학식 VIIB.3)의 제조.
마그네틱 교반기가 있는 20 mL 바이알에 6-아미노카프로산(1180 mg), 수산화나트륨(1M, 22.5 mL) 및 디옥산(23 mL)을 넣었다. 2-클로로에틸 클로로포르메이트(932 uL)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. pH가 산성이 될 때까지 혼합물을 과량의 1M 시트르산으로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고(x3) 유기층을 보유하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 237.1 (M+H)+, 발견값 238.1.
6- {[(2-아지도에톡시)카르보닐]아미노}헥산산(화학식 VIIB.6)의 제조 .
마그네틱 교반기가 있는 20 mL 바이알에 6-{[(2-클로로에톡시)카르보닐]아미노}헥산산(250 mg) 및 DMSO(5 mL)을 넣었다. 아지드 나트륨을 첨가하였다. 2-클로로에틸 클로로포르메이트(70 mg)를 60C까지 가열하고, 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물(5 mL)로 희석하고, 1M 시트르산(10 mL)에 따라 부었다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고(x3) 유기층을 보유하였다. 유기층을 합하고, 5% 염화리튬으로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 244.1 (M+H)+, 발견값 245.2.
6- { [( 프로프 -2-인-1- 일옥시 )카르보닐]아미노} 헥산산(화학식 VIIB.5)의 제조.
마그네틱 교반기가 있는 20 mL 바이알에 6-아미노카프로산(220 mg), 수산화나트륨(1M, 4.2 mL) 및 디옥산(2 mL)을 넣었다. 프로파질 클로로포르메이트(163 uL)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. pH가 산성이 될 때까지 혼합물을 과량의 1M 시트르산으로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고(x3) 유기층을 보유하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 213.1 (M+H)+, 발견값 214.1.
5- { [( 프로프 -2-엔-1- 일옥시 )카르보닐]아미노} 펜탄산(화학식 VIIB.2)의 제조.
마그네틱 교반기가 있는 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 5-아미노발레르산(15.0 g), 물(100 mL) 및 2N 탄산나트륨(40 mL)을 넣었다. 디옥산(100 mL) 내 알릴 클로로포르메이트(8.2 mL)를 점적 첨가하고, 최종 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 2N HCl(약 50 mL)로 산성화하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고(4 x 100 mL) 유기층을 보유하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 201.1 (M+H)+, 발견값 202.1.
실시예 7 . 화학식 V 및 VI 유사체의 제조
(S)-2-아미노-6( (2-옥소-2-페닐아세트아미드)헥산산 (화학식 V. 6)의 제조
Figure pct00047
마그네틱 교반기가 있는 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 디클로로메탄 및 DMF의 2:1 혼합물(20 mL) 내에 피루브산(3.5 g, 23.3 mmol)을 용해시켰다. 이러한 혼합물에 DCC(5.7 g, 27.6 mmol) 및 NHS(3.2 g, 27.6 mmol)를 첨가하였다. 이러한 혼합물을 30분 동안 교반하며 50C까지 가열하였다. 용액을 냉각시킨 다음, 필터를 통해 마그네틱 교반기가 있는 별도의 100 mL 둥근 바닥 플라스크 내의 DMF(20 mL) 중 N-Boc-리신(5.2 g, 21.2 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 활성화된 에스테르를 첨가한 후, 트리에틸아민(8.8 mL, 63.6 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 이러한 혼합물을 에틸 아세테이트와 시트르산 사이에 분할하였다. 층을 분리하고, 수층을 에틸 아세테이트로 4회 추출하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켰다. 얻어진 잔여물을 플래시 크로마토그래피로 더 정제하여 최종 N-Boc 리신 유도체를 오일로 수득하였다.
100 mL 둥근 바닥 플라스크에 아세토니트릴(50 mL) 중 케토-N-Boc 리신 유도체(4 g, 10.6 mmol)를 넣었다. 여기에 염산 용액(15 mL, 디옥산 중 4N)을 첨가하였다. 이러한 용액을 2시간 동안 교반하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피에 의한 최종 정제 결과 표적 아미노산을 얻었다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 278.1 (M+H)+, 발견값 279.1.
(2S)-2-아미노-6- (2-아지도아세트아미도)헥산산 (화학식 V. 8)의 제조
Figure pct00048
25 mL 둥근 바닥 플라스크에 디옥산(5 mL) 중에 현탁된 N-Boc-리신(500 mg, 2.0 mmol)을 넣었다. 포화 NaHCO3를 첨가하고(2 mL), 이 용액을 0℃까지 냉각시켰다. 디옥산(2 mL) 중 염화 브로모아세틸(169 uL, 2.0 mmol)을 서서히 첨가하였다. 이러한 용액을 0C에서 1시간 동안 교반하도록 한 다음, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 용액을 추출 깔때기로 옮겨, 물과 에테르 사이에서 분할시켰다. 유기층을 제거하고, 수층을 시트르산으로 산성(pH=2)이 되도록 하였다. 수층을 에틸 아세테이트(3x50 mL)로 추출하고, 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 얻어진 잔여물을 다음 단계로 전달하였다.
50 mL 둥근 바닥 플라스크에 디옥산(10 mL) 중 미정제 N-Boc--2-브로모아세틸-리신(740 mg, 2.0 mmol)을 넣었다. 여기에 아지드 나트륨 용액(10 mL, 1M)을 첨가하였다. 이러한 용액을 60℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물은 시트르산(1M, 50 mL)과 에틸 아세테이트(100 mL) 사이에 분할되었다. 유기층을 보유하고, 수층을 3회 추가하여 추출하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 오일이 될 때까지 농축시켰다.
미정제 N-Boc--2-아지도-아세틸-리신을 아세토니트릴(10 mL)에 용해시키고, TFA(2 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 용액을 톨루엔(10 mL)으로 처리하고, 농축시키고(2X), 아세토니트릴(10 mL)로 처리하고 농축시켰다(2X). 잔여물을 진공 하에서 밤새 건조시켰다. 잔여물을 MeOH 내로 취하고, 메틸-t-부틸 에테르로 침전시켰다. 원심분리에 의해 점성이 있는 오일을 분리하였고, 상층액을 처분하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 229.1 (M+H)+, 발견값 230.1.
(2S)-2-아미노-6- (펜트-4-엔아미도)헥산산(화학식 V.5)의 제조
Figure pct00049
25 mL 둥근 바닥 플라스크에 디옥산(10 mL)에 현탁시킨 N-Boc-리신(500 mg, 2.0 mmol)을 넣었다. 1M K2CO3을 첨가하고(5 mL) 이 용액을 0C까지 냉각시켰다. 디옥산(2 mL) 중 염화 4-펜테노일(224 uL, 2.0 mmol)을 서서히 첨가하였다. 이러한 용액을 0C에서 1시간 동안, 그 다음, 실온에서 4시간 동안 교반하도록 하였다. 용액을 추출 깔때기로 옮기고, 물과 에테르 사이에 분할시켰다. 유기층을 제거하고, 수층을 시트르산으로 산성(pH=2)이 되게 하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하고(3x50 mL), 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 얻어진 잔여물을 다음 단계로 전달하였다.
아세토니트릴(5 mL)과 TFA(2 mL)가 있는 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 미정제 N-Boc--N-4-펜테노일 아미드-리신을 넣고, 2시간 동안 마그네틱으로 교반하였다. 혼합물을 농축시켰다. 용액을 톨루엔(10 mL)으로 처리하고 농축시키고(2X), 아세토니트릴(10 mL)로 처리하고 농축시켰다(2X). 잔여물을 진공 하에서 밤새 건조시켰다. 잔여물을 MeOH 내로 취하고, 메틸-t-부틸 에테르로 침전시켰다. 원심분리에 의해 점성이 있는 오일을 분리하였고, 상층액을 처분하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 229.2 (M+H)+, 발견값 229.1.
하이드록시 - 노르류신 유도체(화학식 VI.1 및 화학식 VI.2)의 제조
Figure pct00050
마그네틱 교반기가 있는 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 N-Boc-하이드록실 노르류신(1 g, 4.1 mmol) 및 아세토니트릴(50 mL)을 넣었다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, p-니트로페닐클로로포르메이트(979 mg, 4.9 mmol) 및 피리딘(2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 플래시 크로마토그래피로 정제하였다(실리카, DCM/MeOH 구배).
Figure pct00051
마그네틱 교반기가 있는 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 25 mL의 디옥산 중 브롬화 2-N-Boc-에틸(1 g, 4.4 mmol)을 넣었다. 여기에 아지드 나트륨 용액(1M, 22.2 mmol)을 첨가하였다. 용액을 60℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물은 물과 에틸 아세테이트 사이에 분할되었다. 에틸 아세테이트 층을 보유하고, 수층을 에틸 아세테이트로 추가 3회 추출하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 오일이 될 때까지 농축시켰다.
오일을 아세토니트릴(35 mL)내에 취하고, 디옥산 중 HCl을 첨가하였다(4M, 10 mL). 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 진공 하에서 농축시켰다.
(2S)-2-아미노-6- {[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산(화학식 VI.1)의 제조
Figure pct00052
50 mL 둥근 바닥 플라스크에 디옥산(10 mL) 중 N-Boc-노르류신 p-니트로페닐 카보네이트(503 mg, 1.2 mmoL)를 넣었다. 여기에 디옥산(5 mL) 및 피리딘(1 mL) 중 아미노-아지드 용액(105 mg, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 용액을 밤새 교반하였다. 혼합물은 에틸 아세테이트와 500 mM 시트르산 사이에 분할되었다. 에틸 아세테이트 층을 보유하고, 수층을 에틸 아세테이트로 추가 3회 추출하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 오일이 될 때까지 농축시켰다. 오일을 플래시 크로마토그래피로 더 정제하였다.
분리된 Boc-보호된 아미노산을 아세토니트릴(15 mL) 내로 취하고, 디옥산 중 HCl(4M, 5 mL)로 처리하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 진공 하에서 농축시켰다.
(2S)-2-아미노-6- {[(프로프-2-인-1-일)카르바모일]옥시 } 헥산산(화학식 VI.2)의 제조
Figure pct00053
50 mL 둥근 바닥 플라스크에 디옥산(10 mL) 중 N-Boc-노르류신 p-니트로페닐 카보네이트(337 mg, 0.8 mmoL)를 넣었다. 여기에 디옥산(5 mL) 중 아미노-아지드 용액(135 mg, 2.4 mmol)을 첨가하였다. 용액을 밤새 교반하였다. 혼합물은 에틸 아세테이트와 500 mM 시트르산 사이에서 분할되었다. 에틸 아세테이트 층을 보유하고, 수층을 에틸 아세테이트로 추가 3회 추출하였다. 유기층을 합하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 오일이 될 때까지 농축시켰다. 오일을 플래시 크로마토그래피로 더 정제하였다.
분리된 Boc-보호된 아미노산을 아세토니트릴(15 mL) 내에 취하고, 디옥산 중 HCl(4M, 5 mL)로 처리하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 진공 하에서 농축시켰다.
실시예 8: 항-Her2-독소 접합
항-Her2 항체를 다음과 같이 획득하였다.
Her2의 세포외 도메인에 대한 마우스 항체 4D5의 가변 영역을 오버래핑 올리고머를 이용한 유전자 합성에 의해 생성하고, 셔틀 벡터로 클로닝하였다. 그런 다음, 가변 영역을 pFUSE-CHIg-hG1 및 pFUSE-CHLIg-hK(인비보젠)에 의해 암호화된 인간 프레임워크 상에 접합시켜, 마우스-인간 하이브리드를 생성하였다. 274번과 359번 위치의 중쇄(감마)(각각 SEQ ID 47 및 SEQ ID 49)와 70번과 81번 위치의 경쇄(카파)(각각 SEQ ID 53 및 SEQ ID 55)에 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 앰버 코돈을 도입하였다. 앰버 코돈을 함유하는 클론들을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. pOptivec에 IgG에 대한 통합 구성체를 생성하기 위하여, 프로모터와 중쇄에 대한 ORF를 PCR에 의해 증폭시키고, 제한효소 절단 및 pOptivec으로의 라이게이션에 의해 클로닝하였다. 경쇄 및 tRNA 단일 카피를 오버래핑 올리고머를 이용한 2단계 PCR 방법에 의해 연결하고, 중쇄를 포함하는 pOptivec 플라스미드 내의 이용 가능한 부위로 클로닝하였다.
발현 및 정제
허셉틴 CDR 및 하나 또는 두 개의 부위에 nnAA의 통합이 가능하도록 변형된 IgG1 프레임워크의 유전자 합성 및 이후 그것들의 접합에 의해 HER2에 대한 항체를 생성하였다. 허셉틴의 쥐 CDR을 pFUSE-CHIg-hG1(중쇄) 및 pFUSE-CHLIg-hK(경쇄)(인비보젠)로 클로닝하여 인간화 항체를 생성하였다. 얻어진 벡터 쌍 pFuse-4D5감마 및 pFUSE-4D5카파를 공동 형질 감염 및, 일시적인 형질 감염에 의한 야생형 항-Her2 IgG의 발현(SEQ ID 45, SEQ ID 46, 중쇄; SEQ ID 51, SEQ ID 52, 경쇄)에 이용하였다. 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 원하는 부위에 앰버 코돈을 도입하고, 돌연변이체를 시퀀싱으로 스크리닝함으로써, nnAA 편입 부위를 생성하였다. 이는 274번 위치에 앰버 코돈을 함유하는 중쇄 클론을 가져왔다(pFuse-4D5감마_K274am)(SEQ ID 47). 또한, pFUSE-4D5카파에도 앰버 부위를 구축했다. 우선 종결 코돈을 앰버 코돈으로부터 오커 종결 코돈으로 교체하여 벡터 pFUSE-4D5카파_TAA를 생성하였다. D70번 위치의 앰버 코돈을 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 도입하였다(SEQ ID 53). 이러한 상이한 벡터들을 짝지어, 단일 nnAA 또는 두 개의 nnAA를 함유하는 항체들을 생성할 수 있다.
nnAA를 함유하는 표적 항체들의 일시적인 발현을 pylRS를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 수행하였다. 이 세포주는 pCEP4(라이프 테크놀로지스)에 pylRS 유전자를 함유하는 벡터의 형질감염 및 하이그로마이신B를 함유하는 배지(DMEM(라이프 테크놀로지스), 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 송아지 태아 혈청, 및 0.2 mg/mL 하이그로마이신)에서의 성장에 의한 선택에 의해 생성하였다. 살아 있는 세포들을 제한 희석에 의해 클로닝하고, pylRS의 높은 기능적 활성을 나타내는 클론들을 팽창시켰다. 이는 ALOC nnAA의 존재 하에 tRNApyl을 암호화하는 벡터 및 Y40번 위치에 앰버 코돈을 함유하는 리포터 구성체 GFPY40로 상이한 클론들을 일시적으로 형질감염시켜 달성되었다. 이들 세포에서 Accuri 유세포 분석기를 이용하여 형광 수준을 정량하고, 고기능 클론들을 분리하였다. 항-Her2 항체의 발현을 표준적인 형질감염 조건을 이용하여 수행하였다. 세포들을 대략 90% 포화까지 플레이팅하고, 37℃에서 성장시켰다. 다음날, 플레이팅된 세포들을 특정 제조업체의 설명서에 따라, 친유성 시약(리포펙타민 2000, 293 펙틴(인비트로젠(Invitrogen))으로 이전에 처리된 적절한 DNA와 함께 배양하였다. 1~2 mM 리신-아지드의 존재 하에서 2~5일 성장시킨 후, 성장 배지를 수집하고, 직접적으로 이용하거나, 적절한 방법에 의해 발현된 단백질을 정제하였다. IgG의 발현을 위해, 세포들을 저 IgG 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 성장시켰다. 각각의 경우에, 0.1 부피의 10x PBS를 발현 상층액에 첨가하여 염 및 샘플의 pH를 평형화시키고, 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다. 간략히 말하자면, 발현 상층액을 1 mL 또는 5 mL 단백질 A 세파로오스 고속 유량 컬럼(GE)을 통과시켰다. 결합된 물질을 5~10 컬럼 부피의 PBS로 세척하고, 3~5 부피의 0.1 M 글리신 pH3.0으로 용리하였다. 이어서 분획들을 0.05 부피의 20xPBS를 첨가하여 중화시켜, 중성 pH에 이르게 하였다. 용리 분획들을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석하고, 피크 단백질 분획을 수집하고, 4℃에서 16시간 동안 PBS로 투석시켰다. nnAA으로 리신 아지드를 함유하는 IgG를 AzAb로 지칭한다.
세포 독소- 알킨 유도체의 제조
Figure pct00054
MMAF - 알킨 유도체의 제조
모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)(6 mg, 8.2 umol)을 작은 바이알에 넣고, DMSO(450 uL)를 첨가하였다. MMAF 용액에 DMSO 중 BCN 카보네이트 용액(82.6 ug/uL, 84 uL, 2.4 mg, 8.2 umol)을 첨가하였다. 트리에틸아민(2.5 uL, 18 umol)을 첨가하고, 바이알 뚜껑을 닫고, 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 907.1 (M+H)+, 발견값 908.6.
Figure pct00055
MMAF -발린-시트룰린-p-아미노- 벤조일 - 카보네이트 ( VCP )- 시클로옥틴 유도체의 제조.
마그네틱 교반기가 있는 4 mL 바이알에 MMAF(5 mg, 6.84 umol) 및 디펩티드 val-cit-PABC-Fmoc(5.24 mg, 6.84 umol)를 넣었다. 이 혼합물에 DMSO(350 uL)를 첨가하였다. 에틸(하이드록시이미노)시아노아세테이트의 DMSO 용액(40 mg/mL, 25 uL) 및 칼륨 tert-부톡사이드의 수용액(60 mg/mL, 25 uL)을 첨가하고, 바이알 뚜껑을 닫고, 밤새 교반하도록 하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1358 (M+H)+, 발견값 1359.8. 미정제 혼합물을 직접적으로 다음 단계에 이용하였다.
미정제 MMAF-VCP-Fmoc를 400 uL의 디클로로메탄내에 취하고, 400uL의 디이소프로필아민으로 처리하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 메탄올이 있는 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 농축시켰다. 이러한 물질을 헵탄(2 mL)으로 처리하고 농축시키고, 여분의 디이소프로필아민을 제거하기 위하여 이 순서를 이소프로판올로 반복하였다. 이러한 물질을 높은 진공 하에서 밤새 농축시키고 다음 단계로 전달하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1136.7 (M+H)+, 발견값 1137.6.
미정제 MMAF-VCP-NH2를 DMF(420 uL)내에 취하고, 알킨 카보네이트 용액(40 mg/mL, 50 uL) 및 트리에틸아민(2.8 uL)으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1312.8 (M+H)+, 발견값 1313.7.
Figure pct00056
파클리탁셀 - 시클로옥틴 유도체의 제조.
파클리탁셀(500 mg, 590 umol)과 무수 글루타르산을 마그네틱 교반기가 있는 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 피리딘(10 mL)을 첨가하였다. 이러한 용액을 밤새 교반하였다. 혼합물을 오일이 될 때까지 농축시키고, 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여(헥산/아세톤 용리) 원하는 생성물을 수득하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 968.0 (M+H)+, 발견값 969.1
DMF 중 탁솔-글루타르산 접합체 용액(15.6 ug/uL, 321 uL, 5 mg, 5.2 umol)을 마그네틱 교반 막대가 있는 작은 바이알에 넣었다. HATU 커플링제 용액(46.1 ug/uL, 50 uL, 2.3 mg, 6.2 umol), 시클로옥틴-아민 용액(34 ug/uL, 50 uL, 1.7 mg, 5.2 umol) 및 트리에틸아민(1.6 uL, 11.4 umol)을 연속하여 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 닫아 막고, 밤새 교반하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1273.6 (M+H)+, 발견값 1274.4
Figure pct00057

Figure pct00058
독소루비신 - 시클로옥틴 유도체의 제조
독소루비신 용액(12.5 ug/uL, 320 uL, 4 mg, 7.4 umol)을 작은 마그네틱 교반 막대가 있는 작은 바이알에 넣었다. DMSO 중 시클로옥틴 카보네이트 용액(28.5 ug/uL, 63 uL, 1.8 mg, 7.4 umol)을 바이알에 넣었다. 트리에틸아민(2.2 uL, 16 umol)을 첨가하고, 바이알 뚜껑을 닫고, 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 719.7 (M+H)+, 발견값 720.5.
Figure pct00059
중쇄의 274번 위치에 nnAA 리신-아지드가 편입된 항- Her2 항체(항- Her2 - LYys아지드274h )의 MMAF - 시클로옥틴 유도체를 이용한 접합
200 uL PCR 튜브에 인산 용액(50 mM, pH = 7.4, 3 uL)과 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h) 용액(11.43 uL, 2.1 mg/mL)을 넣었다. 여기에 MMAF-알킨 유도체의 DMSO 용액(1.1 uL, 14.5 mMol)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 닫고 볼텍싱하였다. 혼합물을 4시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 6.4uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 60분 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스(Pierce)) 미니 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액(0.21 mg/mL)을 얻었다.
세포 기반의 형광 분석법을, 4D5 IgG 및 접합된 4D5-MMAF이 결합하여 Her2 에피토프를 발현하는 세포 내로 내재화되었음을 보여주는 데 이용하였다. Her2의 발현을 위한 구성체로 안정적으로 형질감염된, 유방암 세포주 A345, 또는 SKBR3 및 EL4 및 EL4 세포들을 완전 RPMI-1640 또는 DMEM에서 성장시켰다. 세포들을 해리시키고, 계수하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 각 분석법을 위해, 대략 200,000~500,000개 세포들을 0.5% BSA를 함유하는 PBS와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포들을 0.1% 아지드 나트륨의 부재 또는 존재 하에서1 ug의 정제된 4D5 IgG 또는 4D5 IgG-MMAF 접합체로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 세포들을 세척하고, 항-인간 IgG-피코에리트린 접합체와 1시간 동안 37℃에서 배양하고, PBS로 세척하고, PBS 또는 50% 트립판 블루를 함유하는 PBS에 재현탁시키고, 유동 세포 분석법(Accuri)으로 분석하였다.
세포 생존능 및 세포 사멸 분석. 종양 세포 생존능에 미치는 항-Her2-MMAF 접합체의 영향을 MTS 분석법을 이용하여 평가하였다. 간략하게 말하자면, 세포들을 96웰 플레이트 내 페놀 레드가 결여되어 있고, 10% 우태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 1640 50 uL에 플레이팅하였다(웰당 5000개의 SKBR3, MDA-MD, 및 MCF7 세포). 상이한 농도의 항체 접합체 및 대조군을 FBS를 함유하는 RPMI1640 50 uL 내의 세포 5% CO2의 가습 환경에서 37℃에서 3일 동안 첨가하였다. 20 uL의 완전 MTS(피어스)를 첨가하여 세포 생존능을 분석하고, 37℃에서 1~3시간 동안 발색되도록 하였다. 490 nm에서 각 웰의 흡광도를 플레이트 판독기(몰레큘러 다이내믹스(Molecular Dynamics))를 이용하여 기록하였다(도 8의 B).
항- Her2 항체(항- Her2 - 리신아지드274h )의 MMAF -발린-시트룰린-p-아미노- 벤조일 -카보네이트-시클로옥틴 유도체와의 접합
200 uL PCR 튜브에 인산 용액(50 mM, pH = 7.4, 3uL)과 (중쇄의 274번 위치에 NNAA 리신-아지드가 편입된) 항-Her2 항체의 용액(11.43 uL, 2.1 mg/mL)을 넣었다. 여기에 MMAF-알킨 유도체의 DMSO 용액(1.23 uL, 13 mMol)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 닫고 볼텍싱하였다. 혼합물을 4시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 6.4 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 60분 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스(Pierce)) 미니 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액(0.21 mg/mL)을 얻었다.
항- Her2 항체(항- Her2 - 리신아지드274h )의 파클리탁셀 - 시클로옥틴 유도체와의 접합
200 uL PCR 튜브에 인산 용액(50 mM, pH = 7.4, 3 uL)과 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h) 용액(11.43 uL, 2.1 mg/mL)을 넣었다. 여기에 파클리탁셀-알킨 유도체의 DMSO 용액(1.24 uL, 12.9 mMol)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 닫고 볼텍싱하였다. 혼합물을 4시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 6.4 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 60분 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 미니 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다.
실시예 9: 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h)에 대한 페길화
Figure pct00060
항- Her2 항체(항- Her2 - 리신아지드274h )에 대한 20K 선형 PEG- 시클로옥틴을 이용한 페길화
200 uL PCR 튜브에 인산 완충액(50 mM, pH=7.4, 1 uL)을 넣었다. 아지드를 함유하는 항체의 용액(AzAb-2, 2.1 mg/mL, 1.07 uL)을 첨가하고, 20KPEG 시클로옥틴 용액(60 mg/mL, 1.0 uL)을 첨가하였다. 용액을 볼텍서(피셔(Fisher))로 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 몇 초 동안 두어, 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 이러한 혼합물을 4시간 동안 방치하였다.
용액을 물(7 uL)로 희석하여 최종 부피가 약 10 uL가 되게 하였다. 그런 다음, 용액을 5 uL로 분배시키고, 5 uL의 환원 또는 비환원 겔 로딩 완충액에 첨가하였다. 혼합물을 혼합하고, 95C까지 3분 동안 가열하였다. 그런 다음, 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다(4~20% 트리스-Gly, 인비트로젠). SDS-PAGE(환원 및 비환원)는 페길화가 높은 정도의 전환으로 일어나, 거의 모든 출발물질이 비스-페길화 종으로 전환됨을 보여주었다. 비환원 겔(도 9의 A) 2번 레인: 비처리된 항-Her2 항체(NNAA 리신-아지드가 중쇄의 274번 위치에 편입된 항체), 3번 레인: 20KPEG 선형 PEG 시클로옥틴으로 처리된 항-Her2 항체(NNAA 리신-아지드가 중쇄의 274번 위치에 편입된 항체). 우세한 단일 종에 대해 PEG 처리된 아지드-항체에서 분명한 분자 이동이 관찰되며, 이는 두 개의 PEG 사슬 포함 시의 분자량 이동으로 예상되는 것과 일치한다. PDSI는 높은 정도의 전환을 보여주었다(93% 비스 페길화, 6.9% 모노페길화, 출발물질 없음). 환원 겔(도 9의 B) 2번 레인: 비처리된 항-Her2 항체(NNAA 리신-아지드가 중쇄의 274번 위치에 편입된 항체), 3번 레인: 20KPEG 선형 PEG 알킨으로 처리된 항-Her2 항체(NNAA 리신-아지드가 중쇄의 274번 위치에 편입된 항체). PEG 처리된 항체에서 중쇄의 분명한 분자량 이동(3번 레인)이 관찰되어, 아지드를 함유하는 중쇄에 대한 특이성 및 PEG 접합에 의한 전환율을 말하였다(96.7%, 밀도측정법).
중쇄 274번 위치와 경쇄 70번 위치에 nnAA 리신-아지드가 편입된 항- Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h70l)에 대한 20KPEG시클로옥틴을 이용한 페길화
200 uL PCR 튜브에 항-Her2-리신아지드274h70l 항체 용액(0.5 mg/mL, 4.5 uL)을 넣었다. 20KPEG 시클로옥틴 용액(60 mg/mL, 1.0 uL)을 첨가하고, 용액을 볼텍서(피셔)로 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 몇 초 동안 두어, 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 이러한 혼합물을 18시간 동안 방치하였다.
용액을 물(4.5 uL)로 희석하여 최종 부피가 약 10 uL가 되게 하였다. 그런 다음, 용액을 5 uL로 분할하고, 5 uL의 환원 또는 비환원 겔 로딩 완충액에 첨가하였다. 겔 샘플들을 혼합하고, 95C까지 3분 동안 가열하였다. 그런 다음, 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다(4~20% 트리스-Gly, 인비트로젠). SDS-PAGE(비환원)는 페길화가 높은 정도의 전환으로 일어나, 거의 모든 출발물질이 테트라-페길화 종으로 전환됨을 보여주었다. 비환원 겔(도 10의 A) 2번 레인: 비처리된 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h70l), 3~5번 레인: 모두 20K 선형 PEG 시클로옥틴으로 처리됨. 3번 레인: 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h), 4번 레인: 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h), 5번 레인: 허셉틴(아지드 없음) 음성 대조군, 6번 레인: 비처리 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h) 및 7번 레인: 비처리 허셉틴. 비처리 4D5 AzAb-4의 단일 밴드로부터 우세한 테트라 페길화 종까지 분명한 분자량 이동이 관찰된다. 이러한 테트라-페길화 종은 비스-페길화 종보다 더 크다(4번 레인). 비환원 겔은 아지드를 함유하는 항체의 반응 특이성도 보여주는데, 아지드를 함유하지 않는 허셉틴은 반응성을 나타내지 않는다. PDSI는 높은 정도의 전환을 나타냈다(86% 비스 페길화, 14% 트리스-페길화, 출발물질 없음). 환원 겔(도 10의 B) 2번 레인: 비처리된 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h70l), 3~5번 레인: 모두 20K 선형 PEG 시클로옥틴으로 처리됨. 3번 레인: 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h70l), 4번 레인: 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h), 5번 레인: 허셉틴(아지드 없음) 음성 대조군, 6번 레인: 비처리 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h) 및 7번 레인: 비처리 허셉틴. 환원 겔은 중쇄 및 경쇄 모두(3번 레인) 분명한 분자 이동을 겪었음을 보여주며, 이는 항체의 각 서브유닛에 대한 단일 20KPEG 사슬의 첨가와 일치한다. 밴드들이 뚜렷하여, 반응이 아지드 부위에서만 일어났고, 추가적인 더 높은 MW 밴드의 부재로 나타난 바와 같이 추가적인 페길화는 일어나지 않았다. 중쇄의 동일 위치에서 아지드를 공유하는 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h)와 비교 결과, 양 밴드에 대해 동일한 분자량 이동 및 동일한 겔 전개 시간이 나타났다. 아지드를 함유하지 않은 허셉틴은 20KPEG 알킨으로 처리하였을 때 반응성을 나타내지 않았다. 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h70l)에 대한 접합 효율도 높았으며, 이러한 겔은 비변형 중쇄 또는 경쇄에 대한 증거가 거의 없거나 존재하지 않음을 보여준다.
실시예 10: 구리 촉매화 클릭을 통한 Her2 항체들의 페길화
Figure pct00061
항- Her2 항체(항- Her2 - 리신아지드274h )에 대한 20KPEG 알킨을 이용한 페길화
200 uL PCR 튜브에 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA, 10 mM, 1.5 uL)의 디클로로메탄 용액을 넣었다. 용매를 질소 스트림 하에서 증발시키고, 4D5 AzAb-2 용액(3.5 mg/mL, 2.14 uL)을 첨가하였다. 20KPEG 알킨 수용액을 첨가하고(60 mg/mL, 1.67 uL), 시스테인 수용액(20 mM, 0.5 uL)을 첨가하였다. 마지막으로, 황산구리 용액(10 mM, 0.75 uL)을 첨가하고, 혼합물을 조심스럽게 볼텍싱하여 성분들을 혼합하고, 4시간 동안 방치하도록 하였다.
용액을 나누어(2.5uL), 절반을 환원 겔 로딩 완충액 7.5uL에 첨가하고, 절반을 비환원 겔 로딩 완충액 7.5uL에 첨가하였다. 샘플들을 95C까지 3분 동안 가열한 다음, SDS-PAGE 겔(4~20% 트리스-Gly, 인비트로젠) 상에 로딩하고 전개하였다. 비환원 겔(도 11의 B) 2번 레인: 비처리 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h), 3번 레인: 20KPEG 선형 PEG 알킨으로 처리된 항-Her2 항체(항-Her2-리신아지드274h). 반응하지 않은 (중쇄의 274번 위치에 NNAA 리신-아지드가 편입된) 항-Her2 항체, 하나의 20KPEG 사슬의 포함으로 확인된 더 높은 분자량의 밴드와 비스-페길화 종으로 확인된 더 높은 분자량의 밴드의 혼합물이 비환원 겔(3번 레인)에서 관찰되었다. PDSI는 모노 페길화 종과 비스 페길화 종 사이에 중간 정도의 전환을 나타내었다(5.3% 비스 페길화, 37% 모노페길화, 58% 비변형 Ab). 환원 겔(도 11의 A) 2번 레인: 비처리 항체, 3번 레인: 20KPEG 선형 PEG 알킨으로 처리된 항체. PDSI에 의한 겔 분석은 중쇄 페길화의 중간 정도의 양(10%)을 나타내었다. 경쇄가 바뀌지 않은 것으로 보이므로, 이러한 반응은 중쇄에 대해 특이적이었다.
TBTA 조건을 활용하는 CuAAC 조건 하에서의 4D5-AzAb(HC274)의 20 kDa 페길화의 추가적인 예를 도 32에 나타내었다. 비처리 AzAb와 비교할 때, 이러한 밴드의 유의미한 분자량 이동에 의해 나타난 바와 같이, 아지드를 가지고 있는 중쇄에 대해 페길화가 부위 특이적인 방식으로 발생하였다.
NNAA가 117번 위치에 치환된 항- PSMA scFv(항-PSMAscFV-117)에 대한 20K 선형 PEG-시클로옥틴을 이용한 페길화
항체 J591(BANDER)의 CDR을 scFv 프레임워크 상에 접합시켜 PSMA에 대한 scFv를 생성하였다. 오버래핑 올리고머를 이용한 유전자 합성 및 PCR에 의해 PSMA에 대한 scFv를 생성하고, 생성물을 pJ201에 클로닝하여 pJ201-PSMA를 획득하였다. scFv의 ORF의 제한 효소 절단(XhoI 및 NotI)에 의해 발현 구성체 pCDNA3.1-PSMA를 생성하고, DNA 단편을 정제하였다. 플라스미드 pCDNA3.1을 동일한 효소로 절단하고, T4 DNA 리가아제를 이용하여 PSMA scFv 단편을 삽입하여 CMV 프로모터의 조절 하에서 PSMA에 대한 scFv를 함유하고 인프레임 3' 5xPro-6xHis 태그(PPPPPHHHHHH를 암호화, SEQ ID 81)를 함유하는 pCDNA3.1-J591scFv를 생산하였다. 이러한 scFv에 앰버 코돈을 편입시키기 위하여, 부위 특이적 돌연변이 유도를 이용하여 scFv의 마지막 3' 코돈 뒤에, 그러나 5xPro-6xHis 태그 전에 앰버 종결 코돈을 삽입하였다. 얻어진 구성체를 항-PSMAscFV-117이라 하였다. 앰버 코돈을 함유하는 클론들을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
nnAA를 함유하는 항-PSMAscFv-117의 일시적인 발현을, pylRS를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 수행하였다. 이러한 세포주는 pCEP4(라이프 테크놀로지스)에 pylRS 유전자를 함유하는 벡터의 형질감염 및 하이그로마이신 DMEM B를 함유하는 배지(DMEM(라이프 테크놀로지스), 2 mM 글루타맥스, 1 mM 피루브산 나트륨, 6 mM 글루타민, 1x 비 필수아미노산(Gibco CAT-11140-050), 10% 송아지 태아 혈청, 및 0.2 mg/mL 하이그로마이신)에서의 성장에 의한 선택에 의해 생성하였다. 살아 있는 세포들을 제한 희석에 의해 클로닝하고, pylRS의 높은 기능적 활성을 나타내는 클론들을 팽창시켰다. 이는 ALOC nnAA의 존재 하에 tRNApyl을 암호화하는 벡터 및 Y40번 위치에 앰버 코돈을 함유하는 리포터 구성체 GFPY40로 상이한 클론들을 일시적으로 형질감염시켜 달성되었다. 이들 세포에서 Accuri 유세포 분석기를 이용하여 형광 수준을 정량하고, 고기능 클론들을 분리하였다. 항- PSMAscFv117의 발현을 표준적인 형질감염 조건을 이용하여 수행하였다. 세포들을 대략 90% 포화까지 플레이팅하고, 37℃에서 성장시켰다. 다음날, 플레이팅된 세포들을 특정 제조업체의 설명서에 따라, 친유성 시약(리포펙타민 2000, 293 펙틴(인비트로젠(Invitrogen))으로 이전에 처리된 적절한 DNA와 함께 배양하였다. 1~2 mM 리신-아지드의 존재 하에서 2~5일 성장시킨 후, 성장 배지를 수집하고, 직접적으로 이용하거나, 발현된 단백질을 정제하였다. 간략히 말하자면, 본 출원에 기술된, 발현된 scFv들을 진핵 세포의 일시적인 발현 후에 성장 배지로부터 정제하였다. 각각의 경우에, 0.1 부피의 10x PBS를 발현 상층액에 첨가하여 염 및 샘플의 pH를 평형화시켰다. 발현 상층액을 4℃에서 16시간 동안 PBS로 투석시켰다. 단백질을 배치 결합 또는 중력 유동에 의해 니켈-NTA 비드(GE 헬스케어)에 결합시키고, 세척 완충액(50 mM 인산 나트륨 pH 7.4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)으로 집중적으로 세척하였다. 결합된 물질을 (50 mM 인산 나트륨 pH 7.4, 300 mM NaCl, 250~500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 확인하였다. 피크 분획을 모으고, 더 이용하기 전에 PBS에 대해 투석시켰다.
200 uL PCR 튜브에 NNAA가 117번 위치에서 치환된 항-PSMA scFv의 용액(0.3 mg/mL, 3.6 uL)을 넣고, 이어서 20KPEG 시클로옥틴 용액(60 mg/mL, 1.0 uL)을 첨가하였다. 용액을 볼텍서(피셔)로 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 몇 초 동안 두어, 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 이러한 혼합물을 4시간 동안 방치하도록 하였다.
용액을 환원 겔 완충액(6 uL)으로 희석하여 최종 부피가 약 10 uL가 되게 하였다. 그런 다음, 샘플들을 SDS-PAGE 겔(4~20% 트리스-Gly, 인비트로젠) 상에 로딩하였다. SDS-PAGE(환원)는 페길화가 성공적으로 대부분의 항-PSMA scFv 밴드를 소비하고 있음을 나타냈다. 환원 겔(도 12의 A) 2번 레인: 비처리된 항-PSMA scFv(NNAA 리신-아지드가 117번 위치에 편입됨). 3번 레인: 20KPEG 선형 PEG 시클로옥틴으로 처리한, 위치에 NNAA 리신-아지드가 편입된 항-PSMA scFv.
J591-scFv이 기능적인지 그리고 PSMA에 결합하였는지를 결정하기 위하여, 세포 기반의 형광 분석법을 이용하였다. 전립선암 PC3(PSMA 음성)와 LNCaP(PSMA 양성) 및 유방암 세포주 A345를 RPMI-1640에 성장시켰다. 세포들을 해리시키고, 계수하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 각 분석법을 위해, 500,000개 세포들을 0.5% BSA를 함유하는 PBS와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포들을 200 uL의 pCDNA3.1-J591 형질감염 상층액으로 처리하고, PBS로 세척하였다. 그런 다음, 세포들을 1 ug/mL의 마우스 항-6xHIS 항체(클론테크(Clontech))와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포들을 PBS로 세척하고, 피코에리트린이 접합된 항-마우스 항체(밀테니(Miltenyi))와 30분 동안 실온에서 배양하였다. 세포들을 PBS로 세척하고, 유동 세포 분석법(Accuri)으로 분석하였다. 내재화 분석은 다음과 같은 변형과 함께 위에서와 같이 수행하였다: 정제된 PSMA를 내재화 분석에 활용하였다. 항-PSMA scFv와의 배양 중에, 세포 코호트를 아지드 나트륨(0.1%)으로 4℃에서 1시간 동안 처리하여, 세포 표면 마커의 내재화를 억제하였다. 다른 배양들을 37℃에서 수행하였다. 또한, 마지막 세척 후에, 피코에리트린 신호를 ?칭하기 위하여 트립판 블루를 첨가하여 표면 염색을 억제하였다.
NNAA가 117번 위치에서 치환된 항 PSMA scFv(항-PSMAscFV-117)의 MMAF -발린-시트룰린-p-아미노-벤조일-카보네이트-시클로옥틴 유도체를 이용한 접합
Figure pct00062
200 uL PCR 튜브에 인산 용액(50 mM, pH = 7.4, 1 uL)과 항-PSMAscFV-117 용액(40.5 uL, 2.1 mg/mL)을 넣었다. 여기에 MMAF-발린-시트룰린-p-아미노-벤조일-카보네이트-시클로옥틴 유도체의 DMSO 용액(3.46 uL, 13 mMol)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 닫고 볼텍싱하였다. 혼합물을 4시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 20uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 60분 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 미니 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 scFv-약물 접합체 용액을 얻었다. SDS-PAGE(환원)에 의한 반응 혼합물의 조사 결과, 약물 모이어티의 단백질에 대한 접합과 일치하는, 주요 PSMA 밴드의 작은 분자량의 이동이 나타났다. PAGE 겔의 이러한 약간의 이동은 별도의 scFv 구성체, 28D2에서도 관찰된다(도 12).
실시예 11: 유인성 아미노산의 시험
시험관 내 분석법에서 pylRS에 대한 고친화도 기질(리신-아지드)과 경쟁하는 능력으로, 리포터 단백질로 관찰된 배경 앰버 억제 수준을 감소시키는 능력 및 높은 pylRS/tRNA 활성에 대해 이전에 선택된 세포들의 생존능 및 기능을 향상시키는 능력에 대해 효과적인 dnnAA을 확인하였다.
리신-아지드와의 pylRS 결합에 대해 효과적으로 경쟁할 수 있는 유사체들을 확인하기 위하여, WT PylRS 및 tRNAPyl을 발현하는 세포들의 리포터 단백질 GFPY40의 표적 부위에 nnAA를 도입하는 능력을 기초로 하여, 시험관 내 기능 분석법에서의 기능에 대해 dnnAA을 먼저 시험하였다. 이 리포터는 개방형 해독틀에 앰버 코돈을 함유하여, 앰버 억제 부재 시에 형광을 나타내지 않는 절단된 단백질을 생성한다. 앰버 억제 이벤트 시, 형광 검출법에 의해 검출될 수 있는 전체 길이의 GFP 단백질이 생성된다. 이러한 분석법에서, 안정적으로 pylRS를 발현하는 HEK293 세포를 tRNA 발현 구성체 및 GFPY40 리포터 카세트로 일시적으로 형질감염시켰다. 그런 다음, 세포들을 0.5 mM 내지 2 mM 범위의 상이한 농도의 dnnAA의 존재 또는 부재 하에 0.5 mM 리신 아지드와 배양하였다. 그런 다음, GFP 형광 수준을 유동 세포 분석법으로 정량하였다. 이러한 분석법에 대해, 각 조건에서의 형광 세포의 비율을 결정하고, 그래프로 나타내었다. dnnAA가 pylRS/tRNA 결합을 두고 nnAA(리신-아지드)와 경쟁할 것으로 예상되므로, 효과적인 dnnAA는 전체 길이의 GFP의 발현을 감소시키거나 방지할 것이다(위에 기술된 바와 같이, dnnAA는 tRNA에 의해 앰버 부위로 전달될 수 있지만, 단백질 합성을 전파할 수 없다). 화학식 VII의 몇몇 dnnAA를 시험하였다. 화학식 VIIB.4의 dnnAA의 경우(도 13), 증가하는 농도의 dnnAA는 부수되는 형광 세포의 수의 감소를 초래하여, 용량 관련된 효과를 시사하였다(도 13의 A 및 B). dnnAA가 앰버 코돈 번역초과를 가능하게 했는지를 확인하기 위하여, 형질감염된 세포들을 오로지 dnnAA와만 배양하고, GFP 발현을 유동 세포 분석법으로 모니터링하였는데, 화학식 VIIB.4의 dnnAA는 GFP 발현을 유도하지 않았다. dnnAA의 비특이적인 효과를 제어하기 위하여, 세포들을 앰버 코돈이 결여된 리포터 단백질로 형질감염시키자, 앰버 억제와는 무관한, 야생형 GFP(GFPwt)의 생성이 dnnAA의 존재 하에서도 모니터링되었다(도 13의 A). 식 VIIB.4의 dnnAA(도 13의 A)는 단백질 발현에 아무런 영향을 미치지 않음을 보여주었으며, 이러한 후자의 dnnAA에 의한 앰버 억제의 저해가 특이적임을 시사하였다.
표 1에 열거된 화학식 VIIB의 dnnAA의 효과를 측정하기 위하여 비슷한 시험관 내 분석법을 이용하였는데 이때, 표 1에는 시험했던 아미노산에 대한 설명과 그 결과를 요약한 것을 나타내었다. 이러한 분석을 위하여, 유동 세포 분석법에 의해 각 샘플의 기하학적 평균 형광 강도가 결정되었고, 그래프로 그려졌다. 시험했던 각 dnnAA에 대해, 야생형 GFP로 형질감염시킨 대조군 세포들을 양성 대조군으로 측정하였다. 또한, 리포터 GFPY40으로 형질감염시키고, 0.5mM 리신 아지드 또는 2 mM 리신 아지드에 노출시킨 세포들을 이용하여 억제자 부재 시의 최대 GFP 발현 수준을 결정하였다. 각 경우에 활발한 GFP 발현 수준이 관찰되었다. 임의의 dnnAA가 GFP 발현의 효능을 감소시킬 수 있을지 시험하기 위하여, 세포들을 0.5mM, 1mM 및 2mM 리신 아지드의 존재 하에 배양하였다. 증가된 dnnAA 농도와 동시적인 GFP 발현의 감소가 모든 경우에서 관찰되었다(도 14). 화학식 VIIB.1, 화학식 VIIB.3 및 화학식 VIIB.6의 dnnAA는 dnnAA가 결여된 샘플에 비해 GFP 발현의 최대 감소를 나타냈다(도 14의 A, E, I). 그것들의 GFP 발현 억제는 dnnAA의 증가하는 농도와 함께 증가되어, 이들이 pylRS에 대한 특이적인 고 친화도 기질임을 시사하였다. 화학식 VIIB.2 및 화학식 VIIB.5의 dnnAA 또한 dnnAA의 농도 증가에 따른 GFP 발현 감소를 나타냈다(도 14의 C, G). 그러나, GFP 발현의 상대적인 감소는 훨씬 낮아, 이들 아미노산 유사체들이 pylRS에 대해 낮은 친화도를 나타냄을 시사한다. 따라서, 본 발명의 dnnAA는 pylRS에 대한 결합을 두고 리신-아지드 nnAA와 경쟁할 수 있고, nnAA 도입의 생리적 기전을 방해할 수 있다. pylRS/tRNA 쌍과 GFPY40 리포터 구성체로 형질감염시켰으나, 리신-아지드 또는 dnnAA에 노출시키지 않은 세포들을 이용하여 배경 앰버 억제 수준을 결정하고, 음성 대조군으로 이용하였다. 각 경우에 낮은 GFP 발현 수준이 관찰되었다.
고친화도 기질의 존재 하에서 dnnAA 억제에 대한 경쟁적 분석법은 pylRS에 대한 결합을 위해 경쟁하여, pylRS/tRNA의 특이적인 억제자인 dnnAA를 확인시켜 주었다. 그러나 유인성 nnAA는 nnAA의 부재 하에 배경 앰버 억제의 수준을 감소시키고자 한 것이다. 배경 앰버 억제 수준이 감소될 수 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 dnnAA 중 하나를 함유하는 배지에 GFPY40 리포터 구성체와 pylRS/tRNApyl 쌍을 함유하는 세포들을 배양하였다. 이를 위해, 안정적으로 pylRS를 발현하는 HEK293 세포를 tRNA 발현 구성체 및 GFPY40 리포터 카세트로 일시적으로 형질감염시켰다. 3일의 배양 후, 세포들을 대상으로 유동 세포 분석법에 의해 GFP의 발현을 분석하고, 샘플의 기하학적 평균 형광 강도를 결정하였다. 본 발명자들은 이전에 pylRS/tRNA 앰버 억제 시스템의 전체 보체를 함유하는 세포들이 앰버 억제 시스템이 결여된 세포에서 관찰되는 것을 넘는 GFP 리포터 구성체의 검출 가능한 발현을 나타냄을 관찰하였다. 이러한 관찰은 pylRS/tRNA 쌍이 결여된 세포에서보다 더 높은 앰버 억제 수준을 초래하는, pylRS/tRNA 쌍으로부터 유래된 비직교성 활성이 있음을 시사한다. 배경 앰버 억제 수준을 감소시킬 수 있는 dnnAA를 확인하기 위하여, 형질감염된 세포들을 0.5 mM, 1 mM 및 2 mM의 dnnAA 각각과 배양하고, GFP 수준을 유동 세포 분석법에 의해 측정하였다. 화학식 VIIB.1, 화학식 VIIB.3, 화학식 VIIB.6, 화학식 VIIB.2, 및 화학식 VIIB.5의 dnnAA는 모두 대조군 샘플(dnnAA 미함유 세포 (도 14의 A ~ 도 14의 J; GFPY40+tRNA-nnAA))에 비해 배경 앰버 억제 수준의 감소를 나타냈다(도 14의 D, F, J, D).
배경 앰버 억제의 감소에 의존적인 GFP 발현은 용량 의존적이었으며, dnnAA 농도가 증가함에 따라 향상되었다. 흥미롭게도, dnnAA 중 하나인 화학식 VIIB.2의 dnnAA는 본 분석에서 매우 효율적인 배경 앰버 억제 저해를 나타내었고, 대조군 샘플에 비해 GFP 형광 수준을 57.7% 감소시켰으나, 리신-아지드의 강력한 경쟁자로 확인되지는 않았다. 이는 화학식 VIIB.2의 dnnAA가 pylRS에 대해 낮은 친화도를 나타낼 수 있어, 리신-아지드에 의해 용이하게 교체됨을 시사한다. 이러한 특질은 배경 앰버 억제의 억압을 가능하게 하므로 플랫폼 개발에 있어서 매력적인 특성이나, 이러한 시스템은 리신-아지드와 같은 강한 pylRS 기질의 첨가 시에 활성화될 수 있다. 이러한 데이터는 이러한 dnnAA가 pylRS-tRNA 쌍을 차지할 수 있으며, 천연 아미노산으로의 앰버 억제를 방지할 수 있음을 시사한다. 화학식 VIIB.1(62.5% 감소), 화학식 VIIB.3(49.7%), 화학식 VIIB.6(32%) 및 화학식 VIIB.5(35%) 및 화학식 VIIB.4(46.3%) 또한 이러한 분석법에서 배경 앰버 억제 수준을 감소시키는 데에 효과적이었다. 그것들의 효능을 대조군 샘플(dnnAA에 노출시키지 않음)에 대한 GFP 발현의 감소로 정량하였으며, 데이터를 표 1로 요약하였다.
Figure pct00063
실시예 12. 본 발명의 유인성 nnAA이 플랫폼 세포주 생존능에 미치는 영향
본 발명의 dnnAA가 pylRS 및 tRNApyl을 함유하는 세포들의 생존능을 향상시키는 기능을 할 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 안정적으로 pylRS 및 tRNApyl를 발현하는 세포주의 성장 및 생존능을 모니터링하였다. 이러한 분석을 위해, pylRS와 tRNApyl 및 중쇄에 앰버 코돈을 함유하는 her2/neu에 대한 IgG를 안정적으로 발현하고, 발현된 IgG로 효과적으로 nnAA를 편입시켜, nnAA를 함유하는 항체를 생산하는 것으로 나타난, CHO 세포들을 본 실험에 이용하였다. pylRS/tRNApyl 쌍의 높은 발현 수준에도 불구하고, 이 세포주는 nnAA가 결여된 배지에서 성장시켰을 때, 매우 왕성한 세포 성장 특징을 나타낸다. 앰버 코돈을 함유하는, 높게 발현된 표적의 존재는 세포들에 앰버 억제 활성을 흡수하는 높은 수준의 앰버 코돈을 공급함으로써 세포에 대해 보호 효과를 나타낼 가능성이 높고, 필수적인 유전자에서 배경 앰버 억제의 효과로부터 세포들을 보호한다. 그러나 성장 배지에 nnAA(리신-아지드)를 첨가하여 앰버 억제 기구를 활성화시켰을 때, 세포 성장 속도의 감소가 관찰된다. 즉, 배양물의 세포 농도는 안정적으로 유지되는 것으로 보여, 앰버 억제 기구의 활성화는 세포 증식 억제 효과를 초래함을 시사한다. dnnAA가 이러한 효과를 구제할 수 있는지를 결정하기 위하여, 무혈청 배지에서 배양된 세포들을 0.5 x 106개 세포/mL의 세포 밀도까지 성장시키고, 그 후, 0.5 mM 리신 아지드를 단독으로 또는 2 Mm dnnAA와 조합하여 처리하였다. 7일에 걸쳐 매일 세포 생존능 및 세포수를 모니터링하였다. 리신 아지드를 단독으로 처리한 세포들은 nnAA 첨가 후 3일차에 1x106개 세포/mL 미만의 세포 밀도에 도달해서, 분석(7일)의 나머지 기간 동안 이 밀도를 유지하였다(도 15의 A). 배양물은 실험 전반에 걸쳐 높은 생존능을 보유하였으므로(약 70% 생존 세포), 성장 부족은 생존능의 상실 때문일 가능성은 낮았다(도 15의 B). 0.5mM 리신-아지드와 조합하여, 2 mM 화학식 VIIB.4의 화합물 또는 2 mM 화학식 VIIB.1로 처리한 배양물은 1.5x106개 세포/mL 이상에 도달하였고, 90%의 세포 생존능을 보유한 배양물의 지속적인 성장을 지지하였다. 화학식 VIIB.2의 dnnAA로 처리된 세포들은 분석 기간 동안 3x106 이상의 세포 밀도 및 90%를 훨씬 넘는 생존능을 나타냈다. 대조적으로, 화학식 VIIB.3으로 처리된 세포들은 분석 과정에 걸쳐 세포 생존능의 감소(< 0.5x106개 세포/mL) 및 불량한 생존능(6일까지 30~40%)을 보였다. 이러한 데이터는 화학식 VIIB.2, 화학식 VIIB.4 및 화학식 VIIB.1의 dnnAA가 앰버 억제 시스템의 활성화에 의해 유도된 세포 증식 억제 효과를 방지함을 시사한다. 화학식 VIIB.2의 dnnAA의 존재 하에 성장시킨 세포들은 시간의 경과에 따라 선형 세포 성장을 나타냈고, 7일에 걸쳐 3x106의 세포 밀도에 도달했다. 이러한 데이터는 화학식 VIIB.2의 dnnAA를 pylRS/tRNA 기능에 대한 리신-아지드의 가장 효율적인 경쟁자로 가리킨다.
위의 데이터는 화학식 VIIB.2의 dnnAA가 pylRS/tRNA의 효율적인 저해자로서, 매우 활성이 높은 앰버 억제 기구를 함유하며 nnAA의 존재 하에서 표적 유전자를 발현하는 세포에서 앰버 억제 의존성 세포 증식 억제 효과를 감소시키는 것으로 나타났음을 보여주었다. 그러나 dnnAA의 의도된 용도는 그것들의 개발 및 분리 중에 매우 높은 활성의 앰버 억제 기구가 있는 세포들을 보호하는 데에 있다. 따라서 본 발명자들은 다음으로 dnnAA가 매우 활성이 높은 앰버 억제 기구에 대해 강화된 세포 풀(플랫폼 세포주)의 생존능 및 성능을 향상시킬 수 있는지를 물었다. 이를 위해, 앰버 억제 기구의 높은 활성에 대해 선택된 플랫폼 세포주를 여러 계대 동안 dnnAA의 존재 또는 부재 하에서 성장시키고, 이후에 웰당 10개의 세포로 96웰 플레이트에 시딩하고 dnnAA(화학식 VIIB.2)의 존재 또는 부재 하에서 성장시켰다. 각 플레이트를 수 일 동안 배양하고, 세포들을 수확하여 모으고 계수하였다. 흥미롭게도, 유인성 nnAA와 함께 배양했던 플레이트는 dnnAA의 부재 하에 성장시켰던 것들보다 더 높은 세포 수를 나타냈다(dnnAA 없을 때 1.66 x 106 및 1.5 x 106개 세포/mL, dnnAA에서 성장시킨 배양물로부터는 3.0 및 3.7 x 106개 세포/mL). 이러한 세포 수의 두 배 증가는 dnnAA의 보호 효과때문일 수 있다. 이러한 조건 하에서 성장시킨 세포들의 활성을 조사하기 위하여, 각 플레이트로부터 모은 0.5 x 106개 세포들을 6웰 플레이트에 시딩하고, dnnAA의 부재 하에 GFPY40 리포터 구성체로, 그리고 리신-아지드로 형질감염시켰다. 24시간 후, 각 샘플의 세포들의 형광 강도를 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 데이터를 단일 세포들을 포함하도록 게이팅하고 각 이벤트의 강도를 나타내도록 그래프화하였다(산점도, 도 16). GFP 강도 스펙트럼의 상위 10% 내에 해당하는 이벤트의 수를 각 샘플에 대해 결정하였다(표 2). dnnAA의 존재 하에 성장시킨 세포들은 확립된 게이트 내에 해당하는, 높은 수의 이벤트를 나타냈다(n= 139 유인물 없음 및 n=175 유인물(화학식 VIIB.2) 존재). 이는 더 높은 활성의 세포들이 유인성 nnAA를 함유하는 배지에서의 성장에 의해 보존됨을 시사한다. 추가적인 측정 기준을 활용하여 최고의 GFP 발현을 나타내는 상위 300개의 이벤트(상위 300)에 대한 기하학적 평균을 분리하여 세포들의 성능을 정량하였다. 이러한 측정 기준 하에서, dnnAA 배양된 세포들은 dnnAA 부재 하에서 성장시킨 세포들에 비해 성능 향상을 나타냈다(GM=954 유인물 없음; GM=1142 유인물(화학식 VIIB.2) 존재). 양 집단으로부터의 세포들을 야생형 GFP를 암호화하는 구성체로 형질감염시켰다. 이 집단에 대해 동일한 분석들을 수행하였다. 이러한 데이터를 표 2에 요약하였고, dnnAA(화학식 VIIB.2)를 함유하는 배지에서 성장시킨 세포들은 dnnAA의 부재 하에서 성장시킨 동일한 세포주에 비해 더 높은 수의 높은 형광을 나타내는 세포들과 더 높은 형광 수준을 나타냄을 보여주었다.
dnnAA(화학식 VIIB.2)은 플랫폼 세포 집단에서 앰버 억제 활성을 증가시킨다
샘플 상위 300 (GM) 상위 게이트에서 이벤트의 수
1 - 트레이서 343 25
6 - 트레이서 529 59
1 유인물 부존재 1024 153
3 유인물 부존재 885 125
5 유인물 1149 179
6 유인물 1135 171
dnnAA는 플랫폼 세포들의 생존능을 보존하는 것으로 보였지만, 더 높은 수준의 앰버 억제 기능성을 나타내는 세포들 또한 보존하였다. dnnAA가 매우 활성이 높은 앰버 억제 시스템을 함유하는 플랫폼 세포주의 세포 성장 특성에 미치는 영향을 더 평가하기 위하여, 본 발명자들은 동적 성장 분석을 수행하였다. 이를 위하여, 플랫폼 세포주를 위에 기술된 바와 같이 96웰 플레이트에서 dnnAA의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 각 플레이트로부터의 세포들을 모으고, 96웰 플레이트에 웰당 1000개의 세포들로 3회 반복하여 시딩하였으며, 세포를 4일 동안 배양하였다. 4일차에 알라마 블루 염료를 세포에 첨가하고, 생존능을 형광 방출로 분석하였다. 알라마 블루는 세포 생존능의 편리한 지표로서 작용한다. 생존 세포들은 알라마 블루를 대사하여 레소루핀(resorufin)을 생산하는데, 이는 고도의 형광성 염료이다. 형광 수준을 5, 6, 9, 및 11일차에 모니터링하고, 형광값을 그래프로 나타내었다(도 17). 유인물 존재 하에서의 성장 세포들은 dnnAA 부재 하에서 성장된 세포들과 비교할 때 향상된 세포 생존능을 보여주었다. 이것을 그래프로 나타낸 성장 속도 및 각 계산값에 대한 기울기에 대해 선을 맞추어 표시했다. 유인성 nnAA를 함유하는 배지에서 성장시킨 세포들(평균 기울기 = 1190)은 dnnAA의 부재 하에서 성장시킨 세포들(평균 기울기 = 669)보다 더 빠른 성장 속도를 보여주었다. 이들 데이터는 dnnAA의 이용이 앰버 억제의 만성적 효과로부터 세포들을 보호하고, 세포 생존능 및 배양물의 성장을 향상시킴을 보여준다. 종합하면, 이러한 데이터는 플랫폼 세포주 개발 및 높은 앰버 억제 활성을 나타내는 세포들의 보존에 필수적인 성분으로 dnnAA를 가리킨다.
실시예 13: nnAA로서 신규한 피롤리신 유사체의 GFP 분석법을 이용한 번역 시험
pylRS/tRNA 쌍 및 본 발명의 피롤리신 유사체(nnAA)의 양립가능성 및 표적 단백질로의 nnAA 통합의 효율을 평가하기 위하여 시험관 내 세포 기반 분석법을 개발하였다. 이를 위하여, pylRS를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포들(3H7)을 표준적인 형질감염 프로토콜을 이용하여 tRNApyl 및 (아미노산 잔기 번호 40(여기서 1은 개시자 메티오닌임)의 티로신 대신 앰버 코돈을 함유하는) GFPY40을 암호화하는 리포터 구성체의 발현을 위한 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 2~3일 동안 2 mM의 nnAA와 배양하였다. GFP 생산량을 현미경에서 육안으로 검토하여 정성적으로 분석하였다. Accuri 유세포 분석기를 이용하여 유동 세포 분석법으로 GFP 형광을 정량하고, 형광성 세포들의 기하학적 평균을 결정하였다.
이러한 세포 기반의 분석법을 상이한 nnAA가 pylRS에 대한 적절한 기질인지, 그리고 표적 단백질로의 번역을 허용하는지를 결정하는 데에 이용하였다. PylRS/tRNApyl 쌍을 발현하고, GFPY40 리포터 유전자를 암호화하는 벡터를 함유하는 세포들을 nnAA의 존재 하에 배양하였다. PylRS/tRNApyl 쌍이 용이하게 활용하는 nnAA는 nnAA의 GFP의 앰버 부위로의 번역을 뒷받침하고, 전체 길이의 GFP(형광 단백질)을 생산하는 유전자의 번역초과를 허용한다. 이러한 세포들의 형광 강도는 nnAA 편입의 효율에 따라 달라진다. 따라서, 잘 활용되지 않는 nnAA는 약한 형광성 또는 형광을 나타내지 않는 세포들을 생산한다. 현미경 관찰로 pylRS에 의해 이용 가능한 다수의 nnAA를 확인하였다(표 1, 양성 GFP). 나아가, 각 샘플에서의 상대적인 발현 수준을 pylRS가 효율적으로 활용한다고 알려져 있는 기질에 의해 생성된 것들과 비교하였다. 화학식 V.1(MFI = 931,289), 화학식 V.2(MFI=1,676,250) 및 화학식 V.3(MFI=2,250,000)(표 3 참조)은 기하학적 평균으로 높은 수준의 GFP 발현을 뒷받침하였다.
본 발명의 유사체 화학식 VI.1 및 VI.3은 본 발명자들에 의해 GFP 리포터 유전자에 편입되는 것으로 밝혀졌고, 사용된 실험 조건 하에서 녹색 세포를 제공하였다. 이 중에서도 화학식 VI.1의 유사체가 높은 수준의 GFP 발현을 뒷받침하였고(MFI 904206), 시험했던 실험 조건 하에서 pylRS/tRNA 쌍에 의해 효율적으로 활용되는 유사체를 대표한다(표 4 참조).
화학식 V 유사체의 GFP 결과
화학식 IUPAC 명칭 양성 GFP MFI
V.1 (2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에톡시)카르보닐]아미노}헥산산 네 931289
V.2 (2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-인-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산 네 1676250
V.3 (2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}헥산산 네 2250000
화학식 VI 유사체의 GFP 결과
화학식 IUPAC 명칭 양성 GFP 분석 MFI
VI.1 (2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산 네 904206
VI.3 (2S)-2-아미노-6-{[(프로프-2-엔-1-일)카르바모일]옥시}헥산산 네
항- Her2 항체의 구축 및 발현
(각 중쇄에 하나씩) 두 개의 비천연 아미노산을 함유하는 전체 길이의 항-Her2 항체(4D5-2AZ ab)를 포유류 세포에서 발현시켰다. 아지드 모이어티를 함유하는 nnAA를 선택된 부위에 편입시키고, 단백질 A 수지(GE 헬스케어) 또는 IgSelect(GE 헬스케어, 17096901)를 이용한 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 그런 다음, 정제된 물질을 농축시키고, 접합 반응을 일으켰다.
마우스 항체 4D5의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인간 IgG를 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터로 클로닝하여 Her2/neu의 세포외 도메인에 대한 항체를 생성하였다. 오버래핑 올리고머를 이용한 유전자 합성에 의해 4D5의 가변 영역을 생성하고, pFUSE-CHIg-hG1(IgG1 중쇄;감마) 및 pFUSE-CHLIg-hK(경쇄; 카파; 인비보젠)에 의해 암호화된 인간 IgG1 프레임워크로 클로닝하여 마우스-인간 하이브리드를 생성하였다. 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 K274번 위치에서 중쇄(감마)로 앰버 코돈을 도입하였다. 앰버 코돈을 함유하는 클론들을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 통합 구성체를 생성하기 위하여, 프로모터들과 중쇄에 대한 ORF를 PCR로 증폭시키고, 제한 효소 절단 및 pOptivec(라이프 테크놀로지스)에 라이게이션하여 클로닝하였다. 경쇄 및 tRNA의 단일 카피를 오버래핑 올리고머를 이용한 2단계의 PCR 방법으로 연결시키고, 중쇄를 함유하는 pOptivec 플라스미드 내의 이용 가능한 부위로 클로닝하였다. 그런 다음, 구성체를 pylRS/tRNA 쌍을 함유하는 CHO 세포주 안으로 형질감염시키고, 높은 IgG 발현을 나타내는, 안정적으로 형질감염된 세포주를 선택하였다. 이는 nnAA를 함유하는 mAb를 안정적으로 발현하는 세포주의 제2의 예를 나타내며, 이러한 과정이 mAb의 발현에 사용하기에 폭넓은 적용 가능성이 있음을 나타낸다. 이 세포주를 활용하여 위에 기술된 nnAA를 함유하는 IgG를 생성하였다. 세포들을 엑셀(Excel) DHFR 배지(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 1~2 x 106개 세포/mL의 밀도까지 성장시키고, nnAA를 최종 농도 1 mM까지 배양물에 첨가하였다. 세포들을 5일 동안 배양하고, 성장 배지로부터 IgG를 정제하였다. 상층액을 수확하여 원심분리시켜 현탁된 세포 및 기타 찌꺼기를 모았다. 그런 다음, 상층액을 0.22 um 필터로 여과하여 크로마토그래피 컬럼에 적용하기 전에 임의의 입자성 물질을 제거하였다. 여과된 상층액을 AKTA 크로마토그래피 시스템을 이용하여 1~5 mL/분 유속으로 1 mL~5 mL의 사전 충전된 HiTrap 단백질 A 세파로오스에 적용하였다. 결합된 물질과 수지를 PBS로 세척하여 느슨하게 결합된 단백질을 제거하고, 결합된 물질을 1 mL/분의 유속으로 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 용리시켰다. 표적 단백질을 함유하는 피크 분획을 0.1 분획 부피의 1M 트리스-HCl(pH8.0)로 중화시켰다. 모든 구성체를 PBS로 4℃에서 16시간 동안 투석시키고, 최종 인산 완충액으로 투석시켰다. 274번 위치에서 중쇄들 둘 다에 nnAA로서 화학식 VI.1이 편입된 항체를 "4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산"이라 칭했다.
4D5 - 2AzAb -HC274-(2S)-2-아미노-6-{[(2- 아지도에틸 ) 카르바모일 ] 옥시 } 헥산산의 페길화
200 uL PCR 튜브에 인산 완충액(5 uL, 500 mM, pH=7.4)을 넣었다. 4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산(화학식 VI.1)의 용액(10 uL, 0.55 mg/mL)을 첨가하고, 이어서 20KPEG 시클로옥틴 용액(3.3, 60 mg/mL)을 첨가하였다. 이러한 용액을 볼텍서로 격렬하게 혼합하였다. 혼합물을 밤새 방치하였다. 혼합물을 200 uL까지 희석하고, 단백질-A 마그네틱 비드에 적용시켰다. 혼합물을 볼텍싱하고, 회전시켜 비드를 90분 동안 혼합하였다. 비드를 고정시키고, 흘러내린 물질들은 처분하였다. 비드를 PBS로 세척한 다음(2X), 환원 겔 완충액에 현탁시켰다. 볼텍싱한 다음, 95C까지 3분 동안 가열하였다. 현탁액을 직접 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색은 중쇄의 선택적인 페길화를 나타냈다(도 18, 3번 레인).
SPAAC에 의한 4D5 - 2AzAb -HC274-(2S)-2-아미노-6-{[(2- 아지도에틸 ) 카르바모 일]옥시}헥산산의 플루오레세인 염료와의 접합
200 uL PCR 튜브에 인산 완충액(65 uL, 50 mM, pH=7.4)을 넣었다. 4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-아미노-6-{[(2-아지도에틸)카르바모일]옥시}헥산산 용액(30 uL, 0.55 mg/mL)을 첨가하고, 이어서 DMCO-Fluor 488 시클로옥틴 용액(5.4, DMSO 내 5 mM, 클릭 화학 도구)을 첨가하였다. 이러한 용액을 볼텍서로 격렬하게 혼합하였다. 혼합물을 24시간 동안 방치하였다. 혼합물을 HIC 크로마토그래피로 분석하여(Tosoh TSKgel 부틸 NPR, 인산 완충액에 대한 1M 황산나트륨 구배), 접합이 일어났음을 보여주었으며, DAR1 및 DAR 2 종의 혼합물이 얻어졌다(도 19).
실시예 14: 추가적인 nnAA 데이터
Figure pct00064
(2S)-2-아미노-6-[[(2- 아지도에틸 ) 카르바모일 ] 옥시 ] 헥산산 , 화학식 VI.1.의 대안적 제조
1단계 : 마그네틱 교반기가 있는 4 mL 바이알에 Boc-N-6-하이드록시노르류신(50 mg, 1 eq) 및 DMF(1 mL)을 넣었다. 여기에 2-클로로에틸 이소시아네이트 (17.3 mg, 1.0 eq) 및 피리딘 (32.3 uL, 2 eq)을 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 덮고, 5시간 동안 교반하였다. 용액을 추출 깔때기로 옮기고, 에틸 아세테이트 및 100 mM 시트르산으로 희석하였다. 혼합물을 진탕하고, 층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추가로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, 5% 염화 리튬으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 직접적으로 다음 단계로 전달하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 352.1 (M+H)+, 발견값 352.1.
2단계 : 마그네틱 교반기가 있는 4 mL 바이알에 위의 미정제 클로로 유도체와 DMSO(1 mL)를 넣었다. 아지드 나트륨(130 mg, 5 eq) 및 피리딘(32.3 uL, 2 eq)을 혼합물에 첨가하고, 바이알 뚜껑을 덮었다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 추출 깔때기로 옮기고 100 mM 시트르산 및 에틸 아세테이트로 희석하였다. 혼합물을 진탕하고, 층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추가로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, 5% 염화 리튬으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 다음 단계로 전달하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 359.2 (M+H)+, 발견값 360.2.
최종 단계 : 20 mL 바이알에 미정제 Boc 보호된 아미노산 및 아세토니트릴 (2 mL)을 넣었다. 여기에 디옥산 중 염산 용액(4N, 2.5 mL)을 첨가하였다. 용액을 2시간 동안 교반한 다음, 감압 하에서 농축시켰다. 혼합물을 반고체가 될 때까지 동결건조시키고, 번역 시험에 이용하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 259.1 (M+H)+, 발견값 260.2.
Figure pct00065
(2S)-2-아미노-6-{[( 프로프 -2-엔-1-일) 카르바모일 ]아미노} 헥산산 , 화학식 VI.3.의 제조
마그네틱 교반기가 있는 4 mL 바이알에 Boc-N-6-하이드록시노르류신(50 mg, 1 eq) 및 DMF(1.5 mL)를 넣었다. 여기에 알릴 이소시아네이트(18.0 uL, 1.0 eq) 및 피리딘(32.3 uL, 2 eq)을 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 덮고, 4시간 동안 교반하였다. 용액을 추출 깔때기로 옮기고 에틸 아세테이트 및 100 mM 시트르산으로 희석하였다. 혼합물을 진탕하고, 층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추가로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, 5% 염화 리튬으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 질량 분광분석법으로 확인하고, 다음 단계에 직접 전달하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 330.2 (M+H)+, 발견값 331.3.
20 mL 바이알에 아세토니트릴 중 미정제 하이드록실 류신-알릴 카바메이트 유도체(2 mL)를 넣었다. 여기에 디옥산 중 염산 용액(4 N, 2.5 mL)을 첨가하였다. 용액을 2시간 동안 교반한 다음, 감압 하에서 농축시켰다. 혼합물을 반고체가 될 때까지 동결건조시키고, 번역 시험에 이용하였다. 생성물을 질량 분광분석법으로 확인하였다. 추가적인 정제는 이온 교환 크로마토그래피로 할 수 있다(DOWEX-50). 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 230.1 (M+H)+, 발견값 231.2.
실시예 15: IgG 제1 안정적인 세포주
허셉틴을 발현하고, 274번 위치에 NNAA를 도입할 수 있는 세포주를 구축하였다. DG44 CHO 세포를 두 개의 벡터, pOptivec에 중쇄에 대한 발현 카세트를 함유하는 벡터와 허셉틴의 pcDNA3.1(하이그로(hygro)+)에 경쇄용 벡터로서 H274번 위치에 앰버 코돈을 함유하는 벡터로 형질감염시켰다. 세포를 하이그로마이신을 함유하는 배지에서 선택하고, 그 후, 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서 성장에 의해 발현에 대해 선택하였다. 절단형 IgG를 높이 발현하는 클론들을 클로닝으로 분리하였다. 최고의 발현 클론을 pylRS 및 U6-tRNApyl의 18개 카피를 암호화하는 벡터(pMOAV-2 puro)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 항생제 내성에 의해 선택하고, 가장 높은 앰버 억제 활성을 나타내는 세포들을 클론들을 nnAA(리신-아지드)에 노출시킨 후 전체 길이 IgG 발현을 정량하는 ELISA 분석법을 통해 확인하였다. 12 ug/mL의 nnAA를 함유하는 IgG의 안정적인 발현을 나타내는 클론을 분리하였다. 이러한 데이터는 pylRS/tRNA 쌍에 의해 nnAA 편입을 할 수 있는 mAb 발현 세포주의 구축의 제3 실시예를 설명한다. 또한, 이 접근법은 이전에 기능적 요소들의 도입 순서에서 활용했던 방법들과는 상이하다.
실시예 16: nnAA의 도입을 위한 IgG 위치 돌연변이
실시예 5, 항-IL6 항체와 항 Her2 항체에서 중쇄 274번 위치에서의 돌연변이 도입 및 변형된 항체들의 다양한 분자에 대한 성공적인 접합을 기술하였다.
여기서는 돌연변이의 cDNA로의 도입으로부터 ADC의 세포독성 데이터까지, 새로운 IgG 위치 돌연변이와 DAR2 및 DAR4 ADC의 생성을 기술한다.
중쇄의 H274 및 H359번 위치와 경쇄의 L70 및 L81번 위치에 각각 따로 놓인 앰버 종결 코돈으로 4D5 항 Her2 항체를 구축하였다. H274, H359 및 L81를 개별적인 돌연변이로서 발현시켰고, H274 또한 L70 또는 L81 중 어느 하나와 함께 HEK293 세포에서 이중 돌연변이로서 발현시켰다. 이들 4D5 돌연변이들을 PylRS를 안정적으로 발현하는 HEK 세포에서 Pyl-tRNA와 함께 공동 발현시켰다. 상층액을 단백질 A로 정제하고, mAb를 페길화하고, PAGE로 분석하였다(도 20). 이러한 데이터는 페길화가 각 위치에서 효율적으로 일어나며, 반응 혼합물에 존재하는 DAR4 종들에 의해 예시된 바와 같이 여러 위치에 대한 접합이 동시에 발생함을 나타낸다. 4D5-AzAb(HC274) 및 4D5-4AzAb(HC359)는 SDS-PAGE 겔에서 부위 특이적인 페길화의 결과로서 분명한 분자량 이동을 거친다. 마찬가지로, 4D5-AzAb (LC81) 또한 PAGE 겔에서 관찰 가능한 바와 같이 분자량의 비슷한 증가를 보여준다. 중쇄는 (잔류 PEG가 겔을 이동하면서 일그러뜨리긴 했으나) 본래 그대로 남아 있다. 네 개의 아지드를 함유하는 HC274 및 LC81 돌연변이(4D5-AzAb(HC274-LC81)) 또한 용이하게 페길화되었고, SDS-PAGE 겔에 의해 검출 가능하였다. 중쇄 및 경쇄는 두 개의 아지드를 함유하는 항체의 그것들과 유사하게 유의미한 분자 이동을 보여준다(도 20).
위치 돌연변이의 페길화
20K 선형 PEG- 시클로옥틴의 4D5 - AzAb(LC81)에 대한 페길화
200 uL PCR 튜브에 4D5-2AzAh(LC81) 용액(8 uL, 0.106 mg/mL)을 넣고, 이어서 20KPEG 시클로옥틴 용액(2.0 uL, 60 mg/mL)을 첨가하였다. 이러한 용액을 볼텍서로 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 몇 초 동안 두어, 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 이러한 혼합물을 24시간 동안 방치한 다음, SDS-PAGE로 분석하였다(도 20). 경쇄의 변형은 20 kDa MW PEG의 편입과 일치하는, 분명한 분자량 이동으로 분명히 나타났다(7번 레인).
20K 선형 PEG- 시클로옥틴의 4D5 - AzAb(HC359)에 대한 페길화
200 uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(HC359) 용액(8 uL, 0.145 mg/mL)을 넣고, 이어서 20KPEG 시클로옥틴 용액(2.0 uL, 60 mg/mL)을 첨가하였다. 이러한 용액을 볼텍서로 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 몇 초 동안 두어, 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 이러한 혼합물을 24시간 동안 방치한 다음, SDS-PAGE로 분석하였다(도 20). 아지드가 359번 위치에 있는, 아지드를 함유하는 항체들은 부위 특이적인 페길화의 결과로서, 중쇄에 특이적인, 분명한 분자량 이동을 보여주었다(5번 레인).
20KPEG시클로옥틴의 4D5 - AzAb(HC274 : LC70)에 대한 페길화
200 uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(HC274 : LC70)(2 uL, 0.47 mg/mL)의 용액을 넣었다. 20KPEG 시클로옥틴 용액(1.0 uL, 60 mg/mL)을 첨가하고, 이러한 용액을 볼텍서로 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 몇 초 동안 두어, 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 이러한 혼합물을 24시간 동안 방치한 다음, SDS-PAGE로 분석하였다(도 20). 중쇄 및 경쇄는 모두 접합에 의해 특이적으로 단일한 PEG 부착 부위를 갖게 된 결과로서, PAGE 겔에서 분명한 분자량 증가를 겪는다(6번 레인).
세포독성제의 위치 돌연변이에 대한 접합
4D5-AzAb(LC81)의 AF-시클로옥틴 유도체와의 접합. 200 uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(LC81) 용액(150 uL, 0.106 mg/mL) 및 AF-시클로옥틴의 DMSO 용액(20 uL, 0.5 mMol)을 넣고, 튜브의 뚜껑을 덮어 볼텍싱하고 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 20 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 두 개의 미니 ZEBA(피어스) 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다. 혼합물을 SDS-PAGE(도 22)와 HIC 크로마토그래피(도 21)로 분석하였다. 얻어진 접합체는 HIC 크로마토그램에서 단일 종으로 나타났고, 체류 시간으로 결정된 바와 같이 HC274 변이형보다 약간 더 소수성이었다. SDS-PAGE(비환원)은 약물과 접합한 결과로서 MW의 약간의 증가를 나타냈다(도 22).
4D5 - AzAb(HC359)의 AF - 시클로옥틴 유도체와의 접합
200 uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(HC359) 용액(150 uL, 0.145 mg/mL) 및 AF-시클로옥틴의 DMSO 용액(20 uL, 0.75 mMol)을 넣고, 튜브의 뚜껑을 덮어 볼텍싱하고 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 20 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 두 개의 미니 ZEBA(피어스) 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다. 혼합물을 HIC 크로마토그래피(도 21)로 분석하였다. 얻어진 접합체는 HIC 크로마토그램에서 단일 종으로 나타났고, 체류 시간으로 결정된 바와 같이 HC274 변이형보다 약간 더 소수성이었다. SDS-PAGE 또한 HC359 변이형에 대한 모항체보다 분자량이 더 높은 밴드의 형성을 나타냈다.
4D5 - AzAb(HC274 : LC81)의 AF - 시클로옥틴 유도체와의 접합
200 uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(HC274 : LC81) 용액(150 uL, 0.187 mg/mL) 및 AF-시클로옥틴의 DMSO 용액(20 uL, 1 mMol)을 넣고, 튜브의 뚜껑을 덮어 볼텍싱하고 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 20 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 두 개의 미니 ZEBA(피어스) 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다. 혼합물을 SDS-PAGE(도 22)와 HIC 크로마토그래피(도 21)로 분석하였다. 얻어진 접합체는 HIC 크로마토그램에서 우세하게 단일한 종으로 나타났고, DAR2 HC274보다 상당히 더 소수성이었다. 비환원 조건 하의 SDS-PAGE에서 분자량의 증가 또한 관찰되었다.
4D5 - AzAb(HC274 : LC70)의 AF - 시클로옥틴 유도체와의 접합
200 uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(HC274 : LC74) 용액(50 uL, 0.47 mg/mL) 및 AF-시클로옥틴의 DMSO 용액(5 uL, 3 mMol)을 넣고, 튜브의 뚜껑을 덮어 볼텍싱하고 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 20 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 두 개의 미니 ZEBA(피어스) 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다. 혼합물을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 22). 비환원 조건 하의 SDS-PAGE에서 분자량의 증가가 관찰되었다.
시험관 내 세포독성 활성
위에 기술된 바와 같이 형성된 ADC를 대상으로, 항 Her2 항체의 활성 및 ADC 세포주를 시험하기 위한 표준적인 표적 세포인 SKOV3과 HCC1954과 PC3 종양 세포주에서 세포독성 활성을 시험하였다. SKOV3와 HCC1954는 높은 수준의 Her2를 발현하는 데 반해, PC3는 낮은 수준으로 Her2를 발현한다. 세포독성 활성은 표 5에 기술된 바와 같이 시험관 내에서 종양 세포의 50%를 사멸시키는 ADC의 농도로서 계산되었다. 특히, 허셉틴 단독은 시험했던 세포주 중 어느 세포주에도 세포독성 효과를 나타내지 않는다.
시험관 내에서 종양 세포의 50%를 사멸시키는 약물의 농도를 나타내는 EC50(nM)을 나타냈다:
EC50 nM
PC3 HCC1954 SKOV3
HC-274 DNC 0.02123 0.1869
HC-274/LC-70 DNC 0.03059 0.1083
HC-274/LC-81 DNC 0.01493 0.05233
HC-359 1.327 0.02414 0.1604
LC-81 1.133 0.04365 0.201
AF 103.5 18.81 69.39
허셉틴 DNC 0 0
각 위치 돌연변이에 대해 도 23의 D, E, F에 나타낸 바와 같이, DAR2 ADC와 DAR4 ADC가 비교되었다. 각각의 Her2 양성 종양 세포주에서, DAR4 ADC는 DAR2보다 더 강해, DAR2 ADC보다 DAR4 ADC에 의한 더 많은 약물이 전달됨을 확인시켜 주었다.
도 23은 표 5의 EC50 값이 유래된 세포독성 분석법을 보여준다.
도 23의 A는 SKOV3 종양 세포주에서 4D5-AzAb(HC274)-AF 및 4D5-AzAb(HC359)-AF DAR2 ADC의 종양 세포독성 활성뿐만 아니라, 4D5-AzAb(HC274, LC-70)-AF DAR4 ADC의 종양 세포독성 활성을 보여준다. 이들 세포는 허셉틴 단독에 대해 저항성을 나타내지만, 다른 위치에서 접합된 독소가 있는 ADC에 의해 효과적으로 사멸된다. 명백하게, 이러한 ADC는, 수동확산과 비교할 때, 아마도, 모든 AF를 직접적으로 세포에 효율적으로 표적화함으로써 종양 세포를 살상하는데 필요한 AF의 농도를 현저하게 낮춘다.
도 23의 B는 HCC1954 세포에서 4D5-AzAb(HC274)-AF 및 4D5-AzAb(HC359)-AF DAR2 ADC의 종양 세포독성 활성뿐만 아니라, 4D5-AzAb(HC274, LC-70)-AF의 종양 세포독성 활성을 보여준다. SKOV3 세포와 유사하게, HCC1954 세포는 허셉틴에 저항성을 나타내지만, 다른 위치에서 접합된 독소가 있는 ADC에 의해 효과적으로 사멸된다.
도 23의 C는 매우 낮은 수준의 Her2를 발현하고, 표 5와 본 도면에서 보여지는 바와 같이, ADC에 의한 종양 사멸에 훨씬 더 저항적인, PC3 종양 세포주에서 4D5-AzAb(HC274)-AF 및 4D5-AzAb(HC359)-AF DAR2 ADC의 종양 세포독성 활성뿐만 아니라, 4D5-AzAb(HC274,LC-70)-AF DAR4 ADC의 종양 세포독성 활성을 보여준다.
도 23의 D는 Her2 과발현 종양 세포주인 HCC1954 세포에서의 4D5-AzAb(HC274)-AF 및 4D5-AzAb(LC-81)-AF DAR2 ADC의 종양 세포독성 활성뿐만 아니라, 4D5-AzAb(HC274,LC-81)-AF DAR4 ADC의 종양 세포독성 활성을 보여준다. 표 5와 본 도면에서 보여지는 바와 같이, DAR4 ADC는 DAR2 성분들보다 훨씬 더 강하다.
도 23의 E는 Her2 과발현 종양 세포주인 SKOV3 세포에서의 4D5-AzAb(HC274)-AF 및 4D5-AzAb(LC-81)-AF DAR2 ADC의 종양 세포독성 활성뿐만 아니라, 4D5-AzAb(HC274,LC-81)-AF 의 종양 세포독성 활성을 보여준다. 표 5와 본 도면에서 보여지는 바와 같이, DAR4 ADC는 DAR2 성분들보다 훨씬 더 강하다.
도 23의 F는 매우 낮은 Her2를 발현하는 종양 세포주인 PC3 세포에서의 4D5-AzAb(HC274)-AF 및 4D5-AzAb(LC-81)-AF DAR2 ADC의 종양 세포독성 활성뿐만 아니라, 4D5-AzAb(HC274, LC-81)-AF의 종양 세포독성 활성을 보여준다. 표 5와 본 도면에서 보여지는 바와 같이, 이러한 표적에 대한 이들 ADC의 활성은 매우 작거나 없다.
실시예 17: HC274번 위치에서 접합된 항체들의 약물동태학, 안정성 및 생체 내 항종양 활성
항- Her2 항체( 4D5 AzAb (HC274))의 DBCO - Fluor 488과의 접합
마그네틱 교반기를 갖춘 1000 uL HPLC 바이알에 인산 용액(511 uL, 50 mM, pH = 7.4)과 4D5-AzAb 용액(164 uL, 6.87 mg/mL)을 넣었다. 여기에 DBCO-Fluor 488의 DMSO 용액(75 uL, DMSO 중 10 mM)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 덮고, 24시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250mM, 50 uL)로 처리하고, 2시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 2 mL 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 항체-염료 접합체를 얻었다. 이러한 물질을 HIC 크로마토그래피 및 SDS-PAGE로 평가하였다. HIC 크로마토그래피는 항체당 2개의 염료 분자의 첨가와 일치하는, 단일한 주요 종의 형성을 나타냈다(도 24).
랫트에 4D5 AzAb(HC274)- DBCO-Fluor 488 또는 허셉틴을 1 mg/kg의 용량으로 정맥 내 주사하고, 11일 동안 항-IgG ELISA를 이용하여 두 분자들의 혈청 수준을 모니터링하였다.
도 25의 A에 나타낸 바와 같이, 불변 중쇄 위치 274번에서의 IgG의 변형은, 혈청 수준으로 측정한 바와 같이, 그리고 비변형 허셉틴과 비교하였을 때, 약물동태학적 프로파일에 영향을 미치지 않는다.
IgG에 대한 랫트 신생아의 Fc 수용체는 인간 FcRn과 동일한 잔기의 인간 IgG Fc 도메인을 인식한다. 본 발명의 ADC와 같은 변형된 인간 IgG는 랫트의 FcRn의 기능 덕분에 접합체와 FcRn의 상호 작용이 온전하게 남아 있는 한 연장된 기간 동안 생체 내에서 보유될 것이다. 이러한 데이터는 HC-274가 변형된 IgG가 랫트에서 긴 생체 내 반감기를 보유함을 보여주어, FcRn 상호 작용이 이러한 접합체에 의해 차단되지 않음을 나타낸다. 랫트 FcRn과 상호 작용하는 4D5 상의 동일한 잔기들도 인간 FcRn과의 상호 작용을 담당한다. 이러한 데이터는 HC-274에서의 접합체와 함께 ADC가 인간 FcRn과 상호 작용할 것이며, 따라서 인간에서 오랜 반감기를 보유하리라는 점을 보여준다.
도 25의 A에 나타난 PK 분석을 위해 수집된 동일한 혈청을 대상으로, 4D5 IgG에 대한 FITC 접합체의 존재에 대해, 항체가 플라스틱 ELISA 웰에 코팅된 Her2 세포외 도메인 단백질에 의해 포획되는 정량적 ELISA 분석법에 의해 시험하였다(도 25의 B). 배양 후, 웰을 세척하고, HRP에 접합된 항-FITC 항체와 배양한다. 배양 후, 웰을 세척하고, HRP 기질을 첨가한다. 이러한 ELISA는 ADC 상에 남아있는 FITC의 양을 측정하며, 도 25의 B에 나타낸 바와 같이, 모든 FITC가 온전한 상태의 ADC를 ng/ml로 보고한다. DAR2가 있는 혈청 내의 4D5 ADC는 비처리된 ADC와 동일한 수준이어서, FITC의 손실이 없음을 나타낸다. 이러한 데이터는 염료가 완전하게 보유되며, 11일의 연구 기간 동안 랫트의 생체 내애서 안정적임을 분명하게 나타낸다.
4D5 - AzAb(HC274)의 AF - 시클로알킨 유도체와의 접합.
마그네틱 교반기가 있는 1000 mL HPLC 튜브에 인산염 용액(24 uL, 50 mM, pH = 7.4)과 4D5-AzAb 용액(149 uL, 6.87 mg/mL)을 넣었다. 여기에 5의 DMSO 용액(27.2uL, 2 mMol)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하였다. 혼합물을 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250mM, 50 uL)로 처리하고, 볼텍싱하고, 60분 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 2 mL 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다. 이러한 혼합물을 HIC 크로마토그래피 및 SDS-PAGE로 평가하였다(도 26의 A 및 B). HIC 크로마토그래피는 항체당 첨가되는 2개의 아우리스타틴 분자와 일치하는 주요 종의 형성을 나타냈다. SDS-PAGE(환원)는 첨가되는 아우리스타틴 분자의 첨가와 일치하는, 중쇄에 대한 작은 분자량의 이동을 나타냈다.
시험관 내 활성
4D5-AzAb(HC274)-AF를 대상으로 Her2 양성 세포주에 대한 시험관 내 효능을 시험하였다. Her2를 과발현하는 세포주인 SKBR3 및 SKOV3을 매우 낮은 수준의 Her2를 발현하는 세포주인 PC3과 비교하였다. 4D5-AzAb(HC274)-AF는 아우리스타틴(AF) 단독과 비교하였다. ADC는 특이적으로 Her2를 과발현하는 SKBR3 및 SKOV3 세포를 사멸시켰지만, 매우 적은 Her2를 발현하는 PC3 세포는 사멸시키지 않았다. 3개의 표적 세포주에 대한 이 ADC의 효능을 표 6에 나타내었다. 이 값들은 도 27에 나타낸 세포독성 데이터에 대해 계산되었다. ADC가 SKOV3 및 SKBR3에 대해서는 피코몰의 효능을 나타내지만, PC3에 대해서는, 비록 그 세포주가 아우리스타틴 단독에 대해 꽤 민감하지만 불활성이다. 이는 높은 수준의 Her2를 발현하는 세포들에 대한 이러한 ADC의 특이성을 증명한다.
시험관 내에서 Her2 양성 종양 세포주에 대한 4D5 아우리스타틴 접합체의 효능
EC 50 nM
PC3 SKOV3 SKBR3
4D5-AF -- 0.019 0.0074
아우리스타틴 336 287 71
생체 내 항종양 활성
SKOV3 종양 세포주는 Her2를 과발현하지만, 허셉틴에는 저항성을 나타내는 인간 난소 암종으로부터 유래된다. SKOV3 세포로부터 유래된 종양은 스키드(scid) 마우스에서 확립되었다. 이 종양은 2주 이내에 대략 100 mm3에 이르렀으며, 그 때, 마우스를 무작위화하고, 마우스 절반(n=4/군)을 6 mg/kg의 4D5-2AzAb(HC274)-AF ADC의 단일 피하 주사로 처리하였다(도 28). 종양 크기를 캘리퍼로 측정하여 종양 진행을 추적하였다. 처리된 마우스 전부는 종양 수축의 짧은 기간 후에 종양 진행에서 매우 유의미한 지연을 보여주었다. 마우스 한 마리는 완전히 치유된 반면, 나머지 세 마리의 마우스는 결국 재발하였다(도 28의 B). 최대 80일까지 종양 진행을 모니터링하여 유일하게 치유된 마우스가 재발하지 않음을 확실히 하였다.
이 실시예는 4D5-AF ADC가 생체 내 순환계에서 보유되며, 대사 분해에 안정적이지만, 표적 종양 세포의 세포질에 특이적으로 강한 독성 활성을 전달하는 데 이용 가능함을 보여준다.
실시예 18: 이중특이적인 항체/항체 단편의 생성 및 특성 분석
4D5 AzAb-0.5KPEG 중간물질의 제조. 200 uL PCR 튜브에 인산 완충액 용액(34.3 uL, 50 mM, pH = 7.4)을 넣었다. 여기에 4D5 2-AzAb(HC274) 용액(23.61 uL, 13 mg/mL)과 비스-시클로옥틴 링커 용액(2.04 uL, 디옥산 중 20 mM, 500 kDa)을 첨가하였다. 이러한 혼합물을 24시간의 기간에 걸쳐 간헐적으로 볼텍싱하였다. 혼합물을 CHT 수지에 의해 정제하여 기능화된 중간물질을 얻었다.
28D2 scFv-AHA는 실시예 4의 항-IL6 항체로부터 유래된다. 전체 SEQ ID와 제조에 대한 상세한 설명은 WO12032181에서 찾아볼 수 있다. 간략히 말하자면, 항체 단편 28D2 scFv-AHA는 e. 콜라이에서 발현되며, nnAA 아지도호모알라닌이 이러한 서열의 C 말단에 편입된다. 이러한 단백질은 발효로부터 분리되며, 니켈 친화 크로마토그래피에 의해 정제된다.
이중특이적인 4D5 AzAb (HC274)- 28D2(scFv)의 제조
200 uL PCR 튜브에 4D5-0.5KPEG 접합체(37.5 uL, 2 mg/mL)와 28D2 scFv-AHA 용액(22 uL, 4.6 mg/mL)을 넣었다. 혼합물의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하고, 24시간 동안 방치하였다. 혼합물을 단백질 A 마그네틱 비드(GE)로 정제하고, SDS-PAGE로 분석하였다(도 29). SDS-PAGE는 아지드를 함유하는 출발 항체보다 분자량이 더 큰 두 개의 뚜렷한 밴드의 형성을 나타냈으며, 이는 하나 그리고 두 개의 scFv 분자의 첨가와 일치한다.
ELISA 분석법에서, 항 IgG 항체를 고체 표면에 부착시켰다. 이중특이적인 Her2-항-IL6은 이중특이체의 Fc 영역에 포획되었다. 그런 다음, IL-6의 첨가에 의해, 비오틴 표지로 검출되는, 이중특이체의 기능을 평가하였다.
제1 ELISA 분석에서, 이중특이체가 Her2 항원에 결합하는 능력을 조사하였다. 이중특이체는 대조군 4D5 AzAb(HC274) 항체와 비슷한 수준의 항원 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 30의 C).
제2 ELISA 분석에서, 이중특이체가 IL-6에 결합하는 능력을 조사하였다. 이 버전의 ELISA에서, 이중특이체는 항-IgG 상호 작용에 의해 ELISA 플레이트 상에 포획되었다. 그런 다음, IL-6 친화도를 조사하였다. 이중특이체는 IL-6에 대해 전체 길이의 항체 13A8과, 비슷한 수준의 친화도를 보유하는 것으로 밝혀졌다(도 30의 B).
마지막 ELISA 분석에서, 이중특이체가 동시에 양 말단에 작용하는 능력을 조사하였다. 이중특이체는 Her2 항원에 대한 항체 친화도에 의해 ELISA 플레이트에 포획되었다. 그런 다음, IL-6 활성을 조사하였다. 이중특이체는 동시에 Her2 항원과 IL-6에 대해 높은 친화도를 보유하는 것으로 밝혀졌다. 대조군 항체는 비슷한 이중기능성 활성을 보여줄 수 없었다(도 30의 A).
FGF21 폴리펩티드(FGF21-AHA(s86))를 e. 콜라이에서 발현시키고, SEQ ID 62의 86번 위치에서 변형시켜 세린을 대체하여 아지도호모알라닌을 편입시켰다. 변형된 단백질을 봉입체로서 분리하고, 니켈 친화 크로마토그래피로 정제하였다.
이중특이적인 4D5 AzAb - FGF21(사이토카인)의 제조
200 uL PCR 튜브에 항체-링커 중간물질 용액(3.0 uL, 2 mg/mL) 및 FGF21-AHA(S86) 용액(28.6 uL, 2.8 mg/mL)을 넣었다. 튜브의 뚜껑을 덮고, 37C에서 24시간 동안 배양하였다. 혼합물을 단백질 A 마그네틱 비드로 정제하고, SDS-PAGE로 분석하였다(도 31). 중간물질 링커에 의해 중쇄에 FGF21(S86) 분자를 첨가한 것과 일치하는, SDS-PAGE 겔에서 분자량 이동이 발견되었다.
실시예 19. 구리에 의해 촉진된 아지드 알킨 고리 첨가가 있는 4D5 Azab와 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(THPTA) 리간드의 페길화
THPTA와의 20 kDA 페길화. 200 uL PCR 튜브에 인산 완충액 용액(3 uL, 150 mM, pH=7.4)을 넣었다. 여기에 4D5 아지드를 함유하는 항체 용액(6.5 uL, 4.6 mg/mL)과 20 kDa PEG 알킨 용액(4 uL, 60 mg/mL)을 첨가하였다. 별도의 튜브에 황산구리 용액(2.0 uL, 10 mM)과 THPTA 용액(2.5 uL, 40 mM), 아미노 구아니딘 용액(1.0 uL, 100 mM) 및 아스코르브산 나트륨 용액(1.0 uL, 100 mM)을 넣었다. 튜브의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여, 10분 동안 방치하였다. 전체 구리 복합체를 AzAb-알킨 용액에 첨가하였다. 최종 혼합물의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여 37℃ 또는 50℃에서 2시간 동안 배양하였다. 반응물을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 33). SDS-PAGE는 20 kDa PEG의 첨가와 일치하는, 중쇄의 분자량 이동을 나타냈다.
THPTA와의 2 kDA 페길화. 200 uL PCR 튜브에 4D5 아지드를 함유하는 항체 용액(4.9 uL, 13 mg/mL)과 20 kDa PEG 알킨 용액(4.2 uL, 20 mM)을 넣었다. 별도의 튜브에 황산구리 용액(3.5 uL, 20 mM)과 THPTA 용액(8.8 uL, 40 mM), 아미노 구아니딘 용액(3.5 uL, 100 mM) 및 아스코르브산 나트륨 용액(3.5 uL, 100 mM)을 넣었다. 튜브의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여, 10분 동안 방치하였다. 구리 복합체 일부분(1.93 uL)을 AzAb-알킨 용액에 첨가하였다. 최종 혼합물의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여 37℃ 또는 60℃에서 2시간 동안 배양하였다. 반응물을 SDS-PAGE(도 34) 및 HIC 크로마토그래피로 분석하였다. 환원 SDS-PAGE는 2 kDa 분자량의 PEG 첨가와 일관된, 중쇄의 분자량의 약간의 증가를 보여주었다. 비환원 조건 하의 SDS-PAGE는 PEG의 첨가와 일치하는, 전체 길이 항체의 작은 분자량 이동을 나타냈다. HIC 크로마토그래피(도 34의 B)에 의해 추가적인 확인이 이루어졌는데, 이는 항체에 대한 PEG의 첨가와 일치하는, 단일한 주요 종을 나타냈다.
실시예 20. 추가적인 세포 독소-알킨 유도체의 제조
아마니틴 - 시클로옥틴 유도체의 제조
Figure pct00066
α-아마니틴(5 mg, 5.5 umol)과 무수 글루타르산(1.5 mg, 13.2 umol) 및 피리딘(500 uL)을 마그네틱 교반기가 있는 2 mL 바이알에 넣었다. 용액을 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공 하에서 농축시키고, 소량의 디클로로메탄 내로 취하고, 메틸 t부틸 에테르에 침전시켰다. 고체를 다음 단계에 전달하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1031.4 (M+H)+, 발견값 1033.3.
아마니틴-GA(5.6 mg, 5.5 umol), HBTU(4.6 mg), 시클로옥틴-아민(1.8 mg) 및 트리에틸아민(1.9 uL)을 5 mL 원심분리 튜브에 넣고, DMF(1 mL)에 용해시켰다. 작은 마그네틱 교반 막대를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 메틸 t부틸 에테르로부터 혼합물을 침전시켰다. 고체를 원심분리에 의해 분리하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1337.6 (M+H)+, 발견값 1339.4.
아우리스타틴 F - 시클로옥틴 유도체의 제조
Figure pct00067
마그네틱 교반기가 있는 4 mL 바이알에 DMF(1 mL) 중 아우리스타틴 F(AF)(5 mg, 10 umol)를 넣었다. 이 혼합물에 HBTU(7.6 mg, 20 umol), BCN 아민(3.2 mg, 10 umol) 및 트리에틸아민(3.4 uL, 25 umol)을 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 덮고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 용액을 역상 HPLC로 정제하였다(아세토니트릴/물 0.1% TFA 구배). 원하는 분획을 모으고, 분말이 될 때까지 동결건조하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 1051.7 (M+H)+, 발견값 1052.7.
Figure pct00068
아우리스타틴 F - 프로파질아미드 유도체 AF -PA0
AF-PA0는 알킨과 아우리스타틴 F 사이의 PEG 스페이서를 지칭한다. AF-PA0의 경우, PEG 스페이서가 없으므로, 0이다. AF-PA3는 알킨과 아우리스타틴 F 구조 사이에 세 개의 에틸렌 단위를 편입시킨다.
4 mL 바이알에 DMF(1 mL) 중 아우리스타틴 F(AF)(6.1 mg, 8.18 umol)를 넣었다. 이 혼합물에 HBTU 용액(6.2 mg, 16 umol), 프로파질아민(0.6 uL, 9 umol) 및 트리에틸아민(2.8 uL, 20 umol)을 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 덮고, 혼합물을 밤새 배양하였다. 용액을 역상 HPLC로 정제하였다(아세토니트릴/물 0.1% TFA 구배). 원하는 분획을 모으고, 분말이 될 때까지 동결건조하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 782.5 (M+H)+, 발견값 783.3.
Figure pct00069
아우리스타틴 F - 프로파질아미드 유도체 AF -PA3
마그네틱 교반기가 있는 1 mL 바이알에 DMF(200 uL) 중 아우리스타틴 F(AF)(4.7 mg, 6.3 umol)를 넣었다. 이 혼합물에 HBTU 용액(6.0 mg, 50 uL DMF 중 16 umol), 프로프-2-인-1-일 N-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸}카바메이트(3.7 mg, 100 uL DMF 내 14 umol) 및 트리에틸아민(3.7 uL, 25 umol)을 첨가하였다. 바이알 뚜껑을 덮고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 용액을 역상 HPLC로 정제하였다(아세토니트릴/물 0.1% 포름산 구배). 원하는 분획을 모으고, 분말이 될 때까지 동결건조하였다. 분석적 MS : m/z (ES+) 계산값 957.6 (M+H)+, 발견값 958.5.
실시예 21 : 독소-알킨 유도체와의 항-Her2 항체에 대한 접합
4D5-AzAb(HC274 : LC70)의 AF-시클로옥틴 유도체와의 접합.
200uL PCR 튜브에 4D5-AzAb(HC274 : LC70) 용액(24 uL, 0.5 mg/mL) 및 AF-시클로옥틴의 DMSO 용액(0.8 uL, 10 mMol)을 넣고, 튜브의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 증 250 mM, 20 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액을 얻었다. 혼합물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
4D5-AzAb(HC274 : LC70)-AF 및 4D5-AzAb(HC274)-AF를 시험관 내 효능 분석에 의해 Her2 양성 세포를 사멸시키는 능력에 대해 평가하였다. 이러한 시험관 내 분석법은 실시예 16에 기술되어 있다. 간략히 말하자면, ADC를 비접합 항체(허셉틴) 및 자유로운 약물과 비교하였다. 세포 독성 분석법에서, SKOV3 및 SKBR3와 같은 Her2 양성 발현 세포주에 대해, DAR4 ADC는 실시예 15와 도 23에서 기술된 바와 같이, 관련된 DAR2(4D5AzAb(HC274)-AF) 화합물보다 약간 더 강한 것으로 밝혀졌다. 이러한 화합물들은 PC3와 같은 저 Her2 발현 세포주에 대해 최소한의 활성을 나타냈다. 양 ADC는 비접합 항체 또는 자유로운 약물보다 훨씬 더 강했다(도 35의 A, B, C). 항-Her2 항체(4D5-AzAb(HC274))의 아마니틴-시클로옥틴 유도체와의 접합.
200 uL PCR 튜브에 인산염 용액(5 uL, 50 mM, pH = 7.4) 및 4D5-AzAb(HC274) 용액(3.94 uL, 13 mg/mL)을 넣었다. 여기에 아마니틴 알킨의 DMSO 용액(1.13 uL, 3 mMol)을 첨가하고, 튜브 뚜껑을 덮고 볼텍싱하였다. 혼합물을 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 7 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 2시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 미니 스핀 컬럼을 통해 염을 제거하여 최종 ADC 용액 4D5-AzAb (HC274)-아마니틴을 얻었다.
4D5-AzAb (HC274)-아마니틴을 시험관 내 효능 분석에 의해 Her2 양성 세포를 사멸시키는 능력에 대해 평가하였다. 이러한 시험관 내 분석법은 실시예 16에 기술되어 있다. 간략히 말하자면, ADC를 다른 ADC(4D5AzAb(HC274)-AF) 및 자유로운 약물과 비교하였다. 4D5AzAb(HC274)-아마니틴 ADC는 Her2 양성 세포주인 SKBR3에서 활성을 나타냈지만(도 36의 A), PC3와 같은 저 Her2 발현 세포주에서는 최소한의 활성을 보여주었다(도 36의 B). 4D5-AzAb(HC274)-아마니틴은 4D5AzAb(HC274)-AF와 비슷하게 효능이 있었고, 자유로운 약물 단독보다는 더 강했다.
실시예 22 : CuAAC로의 4D5 2AzAb(HC274)의 AF-알킨과의 접합
4D5-2AzAb(HC274)의 AF-PA0 또는 AF-PA3와의 접합. 200 uL PCR 튜브에 인산 완충액(3.0 uL, 50~500 mM, pH=7.4), 4D5-AzAb(HC274) 용액(2.1 uL, PBS 중 25 m/mL) 및 세포독성제 AF-PA0 또는 AF-PA3의 유기 용액(0.70 uL, DMSO 또는 프로필렌 글리콜 중 5 mM)을 넣었다. 별도의 튜브에 황산구리 용액(7 uL, 10~160 mM), THPTA (3.6 uL, 10~160 mM), 아미노 구아니딘(7.0 uL, 10~200 mM) 및 아스코르브산 나트륨(7.0 uL, 50~300 mM)을 넣었다. THPTA-CuSO4 복합체의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여 10분 동안 방치하였다. 구리 복합체(반응당 1.23 uL)을 AzAb-알킨 용액에 첨가하였다. 최종 혼합물의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여, 0.5~18시간 동안 배양하였다(4C 내지 60C). 이러한 물질을 피어스 제바 미니 스핀 컬럼(Cat-89882, MWCO = 7000)을 통과시켜 염을 제거하고, 10X PBS로 처리하였다. 대안적으로, 반응 혼합물을 CHT 크로마토그래피로 정제하였다.
실온에서 1:1 THPTA : CuSO4 비율에서의 4D5-2AzAb의 AF-PA0와의 접합: 200 uL PCR 튜브에 인산 완충액(2.8 uL, 500 mM, pH=7.4), 4D5-AzAb(HC274)(2.1 uL, 25 mg/mL) 및 AF-PA0(0.7 uL, 5 mM, DMSO 용액)을 넣었다. 별도의 튜브에 황산구리 용액(3.5 uL, 20 mM), THPTA(1.8 uL, 40 mM), 아미노 구아니딘(3.5 uL, 100 mM) 및 아스코르브산 나트륨(5.3 uL, 100 mM)을 넣었다. THPTA-CuSO4 복합체의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여 10분 동안 방치하였다. 구리 복합체(1.4 uL)을 AzAb-알킨 용액에 첨가하였다. 최종 혼합물의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하여, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 반응물을 제바 스핀 컬럼(MWCO = 7000)을 통과시켜 염을 제거하였다. HIC 크로마토그래피에 의한 반응 분석 결과, 원하는 DAR2 생성물이 분명히 형성되었음이 나타났다(도 38).
효능 및 선택성을 측정하기 위한 시험관 내 분석법에 의해 CuAAC 기반의 항-Her2 아우리스타틴 ADC를 관련된 시클로알킨 유래의 항-Her2 아우리스타틴 ADC와 비교하였다. 시험관 내 효능 분석법을 실시예 16에 기술된 바와 비슷한 방식으로 진행하였다. CuAAC 기반의 ADC는 SKBR3 및 SKOV3와 같은 Her2 양성 세포주에 대해 시클로알킨 유래의 ADC와 비슷한 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 37의 A, B). 동일한 ADC를 저발현 Her2 세포주인 PC3에 대한 선택성에 대해 시험하였고, 강하지 않은 것으로 밝혀졌다(도 37의 C).
AzAb 접합에 활용된 CuAAC 조건 요약
반응성분 아지드 함유 단백질 알킨 기질 구리
공급원		 구리 안정화
리간드		 환원제
예 PSMA-아지드
scFv-아지드
α-IL6 AzAb
α-Her2 AzAb		 세포독성제
염료
PEG
(2~20 kDa)
단백질-PEG 접합체		 CuSO4
CuI
CuCl2
Cu(Ac)2
CuBr		 THPTA
TBTA
MES
ET3N		 BME
시스테인
TCEP
아스코르브산 나트륨
아황산수소나트륨
하이드라진
하이드록실아민
농도 범위 (mM) 0.001~0.1 0.001~5 0.1~10 0.2~20 0.1~30
실시예 23 : 허셉틴 ADC의 생성 및 접합
실시예 15에 기술된 세포주를 중쇄(돌연변이 중쇄, SEQ ID 76, 77; SEQ ID 78, 79에 따른 비변형 경쇄)의 274번 위치에 nnAA를 함유하도록 변형된 허셉틴으로부터 유래된 항-Her2 azAb 항체(SEQ ID 74 및 75, 경쇄; SEQ ID 76, 77, 중쇄)인 허셉틴 AzAb(HC274)를 생성하는 데 이용하였다. 3x106개 세포/mL를 125 mL의 엑셀 DHFR 배지에 시딩하고, 리신-아지드에 7일 동안 노출시켰다. 배지를 수집하고, 세포를 원심분리에 의해 수확하였다(10분, 1000xg). 12.5 mL의 10x 인산 완충 식염수(10xPBS; 라이프 테크놀로지스)를 첨가하고, 배지를 300 ul(충전 부피) IgSelect 수지(GE 헬스케어)에 3회 통과시켰다. 결합된 단백질을 10 컬럼 부피의 0.1% 트윈-20을 함유하는 트리스 완충 식염수(TBS-T pH 7.5)로 세척하였다. 허셉틴-AzAb를 0.1M 글리신 pH2.5으로 용리시키고, 250 ul 용리 분획을 수집하였다. 산을 즉시 50 ul 1M 트리스 pH8.0로 중화시켰다. 각 분획을 분광분석법으로 분석하고, OD280 판독치를 나타내는 분획을 보유하였다. 피크 단백질 분획을 합하고, 단백질을 농축시키고, 아미콘 울트라-4 농축기(밀리포어(Millipore))를 이용하여 인산 완충 식염수로 완충 용액을 교환하였다. 농축된 샘플을 접합을 위해 가공하였다.
20K 선형 PEG-시클로알킨의 허셉틴-AzAb (HC274)에 대한 페길화. 200 uL PCR 튜브에 허셉틴-2AzAb(HC274) 용액(1.0 uL, 2.4 mg/mL)을 넣고, 이어서 20KPEG 시클로옥틴 용액(1.0 uL, 60 mg/mL)을 넣었다. 용액을 볼텍서 상에서 격렬하게 혼합하였다. 튜브를 PCR 튜브 원심분리기에 넣고, 수 초 동안 원심분리하여 모든 액체가 튜브의 바닥에 가도록 하였다. 혼합물을 4시간 동안 방치한 다음, SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE(환원)는 20kDa PEG 알킨이 우수한 효율로 중쇄의 아지드에 부위 특이적으로 접합되나, 남아 있는 비반응 중쇄가 없을 때에는 최소로 나타났다(도 39).
허셉틴-AzAb(HC274)의 AF-시클로옥틴 유도체와의 접합. 200 uL PCR 튜브에 허셉틴-2AzAb 용액(19 uL, 4.8 mg/mL)을 넣었다. 여기에 AF-시클로옥틴 유도체의 DMSO 용액(1.5 uL, 5 mMol)을 첨가하고, 튜브의 뚜껑을 덮고, 볼텍싱하였다. 혼합물을 24시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 아지도호모알라닌 용액(AHA, 1M HEPES 중 250 mM, 10 uL)으로 처리하고, 볼텍싱하고, 60분 동안 방치하였다. 그런 다음, 혼합물을 ZEBA(피어스) 2mL 스핀 컬럼으로 염을 제거하여, 최종 ADC 용액을 얻었다. HIC 크로마토그래피에 의한 분석 결과, 원하는 DAR2 생성물이 분명히 생성된 것으로 나타났다(도 40). SDS-PAGE(비환원)에 의한 추가적인 분석 결과, 중쇄의 분자량의 작은 증가가 나타났고, 비환원 PAGE 또한 주요 단백질 밴드의 분자량의 증가를 나타냈다.
CuAAC 조건 하에서의 허셉틴-2AzAb의 AF-PA0와의 접합. 실시예 22에 기술된 조건 하에서 접합을 수행하였다. 반응물을 제바 스핀 컬럼(MWCO=7000)을 통한 염 제거에 의해 정제하였다. HIC 크로마토그래피에 의한 반응 분석 결과, 원하는 DAR2 생성물이 분명히 생성된 것으로 나타났다(도 41). SDS-PAGE(환원)에 의한 추가적인 분석 결과, 이러한 서브유닛에 대한 약물의 접합 때문에 분자량의 작은 증가가 나타났다. 추가적인 (비환원) PAGE 분석 또한 주요 단백질 밴드의 분자량 증가를 나타냈다(도 41).
시험관 내 세포독성 활성
위에 기술된 바와 같이 생성된 ADC를 대상으로, 항 Her2 항체의 활성 및 ADC 세포주에 대해 시험하기 위한 표준적인 표적 세포인 SKOV3과 PC3 종양 세포주에서 세포독성 활성을 시험하였다. SKOV3 세포는 높은 수준의 Her2를 발현하는 데 반해, PC3는 낮은 수준으로 Her2를 발현한다. 간략히 말하자면, 각 분석법을 위해, 1000개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 적정값의 아우리스타틴 F 단독, 또는 SPAAC 또는 CUAAC 화학에 의해 생성된 허셉틴-AF 접합체와 배양한다. 약물 처리된 세포들을 100 ul 배지 내에 3일 동안 37C에서 배양한다. 20 ul의 알라마 블루(라이프 테크놀로지스)를 각 웰에 첨가하고, 세포를 16~24시간 동안 배양하고, 각 웰에 대해 OD 450nm을 결정하였다. 접합체의 세포독성 활성을 표 8에 기술된 바와 같이 시험관 내에서 종양 세포의 50%를 사멸시키는 ADC의 농도로 계산하였다.
상이한 종양 세포주에 대한 허셉틴 ADC의 효능
EC 50 nM
PC3 SKOV3 HCC1954 BT474 SKBR3
허셉틴- CUAAC - AF ADC NA 0.030 0.023 0.069 0.017
허셉틴- SPAAC - AF ADC NA 0.026 0.023 0.062 0.017
아우리스타틴 F 166.2 23.48 12.9 58.81 33.27
도 42의 A와 B에 나타난 바와 같이, CUAAC 또는 SPAAC 접합 화학과 함께 구축된 허셉틴-AzAb(HC274)-AF ADC들을 비교하였다. 각 경우에 허셉틴 ADC는 SKOV3 세포(Her2 양성 종양 세포주)에서 강력하였으나, PC3 세포에는 영향을 미치지 않았다.
도 42의 A 및 B는 표 8의 EC50 값이 유래된 세포독성 분석법을 보여준다.
도 42의 A는 SKOV3 종양 세포주에서 허셉틴-AzAb(HC274)-CUUAC-AF 및 허셉틴-AzAb SPAAC-AF의 종양 세포독성 활성을 보여준다. 이러한 세포들은 상이한 접합 화학에 의해 생성된, 독소가 접합된 ADC에 의해 효과적으로 사멸된다. 명백하게, 이러한 ADC는, 수동확산과 비교할 때, 아마도 AF 전부를 직접적으로 세포에 효과적으로 표적화함으로써, 종양 세포를 사멸시키는 데 필요한 AF의 농도를 크게 낮춘다. 도 42의 B는 PC3 세포에 미치는 허셉틴 접합체의 효과를 보여준다. 여기서, SPAAC와 CUUAC로 생성된 접합체는 모두 조사했던 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 데이터는 SPAAC와 CUUAC 접합 방법에 의해 생성된 허셉틴 ADC들의 특이적인 표적화 및 활성을 보여준다.
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본 명세서 및 이어지는 특허청구범위 전체에 걸쳐, 맥락에서 달리 요구된지 않는 한, 단어 '포함하다(comprise)' 및 '포함한다(comprises)'와 '포함하는(comprising)'과 같은 변형들은 언급된 정수, 단계, 정수 집단 또는 단계 집단을 포함하나, 임의의 다른 정수, 단계, 정수 집단 또는 단계 집단을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에 언급된 모든 특허 및 특허 출원은 전체가 참조로써 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Allozyne, Inc <120> Cell lines <130> ALL-P1457PCT <150> US 61/705,116 <151> 2012-09-24 <150> US 61/862,495 <151> 2013-08-05 <160> 84 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Methanosarcina mazei <400> 1 Met Asp Lys Lys Pro Leu Asn Thr Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp 1 5 10 15 Met Ser Arg Thr Gly Thr Ile His Lys Ile Lys His His Glu Val Ser 20 25 30 Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val 35 40 45 Asn Asn Ser Arg Ser Ser Arg Thr Ala Arg Ala Leu Arg His His Lys 50 55 60 Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys Arg Val Ser Asp Glu Asp Leu Asn 65 70 75 80 Lys Phe Leu Thr Lys Ala Asn Glu Asp Gln Thr Ser Val Lys Val Lys 85 90 95 Val Val Ser Ala Pro Thr Arg Thr Lys Lys Ala Met Pro Lys Ser Val 100 105 110 Ala Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu Asn Thr Glu Ala Ala Gln Ala Gln 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Lys Phe Ser Pro Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu 130 135 140 Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val Ser Thr Ser Ile Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Thr Gly Ala Thr Ala Ser Ala Leu Val Lys Gly Asn Thr Asn Pro Ile 165 170 175 Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Gln Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys 180 185 190 Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile 195 200 205 Ser Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu 210 215 220 Ser Arg Arg Lys Lys Asp Leu Gln Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu 225 230 235 240 Asn Tyr Leu Gly Lys Leu Glu Arg Glu Ile Thr Arg Phe Phe Val Asp 245 250 255 Arg Gly Phe Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr 260 265 270 Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile 275 280 285 Phe Arg Val Asp Lys Asn Phe Cys Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn 290 295 300 Leu Tyr Asn Tyr Leu Arg Lys Leu Asp Arg Ala Leu Pro Asp Pro Ile 305 310 315 320 Lys Ile Phe Glu Ile Gly Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Ser Asp Gly Lys 325 330 335 Glu His Leu Glu Glu Phe Thr Met Leu Asn Phe Cys Gln Met Gly Ser 340 345 350 Gly Cys Thr Arg Glu Asn Leu Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Leu Asn 355 360 365 His Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ile Val Gly Asp Ser Cys Met Val Tyr 370 375 380 Gly Asp Thr Leu Asp Val Met His Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala 385 390 395 400 Val Val Gly Pro Ile Pro Leu Asp Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro 405 410 415 Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His 420 425 430 Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala Ala Arg Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn 435 440 445 Gly Ile Ser Thr Asn Leu 450 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: PylRS Methanosarcina mazei Y384F mutant amino acid sequence <400> 2 Met Asp Lys Lys Pro Leu Asn Thr Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp 1 5 10 15 Met Ser Arg Thr Gly Thr Ile His Lys Ile Lys His His Glu Val Ser 20 25 30 Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val 35 40 45 Asn Asn Ser Arg Ser Ser Arg Thr Ala Arg Ala Leu Arg His His Lys 50 55 60 Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys Arg Val Ser Asp Glu Asp Leu Asn 65 70 75 80 Lys Phe Leu Thr Lys Ala Asn Glu Asp Gln Thr Ser Val Lys Val Lys 85 90 95 Val Val Ser Ala Pro Thr Arg Thr Lys Lys Ala Met Pro Lys Ser Val 100 105 110 Ala Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu Asn Thr Glu Ala Ala Gln Ala Gln 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Lys Phe Ser Pro Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu 130 135 140 Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val Ser Thr Ser Ile Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Thr Gly Ala Thr Ala Ser Ala Leu Val Lys Gly Asn Thr Asn Pro Ile 165 170 175 Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Gln Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys 180 185 190 Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile 195 200 205 Ser Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu 210 215 220 Ser Arg Arg Lys Lys Asp Leu Gln Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu 225 230 235 240 Asn Tyr Leu Gly Lys Leu Glu Arg Glu Ile Thr Arg Phe Phe Val Asp 245 250 255 Arg Gly Phe Leu Glu Ile Lys Ser Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr 260 265 270 Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile 275 280 285 Phe Arg Val Asp Lys Asn Phe Cys Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn 290 295 300 Leu 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agtttacaat gctgaatttc 960 tgccagatgg gatcgatgtg cacacgaaag accctggaaa atttgataga tgaattactg 1020 gaatttatgg atattgaata tgaaatcgta tctgataact gccatgtata tggagctact 1080 attgatgttc ttcacaaaga tatggaactt gcatctgctg ttgttgggcc aattccaaaa 1140 gatgcagact ggggaatcac aaaaccatgg atcggtgctg gatttggtct tgaacgtttg 1200 ctcaaagtca tgcataatta taagaatata agacgtgcga gcagatctga gtcgtattat 1260 aatggcataa ctacaaatct ctaa 1284 <210> 23 <211> 1245 <212> DNA <213> Methanohalobium evestigatum <400> 23 atgtctaaaa aatcactggc atcattaata tcagacctcc aagtatgggt ttcaaggagt 60 ggtttactcc atgaaataaa aaattatgaa gtgtcacaaa gatacattca tatggaaatg 120 gattgtgggg aaaaaatcac agtaagaaat tccagaaata gtcgtacagc aagaatatta 180 agacttaaaa aatacaaaaa accctgtaaa aactgcaagg tttctgatga ggttattaac 240 agatttttac aaaaacatac cgacagaact gatacaaaag taactgcttt ttcatattct 300 gaatcaaaga aaaagaaatc caagcaactg ggacacaaaa aaaagaagca atcaaaagtg 360 caggttaacc ccactactga aagtattcaa tcaaacacat cagtttcaga agataaaaca 420 gacaacaaaa ttgagccaga gacatttact tctgcacaga aagaacgaat taatgaacta 480 cttttgcctg gagaaaaaat accattttct aatgaaccat caaaatttaa ggaaatagaa 540 tctgaattgg tcaacaaaag gcgaaatgat ttcaaacaga tgtatgaaaa cgaccgagaa 600 gaacaaattg caaaacttga gagaactatt tcccaatttt ttgttgataa agggtttata 660 gaaattaaag ccccaataat tattgatatt gattctgtta aaaaaatggg tatcgataca 720 gatcataaat tatcaaaaca aatattttat cttgataata aacactgctt gcgacccatg 780 cttgcaccgg gtctctacca gtggcttaaa aattttgaca aaatcctgcc tgatccgatt 840 aaaatttttg aaatcggacc gtgttatcgg aaagagtcag aaggtagcca gcaccttgaa 900 gaatttacaa tgtttaactt ctgtcaaatg ggttctggtg caaacagaga aaaccttcta 960 aatcatatag atgacctgtt aaaacatcta aacatcgact acaaaataat tgatgataac 1020 tgtcatgttt atggtgagac catagatatc gtccacggtg atttagaact ttcatctgct 1080 gttgtaggtc ctgttccaat cgatatgaac tggggaatcg ataaaacatg gattggtgca 1140 ggattaggac tggaaagatt gctaaaggtt aaacacggat ataaaaatat aaaacgcgcc 1200 agtaaatctc attcatatta taatggtata tcaaccaatc tttaa 1245 <210> 24 <211> 867 <212> DNA <213> Desulfotomaculum gibsoniae <400> 24 atgtttttaa caaggaggga cccacccttg agcagctttt ggacaaaggt tcaatatcaa 60 cgcctgaaag aactcaatgc ctccggggag cagctggaaa tgggtttttc cgatgcacta 120 agccgtgacc gcgcttttca ggggattgaa catcaactga tgagccaggg aaaacgccat 180 ttggaacagc tgcgcacggt gaagcatcgt cccgccttgc tcgagcttga agagaaatta 240 gcgaaagcat tgcaccaaca gggatttgtt caggtggtga ccccgacgat tattacgaag 300 tcggccttgg ctaagatgac cataggggag gaccatcctt tgttttccca ggttttttgg 360 ttggatggga agaaatgttt gcggccgatg ctggctccca atctatacac tttgtggaga 420 gagcttgagc gcctgtggga taagccgatc cggattttcg agattggaac ctgttaccgg 480 aaagagtccc agggggcaca gcatctcaat gaatttacca tgctgaatct cacggaactg 540 gggactcccc tggaagagcg gcatcaacgt cttgaagaca tggcccgctg ggtgctggaa 600 gctgcgggaa taagggagtt tgagctggtt acggaatcct cggtagttta cggggatacg 660 gtagatgtga tgaagggcga tctggagctg gcttcggggg ccatggggcc ccacttcctt 720 gatgaaaaat gggagatatt tgatccctgg gtaggtctgg gctttggtct ggaaaggctt 780 ctgatgattc gtgaaggaac acaacatgtt cagagtatgg ccagaagcct gagctatctt 840 gatggagtac gcttaaatat caattga 867 <210> 25 <211> 1215 <212> DNA <213> Methanohalophilus mahii <400> 25 atggaaagga aaccactaga tttacttata gacaccaacg gagtgtggct ctctaggaac 60 gggttacttc atggtgtaaa gaacttcgag gtgtcaagaa accatattca tatcactact 120 gactgccaaa gccgctttac agtacgcaat tcaagaagaa gtcgctctgc aagggcgcta 180 cgcaacaata aatatcgcaa agcatgcaaa aactgcaaac tttccgatga gcgtattact 240 cgttttgtca caaaagattt tggcagggga agccaggcac gtgttatcac atcttcaaaa 300 acaaaaaaga gtaaatctcc aaaggaagca gtggtaaaat ctgtatccag caaggcaaat 360 gaaatgccac ctgttgtaga ggcaaaaaaa gaaaagcctg taaaaccgga ttacacgcct 420 gcccagaaga aaaggattac aacactgctt agccctgcag acgaccttag ttcaataaaa 480 gaactcccca ccttcaagga gctggagaca gaacttgtta aaaaaagaaa acaagacctg 540 cgccagatgt atgaggatga ccgcagacat cagctggccc agctcgaaag ggacatctcc 600 ctatttttaa tagaaaaagg attcatggaa gtacgtactt ctgtcctgat acctgccaaa 660 ttcattgaaa gaatgggcat cacagaagaa gaccccctct acaagcagat cttccgggtg 720 gatgagaata catgcctgcg gcccatgctt gccccgggat tatataatta tcttcacaat 780 tttgataaca taatgcccga ccccctcaag atattcgaga tcggtacctg ctacagaaag 840 gaatccgacg gcaaagaaca tcttgaagag tttacaatgg ttaatttctg ccagatgggt 900 tcgggatgca caaaagaaaa cctgttaaat attatcgatg acctgctcaa atatctaaac 960 atcgattacg aagtaatctc ggataattgc atggtgtatg gagataccat tgacataatg 1020 catggggata tggaaatatc ttcagccgtt gtgggaccca ttccacagga cctcgactgg 1080 ggagtgacca aaccctggat gggtgcagga atgggaattg agagattact caaggtaaag 1140 cacaaataca caaacataaa gcgctcaagc aggtctattt catactataa cggaattaca 1200 accaatctca ggtga 1215 <210> 26 <211> 67 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 26 ggaaaccuga ucauguagau cguggacucu aaauccgcag ccggguagau ucccgggguu 60 uccgcca 67 <210> 27 <211> 72 <212> DNA <213> Methanosarcina acetivorans <400> 27 ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60 gggtttccgc ca 72 <210> 28 <211> 72 <212> DNA <213> Methanosarcina mazei <400> 28 ggaaacctga tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg 60 gggtttccgc ca 72 <210> 29 <211> 72 <212> DNA <213> Methanococcoides burtonii <400> 29 ggagacttga tcatgtagat cgaacggact ctaaatcctt tcagccgggt tagattcccg 60 gagtttccgc ca 72 <210> 30 <211> 67 <212> RNA <213> Desulfobacterium hafniense <400> 30 ggaaaccuga ucauguagau cguggacucu aaauccgcag ccggguagau ucccgggguu 60 uccgcca 67 <210> 31 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: H1/TO promoter <400> 31 aatatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat ccctatcagt 60 gatagagact tataagttcc ctatcagtga tagagacacc a 101 <210> 32 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: U6 snRNA promoter <400> 32 agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga 60 gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag 120 aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca 180 tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg 240 acgaaacacc 250 <210> 33 <211> 269 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: SNR52 promoter <400> 33 tctttgaaaa gataatgtat gattatgctt tcactcatat ttatacagaa acttgatgtt 60 ttctttcgag tatatacaag gtgattacat gtacgtttga agtacaactc tagattttgt 120 agtgccctct tgggctagcg gtaaaggtgc gcattttttc acaccctaca atgttctgtt 180 caaaagattt tggtcaaacg ctgtagaagt gaaagttggt gcgcatgttt cggcgttcga 240 aacttctccg cagtgaaaga taaatgatc 269 <210> 34 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: H1 promoter <400> 34 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accacagatc t 221 <210> 35 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: U6-tRNApyl construct <400> 35 aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60 aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120 aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagtttttaa aattatgttt 180 taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata 240 tatcttgtgg aaaggacgaa acaccgaatt ctctagactc gagggaaacc tgatcatgta 300 gatcgaatgg actctaaatc cgttcagccg ggttagattc ccggggtttc cggacaagtg 360 cggtttttgt tt 372 <210> 36 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GFP nucleotide sequence <400> 36 atggcctcca aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60 ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgctacatac 120 ggaaagctta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca 180 cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga tcatatgaaa 240 cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg cactatatct 300 ttcaaagatg acgggaacta caagacgcgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatcgta tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag atggaaacat tctcggacac 420 aaactcgagt acaactataa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgtcac aacattgaag atggatccgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcga cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggatcaggc caagcctttg 720 tctcaagaag aatccaccct cattgaaaga gcaacggcta caatcaacag catccccatc 780 tctgaagact acagcgtcgc cagcgcagct ctctctagcg acggccgcat cttcactggt 840 gtcaatgtat atcattttac tgggggacct tgtgcagaac tcgtggtgct gggcactgct 900 gctgctgcgg cagctggcaa cctgacttgt atcgtcgcga tcggaaatga gaacaggggc 960 atcttgagcc cctgcggacg gtgccgacag gtgcttctcg atctgcatcc tgggatcaaa 1020 gccatagtga aggacagtga tggacagccg acggcagttg ggattcgtga attgctgccc 1080 tctggttatg tgtgggaggg ctaa 1104 <210> 37 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: GFP amino acid sequence <400> 37 Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Gln Ala Lys Pro Leu 225 230 235 240 Ser Gln Glu Glu Ser Thr Leu Ile Glu Arg Ala 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ccgacaacag tggacacggc cacctatttc tgtgccaggg aatatgctgg tgatagttat 360 tatactggat acactcagtt ggatctctgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcgagt 420 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 40 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-IL-6 (28D2) Gamma Amino acid Sequence <400> 40 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Gly Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser 35 40 45 Lys Asn Ala Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ala Thr Thr Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu 85 90 95 Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Arg Glu Tyr Ala Gly Asp Ser 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gattatccct cagtaagaat gcaattgcct gggtccgcca ggctccaggg 180 aagggactgg aatggatcgg aatcatttat gctggtggtg ccacaaccta cgcgagctgg 240 gcgaaaggcc gattcaccat ctccaagtcc tcgaccacgg tggatctgaa gatcaccagt 300 ccgacaacag tggacacggc cacctatttc tgtgccaggg aatatgctgg tgatagttat 360 tatactggat acactcagtt ggatctctgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcgagt 420 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcta gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 42 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-IL-6 (28D2) Gamma_amber K274 amino acid Sequence <220> <221> SITE <222> (297)..(297) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 42 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Gly Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser 35 40 45 Lys Asn Ala Ile Ala Trp Val Arg 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<213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-Her2 (4D5)Kappa amino acid sequence <400> 52 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 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cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagttcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 54 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-Her2 Kappa D70amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (90)..(90) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 54 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg 115 120 125 Thr 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taggattttg caacttacta ctgtcaacag cactacacca ctcctccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcga acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagttcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 56 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-Her2 Kappa E81amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (101)..(101) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 56 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu 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gacatcgtca tgactcagtc acacaagttc atgtcgactt cggtgggaga tagggtgtcc 120 atcatttgca aagcaagcca agatgtaggg acagcggtcg actggtatca gcagaagccc 180 ggtcagtccc ctaaactcct catctactgg gcatcgacgc gacacacggg cgtcccggac 240 cgcttcacgg gatcgggatc aggtactgac tttacattga caattacaaa cgtccaatcg 300 gaggaccttg cggattactt ctgtcaacag tacaattcgt atcccctgac gttcggggct 360 gggacaaagc tcgacttgaa gggcggtgga gggtcaggtg gaggaggctc cggtggggga 420 gggagcggag ggggtggttc ggaggtgcag ttgcagcaat caggcccgga acttaagaaa 480 cccgggacct cagtaagaat cagctgtaag acaagcgggt acacgtttac cgaatatact 540 atccattggg tgaagcagtc gcatggaaaa tcgcttgaat ggatcgggaa cattaatcct 600 aataacgggg gaaccacgta caaccagaag tttgaggata aagccaccct tactgtggac 660 aaatcctcca gcactgccta tatggaattg cggtccctga cctcggagga ttcagccgta 720 tactactgcg cggcaggatg gaattttgat tattgggggc agggaacaac attgacagtc 780 tcgagcggtc cacctcctcc acctcaccat caccatcatc actga 825 <210> 58 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-PSMA scFv 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caggcccgga acttaagaaa 480 cccgggacct cagtaagaat cagctgtaag acaagcgggt acacgtttac cgaatatact 540 atccattggg tgaagcagtc gcatggaaaa tcgcttgaat ggatcgggaa cattaatcct 600 aataacgggg gaaccacgta caaccagaag tttgaggata aagccaccct tactgtggac 660 aaatcctcca gcactgccta tatggaattg cggtccctga cctcggagga ttcagccgta 720 tactactgcg cggcaggatg gaattttgat tattgggggc agggaacaac attgacagtc 780 tcgagctagg gtccacctcc tccacctcac catcaccatc atcactga 828 <210> 60 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: anti-PSMA scFv_amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (263)..(263) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 60 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val 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<400> 61 atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt ggagctgcag ttgctaagct tcaccatcac 60 catcaccatc cgattccaga ctcatctccg ttgctgcagt ttggcgggca ggtgcggcag 120 cgctatctgt acaccgacga cgcacagcaa acagaggctc atcttgaaat ccgggaggat 180 ggcactgttg gcggtgcggc ggatcagagt cccgagtcac tgcttcaact taaggccttg 240 aaaccaggag tgattcaaat cctcggtgtg aaaacgagta gattcctctg ccaaaggccc 300 gatggcgccc tgtacggaag cctccacttc gaccctgagg catgtagctt tcgcgaactc 360 ctgttggaag atgggtataa cgtctatcag tccgaggcac acggccttcc tctccacctc 420 cccgggaata agtcaccgca cagggacccc gctccaaggg gtcccgcacg attcctgccc 480 ttgccagggc tgccacccgc cctgccagaa ccgcctggaa ttctggcccc tcagccacct 540 gacgtcgggt ctagcgaccc cctgagtatg gtaggaccta gccagggcag atccccctcc 600 tacgcctcct aa 612 <210> 62 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys 20 25 30 Asp Asp Asp Asp Lys Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu 35 40 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tcaccatcac 60 catcaccatc cgattccaga ctcatctccg ttgctgcagt ttggcgggca ggtgcggcag 120 cgctatctgt acaccgacga cgcacagcaa acagaggctc atcttgaaat ccgggaggat 180 ggcactgttg gcggtgcggc ggatcagagt cccgagtcac tgcttcaact taaggccttg 240 aaaccaggag tgattcaaat cctcggtgtg aaaacgagta gattcctctg ccaaaggccc 300 gatggcgccc tgtacggaag cctccacttc gaccctgagg catgtagctt tcgcgaactc 360 ctgttggaag atgggtataa cgtctatcag tccgaggcac acggccttcc tctccacctc 420 cccgggaata agtcaccgca cagggacccc gctccatagg gtcccgcacg attcctgccc 480 ttgccagggc tgccacccgc cctgccagaa ccgcctggaa ttctggcccc tcagccacct 540 gacgtcgggt ctagcgaccc cctgagtatg gtaggaccta gccagggcag atccccctcc 600 tacgcctcct aa 612 <210> 64 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 R131amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (169)..(169) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 64 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile 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F12amber nucleotide sequence <400> 65 atgtctgctc ttctgatact cgccttggta ggggctgctg ttgccgacta taaggatcac 60 gacggcgatt acaaggacca tgatatcgat tacaaagatg acgacgacaa gtctcatccg 120 attccagact catctccgtt gctgcagtag ggcgggcagg tgcggcagcg ctatctgtac 180 accgacgacg cacagcaaac agaggctcat cttgaaatcc gggaggatgg cactgttggc 240 ggtgcggcgg atcagagtcc cgagtcactg cttcaactta aggccttgaa accaggagtg 300 attcaaatcc tcggtgtgaa aacgagtaga ttcctctgcc aaaggcccga tggcgccctg 360 tacggaagcc tccacttcga ccctgaggca tgtagctttc gcgaactcct gttggaagat 420 gggtataacg tctatcagtc cgaggcacac ggccttcctc tccacctccc cgggaataag 480 tcaccgcaca gggaccccgc tccaaggggt cccgcacgat tcctgccctt gccagggctg 540 ccacccgccc tgccagaacc gcctggaatt ctggcccctc agccacctga cgtcgggtct 600 agcgaccccc tgagtatggt aggacctagc cagggcagat ccccctccta cgcctcctaa 660 <210> 66 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 F12amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (50)..(50) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 66 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys 20 25 30 Asp Asp Asp Asp Lys Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu 35 40 45 Gln Xaa Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala 50 55 60 Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu 100 105 110 Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro 115 120 125 Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val 130 135 140 Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys 145 150 155 160 Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro 165 170 175 Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala 180 185 190 Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly 195 200 205 Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 210 215 <210> 67 <211> 612 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 L60amber nucleotide sequence <400> 67 atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt ggagctgcag ttgctaagct tcaccatcac 60 catcaccatc cgattccaga ctcatctccg ttgctgcagt ttggcgggca ggtgcggcag 120 cgctatctgt acaccgacga cgcacagcaa acagaggctc atcttgaaat ccgggaggat 180 ggcactgttg gcggtgcggc ggatcagagt cccgagtcac tgcttcaact taaggccttg 240 aaaccaggag tgattcaaat ctagggtgtg aaaacgagta gattcctctg ccaaaggccc 300 gatggcgccc tgtacggaag cctccacttc gaccctgagg catgtagctt tcgcgaactc 360 ctgttggaag atgggtataa cgtctatcag tccgaggcac acggccttcc tctccacctc 420 cccgggaata agtcaccgca cagggacccc gctccaaggg gtcccgcacg attcctgccc 480 ttgccagggc tgccacccgc cctgccagaa ccgcctggaa ttctggcccc tcagccacct 540 gacgtcgggt ctagcgaccc cctgagtatg gtaggaccta gccagggcag atccccctcc 600 tacgcctcct aa 612 <210> 68 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 L60amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (104)..(104) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 68 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys 20 25 30 Asp Asp Asp Asp Lys Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala 50 55 60 Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Xaa Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu 100 105 110 Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro 115 120 125 Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val 130 135 140 Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys 145 150 155 160 Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro 165 170 175 Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile 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<210> 70 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 P90amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (128)..(128) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 70 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys 20 25 30 Asp Asp Asp Asp Lys Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala 50 55 60 Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu 100 105 110 Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Xaa 115 120 125 Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val 130 135 140 Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys 145 150 155 160 Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro 165 170 175 Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala 180 185 190 Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly 195 200 205 Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 210 215 <210> 71 <211> 612 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 P140amber nucleotide sequence <400> 71 atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt ggagctgcag ttgctaagct tcaccatcac 60 catcaccatc cgattccaga ctcatctccg ttgctgcagt ttggcgggca ggtgcggcag 120 cgctatctgt acaccgacga cgcacagcaa acagaggctc atcttgaaat ccgggaggat 180 ggcactgttg gcggtgcggc ggatcagagt cccgagtcac tgcttcaact taaggccttg 240 aaaccaggag tgattcaaat cctcggtgtg aaaacgagta gattcctctg ccaaaggccc 300 gatggcgccc tgtacggaag cctccacttc gaccctgagg catgtagctt tcgcgaactc 360 ctgttggaag atgggtataa cgtctatcag tccgaggcac acggccttcc tctccacctc 420 cccgggaata agtcaccgca cagggacccc gctccaaggg gtcccgcacg attcctgccc 480 ttgtaggggc tgccacccgc cctgccagaa ccgcctggaa ttctggcccc tcagccacct 540 gacgtcgggt ctagcgaccc cctgagtatg gtaggaccta gccagggcag atccccctcc 600 tacgcctcct aa 612 <210> 72 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: FGF21 P140amber amino acid sequence <220> <221> SITE <222> (178)..(178) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 72 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys 20 25 30 Asp Asp Asp Asp Lys Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala 50 55 60 Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu 100 105 110 Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro 115 120 125 Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val 130 135 140 Tyr Gln Ser Glu Ala His 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cggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgtcac aacattgaag atggatccgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcga cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggatcaggc caagcctttg 720 tctcaagaag aatccaccct cattgaaaga gcaacggcta caatcaacag catccccatc 780 tctgaagact acagcgtcgc cagcgcagct ctctctagcg acggccgcat cttcactggt 840 gtcaatgtat atcattttac tgggggacct tgtgcagaac tcgtggtgct gggcactgct 900 gctgctgcgg cagctggcaa cctgacttgt atcgtcgcga tcggaaatga gaacaggggc 960 atcttgagcc cctgcggacg gtgccgacag gtgcttctcg atctgcatcc tgggatcaaa 1020 gccatagtga aggacagtga tggacagccg acggcagttg ggattcgtga attgctgccc 1080 tctggttatg tgtgggaggg ctaa 1104 <210> 74 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Herceptin Nucleotide sequence Gamma Chain <400> 74 atggaggctc ccgcccagct gctctttctg ctccttctct ggcttcccga cacaaccggt 60 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggtggc ttggtacagc cgggcgggtc cctgcgcctc 120 tcctgtgccg cttccggatt caacatcaaa gacacgtata ttcactgggt ccgtcaggca 180 cctggcaagg gtctggagtg ggtggcccgc atttatccta ccaatggtta cactcgctac 240 gccgactctg tgaagggccg cttcaccatc agcgccgaca cgtccaagaa caccgcttat 300 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtgt attactgcag ccgctggggc 360 ggtgatggct tttacgcgat ggactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcgagt 420 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720 cctaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1140 gagctcacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa 1416 <210> 75 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Herceptin amino acid sequence Gamma Chain <400> 75 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 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sequence <220> <223> Synthetic sequence: Herceptin H274 Nucleotide sequence Gamma Chain <400> 76 atggaggctc ccgcccagct gctctttctg ctccttctct ggcttcccga cacaaccggt 60 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggtggc ttggtacagc cgggcgggtc cctgcgcctc 120 tcctgtgccg cttccggatt caacatcaaa gacacgtata ttcactgggt ccgtcaggca 180 cctggcaagg gtctggagtg ggtggcccgc atttatccta ccaatggtta cactcgctac 240 gccgactctg tgaagggccg cttcaccatc agcgccgaca cgtccaagaa caccgcttat 300 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtgt attactgcag ccgctggggc 360 ggtgatggct tttacgcgat ggactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcgagt 420 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720 cctaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt ctagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggac 1140 gagctcacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa 1416 <210> 77 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Herceptin 274 amino acid sequence Gamma Chain <220> <221> SITE <222> (298)..(298) <223> Xaa is nnAA, a non natural amino acid. <400> 77 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Xaa Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 78 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Herceptin nucleotide sequence Kappa Chain <400> 78 atggaggctc ccgcccagct gctctttctg ctccttctct ggcttcccga cacaaccggt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga ccgtgtcaca 120 atcacttgcc gtgctagcca ggatgtgaat acagcggtgg cctggtatca gcagaaacct 180 ggcaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagcgg cgtgccgagc 240 cgcttcagcg gcagccgttc tggtaccgat ttcactctca ccatcagctc tctgcaaccg 300 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cactacacca ctcctccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagttcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 705 <210> 79 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Herceptin amino acid sequence Kappa Chain <400> 79 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: 3 x Flag tag sequence <400> 80 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser 20 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: 5xPro-6xHis tag <400> 81 Pro Pro Pro Pro Pro His His His His His His 1 5 10 <210> 82 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 1 5 10 15 Gln <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 1 5 10 15

Claims (75)

  1. PylRS 및 tRNApyl을 발현하고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한 진핵 세포주를 안정시키는 방법으로서, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl 발현의 부정적인 효과가 감소되거나 제거되는 조건 하에서 상기 세포주를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, 세포주가 배양되는 배지에, PylRS에 대한 기질이지만 연장되는 단백질 사슬로 편입될 수 없는 유인성(decoy) 아미노산이 존재하는 조건을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 유인성 아미노산은 N-포밀 리신과 같은 화학적으로 변형된 아민기가 있는 PylRS에 대한 아미노산 기질인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 유인성 아미노산은 화학식 VII의 화합물인 방법:
    Figure pct00070

    (화학식 VII에서,
    G = H, OH, -OCH3, OCH2CH3, O-C(=O)-CH3 또는 NH-K-Q;
    X = 결합, CH2, S, O, NH, N-(C=O)- 또는 CH-J;
    J = 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 20개의 천연 아미노산 중 하나의 곁사슬;
    Y = 결합, NH, O, S, CH2;
    Z = O, NH, CH2, S, CH-NH2;
    K = CO 또는 SO2;
    a= 0, 1, 2 또는 3;
    b = 0, 1, 2 또는 3;
    Q= -H, C1- 6알킬, 아릴, 헤테로아릴 -OC1- 6알킬, -OCH2아릴, -OCH2헤테로아릴, -C2-6알케닐 또는 -OC2-6알케닐; 및
    R= C1- 6알킬, C2- 6알케닐, -CH2아릴, C2- 6알키닐, C1- 6할로알킬 또는 C1- 6아지도알킬임).
  5. 제4항에 있어서, 화학식 VII의 화합물은 화학식 VIIA의 화합물인 방법:
    Figure pct00071
  6. 제4항에 있어서, 화학식 VII의 화합물은 화학식 VIIB의 화합물인 방법:
    Figure pct00072

    (화학식 VIIB에서,
    G= H;
    a= 4 또는 5; 및
    R= C1- 6알킬, C2-6 알케닐, -CH2아릴, C2- 6알키닐, C1- 6할로알킬 또는 C1- 6아지도알킬임).
  7. 제6항에 있어서, 유인성 아미노산은 다음으로부터 선택되는 방법:
    Figure pct00073

    Figure pct00074
  8. 제1항에 있어서, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되는 조건을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 유인성 단백질도 상기 세포주에 의해 유도성 프로모터의 조절 하에서 발현되는 조건을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 유인성 단백질은 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 알부민, SEAP, 액틴, b-2 마이크로글로불린, 글루타티온-s-전이효소, IgG, 또는 폴리 앰버를 함유하는 펩티드로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향이 감소되거나 제거되는 조건이, tRNAPyl의 발현이 억제성 프로모터의 조절 하에서 일어나는 조건을 포함하는 방법.
  12. PylRS 및 tRNAPyl을 발현하고, 유도성 프로모터의 조절 하에서 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 유인성 단백질도 발현하는 안정적인 진핵 세포주.
  13. PylRS 및 tRNAPyl을 발현하거나 이들을 발현할 수 있는 안정적인 진핵 세포주로서, tRNAPyl의 발현이 억제성 프로모터의 조절 하에서 일어나는, 안정적인 진핵 세포주.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 안정적인 세포주.
  15. PylRS 및 tRNAPyl을 발현할 수 있고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하여, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를, PylRS에 대한 기질이지만 연장되는 단백질 사슬 내에 편입될 수 없는 유인성 아미노산의 존재 하에서 배양 또는 선택하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  16. PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현할 수 있는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl를 암호화하는 유전자를 진핵 세포주로 도입하여, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를, PylRS에 대한 기질이지만 연장되는 단백질 사슬 내로 편입될 수 없는 유인성 아미노산의 존재 하에서 배양 또는 선택하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계, (c) 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 진핵 세포주에 도입하는 단계, 및 (d) 상기 유인성 아미노산의 부재 하에서 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  17. PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현하는, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주로 도입하여, 상기 유전자가 상기 세포주에 안정적으로 통합되도록 하는 단계, (b) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl를 암호화하는 유전자를 상기 세포주에 더 도입하여, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 (c) tRNAPyl가 상기 세포주에 의해서만 발현되고, 동시에 표적 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되는 조건 하에서, 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에, 얻어진 세포주를 배양하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  18. PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 유인성 단백질을 발현할 수 있고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 하나 이상의 단계에서, pylRS, tRNApyl 및 상기 유인성 단백질을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하여 pylRS, tRNApyl 및 유인성 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) tRNAPyl가 상기 세포주에 의해서만 발현되고, 동시에 유인성 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되어, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 조건 하에서, 얻어진 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제3항 또는 제18항에 있어서, 유인성 단백질의 발현은 테트라사이클린 조절 프로모터(TetO 또는 tTA; TetOn 및 TetOFF), 독시사이클린 유도성(TRE) 프로모터, cAMP 유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 활성화 프로모터 시스템, IPTG 유도성 프로모터(lac), Cd2+ 또는 Zn2+ 유도성 프로모터(금속단백질 프로모터), 인터페론 의존성 프로모터(예컨대 쥐 MX 프로모터), HIV LTR 프로모터(Tat), DMSO 유도성 프로모터(GLVP/TAXI, 엑디손), 및 라파마이신 유도성 프로모터(CID)와 같은 조건부 활성화 프로모터 및 프로모터 시스템을 포함하는 유도성 프로모터 시스템 하에 있는 방법.
  20. PylRS, tRNAPyl, 유인성 단백질 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현시킬 수 있는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 하나 이상의 단계에서 pylRS, tRNApyl 및 유인성 단백질을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하는 단계로서, 상기 유인성 단백질은 유도성 프로모터의 조절 하에서 발현되며, PylRS, tRNAPyl 및 유인성 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) tRNApyl가 상기 세포주에 의해서만 발현되고, 동시에 유인성 단백질도 상기 세포주에 의해 발현되는 조건 하에서, 얻어진 세포주를 배양하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNApyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계, (c) 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 진핵 세포주에 도입하여, 상기 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 (d) 유인성 단백질을 발현시키지 않고 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  21. PylRS, tRNAPyl를 발현할 수 있고, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자의 편입에 적합한, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 하나 이상의 단계에서, PylRS 및 tRNAPyl를 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하는 단계로서, 이때, tRNAPyl는 억제성 프로모터의 조절 하에 있어서, PylRS 및 tRNAPyl가 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를 억제자의 존재 하에서 배양하여 tRNAPyl의 발현이 억제되도록 하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. PylRS, tRNAPyl 및 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 발현할 수 있는 안정적인 진핵 세포주의 생산방법으로서, (a) 하나 이상의 단계에서 PylRS 및 tRNAPyl을 암호화하는 유전자를 진핵 세포주에 도입하는 단계로서, 이때, tRNAPyl는 억제성 프로모터의 조절 하에 있어서, PylRS 및 tRNAPyl은 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, (b) 얻어진 세포주를 억제자의 존재 하에서 배양하여 tRNAPyl의 발현이 억제되도록 하여, 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는 단계, (c) 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 상기 진핵 세포주에 도입하는 단계, 및 (d) 상기 억제자의 부재 하에서 표적 단백질을 발현시켜, tRNAPyl가 발현되도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제15항, 제18항, 제19항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주의 배양 또는 선택 단계는, PylRS에 대한 기질이지만 연장되는 단백질 사슬 내로 편입될 수 없는 유인성 아미노산의 존재 하에서 이루어지며, 그에 의해 세포 생존능 및/또는 세포 생장에 미치는 tRNAPyl의 부정적인 영향을 감소시키는, 안정적인 진핵 세포주의 생산방법.
  24. 제16항, 제17항, 제20항 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 안정적인 진핵 세포주.
  25. 제18항에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 안정적인 진핵 세포주.
  26. 제19항에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 안정적인 진핵 세포주.
  27. 제15항에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 안정적인 진핵 세포주.
  28. 제21항에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 안정적인 진핵 세포주.
  29. 제23항에 따른 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 안정적인 진핵 세포주.
  30. 제24항에 따른 안정적인 세포주를 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법.
  31. 제25항 또는 제26항에 따른 안정적인 진핵 세포주에, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서, 그리고 유인성 단백질 발현의 임의의 유도자(inducer)의 부재 하에서, 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법.
  32. 제27항에 따른 안정적인 진핵 세포주에, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서, 그리고 임의의 유인성 아미노산의 부재 하에서, 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법.
  33. 제28항에 따른 안정적인 진핵 세포주에, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서, 그리고 tRNAPyl 발현의 임의의 억제자의 부재 하에서, 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법.
  34. 제29항에 따른 안정적인 진핵 세포주에, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여, 표적 단백질이 상기 세포주에서 안정적으로 발현되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 비천연 아미노산의 공급원의 존재 하에서 상기 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 넌센스 코돈에 의해 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 표적 단백질의 제조방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 따라 표적 단백질을 제조하는 단계 및 얻어진 표적 단백질을 화학적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 화학적으로 변형된 표적 단백질의 제조방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포주는 예컨대, CHO, HEK293, PERC6, COS-1, COS-7, HeLa, VERO, 마우스 하이브리도마 및 마우스 골수종 세포주로부터 선택된, 포유류 세포주인, 방법 또는 세포주.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 넌센스 코돈은 앰버 코돈인, 방법 또는 세포주.
  38. pylRS에 대한 기질인 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 IgG 유형의 항체로서, 그러한 비천연 아미노산의 위치는 중쇄의 SEQ ID No 82의 157번과 242번 위치 및 SEQ ID No 52와 79의 경쇄의 프레임워크 영역의 70번과 81번 위치로부터 선택되거나 또는 상이한 IgG의 상응하는 위치인, 항체.
  39. 제38항에 있어서, 양 중쇄의 SEQ ID No 82의 157번 위치에 상기 비천연 아미노산을 함유하는 항체.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 양 중쇄의 SEQ ID No 82의 157번 위치 및 양 경쇄의 SEQ ID No 52와 79의 경쇄의 프레임워크 영역의 70번 위치, 또는 상이한 IgG의 상응하는 위치에 상기 비천연 아미노산을 함유하는 항체.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, 양 중쇄의 SEQ ID No 82의 157번 위치 및 양 경쇄의 SEQ ID No 52와 79의 경쇄의 프레임워크 영역의 81번 위치, 또는 상이한 IgG의 상응하는 위치에 상기 비천연 아미노산을 함유하는 항체.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항-Her-2 항체인 항체.
  43. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항-IL-6 항체인 항체.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 항체 접합체로서, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된, 항체 접합체.
  45. 제44항에 있어서, 항체는 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된, 항체 접합체.
  46. 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된 항-Her-2 항체를 포함하는 항체 접합체.
  47. 제46항에 있어서, 항체는 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 항체인, 항체 접합체.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 트리아졸 모이어티는 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 또는 알킨 모이어티와, 단백질, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 또는 아지드 모이어티의 반응에 의해 형성되는, 항체 접합체.
  49. 제48항에 있어서, 트리아졸 모이어티는 Cu(I) 촉매 작용의 조건 하에서, 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 또는 알킨 모이어티와, 단백질, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 또는 아지드 모이어티의 반응에 의해 형성되는, 항체 접합체.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No 52의 경쇄 서열 또는 그에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체 및 SEQ ID No 46의 중쇄 서열 또는 그에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체를 가지고 있는 항-Her2-항체, 또는 SEQ ID No 79의 경쇄 서열 또는 그에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체 및 SEQ ID No 75의 중쇄 서열 또는 그에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체를 가지고 있는 항-Her2-항체인, 항체 접합체.
  51. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No 79의 경쇄 서열 또는 그에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 나타내며 동일한 CDR을 가지고 있는 유도체 및 SEQ ID No 77의 중쇄 서열을 가지고 있는 항-Her2-항체인, 항체 접합체.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티는 PEG 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  53. 제52항에 있어서, PEG 모이어티는 0.5~40 kDa의 분자량을 나타내는, 항체 접합체.
  54. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티는 독소루비신, 파클리탁셀 아마니틴 및 아우리스타틴 모이어티로부터 선택된 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  55. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티는 항체 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  56. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커 또는 상기 링커는, 링커 내에, 절단 부위를 함유하는 스페이서의 존재로 인한 절단 가능한 링커인, 항체 접합체.
  57. 제56항에 있어서, 절단 부위는 효소적으로 불안정한 절단 부위인, 항체 접합체.
  58. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커 또는 상기 링커는 절단 가능한 링커가 아닌, 항체 접합체.
  59. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 트리아졸 모이어티는 항-Her-2 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 모이어티와, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 모이어티의 반응에 의해 형성되는, 항체 접합체.
  60. 제38항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, PylRS에 대한 하나 이상의 비천연 아미노산 기질은 비천연 리신 유사체인, 항체 또는 항체 접합체.
  61. 제38항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, PylRS에 대한 하나 이상의 비천연 아미노산 기질은 (S)-2-아미노-6((2-아지도에톡시)카르보닐아미노)헥산산인, 항체 또는 항체 접합체.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 모이어티는 시클로옥틴 모이어티와 같은 시클로알킨인, 항체 접합체.
  63. 제44항에 있어서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된 항체를 포함하는 항체 접합체로서, 트리아졸 모이어티는 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 아지드 모이어티와, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 알킨 모이어티의 반응에 의해 형성되고, 알킨 모이어티는 시클로옥틴 모이어티와 같은 시클로알킨인, 항체 접합체.
  64. 제44항에 있어서, 트리아졸 모이어티를 포함하는 링커를 통해 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티에 접합된 항체를 포함하는 항체 접합체로서, 트리아졸 모이어티는 항체의 서열 내로 편입된 비천연 아미노산의 곁사슬의 알킨 모이어티와, 약물 또는 PEG 모이어티에 부착된 아지드 모이어티의 반응에 의해 형성되고, 알킨 모이어티는 시클로옥틴 모이어티와 같은 시클로알킨인, 항체 접합체.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, PylRS에 대한 하나 이상의 비천연 아미노산 기질은 비천연 리신 유사체인, 항체 접합체.
  66. 제63항 또는 제64항에 있어서, PylRS에 대한 하나 이상의 비천연 아미노산 기질은 (S)-2-아미노-6((2-아지도에톡시)카르보닐아미노)헥산산인, 항체 접합체.
  67. 제63항 또는 제64항에 있어서, PylRS에 대한 하나 이상의 비천연 아미노산 기질은 화학식 VI.1인, 항체 접합체.
    Figure pct00075

  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티는 PEG 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  69. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티는 독소루비신, 파클리탁셀 및 아우리스타틴 모이어티로부터 선택된 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  70. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 및 PEG 모이어티로부터 선택된 하나 이상의 모이어티는 항체 모이어티를 포함하는, 항체 접합체.
  71. 제63항 내지 제67항 및 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항-PSMA 항체, 예를 들어 scfv인, 항체 접합체.
  72. 제71항에 있어서, 항체는 117번 위치에 편입된 비천연 아미노산이 존재하는 서열 SEQ ID No 60의 항-PSMA 항체인, 항체 접합체.
  73. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항-Her2 항체인, 항체 접합체.
  74. 화학식 VIIB의 아미노산 유도체:
    Figure pct00076

    (화학식 VIIB에서,
    G= H;
    a= 4 또는 5; 및
    R= C1- 6알킬, C2-6 알케닐, -CH2아릴, C2- 6알키닐, C1- 6할로알킬 또는 C1- 6아지도알킬임).
  75. 제74항에 있어서, 유인성 아미노산은 다음으로부터 선택되는, 아미노산 유도체:
    Figure pct00077

    Figure pct00078
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