NO329246B1 - Fremgangsmate for fremstilling av proteiner ved autoproteolytisk spalting ved bruk av ekspresjonsvektor og bakterievertscelle - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket, heterologt polypeptid med en klart definert homogen N-terminal ende i en bakterievertscelle, der det ønskede heterologe polypeptid spaltes autoproteolytisk fra et initielt uttrykt fusjonsprotein som omfatter et peptid med den autoproteolytiske aktivitet til en autoprotease N<pro> av et pestivirus og det heterologe polypeptid ved den N<p>ro-autoproteolytiske aktivitet.

Ved fremstilling av rekombinante proteiner i heterologe organismer, slik som ekspresjon av humane eller andre eukaryote proteiner i bakterieceller, er det ofte vanskelig å oppnå en klart definert N-terminal ende som er så nær 100 prosent homogen som mulig. Dette gjelder i særdeleshet ved rekombinante, farmasøytiske proteiner der aminosyresekvensen i mange tilfeller må være identisk med aminosyresekvensen naturlig forekommende i menneske/dyr.

Ved naturlig ekspresjon, for eksempel hos mennesker, transporteres mange farmasøytiske proteiner som er i anvendelse inn i det ekstracellulære rom, og spalting av signalsekvensen tilstede i forløperproteinet for denne hensikt resulterer i en klart definert N-terminal ende. En slik homogen N-terminal ende er ikke alltid lett å fremstille, for eksempel i bakterieceller, av ulike årsaker.

Bare i sjeldne tilfeller er eksport til det bakterielle periplasma ved hjelp av en pro- eller eukaryot signalsekvens egnet, fordi det vanligvis er mulig å akkumulere bare svært små mengder av produktet her pga. den lave transportkapasiteten til det bakterielle eksportmaskineriet.

Imidlertid er bakteriecytoplasma betydelig forskjellig fra det ekstracellulære rom hos eukaryoter. På den ene siden er reduserende betingelser tilstede, og på den andre siden finnes det ikke noen mekanisme for spalting av N-terminale ledesekvenser for å danne modne proteiner. Syntesen av alle cytoplasmaproteiner starter med en metionin som spesifiseres av det passende startkodon (ATG = initiering av translasjon). Denne N-terminale metionin bibeholdes i mange proteiner, mens i andre spaltes den av ved metioninaminopeptidase (MAP) tilstede i cytoplasma og intrinsisk hos verten. Effektiviteten av spaltningen avhenger hovedsakelig av to parametre: 1. Egenskapene til den etterfølgende aminosyre, og 2. plasseringen av den N-terminale ende i den tredimensjonale strukturen til proteinet. Den N-terminale metionin fjernes fortrinnsvis når den etterfølgende aminosyre er serin, alanin, glysin, metionin eller valin og når den N-terminale ende er eksponert, dvs. ikke "gjemt" inni proteinet. På den annen side, dersom den etterfølgende aminosyre er en annen, i særdeleshet en ladet (glutaminsyre, asparginsyre, lysin, arginin), eller dersom den N-terminale ende er plassert inni proteinet, oppstår i de fleste tilfeller ingen spalting av den N-terminale metionin (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6. utg., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).

I det europeiske patentet 0 321 973 Bl beskrives et ekspresjonssystem som består av et plasmid kodende for et fusjonsprotein inneholdende en enzymatisk aktivitet som er protease 2A fra Rhinovirus, samt en polypeptidkomponent som kan spaltes av fusjonsproteinet ved autokatalyse.

Og selv om en aminosyre som fremmer spalting, er tilstede ved posisjon 2, er spaltingen sjelden fullstendig. Det er vanlig at en ikke ubetydelig andel (1-50 %) forblir uaffisert avMAP.

Ved produksjon av rekombinante, farmasøytiske proteiner i bakterieceller tidligere, var fremgangsmåten bare å sette et metioninkodende ATG-startkodon foran den åpne leseramme (ORF) for det modne (dvs. uten signalsekvens eller annen N-terminal forlengelse) protein. Det uttrykte protein hadde da sekvensen EfeN-Met-målprotein. Bare i noen fa tilfeller var det mulig å oppnå fullstendig spalting av det N-terminale metionin av det intrinsiske MAP hos verten. Det meste av proteinene produsert på denne måte er derfor enten inhomogene i forhold til deres N-terminale ende (blanding av Met-form og Met-fri form) eller de har alle en ytterligere fremmed aminosyre (Met) ved den N-terminale ende (bare Met-formen).

Denne inhomogenitet eller dette avvik fra den naturlige sekvens er imidlertid uakseptabel i mange tilfeller, fordi disse produktene ofte viser ulike immunologiske (for eksempel induksjon av antistoffdannelse) og farmakologiske (halveringstid, farmakokinetikk) egenskaper. Av disse årsaker er det nå nødvendig i de fleste tilfeller å fremstille et produkt identisk med det naturlige (homogent og uten fremmede aminosyrer ved den N-terminale ende). I tilfelle av cytoplasmisk ekspresjon, avhjelpes dette i de fleste tilfeller ved å fusere en spaltingssekvens (leder) for en spesifikk endopeptidase (for eksempel faktor Xa, enterokinase, KEX-endopeptidaser, IgA-protease) eller aminopeptidase (for eksempel dipeptidylaminopeptidase) til den N-terminale ende av målproteinet. Dette medfører imidlertid et ytterligere trinn, med forbruk av kostnader og materialer, nødvendig under ytterligere opparbeiding, den såkalte nedstrøms (downstream) prosessering, av produktet.

Følgelig er det et behov for en fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein i bakterieceller der intensjonen er at målproteinet kan fremstilles med en enhetlig, ønsket N-terminal ende uten ytterligere kompliserte in vitro trinn (tilbakefolding, rensing, proteasespaltning, gjentatt rensing etc). En slik fremgangsmåte som anvender virusautoproteasen N<pro> fra pestivirus er blitt utviklet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

Pestivirus utgjør en gruppe patogener som forårsaker store økonomiske tap i svine- og drøvtygger-næringen rundt om i verden. Som patogene til en bemerkelsesverdig overførbar sykdom er den klassiske svinefebervirussykdommen (CSFV) særlig viktig. Tapene forårsaket av bovint, viralt diarévirus (BVDV) er også betydelig, spesielt gjennom den normale forekomst av intrauterine infeksjoner hos fostere.

Pestivirus er små kappevirus med et genom som virker direkte som mRNA og er 12,3 kb i størrelse, og fra disse transkriberes de virale genprodukter i cytoplasma. Dette finner sted i form av et enkelt polyprotein som omfatter ca. 4000 aminosyrer og som brytes ned både av virus og av celleproteaser til ca. 12 modne proteiner.

Frem til nå er to viruskodete proteaser identifisert i pestivirus, autoproteasen N<pr0> og serinproteasen NS3. Den N-terminale protease N<pro> er lokalisert ved den N-terminale ende av polyproteinet og har en tilsynelatende molekylmasse på 23 kd. Den katalyserer en spaltning som finner sted mellom dens egen C-terminale ende (Cysl68) og den N-terminale (Serl69) til nukleokapsidproteinet C (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). I tillegg er duplikater av N<pro->genet beskrevet i cytopatogene BVDV-virus. I disse finnes det en annen kopi av N<pro> ved den N-terminale ende av den på samme måte dupliserte NS3-proteasen. En autoproteolytisk spaltning av N<pro->NS3-proteinet er også observert i dette tilfellet (R. Stark et al., se ovenfor).

T. Riimenapf et al., (Journal of virlogy, Mar. 1998,2544-2547) beskriver hvordan de 21 første aminosyrene i N<pro>kan deleteres uten at proteasen mister sin aktivitet.

N<pr0> er en autoprotease med en lengde på 168 aa og en tilsynelatende Mr på ca. 20 000 d i ( in vivo). Det er det første proteinet i polyproteinet til pestivirus (slik som CSFV, BDV

(border disease virus) eller BVDV) og gjennomgår autoproteolytisk spaltning fira det følgende nukleokapsid protein C (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514;

Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). Denne spaltning finner sted etter den siste

aminosyren i sekvensen til N<pro>, Cysl68.

i Muyelderman et al., (Virus Genes 13:2,135-142,1996) beskriver kloning og ekspresjor av p20/pl4 genene fra pestivirus, hvor p20 er et ikke strukturelt protein som har en autoproteolytisk aktivitet.

Det er nå overraskende blitt funnet innenfor rammen ifølge oppfinnelsen, at den autoproteolytiske funksjon til en autoprotease N<pro> av et pestivirus bibeholdes i bakterieekspresjonssystemet, i særdeleshet ved ekspresjon av heterologe proteiner. Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket heterologt polypeptid med en klart definert homogen N-terminale ende i en bakterievertscelle, der det ønskede heterologe polypeptid spaltes fra et initielt uttrykt fusjonsprotein som omfatter et peptid med den autoproteolytiske aktivitet til en autoprotease N<pro> til et pestivirus, og det heterologe polypeptid ved den N<pro->autoproteolytiske aktivitet. Ulike kloningsfremgangsmåter anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Et polypeptid med den autoproteolytiske aktivitet til en autoprotease N<pro> til et pestivirus eller et polypeptid med den autoproteolytiske funksjon til en autoprotease N<pro> av et pestivirus er, i særdeleshet, en autoprotease N<pro> av et pestivirus, eller et derivat av dette, med autoproteolytisk aktivitet.

Innenfor rammen av oppfinnelsen betyr betegnelsen "heterologt polypeptid" et polypeptid som ikke spaltes naturlig av en autoprotease N<pro> fra et pestivirus av et naturlig forekommende fusjonsprotein eller polyprotein. Eksempler på heterologe polypeptider er industrienzymer (prosessenzymer) eller polypeptider med farmasøytisk, i særdeleshet humanfarmasøytisk, aktivitet.

Eksempler på foretrukne polypeptider med human farmasøytisk aktivitet er cytokiner, slik som interleukiner, for eksempel IL-6, interferoner slik som leukocyttinterferoner, for eksempel interferon a2B, vekstfaktorer, i særdeleshet hematopoietiske eller sårhelende vekstfaktorer, slik som G-CSF, erythropoietin eller IGF, hormoner slik som humant veksthormon (hGH), antistoffer eller vaksiner.

Foreliggende oppfinnelse omfatter ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved a t den er kompatibel med en på forhånd definert bakterievertscelle som omfatter minst en ekspresjonskontrollsekvens, og et nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonsprotein omfattende et første polypeptid som har den autoproteolytiske funksjon til en autoprotease N<pr0> fra et pestivirus, og et andre polypeptid som er forbundet med det første polypeptid ved den C-terminale ende til det første polypeptid på en måte slik at det andre polypeptid er i stand til å spaltes fra fusjonsproteinet ved den autoproteolytiske aktivitet til det første polypeptid slik at det andre polypeptid har en tydelig definert homogen N-terminal ende, og der det andre polypeptid er et heterologt polypeptid. Pestiviruset for denne hensikt er fortrinnsvis utvalgt fra gruppen CSFV, BDV og BVDV, der CSFV er særlig foretrukket.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse bakterievertscelle, som er kjennetegnet ved at den omfatter en vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 9.

Til slutt omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket heterologt polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter (i) dyrking av en bakterievertscelle ifølge enten krav 10 eller 11, der dyrkingen foregår under betingelser som medfører ekspresjon av fusjonsproteinet og autoproteolytisk spalting av det heterologe polypeptid fra fusjonsproteinet i vertscellen av den autoproteolytiske aktivitet til det første polypeptid, og (ii) isolering av det spaltede, heterologe polypeptid.

En foretrukket ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen er ett der det første polypeptid av fusjonsproteinet omfatter den følgende aminosyresekvens av autoproteasen N<pro> av CSFV (se også EMBL-database aksesjonsnummer X87939) (aminosyrene 1 til 168, lesende fra N-terminal til C-terminal retning)

eller aminosyresekvensen til et derivat av denne med autoproteolytisk aktivitet.

Derivater med autoproteolytisk aktivitet av en autoprotease N<pro> av et pestivirus er de autoproteaser N<pro> fremstilt ved mutagenese, i særdeleshet aminosyresubstitusjon, delesjon, addisjon og/eller aminosyreinnføyelse, så lenge den nødvendige autoproteolytiske aktivitet, i særdeleshet for å danne et ønsket protein med homogen N-terminal ende, er opprettholdt. Fremgangsmåter for å danne slike derivater ved mutagenese er kjente for fagpersoner innen teknikken. Det er mulig ved slike mutasjoner å optimalisere aktiviteten til autoproteasen N<pr0>, for eksempel i forhold til ulike heterologe proteiner som skal spaltes. Etter fremstilling av en nukleinsyre som koder for et fusjonsprotein, som ved siden av det ønskede heterologe protein omfatter et autoprotease N<pro->derivat som har en eller flere mutasjoner sammenliknet med en naturlig forekommende autoprotease W" 3, fastslås ved om den nødvendige funksjon er tilstede ved å bestemme den autoproteolytiske aktivitet i et ekspresjonssystem.

Den autoproteolytiske aktivitet kan for eksempel initielt påvises ved et in vitro system. I denne hensikt transkriberes DNA-konstruksjonen til RNA og translateres til protein ved hjelp av et in vitro translasjonssett. For å øke sensitiviteten merkes i noen tilfeller det resulterende protein ved inkorporering av en radioaktiv aminosyre. Det resulterende NpTO-målproteinfusjonsprotein gjennomgår ko- og/eller posttranslasjonell autokatalytisk spaltning, der det foregår nøyaktig spaltning av den N-terminale N<pro->delen ved hjelp av dens autoproteolytiske aktivitet fra det etterfølgende målprotein. De resulterende spaltningsprodukter kan enkelt påvises, og blandingen kan opparbeides umiddelbart etter ferdigstillelse av in vitro translasjonsreaksjonen. Blandingen settes deretter på en proteingel (for eksempel Låmmli SDS-PAGE) og utsettes for elektroforese. Gelen farges deretter med egnede fargestoffer eller autoradiograferes. Et western-blot med påfølgende immunfarging er også mulig. Effektiviteten av spaltningen av fusjonsproteinet kan vurderes på bakgrunn av intensiteten til de resulterende proteinbånd.

I et ytterligere trinn kan nukleinsyrefragmentet for fusjonsproteinet klones inn i en bakterieekspresjonsvektor (dersom dette ikke allerede har hendt for in vitro translasjonen) og det sistnevnte kan transformeres inn i en passende vert (for eksempel E. coli). Den resulterende ekspresjonsstammen uttrykker fusjonsproteinet konstitutivt eller etter tilsetting av en inducer. I det siste tilfellet er det nødvendig å dyrke i ytterligere en eller flere timer etter tilsetting av induceren for å oppnå et tilstrekkelig titer av produktet. N<pro->autoproteasen spalter deretter seg selv ko- eller post-translasjonelt fra det uttrykte fusjonsproteinet slik at de resulterende spaltningsrfagmenter er N<pr0->autoproteasen pr. se og målproteinet med definert N-terminal ende. For evaluering av effektiviteten av denne spaltningsreaksjon tas en prøve etter endt dyrking eller induksjonsfase og analyseres ved SDS-PAGE som beskrevet ovenfor.

Et foretrukket autoprotease N<pro->derivat av det beskrevne fusjonsprotein har for eksempel et N-terminalt område der en eller flere aminosyrer er fjernet eller substituert i området mellom aminosyrene 2 til 21 så lenge som det resulterende derivat fortsetter å ha den autoproteolytiske funksjon til autoproteasen N<pr0> i det ønskete omfang. Innenfor rammen av oppfinnelsen omfatter autoprotease N<pro->derivater som er foretrukne i fusjonsproteinet, for eksempel aminosyresekvensen til autoproteasen N<pra> av CSFV med en delesjon av aminosyrene 2 til 16 eller 2 til 21. Det er også mulig ved aminosyresubstitusjon eller addisjon å bytte ut eller introdusere aminosyresekvenser, for eksempel for å introdusere en aminosyresekvens som avhjelper rensing (se eksemplene).

En særlig foretrukket ekspresjonsvektor ifølge foreliggende opprinnelsen, er en der det første polypeptid omfatter aminosyresekvensen Glu22 til Cysl68 av autoproteasen N<pro >av CSFV eller et derivat av denne med autoproteolytisk aktivitet, der det første polypeptid videre har en Met som N-terminal ende, og det heterologe polypeptid er forbundet direkte til aminosyren Cysl68 av autoproteasen N<pro> av CSFV.

Et likedan foretrukket nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse er ett der det første polypeptid omfatter aminosyresekvensen Pro 17 til Cysl68 av autoproteasen N<pra> av CSFV eller et derivat av denne med autoproteolytisk aktivitet, der det første polypeptid videre har en Met som N-terminal ende, og det heterologe polypeptid er forbundet direkte til aminosyren Cysl68 av autoproteasen N<pro> av CSFV.

Et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen er i særdeleshet i form av et DNA-molekyl.

Foreliggende oppfinnelse angår videre kloningselementer, i særdeleshet ekspresjonsvektorer og vertsceller. Følgelig angår foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor som er kompatibel med en på forhånd definert bakterievertscelle, omfattende et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen og minst en . ekspresjonskontrollsekvens. Ekspresjonskontrollsekvensen er i særdeleshet promoterer (slik som lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL eller phoA), ribosombindingsseter (for eksempel naturlig ribosombindingsseter som tilhører de overnevnte promoterer, cro eller syntetiske ribosombindingsseter), eller transkripsjonsterminatorer (for eksempel rrnB T1T2 eller bla). Den overnevnte vertscelle er fortrinnsvis en bakteriecelle fra slekten Escherichia, i særdeleshet E. coli. Det er imidlertid også mulig å anvende andre bakterieceller (se nedenfor). I en foretrukket utførelsesform er ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen et plasmid.

Foreliggende oppfinnelse angår ytterligere en bakterievertscelle som omfatter en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen. En slik bakterievertscelle kan utvelges for eksempel fra gruppen av de følgende mikroorganismer: Gram-negative bakterier, slik som Escherichia arter, for eksempel E. coli, eller andre gram-negative bakterier, for eksempel Pseudomonas sp., slik som Pseudomonas aeruginosa, eller Caulobacter sp., slik som Caulobacter crescentus, eller gram-positive bakterier slik som Bacillus sp., i særdeleshet Bacillus subtilis. E. coli er særlig foretrukket som vertscelle.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte som beskrevet tidligere for fremstilling av et ønsket heterologt polypeptid. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i prinsippet ved initielt å dyrke bakterievertscellen, for eksempel ekspresjonsstammen, i henhold til mikrobiologisk praksis kjent i seg selv. Stammen dyrkes vanligvis frem ved å starte fra en enkelt koloni på et næringsmedium, men det er også mulig å anvende cryokonserverte cellesuspensjoner (cellebanker). Stammen dyrkes vanligvis i en flertrinns prosess for å oppnå tilstrekkelig biomasse for videre anvendelse.

I liten skala kan dette finne sted i risteflasker, der det er mulig i de fleste tilfeller å anvende et sammensatt medium (for eksempel LB-næringsløsning). Det er imidlertid også mulig å anvende definerte medier (for eksempel citratmedium). Ved dyrkingen dyrkes et lite volum av en forkultur av vertsstammen (inokulert med en enkelt koloni eller med en cellesuspensjon fra en cryokultur), temperaturen ved denne dyrkingen er vanligvis ikke kritisk for det senere ekspresjonsresultat, så det er rutinemessig mulig å operere ved relativt høye temperaturer (for eksempel 30 °C eller 37 °C). Hovedkulturen settes opp i et større volum (for eksempel 500 ml), der det er spesielt nødvendig å sikre god lufting (større volum av flaske sammenliknet med volumet av innholdet, høy hastighet på rotasjon). Siden det er tilsiktet at ekspresjonen skal finne sted i løselig form, vil hovedkulturen i de fleste tilfeller også utføres ved en noe lavere temperatur (for eksempel 22 eller 28 °C). Både induserbare systemer (for eksempel med trp, lac, tac eller phoA-promoter) og konstitutive systemer er egnet til produksjon av løselige proteiner. Etter den sene logaritmiske fase er oppnådd (vanligvis ved en optisk tetthet på 0,5 til 1,0 i risteflasker), tilsettes i induserbare systemer inducersubstansen (for eksempel indolakrylsyre, isopropyl-P-D-tiogalactopyranosid = IPTG) og inkuberingen fortsetter i 1 til 5 timer. Konsentrasjonen av inducersubstansen vil i dette tilfelle tendere til å bli valgt ved den øvre grense for å muliggjøre forsiktig ekspresjon. Under dette tidsrom dannes det meste av det N<pro->målrettede proteinfusjonsprotein, det foregår ko- eller post-translasjonell spaltning av N<pro->delen, slik at de to avspaltede delene er tilstede atskilt ved slutten av dyrkingsperioden. De resulterende celler kan høstes og bearbeides videre.

I en større skala står flertrinnssystemet av flere bioreaktorer (fermentorer), der det foretrekkes anvendelse av definerte næringsmedier for å være i stand til å forbedre den fremgangsmåtetekniske kontroll av prosessen. I tillegg er det mulig å øke biomassen og produktdannelsen kraftig ved å måle i særdeleshet næringsstoffer (matet batch). Ellers er fremgangsmåten analog med risteflasken. For eksempel anvendes en preliminær stadiumsfermentor og en hovedstadiumsfermentor, der kulturtemperaturen velges tilsvarende den i risteflasken. Den preliminære stadinmsfermentor inokuleres med et såkalt inoculum som vanligvis er dyrket fra en enkelt koloni eller en cryokultur i en risteflaske. God lufting og en tilstrekkelig inducerkonsentrasjon må også sikres i fermentoren - og spesielt i hovedstadiet. Induksjonsfasen må imidlertid i noen tilfeller gjøres betydelig lengre sammenliknet med risteflasken. De resulterende celler avleveres nok en gang for videre prosessering.

Det heterologe målprotein som er spaltet fra fusjonsproteinet kan deretter isoleres ved proteinrensemetoder kjent for fagpersonen (for eksempel M. P. Deutscher, i: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392). En renserekkefølge omfatter vanligvis et celleødeleggelsestrinn, et oppldaringstrinn (sentrifugering eller mikrofiltrering) og ulike kromatografiske trinn, filtreringer og presipiteringer.

Eksempler

Eksempel 1: Ekspresjon og in vivo spalting av et Npro- C- fusjonsprotein i en bakterievert

Plasmidet NPC-pET konstrueres for ekspresjon av et N<pro->C-fusjonsprotein i en bakterievert. Ekspresjonsvektoren som anvendes er vektoren pETl la (F. W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Det naturlig strukturelle genet (fra CSFV-RNA-genomet) for N<pro->C-fusjonsproteinet klones inn i denne vektoren. Det strukturelle gen for dette fusjonsprotein frembringes ved PCR-amplifisering fra et virusgenom som er transkribert inn i cDNA (og klonet inn i en vektor). Videre erstattes de første 16 aminosyrene til den naturlige N<pr0->sekvensen (MELNHFELLYKTSKQK) med en 10 aminosyrers lang oligohistidinrenset hjelpersekvens (MASHHHHHHH). Den resulterende konstruksjon kalles NPC-pET. Sekvensen til N<pro->delen og det autoproteolytiske spaltingssetet til N<pro->C-fusjonsproteinet kodet på NPC-pET har den følgende struktur, der spaltingssetet er lokalisert mellom aminosyrene Cysl68 og Serl69:

I sekvensen er prolin 17 (posisjon 2 av fusjonsproteinet) fra den naturlige N<pro->sekvensen skrevet i kursiv, og starten på C-sekvensen er uthevet. Fusjonsproteinet har en omtrentlig Mr på 32 kd, der N<pro->delen utgjør 18 kd og C-delen utgjør 14 kd etter autoproteolytisk spaltning.

For å evaluere betydningen av den første C-terminale aminosyre av spaltningssetet, blir serin 169, som naturlig er tilstede der, erstattet av de 19 andre naturlig forekommende aminosyrer ved målsøkt mutagenese. De derved fremstilte konstruksjoner kalles NPC-pET-Ala, NPC-pET-Gly etc. Ekspresjonsstammene fremstilles ved anvendelse av disse plasmider.

Escherichia coli BL21(DE3) anvendes som Escherichia coli-vertsstamme for ekspresjon av N<pro->C-fusjonsproteinene. Stammen har den følgende genotype:

E. coli B F" dan omp T hsdSfo mb ) gal A,(DE3)

Stammen er kommersielt tilgjengelig i form av kompetente celler fra Stratagene. Den inneholder en lysogen lambdafag i genomet som omfatter genet for T7-RNA-polymerase under kontroll av /acC/K5-promoteren. Produksjon av T7-RNA-polymerase og følgelig også målproteinet kan således induseres ved tilsetning av isopropyl-P-D-tiogalaktopyranosid (IPTG). Dette to-trinns system tillater at det oppnås svært høye spesifikke og absolutte ekspresjonsnivåer for mange målproteiner.

Ekspresjonsstammene BL21(DE3)[MPC-pET], BL21(DE3)[MPC-pET-Ala] etc. fremstilles ved å transformere det respektive ekspresjonsplasmid inn i BL21(DE3). Transformasjonen finner sted i henhold til uttalelsene fra leverandøren av de kompetente celler (Stratagene eller Novagen). Transformasjonsblandingen såes ut på Luria-agarplater med 100 mg/l ampicillin. Denne transformasjonen resulterer i mange kloner i hvert tilfelle etter inkubering ved 37 °C (over natten).

En middels stor koloni med klare grenser plukkes og danner basis for den passende ekspresjonsstamme. Klonen dyrkes og konserveres på cryoampuller ved -80 °C ("master cell bank" MCB). Stammen strykes ut på Luria-agarplater (med ampicillin) for daglig anvendelse.

Den spesielle stammen anvendes for inokulering av en forkultur i en risteflaske fra en enkelt koloni dyrket på en agarplate. En alikvot av forkulturen anvendes for å inokkulere en hovedkultur (10 til 200 ml i en risteflaske) og dyrkes inntil OD600 er fra 0,5 til 1,0. Produksjon av fusjonsproteinet induseres deretter med 1,0 mM IPTG (sluttkonsentrasjonen). Kulturene dyrkes videre i 2-4 timer, en OD600 på ca. 1,0 til 2,0 oppnås. Dyrkingstemperaturen er 30 °C ± 2 °C, og det anvendte medium er LB-medium + 2 g/l glukose +100 mg/l ampicillin.

Prøvene tas fra kulturen før induksjon og ved ulike tidspunkt etter induksjon og sentrifugeres, og pelletten kokes i denaturerende prøvebuffer og analyseres ved SDS-PAGE og Coomassiefarging eller Western blot. Prøvene tas under standardiserte betingelser, og tetthetsforskj eller i kulturene kompenseres ved det volum prøvepåsettingsbuffer som anvendes for resuspensjon.

Båndene som fremkommer etter induksjon er plassert noe over 20 kd (N<pro>) og ved ca. 14 kd (C). Spaltningseffektiviteten av fusjonsproteinet med hver konstruksjon estimeres på bakgrunn av intensiteten av båndene i den Coomassiefargede gel og i Western blot. Ut fra dette ble det funnet de fleste aminosyrene tolereres ved posisjonen umiddelbart C-terminalt for spaltningssetet (dvs. ved den N-terminale ende av målproteinet), dvs. svært effektiv autoproteolytisk spaltning finner sted.

Disse data viser at det i prinsippet er mulig med hell å anvende den autoproteolytiske aktivitet av autoproteasen N<pro> for den spesifikke spaltning av et rekombinant fusjonsprotein i en bakterievertscelle.

Eksempel 2: Ekspresjon og in vivo spalting av et fusjonsprotein av N<pro> og humant interleukin 6 ( ML6 ) for å fremstille av homogent, modent hIL6

Plasmidet NP6-pET konstrueres for ekspresjon av N<pro->ML6-fusjonsproteinet. pETl la (F. W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89) anvendes som ekspresjonsvektor. Først klones et fusjonsprotein bestående av N<pro> og CSFV-nukleokapsidproteinet inn i denne ekspresjonsvektor (se eksempel 1). Det strukturelle genet for dette fusjonsproteinet er frembrakt ved PCR. Dette medfører at de første 16 aminosyrene fra den naturlige N<pro->sekvensen (MELNHFELLYKTSKQK) erstattes av en 10 aminosyrer lang oligohistidinrenset hjelpersekvens (MASHHHHHHH).

Et Spel-spaltningssete introduseres inn i det resulterende ekspresjonsplasmid ved forbindelsespunktet mellom N<pro> og nukleokapsidproteinet ved målrettet mutagenese. Dette gjør det mulig å fjerne det strukturelle gen for nukleokapsidproteinet fra vektoren ved restriksjoner med Spel ved den 5' ende (tilsvarende den N-terminale ende av proteinet) og Xhol ved den 3' ende (tilsvarende den C-terminale ende av proteinet). Den tilsvarende lineariserte Npr0-pETl la-vektoren fjernes fra nukleokapsidgenfragmentet ved preparativ gelelektroforese. Det er deretter mulig å introdusere det strukturelle hIL6-genet via de "klebrige" (sticky) Spel- og Xhol-ender.

Det følgende preparative arbeid er nødvendig for dette. Det strukturelle gen amplifiseres ved hjelp av en høypresisjons-PCR (for eksempel Pwo-system fra Roche Biochemicals, fremgangsmåte som beskrevet av produsenten) fra en hIL6-cDNA-klon som kan produseres fra C10-MJ2-celler. De følgende oligonukleotider anvendes for denne hensikt:

Oligonukleotid 1 ("N-terminal"):

Oligonukleotid 2 ("C-terminal"):

Et Spel-spaltningssete introduseres ved den 5' ende, og et Xhol spaltningssete introduseres ved den 3' ende via de anvendte oligonukleotider. I tillegg introduseres et dobbelt ochre stoppkodon (TAATAA) ved den 3' ende av strukturgenet for effektiv terminering av translasjon. Spel-spaltningssetet i framenden tillater ligering i leserammen med Npro-pETl la-vektoren beskrevet ovenfor. Xhol-spaltningssetet i den bakre ende gjør retningsstyrt innkloning mulig.

Sekvensen til PCR-fragmentet (593 bp) med strukturgenet for hIL6 vises nedenfor (les i N-terminal til C-terminal retning). Restriksjonsspaltningssetene er understreket, og det første kodon til hIL6 (Ala) og stoppkodonet er uthevet:

Konstruksjonen fremstilt ved ligeringen med Npro-pETl la-plasmidet kalles NP6-pET.

Sekvensen til N<pro->hIL6-fusjonsproteinet (347 aminosyrer hvorav 162 aminosyrer fra N<pro->delen og 185 aminosyrer fra hIL6-delen), kodet på NP6-pET vises nedenfor, der hIL6-sekvensen er uthevet:

Fusjonsproteinet har en Mr på 39303,76 d i redusert tilstand, og etter en mulig spaltning vil N<pro->delen (redusert) ha en Mr på 18338,34 d og hIL6-delen (redusert) vil ha 20983,63 d. N<pro> har seks cysteiner og hIL6 fire. Det er sannsynlig at disse cysteiner for det meste er i redusert form i bakteriecytoplasma. I løpet av den etterfølgende prosessering er det antatt delvis minst partiell dannelse av sulfidbroer. Det må forventes at det N-terminale metionin i fusjonsproteinet (eller i N<pro->delen) for det meste spaltes av metioninaminopeptidase (MAP) intrinsisk hos verten, som vil redusere Mr med ca. 131 d i hvert tilfelle til 39172,76 d (fusjonsprotein) og 18207,13 d (N<pro>).

Escherichia coli-vertsstammen for ekspresjon av N<pro->hIL6-fusjonsproteinet, er Escherichia coli BL21(DE3) (se eksempel 1).

Ekspresjonsstammen BL21(DE3)[MP6-pET] frembringes ved transformering av ekspresjonsplasmidet MP6-pET beskrevet ovenfor inn i BL21(DE3) som beskrevet i eksempel 1.

Stammen BL21(DE3)[MP6-pET] dyrkes fra en enkelt koloni på en agarplate, som deretter anvendes for å inokulere en forkultur i Luria-næringsløsning + 100 mg/l ampicillin (200 ml i en 1 1 baffleflaske). Forkulturen ristes ved 250 rpm. og 30 °C i 14 timer og når OD600 på omtrent 1,0 i løpet av dette. Deretter anvendes 10 ml forkulturporsjoner for å inokulere hovedkulturer (330 ml av Luria-næringsløsning i hver 11 baffleflaske) (3 % inokulum). Hovedkulturene dyrkes ved 30 °C (250 rpm.) inntil OD600 har øket til 0,8, og deretter induseres fremstilling av fusjonsproteinet med 0,5 eller 1,0 mM IPTG (sluttkonsentrasjon). Kulturene dyrkes ytterligere ved 30 °C og 250 rpm. i 3 timer, OD600 når ca. 1,0 til 2,0.

Kulturene overføres til sterile 500 ml sentrifugeflasker og sentrifugeres ved 10000 g i 30 minutter. Supernatanten kastes og pelletten fryses ved -80 °C inntil det blir ytterligere bearbeidet.

Det nye proteinbånd i det fullstendige lysat kan lett påvises ved Coomassiefarging etter SDS-PAGE. Bånd med tilsynelatende molekylmasse på ca. 19 kd, 21 kd og 40 kd kommer tilsyne i lysatet fraBL21(DE3)[MP6-pET]. Analyser av denne ekspresjon ved anvendelse av spesifikke anti-hIL6-antistoffer bekrefter hovedsakelig resultatene oppnådd etter Coomassiefarging.

For å optimalisere N<pro->hIL6-spaltningen utføres induksjoner ved ulike temperaturer og BPTG-konsentrasjoner og analyseres igjen, både i den fargede gel og ved et western blot. Nesten fullstendig spaltning av N<pro->IL6 observeres ved en dyrkingstemperatur på 22 °C.

Dette eksperiment viser at heterologe proteiner også kan fusjoneres til den C-terminale ende av N<pro> i et bakterieekspresjonssystem, og svært effektiv spaltning finner sted. En endring i den N-terminale aminosyre av det følgende protein (alanin i stedet for serin) har heller ingen skadelig effekter. Dette system er følgelig egnet ifølge oppfinnelsen til å fremstille rekombinante proteiner med homogene, autentiske N-terminale ender, spesielt i et heterologt ekspresjonssystem, slik som et bakterieekspresjonssystem, uten ytterligere prosesseirngstrinn.

Eksempel 3: Ekspresjon og in vivo spalting av et fusjonsprotein sammensatt av N<pro> og humant interferon ct2B ( IFNa2B) for å fremstille homogent, modent IFNa2B

Fremgangsmåten for kloning av IFNa2B for å fremstille vektoren NPI-pET tilsvarer fremgangsmåten beskrevet for hIL6 i eksempel 2. Det strukturelle gen amplifiseres med høypresisjons PCR (for eksempel Pwo-systemet fra Roche Biochemicals, fremgangsmåten ifølge produsent). Templaten som anvendes er en IFNa2B-cDNA-klon som kan fremstilles fra humane leukocytter ved standard metoder kjent for fagpersoner innen teknikken. En alternativ mulighet er også å utføre en fullstendig syntese av genet. Sekvensen til det strukturelle gen kan oppnås i elektronisk form via genbank-databasen under aksesjonsnummer V00548. De følgende oligonukleotider anvendes for

amplifiseringen:

Oligonukleotid 1 ("N-terminal"):

Oligonukleotid 2 ("C-terminal"):

Sekvensen til PCR-fragmentet (533 bp) med det strukturelle gen for IFNa2B vises nedenfor. Restriksjonsspaltingssetet er understreket, og det første kodon av IFNa2B (Cys) og stoppkodonet er uthevet:

Konstruksjonen fremstilt ved ligering med Npro-pETl la-plasmidet kalles NPI-pET.

Sekvensen til N<pro->IFNa2B-fusjonsproteinet (327 aa, av hvilke 162 N<p>ro og 165 IFNa2B) kodet på NPI-pET er vist nedenfor, der IFNa2B-sekvensen er uthevet (vist i retningen fra N-terminale ende til C-terminale ende):

Fusjonsproteinet har en Mr på 37591,44 d i redusert tilstand, og etter en mulig spaltning vil N<pro->delen (redusert) ha en Mr på 18338,34 d og IFNa2B-delen (redusert) vil ha 19271,09 d. Npr0 har seks cysteiner og IFNa2B fire. Der er sannsynlig at disse cysteinene for det meste er i redusert form i bakteriecytoplasmaet. Under etterfølgende prosessering er det antatt minst delvis dannelse av disulfidbroer. Det må forventes at den N-terminale metionin i fusjonsproteinet (eller i N<pro->delen) for det meste spaltes av metioninaminopeptidase (MAP) intrinsisk i verten, som vil redusere Mr med ca. 131 di hvert tilfelle til 37460,23 d (fusjonsproteinet) og 18207,13 d (N<pro>).

Escherichia co/i-vertsstammen for ekspresjon av N<pro->delen IFNa2B-fusjonsproteinet er Escherichia coli BL21(DE3) (se eksempel 1).

Ekspresjonsstammen BL21(DE3)[MP6-pET] fremstilles ved transformering av ekspresjonsplasmidet NPI-pET beskrevet ovenfor inn i BL21(DE3) som beskrevet i eksempel 1.

Stammen BL21(DE3)[MP6-pET] dyrkes fira en enkelt koloni på en agarplate, og dette anvendes for å inokulere en forkultur i Luria-næringsløsning +100 mg/l ampicillin (200 ml i en 11 baffelflaske). Forkulturen ristes ved 250 rpm. og 30 °C i 14 timer og når en OD600 på ca. 1,0 i løpet av dette. 10 ml forkulturporsjoner anvendes deretter for å inokkulere hovedkulturene (330 ml Luria-næringsløsning i hver 11 baffelflaske) (3 % inoculum). Hovedkulturene dyrkes ved 30 °C (250 rpm.) inntil OD600 har øket til 0,8, og produksjon av fusjonsproteinet induseres deretter med 0,5 eller 1,0 mM IPTG (sluttkonsentrasjon). Kulturene dyrkes videre ved 30 °C og 250 rpm. i 3 timer, under ved hvilke en OD600 på ca. 1,0 til 2,0 oppnås.

Kulturene overføres til sterile 500 ml sentrifugeflasker og sentrifugeres ved 10000 g i 30 minutter. Supernatanten kastes og pelletten fryses ved -80 °C inntil ytterligere prosessering.

Det nye proteinbånd i det fullstendige lysat kan lett påvises ved Coomassiefarging etter SDS-PAGE. Molekylmasse på ca. 38 kd og ca. 19 kd fremkommer i lysatet fra BL21(DE3)[MP6-pET]. IFNa2B-båndene kan ikke separeres fra N<pr0->båndet ved SDS-PAGE.

Analyser av disse prøver ved anvendelse av spesifikke anti-IFNa2B-antistoffer bekrefter tilstedeværelse av et spaltet IFNa2B-bånd.

For å optimalisere N<pro->IFNa2B-spaltningen utføres induksjoner ved ulike temperaturer og IPTG-konsentrasjoner i dette tilfelle også, og analyseres igjen, både i den fargede gel og ved et Western blot. Det er også i dette tilfelle funnet at optimal spaltning finner sted ved reduserte temperaturer (22 til 30 °C).

Claims (12)

1. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den er kompatibel med en på forhånd definert bakterievertscelle som omfatter minst en ekspresjonskontrollsekvens, og et nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonsprotein omfattende et første polypeptid som har den autoproteolytiske funksjon til en autoprotease N<pro> fra et pestivirus, og et andre polypeptid som er forbundet med det første polypeptid ved den C-terminale ende til det første polypeptid på en måte slik at det andre polypeptid er i stand til å spaltes fra fusjonsproteinet ved den autoproteolytiske aktivitet til det første polypeptid slik at det andre polypeptid har en tydelig definert homogen N-terminal ende, og der det andre polypeptid er et heterologt polypeptid.

2. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at pestiviruset er valgt fra gruppen av CSFV, BDV og BVDV.

3. Ekspresjonsvektor ifølge krav 2, karakterisert ved at pestiviruset er CSFV.

4. Ekspresjonsvektor ifølge krav 3, karakterisert ved at det første polypeptid omfatter den følgende aminosyresekvens: eller aminosyresekvensen til et derivat av denne med autoproteolytisk aktivitet.

5. Ekspresjonsvektor ifølge krav 3, karakterisert ved at det første polypeptid omfatter aminosyresekvensen Glu22 til Cysl68 fra autoproteasen N<pro> fra CSFV eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet, der det første polypeptid i tillegg har en Met som N-terminal ende, og der det heterologe polypeptid er bundet direkte til aminosyren Cysl68 fra autoproteasen N<pro> fra CSFV.

6. Ekspresjonsvektor ifølge krav 3, karakterisert ved at det første polypeptid omfatter aminosyresekvensen Pro 17 til Cysl68 fra autoproteasen N<pro> fra CSFV eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet, der det første polypeptid i tillegg har en Met som N-terminal ende, og der det heterologe polypeptid er forbundet direkte til aminosyren Cysl68 fra autoproteasen N<pro> fra CSFV.

7. Ekspresjonsvektor ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nukleinsyremolekylet er et DNA-molekyl.

8. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at bakterievertscellen er en E. coli-celle.

9. Ekspresjonsvektor ifølge enten krav 1 eller 8, karakterisert ved at ekspresjonsvektoren er et plasmid.

10. Bakterievertscelle, karakterisert ved at den omfatter en vektor ifølge ethvert av kravene 1 til 9.

11. Bakterievertscelle ifølge krav 10, karakterisert ved at vertscellen er en E. coli-celle.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket heterologt polypeptid, karakteriser t ved at den omfatter (i) dyrking av en bakterievertscelle ifølge enten krav 10 eller 11, der dyrkingen foregår under betingelser som medfører ekspresjon av fusjonsproteinet og autoproteolytisk spalting av det heterologe polypeptid fra fusjonsproteinet i vertscellen av den autoproteolytiske aktivitet til det første polypeptid, og (ii) isolering av det spaltede, heterologe polypeptid.