SK288290B6 - Vektor na expresiu heterológnych proteínov v bakteriálnej hostiteľskej bunke, bakteriálna hostiteľská bunka a spôsob produkcie požadovaného heterológneho polypeptidu - Google Patents

Abstract

Predkladaný vynález sa týka vektora na expresiu heterológnych proteínov v bakteriálnej hostiteľskej bunke, ktorý zahŕňa aspoň jednu sekvenciu riadiacu expresiu a molekulu nukleovej kyseliny kódujúcu fúzny proteín, pričom fúzny proteín zahŕňa prvý polypeptid, ktorým je autoproteáza Npro z pestivírusu alebo jej derivát udržiavajúci si Npro autoproteolytickú aktivitu, a zahŕňa druhý polypeptid, ktorým je heterológny polypeptid. Vynález ďalej opisuje bakteriálnu hostiteľskú bunku a spôsob produkcie požadovaného heterológneho polypeptidu s jasne definovaným homogénnym N-koncom v bakteriálnych hostiteľských bunkách.

Description

Predkladaný vynález sa týka vektora na expresiu heterológnych proteínov v bakteriálnej hostiteľskej bunke, bakteriálnej hostiteľskej bunky a spôsobu výroby požadovaného heterológneho polypeptidu s jasne definovaným homogénnym N-koncom v bakteriálnej hostiteľskej bunke, pričom požadovaný heterológny polypeptid je autoproteolyticky vyštiepený autoproteolytickou aktivitou N^pro z pôvodne exprimovaného fúzneho proteínu, ktorý obsahuje peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestivírusu a heterológny polypeptid.

Doterajší stav techniky

Pri príprave rekombinantných proteínov v heterológnych organizmoch, ako napr. pri expresii humánnych alebo iných eukaryotických proteínov v bakteriálnych bunkách je často ťažké získať jasne definovaný Nkoniec, ktorého homogenita sa približuje čo najviac k 100 %. Toto sa týka predovšetkým rekombinantných farmaceutických proteínov, ktorých aminokyselinová sekvencia by v mnohých prípadoch mala byť zhodná s aminokyselinovou sekvenciou proteínov prirodzene sa vyskytujúcich u človeka/zvieraťa.

Pri normálnej, prirodzenej expresii, napr. u človeka, mnohé farmaceutické proteíny, ktoré sa používajú, sú transportované do extracelulámeho priestoru, pričom štiepenie signálnej sekvencie prítomnej v prekurzorovom proteíne práve na tento účel vedie k vzniku jasne definovaného N-konca. Taký homogénny N-koniec nie je vždy ľahké pripraviť, napr. pri expresii v bakteriálnych bunkách, a to z niekoľkých dôvodov.

Len vo výnimočných prípadoch je export do bakteriálneho periplazmatického priestoru pomocou prokaryotickej alebo eukaryotickej signálnej sekvencie vhodný, pretože sa m môže akumulovať len veľmi malé množstvo produktu z dôvodu nízkej transportnej kapacity bakteriálneho exportného mechanizmu.

Bakteriálna cytoplazma sa však výrazne líši od extracelulámeho priestoru eukarytických organizmov. Na jednej strane sú m redukujúce podmienky, na druhej strane m nie je žiadny mechanizmus na odštiepenie Nkoncovej vedúcej (leader) sekvencie z maturovaného (zrelého) proteínu. Syntéza všetkých cytoplazmatických proteínov začína metionínom, ktorý je kódovaný príslušným iniciačným (štartovacím) kodónom (ATG = iniciácia translácie). Tento N-koncový metionín je pri mnohých proteínoch zachovaný, zatiaľ čo pri iných je odštiepený metioninami-nopeptidázou (MAP), ktorá je prítomná v cytoplazme a je vlastná hostiteľovi. Účinnosť štiepenia závisí v podstate od dvoch parametrov:

1. povaha nasledujúcej aminokyseliny a

2. lokalizácia N-konca v trojrozmernej štruktúre proteínu.

N-koncový metionín je prednostne odstránený, keď nasledujúcou aminokyselinou je serín, alanín, glycín, metionín alebo valín a keď N-koniec je exponovaný, tzn. keď nie je skrytý vnútri proteínu. Na druhej strane, keď je nasledujúcou aminokyselinou iná, najmä nabitá aminokyselina (kyselina glutámová, kyselina asparágová, lyzín, arginín), alebo keď je N-koniec lokalizovaný vnútri proteínu, vo väčšine prípadov k odštiepeniu N-koncového metionínu nedôjde (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).

Dokonca, aj keď aminokyselina podporujúca štiepenie je prítomná v polohe 2, štiepenie je zriedkakedy úplné. Zvyčajne nie bezvýznamné množstvo (1 - 50 %) zostane neovplyvnené s MAP.

V raných dobách produkcie rekombinantných farmaceutických proteínov v bakteriálnych bunkách sa jednoducho vkladal štartovací kodón ATG kódujúci metionín pred otvorený čítací rámec (ORF) pre maturovaný proteín (t. j. bez signálnej sekvencie alebo iného predĺženia N-konca). Exprimovaný proteín potom mal sekvenciu H₂N-Met-cieľový proteín. Len v niekoľkých prípadoch bolo možné dosiahnuť úplné odštiepenie Nkoncového metionínu MAP hostiteľa. Väčšina proteínov pripravovaných týmto spôsobom bola teda buď nehomogénna na svojom N-konci (išlo o zmes Met-formy a formy bez Met), alebo mali všetky molekuly dodatočnú cudzorodú aminokyselinu (Met) na svojom N-konci (len Met-forma).

Táto nehomogenita alebo odchýlka od prírodnej sekvencie je však v mnohých prípadoch neprijateľná, pretože také produkty často vykazujú odlišné imunologické (napr. indukcia protilátok) a farmakologické vlastnosti (biologický polčas, farmakokinetika). Z týchto dôvodov je teraz väčšinou potrebné produkovať prírodné identické produkty (homogénne a bez cudzorodej aminokyseliny na N-konci). V prípade cytoplazmatickej expresie je nápravou spravidla fúzia štiepnej sekvencie (leader sekvencie) pre špecifickú endopeptidázu (napr. faktor Xa, enterokináza, KEX endopeptidázy, IgA proteáza) alebo aminopeptidázu (napr. dipeptidylaminopeptidáza) na N-koniec cieľového proteínu. Avšak toto predstavuje ďalší krok s vynaložením ďalších nákladov a materiálu pri nasledujúcom (tzv. downstream) spracovaní produktu.

Takže existuje stála potreba nových spôsobov prípravy cieľového proteínu v bakteriálnych bunkách, kedy by bol pripravený cieľový proteín s požadovaným uniformným N-koncom bez potreby ďalších in vitro krokov (nové zvinutie, purifikácia, štiepenie proteázou, nová purifikácia atď.). Práve taký spôsob, využívajúci vírusovú autoproteázu N^pro z pestivírusu, je predmetom predkladaného vynálezu.

Pestivírusy tvoria skupinu patogénov, ktoré spôsobujú značné ekonomické straty v chovoch ošípaných a prežúvavcov v celom svete. Obzvlášť významným patogénom je klasický vírus horúčky prasiat (CSFV, Clasical swine fever vírus), ktorý spôsobuje prenosné ochorenie a podlieha teda ohlasovacej povinnosti. Straty spôsobené vírusom hnačky hovädzieho dobytka (BVDV, bovine viral diarrhoea vírus) sú tiež značné, hlavne z dôvodov pravidelného výskytu intrauterinnej infekcie plodov.

Pestivírusy sú malé obalové vírusy, ktorých genóm s veľkosťou 12,3 kb pôsobí priamo ako mRNA, z ktorej sú v cytoplazme transkribované vírusové produkty. K tomu dochádza vo forme jediného polyproteínu, ktorý obsahuje približne 4000 aminokyselín a ktorý je naštiepený vírusovými a bunkovými proteázami na 12 zrelých proteínov.

Do dneška boli identifikované pri pestivírusoch dve proteázy kódované vírusom, a to autoproteáza N^pro a serínová proteáza NS3. N-koncová proteáza N^pro je lokalizovaná na N-konci polyproteínu a má zjavnú molekulovú hmotnosť 23 000 (D). Katalyzuje štiepenie, ku ktorému dochádza medzi jej vlastným C-koncom (Cysl68) a N-koncom (Serl69) nukleokapsidového proteínu C (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088 - 7095). Navyše duplikácie génu N^pro boli opísané pri cytopatogénnych vírusoch BVDV. V nich je druhá kópia N^pro na N-konci podobne duplikovanej NS3 proteázy. Autoproteolytické štiepenie proteínu N^proNS3 bolo pozorované aj v tomto prípade (R. Stark et al., pozri už uvedené).

N^pro je autoproteáza s dĺžkou 168 aminokyselín (aa) a zjavnou M_r 20 000 (D) (in vivo). Je prvým proteínom v polyproteíne pestivírusov (ako je napr. CSFV, BVDV alebo BDV (border disease vírus)) a podlieha autoproteolytickému odštiepeniu od nasledujúceho nukleokapsidového proteínu C (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508 - 4514; Stark et al., J. Virol 67 (1993), 7088 - 7095). Toto štiepenie sa uskutočňuje za poslednou aminokyselinou sekvencie N^pro, t. j. Cys 168.

Podstata vynálezu

V súčasnosti sa prekvapivo zistilo, že autoproteolytická funkcia autoproteázy N^pro pestivírusu je zachovaná v bakteriálnom expresnom systéme, predovšetkým pri expresii heterológnych proteínov. Predkladaný vynález sa teda týka spôsobu výroby požadovaného heterológneho polypeptidu s jasne definovaným N-koncom v bakteriálnej hostiteľskej bunke, pričom požadovaný heterológny polypeptid je autoproteolytickou aktivitou N^pro odštiepený z fúzneho proteínu exprimovaného na začiatku, ktorý obsahuje peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestivírusu a heterológny polypeptid. Predkladaný vynález sa ďalej týka prostriedkov klonovania, ktoré sa používajú pri spôsoboch podľa vynálezu.

Polypeptidom s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestivírusu alebo polypeptidom s autoproteolytickou funkciou autoproteázy N^pro pestivírusu je predovšetkým autoproteáza N^pro pestivírusu alebo jej derivát s autoproteolytickou aktivitou.

V predkladanom vynáleze termín heterológny polypeptid znamená polypeptid, ktorý nie je prirodzene odštiepovaný autoproteázou N^pro pestivírusu z fúzneho proteínu alebo polyproteínu vyskytujúceho sa v prírode. Medzi príklady heterológnych polypeptidov patria enzýmy alebo polypeptidy s farmaceutickou aktivitou, predovšetkým farmaceutickou aktivitou u človeka.

Medzi príklady výhodných polypeptidov s humánnou farmaceutickou aktivitou patria cytokíny, ako sú interleukíny, napr. IL-6, interferóny, ako sú leukocytárne interferóny, napr. interferón a2B, rastové faktory, hlavne rastové faktory zúčastňujúce sa na hematopoéze alebo hojení rán, ako sú napr. G-CSF, erytropoetín alebo IGF, hormóny, ako je napr. humánny rastový hormón (hGH), protilátky alebo vakcíny.

Jeden aspekt predkladaného vynálezu sa týka molekuly nukleovej kyseliny, ktorá kóduje fúzny proteín, pričom tento fúzny proteín obsahuje prvý polypeptid, ktorý má autoproteolytickú aktivitu autoproteázy N^pro pestivírusu a druhý polypeptid, ktorý je spojený s prvým polypeptidom na C-konci prvého polypeptidu takým spôsobom, že druhý polypeptid môže byť odštiepený z fúzneho proteínu autoproteolytickou aktivitou prvého polypeptidu a pritom druhý polypeptid je heterológny polypeptid.

Pestivírus je na účely vynálezu výhodne vybratý zo skupiny obsahujúcej CSFV, BDV a BVDV, obzvlášť výhodný je CSFV.

Výhodná molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu je taká molekula, v ktorej prvý polypeptid fúzneho proteínu obsahuje nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu autoproteázy N^pro z CSFV (pozri tiež sekvenciu s prístupovým číslom X87939 v databáze EMBL) (aminokyseliny 1 až 168, čítanie v smere od N-konca do C-konca).

(l)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTL RDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGS DGKLYHIYVC VDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-( 168), alebo aminokyselinovú sekvenciu jej derivátu, ktorý má autoproteolytickú aktivitu.

Derivátmi s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestivírusu sú autoproteázy N^pro pripravené mutagenézou, predovšetkým použitím substitúcií, delécii, adícií a/alebo inzercií aminokyselín, pokiaľ je zachovaná požadovaná autoproteolytická aktivita, hlavne na vytváranie požadovaných proteínov s homogénnym N-koncom. Spôsoby prípravy takých derivátov mutagenézou sú odborníkom známe. Takými mutáciami je možné optimalizovať aktivitu autoproteázy N^pro, napr. vo vzťahu k rôznym heterológnym proteínom, ktoré majú byť štiepené. Po príprave nukleovej kyseliny, ktorá kóduje fúzny proteín, ktorý okrem požadovaného heterológneho proteínu obsahuje derivát autoproteázy N^pro vykazujúci jednu mutáciu alebo viac mutácií vzhľadom na autoproteázu N^pro vyskytujúcu sa v prírode, sa určí, či je požadovaná funkcia prítomná, stanovením autoproteolytickej aktivity v expresnom systéme.

Autoproteolytická aktivita môže byť napr. na začiatku detekovaná v systéme in vitro. Na tento účel je DNA konštrukt transkribovaný do RNA, a potom translatovaný do proteínu pomocou súpravy na in vitro transláciu. Na zvýšenie citlivosti môže byť v niektorých prípadoch výsledný proteín označený inkorporáciou rádioaktívnych aminokyselín. Výsledný fúzny proteín N^pro - cieľový proteín je podrobený kotranslačnému a/alebo posttranslačnému autokatalytickému štiepeniu, keď nastane presné odštiepenie N-koncového N^pro úseku od zvyšku proteínu jeho vlastnou autoproteolytickou aktivitou. Výsledné produkty štiepenia je možné ľahko detekovať a zmes sa môže ľahko spracovať ihneď po skončení in vitro translácie. Zmes sa nanesie na gél na analýzu proteínov (SDS-PAGE podľa Lämmliho) a podrobí sa elektroforéze. Potom sa gél zafarbí vhodnými farbivami alebo sa uskutoční autorádiografia. Analýza s použitím Western prenosu (Western blot) s nasledujúcim imunofarbením je tiež možná. Účinnosť štiepenia fúzneho proteínu môže byť vyhodnotená na základe intenzity výsledných proteínových pásov.

V ďalšom kroku fragment nukleovej kyseliny pre fúzny proteín môže byť klonovaný do bakteriálneho expresného vektora (pokiaľ sa to už neuskutočnilo kvôli in vitro translácii) a ten je potom transformáciou vnesený do vhodného hostiteľa (napr. E. coli). Vzniknutý expresný kmeň exprimuje fúzny proteín buď konštitutívne, alebo po pridaní induktora. V prípade použitia induktora je potrebné hostiteľa po pridaní induktora ďalej kultivovať 1 hodinu až viac hodín, aby sa dosiahol dostatočný titer produktu. N^pro autoproteáza potom sama štiepi ko- alebo posttranslačne fúzny proteín, takže výslednými fragmentárni sú samotná N^pro autoproteáza a samotný cielový proteín s definovaným N-koncom. Na stanovenie účinnosti štiepnej reakcie je na konci kultivácie alebo indukčnej fázy odobratá vzorka analyzovaná SDS-PAGE, ako už bolo opísané.

Výhodný derivát autoproteázy N^pro opisovaného fúzneho proteínu má napr. N-koncový úsek, kde bola jedna aminokyselina alebo niekoľko aminokyselín deletovaných alebo substituovaných v úseku aminokyselín 2 až 21, pokiaľ vzniknutý derivát naďalej vykazuje autoproteolytickú funkciu autoproteázy N^pro v požadovanom rozsahu. Výhodný derivát autoproteázy N^pro vo fúznom proteíne obsahuje napr. aminokyselinovú sekvenciu autoproteázy N^pro z CSFV s deléciou aminokyselín 2 až 16 alebo 2 až 21. Tiež je možné prostredníctvom substitúcie alebo adície aminokyselín zmeniť alebo vložiť aminokyselinovú sekvenciu, napr. sa vnesie aminokyselinová sekvencia, ktorá uľahčuje purifikáciu (pozri príklady).

Obzvlášť výhodnou molekulou nukleovej kyseliny podľa vynálezu je taká, kde prvý polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu Glu22 až Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV alebo jej derivát s autoproteolytickou aktivitou, pričom prvý polypeptid má okrem toho Met ako N-koniec a heterológny polypeptid je napojený priamo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV.

Podobne výhodná molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu je taká, kde prvý polypeptid obsahuje aminokyselinovú sekvenciu Prol7 až Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV alebo jej derivát s autoproteolytickou aktivitou, pričom prvý polypeptid má okrem toho Met ako N-koniec a heterológny polypeptid je napojený priamo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV.

Molekula nukleovej kyseliny podľa vynálezu je predovšetkým vo forme molekuly DNA.

Predkladaný vynález sa ďalej týka klonovacích elementov, predovšetkým expresných vektorov a hostiteľských buniek, ktoré obsahujú molekulu nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu. Vynález sa ďalej týka expresného vektora, ktorý je kompatibilný s dopredu definovanou bakteriálnou hostiteľskou bunkou a ktorý obsahuje aspoň jednu sekvenciu na kontrolu expresie. Sekvenciami na kontrolu expresie sú predovšetkým promótory (napr. lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL alebo phoA), väzbové miesta ribozómov (napr. prirodzené väzbové miesta ribozómov patriace medzi už spomínané promótory, cro alebo syntetické väzbové miesta ribozómov) alebo terminátory transkripcie (napr. rrnB T1T2 alebo bla) . Hostiteľskými bunkami sú výhodne bakteriálne bunky z rodu Escherichia, hlavne E. coli. Avšak môžu byť použité aj iné bakteriálne bunky. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je expresným vektorom podľa vynálezu plazmid. Predkladaný vynález sa ďalej týka bakteriálnej hostiteľskej bunky, ktorá obsahuje expresný vektor podľa vynálezu. Také bakteriálne hostiteľské bunky môžu byť vybraté zo skupiny obsahujúcej nasledujúce mikroorganizmy: gram-negatívne baktérie z rodu Escherichia, hlavne E. coli alebo iné gram-negatívne baktérie, napr. Pseudomonas sp., ako je napr. Pseudomonas aeruginosa, alebo Caulobacter sp., ako je napr. Caulobacter crescentus, alebo gram-pozitívne baktérie, ako sú baktérie z rodu bacillus sp., hlavne Bacillus subtilis. Obzvlášť výhodnými hostiteľskými bunkami sú E. coli.

Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu výroby požadovaného heterológneho polypeptidu, ktorý obsahuje kroky:

(i) kultivácie bakteriálnych hostiteľských buniek podľa vynálezu, ktoré obsahujú expresný vektor podľa vynálezu, ktorý obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa vynálezu, pričom kultivácia prebieha v podmienkach, ktoré spôsobujú expresiu fúzneho proteínu a ďalej autoproteolytické odštiepenie heterológneho polypeptidu z fúzneho proteínu v hostiteľskej bunke autoproteolytickou aktivitou prvého polypeptidu, a (ii) izolácie odštiepeného heterológneho polypeptidu.

Spôsob podľa vynálezu sa uskutočňuje v princípe počiatočnou kultiváciou bakteriálnych hostiteľských buniek, t. j. expresného kmeňa týchto buniek, zvyčajným mikrobiologickým spôsobom, ktorý je odborníkovi známy. Kmeň je kultivovaný z jednej východiskovej kolónie na živnom médiu, ale je tiež možné použiť ako východiskový materiál kryoprezervovanú suspenziu buniek (bunkové banky). Kmeň sa všeobecne kultivuje v niekoľko stupňovom procese, aby sa získala dostatočná biomasa na ďalšie spracovanie.

V malom meradle prebieha kultivácia v pretrepávaných kultivačných fľašiach, vo väčšine prípadov sa môže použiť úplné médium (napr. LB živné médium). Môže sa však použiť aj špecificky definované médium (napr. citrátové médium). Na kultiváciu sa pripraví maloobjemová prekultúra hostiteľského kmeňa (inokulovaná jedinou kolóniou alebo kryoprezervovanou bunkovou suspenziou), teplota pri tejto kultivácii zvyčajne nie je kritická pre neskoršie výsledky expresie, takže sa rutinne uskutočňuje pri vyšších teplotách (napr. 30 °C alebo 37 °C). Hlavná kultúra sa nasadí vo väčšom objeme (napr. 500 ml), kde je predovšetkým nutné zaistiť dobré prevzdušnenie (veľký objem kultivačnej fľaše oproti objemu obsahu, vysoká rýchlosť rotácie). Vzhľadom na úmysel dosiahnuť expresiu v rozpustnej forme, hlavná kultúra sa vo väčšine prípadoch uskutočňuje pri trochu nižších teplotách (napr. 22 alebo 28 °C). Tak indukovateľné systémy (napr. s promótormi trp, lac, tac alebo phoÁ), ako konštitutívne systémy sú vhodné na produkciu rozpustných proteínov. Po tom, ako sa dosiahla neskorá logaritmická fáza (zvyčajne pri optickej hustote 0,5 až 1,0 v pretrepávaných fľašiach), sa v indukovateľných systémoch pridá induktor (napr. indolylakrylová kyselina, izopropyl-3-D-tiogalaktopyranozid = IPTG) a inkubácia pokračuje ďalej 1 až 5 hodín. Koncentrácia induktora sa v tokom prípade volí v spodnej hranici, aby sa dosiahla mierna expresia. V priebehu tejto doby sa vytvorí väčšina fúzneho proteínu N^pro - cieľový proteín, pričom súčasne nastane ko- alebo posttranslačné odštiepenie úseku N^pro, takže na konci kultivácie v kultivačnom systéme existujú dva odštiepené úseky samostatne. Bunky sa môžu zobrať a ďalej spracovať.

Vo veľkom meradle viacstupňový kultivačný proces prebieha v rade bioreaktorov (fermentorov), pričom je výhodné použiť definované živné médiá, aby bolo možné zlepšiť ovládanie a kontrolu procesu. Okrem toho je možné významne zvýšiť nárast biomasy a tvorbu produktu dávkovaním určitých živín (kŕmna dávka). Inak je proces analogický procesu v malom meradle v pretrepávaných fľašiach. Tak napr. sa použije fermentor na predbežnú fázu a fermentor na hlavnú fázu a zvolia sa kultivačné teploty zhodné s teplotami pri kultivácii vo fľašiach. Do fermentora na predbežnú fázu je inokulované inokulum, ktoré sa vypestuje z jedinej kolónie alebo z kryokultúry v kultivačnej fľaši. Vo fermentore je tiež potrebné zaistiť dobré prevzdušňovanie a prítomnosť dostatočnej koncentrácie induktora, obzvlášť v hlavnej fáze. Indukčná fáza však musí byť niekedy inej dĺžky ako indukcia v kultivačnej fľaši. Výsledné bunky sa potom použijú na ďalšie spracovanie.

Heterológny cieľový proteín, ktorý bol odštiepený z fúzneho proteínu, môže byť izolovaný metódami purifikácie proteínov, ktoré sú odborníkom známe (pozri napr. M. P. Deutscher, in: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309 - 392). Postup purifikácie zvyčajne obsahuje kroky rozrušenia buniek, prečistenia média (centrifugáciou alebo mikrofiltráciou), a potom rôzne kroky chromatografie, filtrácie a precipitácie.

Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu predkladaného vynálezu bez toho, že by akokoľvek obmedzovali jeho rozsah.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Expresia a in vivo štiepenie fúzneho proteínu N^pro-C v bakteriálnom hostiteľovi

Plazmid NPC-pET bol konštruovaný na expresiu N^pro-C fúzneho proteínu v bakteriálnom hostiteľovi. Použitým expresným vektorom bol vektor pETlla (F. W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60 - 89). Prírodný štruktúrny gén (z RNA genómu CSFV) pre N^pro-C fúzny proteín bol klonovaný do tohoto expresného vektora. Štruktúrny gén pre fúzny proteín bol pripravený PCR amplifikáciou z vírusového genómu, ktorý bol transkribovaný do cDNA (a klonovaný do vektora). Navyše prvých 16 aminokyselín prírodnej N^pro-sekvencie (MELNHFELLYKTSKQK) bolo nahradených oligo-histidínovým úsekom dlhým 10 aminokyselín, napomáhajúcim purifikácii (MASHHHHHHH). Výsledný konštrukt bol označený NPC-pET. Sekvencie úseku N^pro a autoproteolytické štiepne miesto fúzneho proteínu N^pro-C kódované NPC-pET majú nasledujúcu štruktúru, kde štiepne miesto je lokalizované medzi aminokyselinami Cysl68 a Ser (169):

MASHHHHHHHFVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCR SGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVC VDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC(168)S(169)DDGAS-(nukleokapsidový protein C).

V tejto sekvencii je prolín 17 (poloha 2 fúzneho proteínu) z prírodnej N^pro sekvencie označený kurzívou a začiatok C sekvencie je označený tučné. Fúzny protein má M_r približne 32 000 (D), kde po autoproteolytickom štiepení úsek N^pro zodpovedá asi 18 000 (D) a úsek C zodpovedá asi 14 000 (D).

Aby bolo možné zhodnotiť význam prvej aminokyseliny C-koncovo od štiepneho miesta, prirodzene sa vyskytujúci serín 169 v tejto polohe bol nahradený postupne každou z 19 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín cielenou mutagenézou. Takto pripravené konštrukty boli označené ako NPC-pET-Ala, NPC-pETGly atď. Z týchto plazmidov potom boli pripravené expresné kmene.

Kmeň Escherichia coli BL21(DE3) bol použitý ako Escherichia coli hostiteľský kmeň na expresiu fúzneho proteínu N^pro-C. Tento kmeň mal nasledujúci genotyp:

E. coli B F dem ompT hsdS(r_bm_b) gal λ(ΌΕ3)

Kmeň bol pripravený z komerčne dostupných kompetentných buniek (Stratagene). Nesie lyzogénny fág lambda, v genóme ktorého je gén pre T7 RNA polymerázu riadený promótorom lacUV5. Produkcia T7 RNA polymerázy a teda aj cieľového proteínu môže byť indukovaná izopropyl-|i-D-tiogalaktopyranozidorn (IPTG). Tento dvojfázový systém dovoľuje vysoko špecifickú a veľmi vysokú expresiu mnohých cieľových proteínov.

Expresné kmene BL21(DE3) [MPC-pET], BL21(DE3) [MPC-pET-Ala] atď. boli pripravené transformáciou príslušných expresných plazmidov do BL21(DE3). Transformácia sa uskutočnila podľa inštrukcií výrobcu kompetentných buniek (Stratagene alebo Novagen). Transformačná zmes bola nanesená na platne s Luriovým agarom obsahujúcim 100 mg/1 ampicilínu. Transformácia po inkubácii cez noc pri teplote 37 °C poskytla niekoľko klonov.

Stredne veľké kolónie s odlíšiteľnými okrajmi boli odobraté a stali sa základom pre príslušné expresné kmene. Klony boli kultivované, a potom konzervované v kryoampulách pri teplote -80 °C (hlavná bunková banka, MCB, master celí bank). Na bežnú dennú prácu bol kmeň vždy nanesený na platňu s Luriovým agarom (obsahujúcim ampicilín).

Jednotlivý kmeň bol použitý na inokuláciu predkultúry v pretrepávanej kultivačnej fľaši z jedinej kolónie na agarovej platni. Alikvot predkultúry bol použitý na inokuláciu hlavnej kultúry (10 až 200 ml v pretrepávanej kultivačnej fľaši) a tá bola potom kultivovaná až do dosiahnutia OD₆₀o 0,5 až 1,0. Produkcia fúzneho proteínu potom bola indukovaná s 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrácia). Kultúry boli ďalej kultivované 2 až 4 hodiny, pokiaľ nebolo dosiahnuté Od₆₀o 1,0 až 2,0. Kultivačná teplota bola 30 °C +/- 2 °C a použilo sa médium LB + 2 g/1 glukózy +100 mg/1 ampicilín.

Vzorky boli z kultúr odobraté pred indukciou a v rôznych časových intervaloch po indukcii, centrifugované a pelety boli denaturované povarením vo vzorkovom pufri a potom analyzované pomocou SDS-PAGE a Coomassie farbením alebo Western prenosom (Western blot). Vzorky sa odoberali pri štandardizovaných podmienkach a rozdiely v hustote kultúr boli kompenzované objemom nanášacieho pufra použitého na resuspendovanie vzorky.

Pásy, ktoré sa objavili po indukcii, boli lokalizované mierne nad 20 000 (D) (zodpovedá N^pro) a približne 14 000 (D) (zodpovedá C). Účinnosť štiepenia fúzneho proteínu v každom konštrukte bola stanovená na základe intenzity pásov na géli zafarbenom s Coomassie modrou a potom podľa Western blotu. Zistilo sa, že väčšina aminokyselín bola tolerovaná v polohe bezprostredne susediacej C-koncovo so štiepnym miestom (t. j. na N-konci cieľového proteínu), tzn. že dochádzalo k veľmi účinnému autoproteolytickému štiepeniu.

Tieto dáta ukazujú, že je možné v princípe úspešne využiť autoproteolytickú aktivitu autoproteázy N^pro na špecifické štiepenie rekombinantného fúzneho proteínu v bakteriálnej hostiteľskej bunke.

Príklad 2

Expresia a in vivo štiepenie fúzneho proteínu N^pro a humánneho interleukínu 6 (hIL6) na produkciu homogénneho zrelého hIL6

Plazmid NP6-pET bol konštruovaný na expresiu fúzneho proteínu N^pro-hIL6. Ako expresný vektor bol použitý pETlla (F. W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60 - 89). Najskôr bol do expresného vektora klonovaný fúzny protein pozostávajúci z N^pro a nukleokapsidového proteínu CSFV (pozri Príklad 1). Štruktúrny gén pre fúzny protein bol pripravený PCR. To umožnilo nahradiť prvých 16 aminokyselín prírodnej sekvencie N^pro (MELNHFELLYKTSKQK) 10 aminokyselín dlhou oligo-histidínovou sekvenciou (MASHHHHHHH) napomáhajúcou purifikácii.

Štiepne miesto Spel bolo vnesené do výsledného expresného plazmidu v mieste spojenia medzi N^pro a nukleokapsidovým proteínom cielenou mutagenézou. To umožnilo deletovať štruktúrny gén pre nukleokapsidový protein z vektora reštrikciou Spel na 5'-konci (zodpovedá N-koncu proteínu) a Xhol na 3'-konci (zodpovedá C-koncu proteínu). Zodpovedajúci línearizovaný vektor N^pro-pETlla bol oddelený od fragmentu nukleokapsidového génu preparatívnou gélovou elektroforézou. Potom bolo možné vložiť štruktúrny gén hIL6 prostredníctvom lepivých koncov Spel a Xhol.

Boli potrebné nasledujúce prípravné práce. Štruktúrny gén bol amplifikovaný pomocou vysoko presného systému PCR (napríklad Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup bol uskutočnený podľa pokynov výrobcu) hIL6 cDNA klonu, ktorý je možné získať z buniek C10-MJ2. Na tento účel boli použité nasledujúce oligonukleotidy:

Oligonukleotid 1 (N-koncový):

5'-ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG-3'

Oligonukleotid 2 (C-koncový):

5'-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC-3'

Pomocou týchto oligonukleotidov sa vnieslo štiepne miesto Spel na 5'-koniec a štiepne miesto Xhol bolo vnesené na 3'-koniec. Navyše bol na 3'-koniec štruktúrneho génu vložený dvojitý stop kodón ochre (TAATAA) kvôli účinnej terminácii translácie. Štiepne miesto Spel na prednom konci dovoľuje ligáciu v zhode s čítacím rámcom vektora N^pro-pETlla už opísaného. Štiepne miesto Xhol na zadnom konci umožňuje priame klonovanie.

Sekvencia PCR fragmentu (593 bp) so štruktúrnym génom hIL6 je tu ďalej uvedená (čítaná v smere od N-konca do C-konca), pričom reštrikčné miesto je podčiarknuté a prvý kodón hIL6 (Ala) a stop kodón sú vyznačené tučným písmom:

ATAATTACTAGTTGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCACACA

GACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATCTC

AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTGG

CAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTCA

ATGAGGAGACTTGCCTGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTA

CCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGT

CCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAAC

CACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAAC

TCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGT

AATAACTCGAGGATCCAATTAT

Konštrukt pripravený ligáciou s plazmidom N^pro-pETl la bol nazvaný NP6-pET.

Ďalej je uvedená sekvencia N^pro-hIL6 fúzneho proteínu (347 aminokyselín, z ktorých 162 aminokyselín tvorí N^pro a 185 aminokyselín tvorí hIL6), kódovaného NP6-pET, pričom sekvencia hIL6 je vyznačená hrubým písmom:

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCR

SGNHFGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPFEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKFYHIYVC

VDGCIFFKFAKRGTPRTFKWIRNFTNCPFWVTSCAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQI

RYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLE

FEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQ

WLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM

Fúzny proteín má M_r 39 303,76 (D) v redukovanom stave a po prípadnom odštiepení úseku N^pro (redukovaný) by mal Mr 18 338,34 (D) a úsek hIF6 (redukovaný) by mal 20 983, 63 (D). N^pro obsahuje šesť cysteínov a hIF6 štyri. Je pravdepodobné, že v bakteriálnej cytoplazme sú tieto cysteíny väčšinou v redukovanej forme. V priebehu ďalšieho opracovania dochádza pravdepodobne aspoň k čiastočnému vytvoreniu disulfidických mostíkov. Potrebné je očakávať, že N-koncový metionín vo fúznom proteíne (alebo časti N^pro) je väčšinou štiepený metionínaminopeptidázou (MAP) vlastnou hostiteľovi, čo by redukovalo Mr približne o 131 (D) na 39 172,76 (D) (fúzny proteín) a 18 207, 13 (D) (N^pro).

Hostiteľský kmeň Escherichia coli na expresiu fúzneho proteínu N^pro-hIF6 je Escherichia coli BL21(DE3) (pozri príklad 1).

Expresný kmeň BF21(DE3) [MP6-pET] bol pripravený transformáciou už opísaného expresného plazmidu MP6-pET do BF21(DE3), ako bolo opísané v príklade 1.

Kmeň BF21(DE3) [MP6-pET] bol inokulovaný z jedinej kolónie na agarovú platňu, ktorá potom bola použitá na inokuláciu predkultúr do FB média (Fúria Broth) obsahujúceho 100 mg/1 ampicílínu (200 ml v 1 1 kultivačnej fľaši s miešacími priehradkami). Predkultúra sa pretrepávala pri 250 rpm a teplote 30 °C počas 14 hodín až do dosiahnutia OD₆₀o približne 1,0. 10 ml alikvóty preakultúry boli použité na inokuláciu hlavnej kultúry (330 ml Luria Broth vil kultivačnej fľaši s miešacími priehradkami) (3 % inokulum). Hlavné kultúry sa udržiavali pri 30 °C (250 rpm) do dosiahnutia OD₆₀o 0,8, a potom bola produkcia fúzneho proteínu indukovaná s 0,5 alebo 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrácia). Kultúry sa ďalej kultivovali pri teplote 30 °C a 250 rpm počas 3 hodín, OD₆₀o dosiahla približne 1,0 až 2,0.

Potom boli kultúry prenesené do sterilných 500 ml centrifugačných kyviet a centrifugované 30 minút pri 10 000 g. Supernatant bol úplne odstránený a pelety boli zmrazené pri -80 °C až do ďalšieho spracovania.

Výskyt nových proteínových pásov v úplnom lyzáte sa ľahko detekoval Coomassie farbením po uskutočnení SDS-PAGE. Pásy v lyzáte BL21(DE3) [MP6-pET] zodpovedali zjavnej molekulovej hmotnosti približne 19 000 (D), 21 000 (D) a 4 000 (D). Analýzy expresie s použitím protilátok anti-hIL6 v základe potvrdili výsledky získané Coomassie farbením.

Na optimalizáciu N^pro-hIL6 štiepenia bola uskutočnená indukcia pri rôznych teplotách a koncentráciách IPTG a výsledné produkty boli analyzované farbením gélov a Western blotom. Takmer úplné štiepenie N^proIL6 bolo pozorované pri kultivácii pri teplote 22 °C.

Tento experiment tiež ukázal, že heterológne proteíny sa môžu fúzovať k C-koncu N^pro v bakteriálnom expresnom systéme, kde dochádza k veľmi účinnému štiepeniu. Zmena N-koncovej aminokyseliny nasledujúceho proteínu (alanín namiesto serínu) tiež nemá žiadny nepriaznivý účinok. Tento systém podľa predkladaného vynálezu je teda vhodný na produkciu rekombinantných proteínov s homogénnym autentickým Nkoncom, hlavne v heterológnom expresnom systéme, ako je napr. bakteriálny expresný systém, bez nutnosti ďalších krokov spracovania.

Príklad 3

Expresia a in vivo štiepenie fúzneho proteínu pozostávajúceho z N^pro a humánneho interferónu a2B (IFNoť2B) na produkciu homogénneho zrelého IFNa2B

Postup klonovania IFNoť2B až po prípravu vektora NPI-pET zodpovedal postupu použitému pri hIL6 v príklade 2. Štruktúrny gén bol amplifikovaný PCR s vysokou presnosťou (napríklad Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup podľa pokynov výrobcu). Ako templát sa použil IFNoť2B-cDNA kloň, ktorý bol pripravený z humánnych leukocytov štandardným postupom odborníkom známym. Alternatívnou možnosťou by bolo uskutočnenie syntézy úplného génu. Sekvenciu štruktúrneho génu je možné získať v elektronickej forme z databázy Genbank pod prístupovým číslom V00548. Na amplifikáciu sa použili nasledujúce oligonukleotidy:

Oligonukieotid 1 (N-koncový):

5'-ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC-3'

Oligonukieotid 2 (C-koncový):

5'-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G-3'

Sekvencia PCR fragmentu (533 bp) so štruktúrnym génom IFNoť2B je uvedená nižšie. Štiepne miesta pre reštrikčné enzýmy sú podčiarknuté a prvý kodón IFNoť2B (Cys) a stop-kodón sú vyznačené tučným písmom:

ATAATTACTAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGC

TCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATT

TCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATG

ATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCC

TAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGG

GGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTT

CCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGA

GCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAAT

AATAACTCGAGGATCCAATTAT

Konštrukt pripravený ligáciou s plazmidom N^pro-pETl la bol označený NPI-pET.

Sekvencia fúzneho proteínu N^pro-IFNa2B (celkovo 327 aminokyselín, z toho 162 aminokyselín je N^pro a 165 aminokyselín je IFNa2B) kódovaného NPI-pET je uvedená ďalej, pričom sekvencia IFNa2B je vyznačená tučným písmom (znázornená v smere od N-konca k C-koncu):

MASHHHHHHHFVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSG

NHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCI

LLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHD

FGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEAC

VIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRS

KE

Fúzny proteín má M_r 37 591,44 (D) v redukovanom stave a po možnom rozštiepení by N^pro časť (redukovaná) mala Mr 18 338, 34 (D) a IFNa2B časť (redukovaná) by mala 19 271,09 (D). N^pro má šesť cystínových zvyškov a IFNa2B má štyri. Je pravdepodobné, že tieto cysteínové zvyšky sú v bakteriálnej cytoplazme z väčšej časti v redukovanom stave. V priebehu nasledujúceho opracovania pravdepodobne dochádza k aspoň čiastočnému vytváraniu disulfidických mostíkov. Nutné je počítať s tým, že N-koncový metionín vo fúznom proteíne (alebo v časti N^pro) je väčšinou odštiepený metionínaminopeptidázou (MAP) vlastnou hostiteľovi, čo by znížilo Mr o 131 (D) na 37 460, 23 (D) (fúzny proteín) a 18 207, 13 (D) (N^pro).

Hostiteľským kmeňom Escherichia coli na expresiu fúzneho proteínu N^pro-IFNa2B bol Escherichia coli BL21(DE3) (pozri Príklad 1).

Expresný kmeň BL21(DE3) [NPI-pET] bol pripravený transformácioú už opísaného expresného plazmidu NPI-pET do BL21(DE3), ako bolo opísané v príklade 1.

Kmeň BL21(DE3) [NPI-pET] bol inokulovaný z jedinej kolónie na agarovú platňu, ktorá bola potom použitá na inokuláciu predkultúr do LB média (Luria Broth) obsahujúceho 100 mg/1 ampicilínu (200 ml v 1 1 kultivačnej fľaši s miešacími priehradkami). Predkultúra bola pretrepávaná pri 250 rpm a 30 °C počas 14 hodín až dosiahla OD₆₀o približne 1,0. 10 ml alikvóty predkultúry bolo použitých na inokuláciu hlavnej kultúry (330 ml Luria Broth vil kultivačnej flaši s miešacími priehradkami) (3 % inokulum). Hlavné kultúry sa udržovali pri 30 °C (250 rpm) do dosiahnutia OD₆₀o 0,8, a potom bola produkcia fúzneho proteínu indukovaná s 0,5 alebo 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrácia). Kultúry boli ďalej kultivované pri 30 °C a 250 rpm počas 3 hodín, OD₆₀o dosiahla približne 1,0 až 2,0.

Potom boli kultúry prenesené do sterilných 500 ml centrifugačných kyviet a centrifugované 30 minút pri 10 000 g. Supematant bol úplne odstránený a pelety boli zmrazené pri -80 °C až do ďalšieho spracovania.

Výskyt nových proteínových pásov v kompletnom lyzáte bol ľahko detekovaný Coomassie farbením po uskutočnení SDS-PAGE. Pásy v lyzáte BL21(DE3) [MP6-pET] zodpovedali zjavnej molekulovej hmotnosti približne 38 000 (D) a 19 000 (D). Pás IFNoť2B nebolo možné technikou SDS-PAGE oddeliť od pásu N^pro.

Analýzy expresie s použitím protilátok anti-IFNoť2B potvrdili prítomnosť vyštiepeného pásu IFNa2B.

Na optimalizáciu štiepenia N^pr°-IFNoť2B sa tiež v tomto prípade uskutočnila indukcia pri rôznych teplotách a rôznych koncentráciách IPTG a výsledné produkty boli opäť analyzované farbením gélov a Western blotom. Tiež sa zistilo, že k úplnému štiepeniu došlo pri zníženej teplote (22 až 23 °C).

Claims (13)

1. Vektor na expresiu heterológnych proteínov v bakteriálnej hostiteľskej bunke zahrňujúci aspoň jednu sekvenciu riadiacu expresiu a molekulu nukleovej kyseliny kódujúcu fúzny proteín, pričom fúzny proteín zahrňuje prvý polypeptid, ktorým je autoproteáza N^pro z pestivírusu alebo jej derivát udržiavajúci si N^pro autoproteolytickú aktivitu, a zahrňuje druhý polypeptid, ktorým je heterológny polypeptid, a pričom druhý polypetid je naviazaný na C-koniec prvého polypeptidu takým spôsobom, že prvý polypeptid môže štiepiť druhý polypeptid z fúzie a vyštiepený druhý polypeptid má jasne definovaný homogénny N-koniec.

2. Expresný vektor podľa nároku 1, pričom pestivírus je vybraný zo skupiny obsahujúcej CSFV, BDV a BVDV.

3. Expresný vektor podľa nároku 2, pričom pestivírusom je CSFV.

4. Expresný vektor podľa nároku 3, pričom prvý polypeptid zahrňuje nasledujúcu sekvenciu aminokyselín: (l)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTL RDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGS DGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), alebo aminokyselinovú sekvenciu jeho derivátu udržiavajúci si autoproteolytickú aktivitu.

5. Expresný vektor podľa nároku 3, pričom prvý polypeptid zahrňuje aminokyselinovú sekvenciu Glu22 až Cysl68 z autoproteázy N^pro z CSFV alebo jej derivát udržiavajúci si autoproteolytickú aktivitu, pričom prvý polypeptid navyše má Met ako N-koniec, a pričom heterológny polypeptid je naviazaný priamo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV.

6. Expresný vektor podľa nároku 3, pričom prvý polypeptid zahrňuje aminokyselinovú sekvenciu Prol7 až Cysl68 z autoproteázy N^pro z CSFV alebo jej derivát udržiavajúci si autoproteolytickú aktivitu, pričom prvý polypeptid navyše má Met ako N-koniec a pričom heterológny polypeptid je naviazaný priamo na amino9 kyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV.

7. Expresný vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, pričom molekulou nukleovej kyseliny je molekula DNA.

8. Expresný vektor podľa nároku 1, pričom bakteriálnou hostiteľskou bunkou je bunka E. coli.

5

9. Expresný vektor podľa nárokov 1 alebo 8, pričom expresným vektorom je plazmid.

10. Bakteriálna hostiteľská bunka zahrňujúca vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.

11. Bakteriálna hostiteľská bunka podľa nároku 10, pričom hostiteľskou bunkou je bunka E. coli.

12. Spôsob produkcie požadovaného heterológneho polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky: (i) kultivácia bakteriálnej hostiteľskej bunky podľa nároku 10 alebo 11, pričom kultivácia sa

10 uskutočňuje v podmienkach, ktoré vedú k expresii fúzneho proteínu a k autoproteolytickému vyštiepeniu heterológneho polypeptidu z fúzneho proteínu v hostiteľskej bunke autoproteolytickou aktivitou prvého proteínu, a (ii) izolácia vyštiepeného heterológneho polypeptidu.

15 Koniec dokumentu