BR9810650B1 - vetor para expressço de proteÍna heteràloga e mÉtodos para extrair proteÍna recombinante e para purificar insulina recombinante isolada. - Google Patents

Description

"VETOR PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA HETERÓLOGA EMÉTODOS PARA EXTRAIR PROTEÍNA RECOMBINANTE E PARA PURIFICARINSULINA RECOMBINANTE ISOLADA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um vetor de múlti-plas finalidades. O vetor pode servir para expressão depelo menos uma proteína heterológa em uma célula adequadatal como E. coli ou outras bactérias Gram-negtivas. Mais es-pecificamente, a presente invenção refere-se a um vetor paraexpressão de proteínas heterólogas compreendendo moléculasde ácido nucléico para uma origem de região de replicação,opcionalmente, mas de preferência um marcador de seleção(que pode ser uma molécula de ácido nucléico de codificaçãoinserida num sítio de restrição), um promotor, uma região deiniciação, por exemplo, uma região de iniciação de traduçãoe/ou um sítio de ligação de ribossomo, pelo menos um sítiode restrição e de preferência sítios de restrição múltiplos,e um terminador de transcrição; um método para extrair pro-teína recombinante sem Iise da célula, por exemplo, bactéri-as; e um método para purificar proteína recombinante isola-da. O vetor pode facilitar a produção termo-regulada de umaproteína ou proteínas heterológas, por exemplo, pró-insulina.

Várias publicações são referenciadas neste pedido.A citação completa dessas publicações pode ser encontrada nofinal do relatório, imediatamente precedente âs reivindica-ções, ou quando da menção da publicação, e cada uma dessaspublicações está ora incorporada por referência. Essas pu-blicações referem-se ao estado da técnica ao qual se referea invenção; contudo, não há aquiescência de que quaisquerdessas publicações sejam, de fato, da técnica anterior.

Fundamentos da invenção

A tecnologia de DNA recombinante permitiu a ex-pressão de proteína estranha (heteróloga) em células micro-bianas e outras células hospedeiras. Um vetor contendo ma-terial genético direcionando a célula hospedeira para produ-zir proteína codificada por uma parte da seqüência de DNAheterólogo é introduzido no hospedeiro, e as células hospe-deiras transformantes podem ser fermentadas e submetidas acondições, que, facilitam a expressão do DNA heterólogo le-vando à formação de grandes quantidades da proteína deseja-da.

As vantagens do uso de uma proteína produzida demodo recombinante, no lugar de isolamento de uma fonte natu-ral incluem: a pronta disponibilidade da matéria prima, al-tos níveis de expressão, que são especialmente úteis paraproteínas de baixa fonte natural; a facilidade com a qualuma proteína normalmente intracelular pode ser excretada nomeio de expressão, facilitando o processo de purificação; ea facilidade relativa com a qual proteínas modificadas (fu-são) podem ser criadas para simplificar ainda mais a purifi-cação da proteína resultante.

Contudo, os benefícios supramencionados da tecno-logia de DNA recombinante são também acompanhados por váriasdesvantagens, a saber: os elementos necessários da proteínaativa que resultam de modificação pós-tradução (ou seja,glicosilação) podem não ser realizados no meio de expressão;a degradação proteolítica da proteína recém-formada pode re-sultar, com a expressão, em células hospedeiras; e na forma-ção dos agregados de alto peso molecular freqüentemente re-feridos como "corpos de inclusão" ou "corpos refratários" oque resulta da incapacidade das proteínas expressadas em do-brarem-se corretamente num meio celular não natural. A pro-teína recombinante não pode ser excretada no meio de culturacom a formação dos corpos de inclusão.

Os corpos de inclusão contêm proteína numa confor-mação não nativa, estável; ou os agregados de proteína po-dem ser amorfos, compostos de proteínas parcialmente e com-pletamente desnaturadas, além de proteínas anômalas sinteti-zadas como resultado da tradução ambígua. Tais corpos de in-clusão constituem uma grande parte da proteína celular to-tal.

Os corpos de inclusão apresentam problemas signi-ficativos durante a purificação das proteínas recombinantes,à medida em que elas são relativamente insolúveis em tampõesaquosos. Desnaturantes e detergentes, ou seja, cloridratode guanidina, uréia, dodecilsulfato de sódio (SDS) e TritonX-100 podem ser necessários para isolar as proteínas doscorpos de inclusão, freqüentemente à custa da atividade bio-lógica da própria proteína, resultando de dobramento incor-reto e modificação incorreta dos resíduos de aminoácidos naseqüência.

Além disso, como resultado da expressão de DNA re-combinante em E. coli têm-se o acúmulo de concentrações ele-vadas de acetato no meio, principalmente durante a fase deindução. 0 efeito prejudicial do acúmulo de acetato (maiordo que 5g/l) no crescimento celular e expressão da proteínarecombinante foi bem documentado na literatura.

Além desse fato, a recuperação da proteína deseja-da dos corpos de inclusão é freqüentemente complicada pelanecessidade em separar a proteína desejada de outros materi-ais celulares hospedeiros, além da separação da proteína de-sejada dos contaminantes de proteína heterólogos dos corposde inclusão. O último problema resulta da forte atração queas proteínas de corpos de inclusão têm umas pelas outras,devido à fortes interações iônicas e hidrofóbicas.

Como conseqüência, protocolos mais estabelecidospar o isolamento de proteínas recombinantes de corpos de in-clusão, resultam em grandes quantidades do material biologi-camente inativo, e muito pouca produção de proteína ativa,não contaminada pela proteína heteróloga estranha.

Os pesquisadores centralizaram-se na manipulaçãodo fago, de modo a estimular a síntese de proteína por umasérie de métodos.

Os promotores do fago Lambda (PL e PR) são fortespromotores que, são negativamente controlados pelo repressorcodificado pelo gene cl. A mutação cl857 tornou o repressorinativo a temperaturas acima de 37°C. Assim, a expressão deuma seqüência controlada por esses promotores e pelo repres-sor cl857 pode ser ativada por uma única alteração na tempe-ratura. Esses promotores são freqüentemente usados nos veto-res de expressão de E. coli, porque eles são forte e efici-entemente reprimidos (Denhardt & Colasanti, 1987).

Remaut et al., (1981) construíram um conjuntode plasmídeos contendo o promotor Pl . 0 promotor e a regiãotrp do gene foram retirados de uma família de fagos (trp44)e inseridos no plasmídeo pBR32, criando o primeiro plasmídeode uma série, plasmídeo pPLa2. Após várias manipulações,foram obtidos outros plasmídeos. Os plasmídeos pPLa2 epPLa8 contidos no fragmento do promotor Pl, a origem de re-plicação, o gene resistente para ampicilina do plasmídeopBR322, e um gene resistente para canamicina do plasmídeopMK2 0. A região de promotor continha o promotor/operador e osítio nutL (antiterminação) mas lhe faltava o começo do geneN.

Os plasmídeos pPLc236, pPLc28 e pPLc24 são dife-rentes dos plasmídeos previamente identificados, com relaçãoà direção da transcrição do promotor PL em relação à orien-tação da origem de replicação, como encontrado em pBR322 ( a= direção inversa aos ponteiros do relógio, c = no sentidodos ponteiros do relógio) . 0 gene resistente para canamici-na está ausente nesses três vetores. A diferença entrepPLc236 e pPLc8 é a presença ou ausência de uma região (pre-sente no primeiro e ausente no último) que afeta a região desítios de clonagem únicos. pPLc24 foi derivado de pPLc28por inserção de uma região contendo o sítio de ligação doribossoma do gene para replicase do fago MS2, permitindo aexpressão dos genes eucarióticos.Esses plasmídeos foram submetidos a teste com aexpressão de diferentes genes, por exemplo, o gene trpA deSalmonella typhimurium, clonado no plasmídeo pPLc24 (precur-sor de pPLc23 6), que mostrou 4 0% de indução do produto emrelação à proteína celular total. pLc236 programado em E.coli resultou numa expressão do gene ROP como 2 0% da proteí-na total (Muesing et al., 1984. As proteínas p4 e p3 do fago29 de Bacillus subtilis também foram produzidas de pPLci eatingiram 30% e 6%, respectivamente, da proteína celular to-tal induzida em E. coli após indução térmica (Mellado & Sa-las, 1982) .

Em 1983 Remault et al. (1983a) construiu um plas-mídeo pPLc24, derivado de pPLc24, em que a região de codifi-cação inicial de replicase foi suprimida e uma região comvários sítios de clonagem singulares foi adicionada, permi-tindo a expressão direta. 0 gene para α-interferon humanofoi clonado a esse plasmídeo, resultando na indução de pro-teína de aproximadamente 2% a 4% da proteína celular total.Para α-interferon, os níveis de expressão variaram de 3% a25% da proteína celular, dependendo dos plasmídeos, usados,por exemplo, pPLc245, pPLc2 8 e pCP4 0 e na presença de umterminador de transcrição do fago T4 (Simons e al., 1984) 0plasmídeo pCP4 0 derivado de pPL, foi construído por Remautet al. (1983b) A região do promotor foi transferida para umplasmídeo derivado de pKN402 com replicação 'fugitiva" de-pendente da temperatura. Quando as culturas são aquecidas a42°C, o repressor cl857 é desativado e o promotor Pl é Iibe-rado, resultando num aumento no número de cópias do plasmí-deo pCP40, em aproximadamente dez vezes.

Crowl et al. (1985) refere-se a quatro plasmídeoscontendo o promotor Pl . O plasmídeo pRC23 foi construídocontendo o promotor PL e uma região sintética Shine-Dalgarnosem o códon ATG, clonado no plasmídeo pRC2 (derivado depBR322). Para construir os outros três plasmídeos, pEV-vrfl,pEV-vrf2 e pEV-vrf3, uma região com sítios de clonagem úni-cos foi inserida, com adição do códon inicial ATG, de modoque, em cada um, os quadros de leitura fiquem em fase. 0plasmídeo pRC23 foi usado para expressão de interleucina-2 eα-interferon, com um nível de 10% a 20% da proteína celulartotal.

Lautenberg et al., (1983) construiu o plasmídeopJL6, contendo o promotor Pl que codifica para início datradução do gene cll do fago com sítios de clonagem singula-res ClaI e HindIII, localizados a 50 bp do sítio inicialATG. Genes, adequadamente clonados nesses sítios são indu-zidos, produzindo proteínas de fusão com a proteína CII.Seth et al. (1986 modificou este vetor, de modo que, a indu-ção das proteínas pudesse ocorrer sem fusão. Três plasmí-deos foram construídos, contendo um sítio KpnI em pANK-12,um sítio HpaI em pANH-1 e um sítio NdeI em pPL2 do códoninicial ATG do gene CII de pJL6. Em paNH-1 o aminoácidos'valina' ocorreu mais freqüentemente na extremidade amino daproteína induzida. A produção de oncogenes foi obtida des-ses vetores.Chang e Peterson (1992) também modificou o plasmí-deo pJL6 e ocnstruiu uma linha de plasmídeos, pXC, em que aregião para iniciação da tradução do gene CII foi substituí-da por uma sintética. Adicionalmente, uma região foi inseri -da com vários sítios de clonagem únicos. A região CII afetaa eficácia da tradução caso a expressão seja necessária semfusão. Com a região sintética, a eficiência se eleva entre10 e 20 vezes, dependendo da região de espaçamento entre SDe ATG. A expressão atingiu 48% da proteína celular totalpara a proteína 14-3-3 de cérebro de vaca da qual o DNA foiampliado por PCR.

Schauder et al. (1987) construíram uma linha deplasmídeos derivados de pJL6, contendo os promotores pR ePL, 'enf ileirados' λ in tandem', a região SD do gene atpE(para subunidade de ATPase) com o terminador de transcriçãodo bacteriófago fd com o gene do repressor cl857. Esses plas-mídeos foram denominados pJLA501 a -05 e diferem nas regiõesdos sítios de clonagem múltiplo. Com o teste a expressãodo gene atpA (para a subunidade de ATPase) , foi encontraduma indução de 50% da proteína celular total. Os genes sucCe sucD, respectivamente, mostraram 3 0% e 15% de proteína in-duzida em relação à proteína celular total.

Rosenberg et al. (1983) construíram o plasmídeopKC3 0 e seus derivados. 0 vetor pKC3 0 é usado para expres-são dos genes bacterianos contendo suas próprias regiões detradução-regulação. Este vetor contém um único sítio de clo-nagem HpaI, localizado 321 bp a jusante do promotor Pl den-tro da região de codificação do gene Ν. A expressão do ati-vador CII e de oito mutantes em apenas um aminoácidos foiconseguida no vetor pKC3 0. Devido a CII ser rapidamente re-ciclado em E. coli e prejudicial para o crescimento celular,com inserção e expressão de seu gene em pKC3 0, os níveis de3% a 5% da proteína celular total foram atingidos. A produ-ção da proteína CII elevou-se quando a proteína N anti-terminador) foi provida pela célula hospedeira, devido àpresença das sequencias "a montante' do gene CII dos sítiosnutL, nuti? (para anti-terminação) e tri (para terminação) .Outras proteínas foram expressas de pKC30, tais como a pro-teína B do fago Mu (Chaconas et al., 1985) e a proteína UvrAde E. coli expressa a níveis de 15% e 7% da proteína celulartotal, respectivamente.

Para expressão dos genes eucarióticos o plasmídeopASl, derivado de pKC3 0, foi construído com o gene clonadoCII. A região de codificação completa de CII foi suprimida eum sítio BamHI foi adicionado imediatamente Λ a jusante' docódon de iniciação ATG. Desta maneira, as regiões de regu-lação para tradução foram mantidas no vetor e um gene euca-riótico ou sintético pode ser expresso caso seja clonadocorretamente ao sítio BamHI. A expressão do gene para o an-tígeno t do vírus SV40 resultou neste vetor em níveis de 10%das proteínas celulares totais, após uma hora de induçãotérmica (Rosenberg et al., 1983).

Lowman et al. , (1988) modificou o plasmídeo pASl,introduzindo um sítio NcoI no ATG inicial, criando o plasmí-deo denominado pASl-N. Obteve-se a expressão do gene CAT efusão com proteínas do vírus SV40. Mais tarde, Lowman & Bina(1990) usaram esses produtos para estudar o efeito da tempe-ratura na indução térmica.

Mott et al. (1985) usou pKC30 e pASl para expres-sar o gene bacteriano rho e verificou que, a indução térmicanão resultou em altos níveis de expressão da proteína Rho. Aindução com ácido nalidíxico e mitomicina C foi testada nocl hospedeiro, que provocou a indução da síntese de Reaçãoa, resultando numa inativação do repressor cl. Desta manei-ra, níveis de expressão variando de 5% a 40% da proteína ce-lular foram alcançados.

Portanto, a manipulação dos plasmídeos para ex-pressão de uma proteína ou peptídeo de interesse é uma áreaem desenvolvimento e um método para a indução de proteínascomplexas, tais como pró-insulina via manipulação de umplasmídeo e um plasmídeo desta, não foi até o presente des-coberto ou sugerido.

A patente U.S. n° 4.734.3 62 concedida a Hung etal. , é dirigida a um método de isolamento de polipeptídeosproduzidos recombinantemente em corpos de inclusão. 0 méto-do apresentado inclui a Iise de célula, e recuperação doscorpos de inclusão compreendendo a desejada proteína recom-binante, solubilização com desnaturante, proteção dos grupossulfidrila da proteína recombinante, derivação dos gruposamino catiônicos da proteína, e recuperação da proteína re-combinante procedente.

Olson na Patente U.S. n° 4.518.526 refere-se a ummétodo de liberar proteínas ativas de corpos de inclusão porlise de células, centrifugação, desnaturação e reconstitui-ção. A patente relata a necessidade de rompimento da célu-la para separar a proteína solúvel e insolúvel, seguido portratamento da fração insolúvel com um forte desnaturante, erecuperação da proteína heteróloga novamente constituída.

Rausch, na Patente U.S. n° 4.766.224 dirige-se aum método de purificação e solubilização de proteínas produ-zidas em microorganismos transformados como corpos de inclu-são. A purificação é efetuada por solubilização dos corposde inclusão em detergente, tratamento com um forte desnatu-rante, seguido por separação por cromatografia para obter-seproteína ativa reconstituída.

Builder et al. , na Patente U.S. n° 4.620.948 tratade um processo para isolar e purificar corpos de inclusãopor lise da cultura celular, precipitação da proteína, des-naturação da fração insolúvel e reconstituição para isolar aproteína refrátil.

Similarmente, a Patente U.S. n°s. 4.734.368,4.659.568, 4.902.783, 5.215.896, e EP 337.243 e WO 87/02673são cada uma direcionadas a métodos de purificação de prote-ína encerradas em corpos de inclusão. Esses métodos utili-zam as seguintes técnicas, (sozinhas ou em combinação): Iiseda célula, desnaturação, separação por cromatografia, cen-trifugação, manipulação da desnaturação reconstituição daproteína e a ligação dos peptídeos líderes, o que facilita aseparação das proteínas dos corpos de inclusão.

Cada um dos processos supramencionados da técnicaanterior, utilizam métodos, que rompem a célula para liberaos corpos de inclusão do material celular. Não se ensina ousugere um meio para o isolamento dos corpos de inclusão domaterial celular sem o rompimento da célula, tampouco existeuma motivação para deduzir um tal método dos ensinamentosda técnica anterior. Contudo, a Iise ou ruptura das célulasé desvantajosa, à medida que ela permite que os contaminan-tes estejam presentes com a desejada proteína, tais como Ii-popolissacarídeos, que são muito difíceis de separar da pro-teína desejada.

As patentes U.S. n°s. 4.877.830, 5.115.102,5.310.663 e EP 656.419, WO 91/11454, WO 91/16912, WO94/07912, Proc. Natl. Acad. Sei. (1991) 88 (20), e Mol Biol.Rep (1993) 18: 223-230 são cada uma direcionadas à purifica-ção por afinidade das proteínas. Esses documentos referem-se ao uso de (sozinho ou em combinação) : cromatografia deafinidade por quelante metálico para separação cromatográfi-ca de proteínas com resíduos de histidina adjacentes, imuno-afinidade cromatográfica, e ao uso de miméticos de aminoáci-dos como eluentes na purificação por afinidade, de proteí-nas .

As patentes U.S. n°s. 4.766.205, 4.599.197,4.923.967, e EP 312.358, EP 302.469, Biochemistry (1968), 7(12), 4247, e J. Biological Chemistry (1959), 234 (7), 1733são cada qual dirigidas a métodos de sulfitólise, ou seja, otratamento de uma proteína solubilizada em uma solução for-temente desnaturante, com um oxidante suave na presença doíon sulfito, que converte cisteína e resíduos de cistina emproteína-S-sulfonatos. A solução fortemente desnaturante éenfraquecida para permitir o redobramento, e ligações dis-sulfeto são reformadas usando um composto sulfidrila, napresença da forma dissulfeto correspondente (oxidada). Si-milarmente, a EP 208.539 e WO 87/02985 são direcionadas amétodos para facilitar o redobramento da proteína in vitro.

A EP 264.250, GB 2.067574, EP 055, 945, MMW (1983)125 (52), 14, J. Biol. Chem. (1971) 246 (22), 6786-91, J.Chrom. (1989 461: 45-61 são cada qual dirigidas a insulina,sua produção a partir de pró-insulina e a purificação da in-sulina e pró-insulina.

A Patente U.S. n° 4.578.355 a Rosenberg, é dirigi-da a uma derivação e ao uso da unidade de transcrição Pl .EP 363.896 é dirigida ao uso de ultrafiltração na purifica-ção de proteína.

A insulina humana, um produto da digestão proteo-lítica da pró-insulina, é um hormônio polipeptídico produzi-do pelas células beta das ilhotas de Langerhans, no pân-creas. Sua finalidade é diminuir a quantidade de glicose nosangue promovendo a absorção da glicose pelas células, e au-mentando a capacidade do fígado em sintetizar o glicogênio.A ação da insulina é antagônica ao glucagon, glicocorticói-des adrenais e adrenalina e sua deficiência ou atividade re-duzida produz diabetes com um elevado nível de açúcar nosangue.

A insulina humana foi preparada a partir de váriasfontes, incluindo: isolamento do pâncreas humano, síntese depeptídeo, a conversão semi-sintética de insulina de suínos efermentação de bactérias de E. coli ou levedura de Saccha-romyces cerevisiae, adequadamente codificada por métodos re-combinantes de DNA. Esses métodos sofrem de fraca produçãoe são onerosos e o desenvolvimento de um método com altorendimento e barato de produção de insulina humana para otratamento da diabetes foi o objeto de muitos esforços dapesquisa ultimamente.

Consequentemente, até o presente não foi realizadou método para a indução de pró-insulina humana via técnicasrecombinantes, em que a proteína pode ser isolada em quanti-dades substanciais de corpos de inclusão especialmente umtal método, onde a Iise da célula ou ruptura da célula sejaevitada.

OBJETOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os objetos da presente invenção podem incluir aprovisão de pelo menos um dentre: um vetor composto por pelomenos um ácido nucléico como DNA para clonagem de um ácidonucléico ou para expressão de pelo menos uma proteína hete-róloga por uma célula, como bactérias gram-negativas (o ve-tor pode compreender uma molécula de ácido nucléico porexemplo, DNA codificando: uma origem de região de replica-ção, opcionalmente e de preferência um marcador de seleção (que pode ser um ácido nucléico de codificação num sítio derestrição) um promotor, uma região de iniciação, por exem-plo, uma região de iniciação de tradução, e/ou um sítio deligação ao ribossomo, pelo menos um sítio de restrição parinserção do ácido nucléico heterólogo, por exemplo, DNA co-dificando a proteína heteróloga, e um terminador de trans-crição) ; um método para extração de uma proteína recombinan-te de dentro de uma célula, tal como uma bactéria Gram-negativa recombinante com uma membrana celular, e um métodopara purificação de uma insulina humana recombinante isolada.

Portanto, a presente invenção propicia um vetorcompreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico oumais preferivelmente, para expressão de pelo menos uma pro-teína heteróloga pela célula tal como uma bactéria Gram-negativa. 0 vetor pode compreender DNA codificando o queseguir: um marcador de seleção original (que pode codificarDNA num sítio de restrição) , um promotor, uma região de ini-ciação, por exemplo, uma região de iniciação de traduçãoe/ou um sítio de ligação ao ribossomo, e, pelo menos um sí-tio de restrição par inserir o DNA heterólogo codificando aproteína heteróloga e um terminador de transcrição.

A bactéria Gram-negativa pode ser E. coli. A ori-gem da região de replicação pode ser do plasmídeo pUC8. Aregião de iniciação pode ser uma região de iniciação detradução e pode ser sintética, por exemplo, regiões de Shi-ne-Dalgarno sintéticas do gene 10 do fago T7. 0 marcador se-letivo pode ser um marcador resistente à tetraciclina. Al-ternativamente, ou adicionalmente a seleção das célulastransformadas contendo o vetor pode ser na base de um produ-to expressado pelo DNA heterólogo codificando a proteína he-teróloga. 0 promotor pode ser um promotor Pl e o termi-nador de transcrição pode ser um terminador independenteRho.

Assim, a invenção pode prover um vetor compreen-dendo DNA para expressão de uma proteína heteróloga por umabactéria Gram-negativa. O vetor pode compreender pelo menosuma molécula de ácido nucléico, por exemplo, DNA, codifican-do o que segue: uma origem de região de replicação, um mar-cador de seleção, um promotor, uma região de iniciação detradução ou um sítio de ligação ao ribossomo, pelo menos umsítio de restrição para inserção de DNA heterólogo codifi-cando a proteína heteróloga e um terminador de transcrição.

0 DNA codificando ao menos esse sítio de restriçãode preferência codifica sítios de restrição múltiplos; e, ossítios de restrição múltiplos são de preferência Ncol, Eco-RI, StuI, PstI, BamHI e BspEI.

A presente invenção propicia ainda um vetor paraexpressão de uma pró-insulina por uma bactéria Gram-negativa. Ou seja, no vetor inventivo, no pelo menos um sí-tio de restrição para inserção do DNA heterólogo (ou um se-qüência de ácido nucléico heterólogo( ou de uma seqüência deácido nucléico heteróloga) lá pode ser inserida uma moléculade ácido nucléico tal como DNA codificando pró-insulina, porexemplo, pró-insulina humana. A proteína expressa pela mo-lécula de ácido nucléico inserida (por exemplo, pró-insulina, como pró-insulina humana, pode conter um rótulo oumarcador, por exemplo, um rótulo His (que é de utilidadepara separação, isolamento e/ou purificação da proteína).

E, portanto, mais genericamente, os vetores inven-tivos podem incluir pelo menos uma molécula de ácido nucléi-co de codificação exógena no pelo menos um sítio de restri-ção para inserção de uma molécula de ácido nucléico heteró-logo, por exemplo DNA de codificação exógena pode ser nopelo menos um sítio de restrição, para inserção do DNA hete-rólogo. Além disso, o DNA de codificação exógena pode codi-ficar, além da proteína heteróloga, um marcador ou rótulopor exemplo, um rótulo His.

Adicionalmente, a invenção propicia um método deextração de uma proteína recombinante tal como pró-insulina,por exemplo, pró-insulina humana, de dentro de uma célula,como uma bactéria Gram-negativa recombinante tendo uma mem-brana celular, sem Iise da bactéria. 0 método pode compre-ender as etapas de:

(a) permeabilizar a membrana celular por contatoda bactéria com um detergente, sob condições que facilitam aextração das proteínas de células nativas da membrana celu-lar sem extrair a proteína recombinante da membrana celular;

(b) solubilizar a proteína recombinante e a mem-brana celular; e

(c) separar a proteína recombinante da membranacelular.

A invenção também propicia um método para purifi-car uma proteína recombinante isolada tal como uma pró-insulina, por exemplo, insulina humana, compreendendo:

(a) submeter a insulina humana recombinante isola-da à sulfitólise e separar um produto líquido da mesma;

(b) submeter o produto líquido de (a) a uma colunade quelação com Ni e obter um eluato,

(c) reconstituir o eluato de (b),

(d) converter o produto de (c) por exemplo, comtripsina e carboxipeptidase B e(e) submeter o produto de (d) à purificação, porexemplo, por cromatografia, para obter insulina humana re-combinante, isolada e purificada.

Essas e outras concretizações estão apresentadasou são evidentes da descrição detalhada a seguir, e sãoabrangidas por esta.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

Na descrição detalhada a seguir será feita refe-rência aos desenhos anexos aqui incorporados por referência,onde:

A figura 1 mostra uma construção do plasmídeopUTc6 contendo o gene de resistência à tetraciclina do plas-mídeo pRP4 e a origem de replicação pUC8 com apenas um sítiode clonagem EcoRI;

A figura 2 mostra uma construção do plasmídeopULTDK 7.1 contendo o promotor Pl do fago lambda e da regiãode Shine-Dalgarno do gene 10 do fago T7;

A figura 3 mostra uma adição de um ligante múlti-plo em pTUC6 e clonagem subsequente do fragmento contendo opromotor Pl e região de Shine Dalgarno do plasmídeo pULTDK7.1 e uma construção do pLMC 8.1;

A figura 4 mostra uma construção final da hiperex-pressão do vetor pLMT8,5 por adição do terminador de trans-crição sintético em pLMC8.1;

As figura 5 e figura 5A mostram um mapa do vetorρLMT8.5;

A figura 6 mostra o resultado d solubilização decorpo de inclusão direta das células pré-tratadas com uréia8Μ versus tempo (faixas 1-2 representam 6 horas de solubili-zação; faixas 3-4 representam8 horas de solubilização e fai-xas 5-6 representam 24 horas de solubilização, em que M in-dica marcador de peso molecular, S indica sobrenadante e Pindica pelota residual);

A figura 7 mostra a purificação da proteína de fu-são de pró-insulina por precipitação de pH, em que alíquotasde proteína de fusão solubilizadas (uréia 8M) e dialisadasforam precipitadas em diferentes valores de pH (a pH 4,5toda a proteína recombinante pode ser recuperada no precipi-tado (faixa 5) ; faixas 1 a 7 representam valores de pH de5,5, 5,5, 5,0, 5,0, 4,5, 4,5, 4,0 e marcador de peso molecu-lar, respectivamente com P referindo-se a pelota e S refe-rindo-se ao sobrenadante);

A figura 8 mostra uma representação esquemática doprocesso inventivo para isolamento de insulina humana recom-binante ;

A figura 9 mostra uma análise de um gel de desna-turação a 15% da proteína celular total de culturas trans-formadas com pLMT8,5, pPTAl ou pPLT4.1 em diferentes temposde indução a 40°C ( a seta indica a proteína pró-insulinarecombinante induzida);

As figuras 10A-M mostram a seqüência de nucleotí-deo de pLMT8.5 e as posições dos sítios de endonuclease derestrição;

As figuras IlA-F mostram uma tabulação dos sítiosde restrição na seqüência de pLMT8.5 e a extensão do frag-mento de restrição produzido;AS figuras 12 e 13 mostram a estratégia para ob-tenção de um fragmento de pLA7 contendo a seqüência de pró-insulina e um rótulo de histidina e a inserção destes no sí-tio de restrição dos sítios de clonagem múltiplos do vetorde plasmídeo ρLMT8.5 para produzir o vetor de plasmídeo pHISe

Figuras 14 e 15 mostram a construção de pPLT4 e aseqüência líder contondo T7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção propicia várias concretiza-ções, incluindo pelo menos uma das seguintes: um vetor com-preendendo pelo menos um ácido nucléico tal como DNA paraclonagem de um ácido nucléico ou para expressão da pelo me-nos uma proteína heteróloga por uma célula, tal como bacté-ria gram-negativa (o vetor pode compreender uma molécula deácido nucléico por exemplo, DNA codificando: uma origem deregião de replicação, opcionalmente e preferivelmente, ummarcador de seleção (que pode ser um ácido nucléico de codi-ficação num sítio de restrição), um promotor, uma região deiniciação, por exemplo, uma região de iniciação de traduçãoe/ou um sítio de ligação a ribossomo, pelo menos um sítio derestrição para inserção do ácido nucléico heterólogo, porexemplo, DNA, que codifica a proteína heteróloga, e um ter-minador de transcrição); um método para extrair uma proteínarecombinante do interior de uma célula como uma bactériaGram-negativa recombinante, com uma membrana celular; e, ummétodo par purificação de uma insulina humana recombinanteisolada. Sem limitar a natureza genérica do precedente, aseguir propicia-se uma discussão de várias concretizações,em detalhe.

Numa concretização, a presente invenção refere-sea um método para permeabilização de uma membrana celular deuma célula como uma bactéria Gram-negativa recombinante,para extrair uma proteína tal como uma proteína recombinan-te, do interior da membrana celular.

Proteínas heterólogas são proteínas que, normal-mente, não são produzidas por uma célula hospedeira, ou asque são normalmente produzidas somente em quantidades limi-tadas. O advento da tecnologia de DNA recombinante e de ou-tras manipulações genéticas padrão, tais como mutagênese porponto, permitiu a produção de proteínas heterólogas em quan-tidades profusas de cultura celulares de hospedeiro trans-fectado.

Na prática, essas proteínas heterólogas são fre-qüentemente produzidas por expressão genética em quantidadesque envolvem a precipitação sob condições, que mantém a so-lubilidade das proteínas celulares hospedeiras.

A presente invenção está direcionada aos procedi-mentos para produzir proteínas heterólogas e a métodos deisolar e purificar proteínas heterólogas com contaminaçãomínima por endotoxinas.

A presente invenção refere-se, ainda, a um métodode produzir proteínas por tecnologia de DNA recombinante. Ainvenção refere-se a: um vetor de múltiplas finalidades paraexpressão de pelo menos uma proteína heteróloga em células,tais como E. coli ou outras bactérias gram-negativas; méto-dos par produção desses vetores; um método para extração daproteína de uma célula, tal coo uma proteína recombinante debactéria, sem Iise da célula ou bactéria; e a um método parapurificar proteína recombinante isolada.

A tecnologia de DNA recombinante permitiu a ex-pressão de proteínas estranhas (heterólogas) em células mi-crobianas e outras células hospedeiras. Neste processo, umvetor contendo material genético direcionando uma célulahospedeira para produzir uma proteína codificada por umaparte de uma seqüência de DNA heteróloga é introduzido nohospedeiro, e s células hospedeiras transformadas podem serlevedadas e submetidas a condições que facilita a expressãodo DNA heterólogo, conduzindo à formação de grandes quanti-dades da proteína desejada.

Plasmídeos são usados extensivamente como vetorespara clonar moléculas de DNA. A maioria dos vetores de plas-mídeo são produzidos retirando-se o DNA de uma série de re-plicons (plasmídeos, cromossomas bacteriófagos, e cromosso-mas bacterianos) e juntando o DNA (usando enzimas de restri-ção e ligase DNA ) para formar um plasmídeo que tem uma ori-gem de replicação, um marcador de seleção (normalmente umgene resistente a antibiótico) e um promotor para expressãode genes de interesse na célula hospedeira requerida.

Na presente invenção o DNA codificando uma proteí-na tal como uma proteína precursora é inserido no vetor. Aseqüência de codificação a ser expressada é inserida em re-lação correta a um promotor específico para hospedeiro e ou-tras seqüências regulatórias transcricionais e no quadro deleitura correto, de modo que seja produzida a proteína hete-róloga. 0 vetor também contém seqüências para tradução efi-ciente (por exemplo, A Região de Shine-Dalgarno para expres-são em células bacterianas) . Os vetores de expressão normal-mente contém um sítio 3' de terminação de transcrição ao ge-ne inserido para garantir que o mRNA produzido evite estarpresente no plasmídeo.

Numa modalidade preferida, o vetor de expressão dapresente invenção caracterizado por pLMT8,5, conter o quesegue:

i. Origem de replicação, de preferência de pUC8(o que garante um número alto de cópias do plasmídeo nas cé-lulas recipientes de E. coli) ;

ii. Um marcador, de preferência um marcador re-sistente à tetraciclina do plasmídeo pRP4;

iii. Um promotor, de preferência um promotor Plisolado de bacteriófago lambda;

iv. regiões de Shine-Dalgarno, de preferência re-giões de Shine-Dalgarno sintéticas, e, de preferência essasregiões sintéticas são do gene 10 do fago T7.

v. Um terminador de transcrição, tal como termi-nador de transcrição eficiente, sintético, que é Rho-independente; e

vi. pelo menos um sítio de restrição, e, de pre-ferência uma região de sítios de restrição múltiplos parafacilita a clonagem dos genes a serem expressados.A construção do plasmídeo pLMT8.5 está ilustradanas figuras 1-5 e figuras IOA-M e IlA-F mostram a seqüênciade nucleotídeo e sítios de restrição em pLMT8.5

Ao pelo menos um sítio de restrição pode ser clo-nado, pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que pode serexógena, por exemplo, codificando um epitopo de interesse,um modulador de resposta biológica, um fator de crescimento,uma seqüência de reconhecimento, um gene terapêutico, umaproteína de fusão ou outras proteínas de interesse (porexemplo, pró-insulina) ou combinações desta. Com relação aesses termos, é feita referência à seguinte literatura e ge-ralmente a Kendrew, THE ENCYCLOPEDIA OF MOLECULAR BIOLOGY(Blackwell Science Ltd., 1995) e Sambrook, Fritsch and Mani-atis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. Ed. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1982.

Um epitopo de interesse é uma região imunologica-mente relevante de um antígeno ou imunogene ou fragmentoimunologicamente ativo deste, por exemplo, de um patógeno outoxina de interesse veterinário ou humano.

Um epitopo de interesse pode ser preparado de umantígeno ou de um patógeno ou toxina, por exemplo, um antí-geno de um patógeno humano ou toxina, por exemplo, um antí-geno de um patógeno humano ou toxina ou de um outro antígenoou toxina que solicita uma resposta com relação ao patógeno,ou de um outro antígeno ou toxina que solicita uma respostacom relação ao patógeno, tal como por exemplo, um antígenoMorbillivirus, por exemplo, um vírus da cinomose de cães ouantígeno do sarampo, ou da peste bovina, como HA ou F; umaglicoproteína da raiva, por exemplo, glicoproteína G de hi-drofobia; antígeno da gripe, por exemplo, vírus da gripe HAou N ou um antígeno da gripe de aves , por exemplo, antígenoHA da gripe de perus, antígeno da gripe Chi-cken/Pennsylvania/1/83, tal como uma nudeoproteína (NP); umantígeno do vírus da leucemia bovina, por exemplo, tegumentogp51,30; um antígeno do Vírus da Doença Newcastle (NDV) porexemplo, HN ou F; um antígeno do vírus da leucemia de gatos(FeLV), por exemplo, proteína de tegumento FeLV; tegumentoFAV-I; prepolímero e/ou matriz do vírus da bronquite infec-ciosa; uma glicoproteína Herpesvirus, por exemplo, uma gli-coproteína do vírus da herpes de gatos, vírus da herpes deeqüinos, vírus da herpes de bovino, vírus falso da raiva,vírus da herpes de cães, HSV, Vírus da Doença de Marek,Epstein-Barr ou citomegalovírus; um antígeno flavivirus, porexemplo, um antígeno do vírus da encefalite japonesa, (JEV).

Um antígeno da Febre Amarela, ou antígeno do vírus da Den-gue; um antígeno da malária {Plasmodium), um antígeno do ví-rus da imunodeficiência, por exemplo, um antígeno do vírusda imunodeficiência felina (FIV) ou um antígeno do vírus daimunodef iciência de símios (SIV) ; ou um antígeno do vírus daimunodeficiência humana (HIV); um antígeno de parvovirose,por exemplo, parvovirose canina, um antígeno da gripo eqüi-na, um antígeno do vírus da varíola, bexiga etc., por exem-pio, um antígeno de vírus da ectromelia, um antígeno do ví-rus da sífilis de canários, ou um antígeno do vírus da sífi-Iis de aves; um antígeno do vírus da doença da cavidade si-novial infecciosa, por exemplo, VP2, VP3, . VP4; um antígenodo vírus da hepatite, por exemplo, HbsAG; um antígeno do ví-rus Hantaan, um antígeno de C. tetani; um antígeno da caxum-ba, um antígeno da pneumonia, por exemplo, PspA; um antígenoda Borrelia, por exemplo, OspA, OspB, OspC de Borrelia asso-ciada com doença de Lyme tal como Borrelia burgdorferi, Bor-relia afzelli e Borrelia garinii; ou um antígeno da catapora(varicella zoster).

Naturalmente, que a lista precedente, destina-se aum exemplo, de como o epitopo de interesse pode ser derivadode qualquer antígeno de qualquer patógeno veterinário ou hu-mano; e a obter um epitopo de interesse, pode-se expressarum antígeno de qualquer patógeno veterinário ou humano. Mo-léculas de ácido nucléico codificando epitopos de interesse,tais como as relacionadas podem ser encontradas na patente eliteratura científica, de modo que, nenhuma experimentaçãoindevida é necessária para prática da invenção reivindicadacom relação a qualquer DNA exógeno codificando pelo menos umepitopo de interesse.

Visto que o DNA heterólogo pode se prestar para umfator de crescimento ou gene terapêutico, é feita referênciaà Patente U.S. n° 5.252.479, que está ora incorporada porreferência, juntamente com os documentos aí citados, e a WO94/16716, cada uma destas estando também ora incorporadasopr referência, juntamente com os documentos lá citados (verKendrew, supra, especialmente à página 455 e, em seguida).O fator de crescimento ou gene terapêutico, por exemplo,pode codificar uma proteína contra doença, uma molécula parao tratamento do câncer, um supressor tumoral, uma citocina,um antígeno associado a tumor, ou interferon; e, o fator decrescimento ou gene terapêutico, pode, por exemplo, ser se-lecionado do grupo que consiste de um gene codificando alfa-globulina, betaglobulina, gamaglobulina, fator estimulantede colônica macrófago-granulócito, fator de necrose tumoral,uma interleucina, fato estimulante de colônia de macrófagos,fator estimulante de colônia de granulócitos, ieritropoieti-na, fator de crescimento de célula mastro, p53 supressor detumor, retinoblastoma, interferon, melanoma associado a an-tígeno ou B7. A patente U.S. n° 5.252.479 propicia uma lis-ta de proteínas que podem ser expressadas em um sistema deadenovírus para terapia genética e os versados na técnicadirecionam-se para esta apresentação. WO 94/16716 propiciagenes para citocinas e antígenos associados a tumor e osversados na técnica dispõem dessa literatura.

Com referência aos epitopos de interesse, os ver-sados na técnica podem determinar um epitopo ou regiãoimunodominante de um peptídeo ou polipeptídeo e, portanto,

0 DNA codificador para eles, a partir do conhecimento doaminoácidos e Seqüências de DNA correspondente do peptídeoou polipeptídeo, bem como da natureza dos aminoácidos parti-culares (por exemplo, tamanho, carga, etc.)k e o dicionáriode códon, sem experimentação indevida. Ver também IvanRoitt, Essential Immunology, 1988; Kendrew, supra; JanisKuby, Immunology (1992) págs. 79-80; Bocchia, M. et al. ,Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pepti-des to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; En-glehard, VH, Structure of peptides associated with class I eclass I MHC molecules Ann. Rev. Iramunol. 12:181 (1994));Gefter et al., Patente U.S. n° 5.019.394, concedida em 28 demaio de 1991 e os documentos citados por ela, ora incorpora-dos a título de referência. (Observe especialmente a seçãoda "Relevant Literature" desta patente, e coluna 13 destapatente que revela que: "Um grande número de epitopos foramdefinidos para uma ampla variedade de organismos de interes-se" De interesse particular são os epitopos aos quais sãodirecionados os anticorpos de neutralização. Apresentaçõesdesses epitopos se encontram em muitas das referências cita-das na seção "Relevant Literature".)

Com relação à expressão de um modulador de respos-ta biológica, é feita referência a Wohstadter, "SelectionMethods," WO 93/19170, publicado em 30 de setembro de 1993,e os documentos aí citados, ora incorporados por referência.

Com relação à expressão de proteínas de fusão pe-los vetores inventivos, é feita referência a Sambrook,Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL2a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (especi-almente o volume 3) e Kendrew supra ora incorporado por re-ferência. Os ensinamentos de Sambrook et al. , podem seradequadamente modificados, sem experimentação indevida, des-ta descrição, pelos peritos na técnica, para gerar recorabi-nantes ou vetores expressando proteínas de fusão.

Assim, um perito na técnica pode criar recombinan-tes ou vetores expressando um fator de crescimento ou geneterapêutico e uso dos recombinantes ou vetores, desta des-crição e do conhecimento na técnica sem experimentação indevida.

Além disso, a partir do precedente e do conheci-mento da técnica, nenhuma experimentação indevida é necessá-ria para o perito na técnica para construir um vetor inven-tivo que expressa um epitopo de interesse, um modulador deresposta biológica, um fator de crescimento, uma seqüênciade reconhecimento, um gene terapêutico ou uma proteína defusão ou qualquer proteína de interesse, tal como pró-insulina; ou para o perito na técnica usar um produto de ex-pressão de um vetor inventivo.

Modalidades adicionais preferidas da invenção in-cluem vetores de plasmídeo contendo uma molécula de ácidonucléico (inserida num sítio de restrição) codificando pró-insulina e pró-insulina com um rótulo His, por exemplo,plasmídeos pPTAl e pHIS (que são consangüíneos a pLMT8.5,mas que contém DNA codificando pró-insulina e pró-insulinacom um rótulo His num sítio de restrição; ver figuras 12 e13). A pró-insulina com um rótulo His é útil para isolamen-to da pró-insulina (ver Exemplo 7).

A estabilidade da proteína pode ser um fator Iimi-tante na expressão deste gene em E. coli que é afetada pormuitos fatores, incluindo a presença ou ausência de enzimasproteolíticas no meio, bem como da seqüência da própria pro-teína.

A formação dos corpos de inclusão da proteína re-combinante produzida pode facilitar proteção contra a pro-teólise. Os corpos de inclusão são produzidos dependendo daproteína. E podem ter algumas vantagens, caso se deseja in-duzir as proteínas que sejam insolúveis ou que sejam tóxicaspara E. coli (Schein, 1989; Kane & Hartley, 1988; Hellebustet al., 1989). Geralmente, eles são formados como agregadoscitoplasmáticos que podem ser purificados após lesão da cé-lula seguido por centrifugação e misturação das proteínascom um forte desnaturante, por exemplo, uréia ou guanidina.

A respeito da estabilidade da proteína induzidaquando ela é afetada pela seqüência de proteína, a meia vidade uma proteína deve também ser considerada em relação a seuresíduo amino-terminal, também conhecido como regulamento N-terminal. Tobias et al., (1991), confirma a existência des-ta regra em E. coli. Os resíduos arginina, lisina, leucina,fenilalanina, tirosina e triptofano no terminal amino, ten-dem a diminuir a meia vida da proteína, ou seja, a meia vidapode ser da ordem de dois minutos, enquanto outros resíduospropiciam proteínas com uma meia vida de mais que dez horaspara a mesma proteína. Os aminoácidos arginina e leucinaatuam como resíduos desestabilizantes secundários, devido aofato de sua atividade depender da conjugação com os resíduosdesestabilizantes primários, leucina e fenilalanina, atravésda transferência proteína-tRNA-fenilalanina/leucina (trans-ferase L/F) . Esta enzima, que está presente em bactériasGram-negativas e ausente em eucariontes, catalisa a conjuga-ção de leucina e fenilalanina em extremidades N-arginina elisina estericamente acessíveis em proteínas ou peptídeos. Aprotease Clp(Ti) uma das duas proteases dependentes de ATPconhecidas em E. coli, (a outra é La) é necessária para adegradação in vivo de substratos da regra N-terminal. Clp(750 kd) é uma proteína contendo duas subunidades, ClpA (21Kda) e ClpP (21 Kda sendo comparáveis aos proteossomas de 20S dos eucariontes. Apesar das mutações clpA de E. coliperderem o padrão da regra N-terminal, elas crescem a umavelocidade da E. coli selvagem, mostrando fenótipos normaise não estabilizam várias meias-vidas de proteínas de E. coliVarsharvsky, 1992).

Um outro modo de formar uma proteína mais estável,heteróloga em E. coli é por produção desta como uma proteínaque se funde com uma parte da proteína nativa/natural dabactéria. Algumas das proteínas heterólogas são rapidamentedegeneradas pela protease do hospedeiro e a fusão genéticaestabiliza a proteína produzida dentro da célula, tambémpropiciando uma estratégia para purificação ulterior(Sherwood, 1991). Um exemplo deste método é a adição de umaregião rica em arginina na extremidade carboxila de urogas-trona, que ajuda na proteção contra a proteólise e na puri-ficação da proteína numa coluna de troca de íon (Smith etal., 1984).

A presente invenção propicia um método alternativopara o desenvolvimento de proteínas estáveis, passíveis deserem isoladas, heterólogas, método esse que supera os pro-blemas supramencionados associados com a estabilidade daproteína induzida.

A presente invenção propicia um método para melho-rar a expressão das proteínas heterólogas por emprego de umvetor para expressão, o plasmídeo pLM8.5 e seus derivados,por exemplo, pPTAl e pHIS, que são resistentes o bastantepara resultar numa taxa de produção de proteína mais alta doque a taxa de degradação.

A presente invenção propicia um processo paraconstrução de um vetor para expressão de proteínas heterólo-gas, de preferência proteínas de baixo peso molecular, porexemplo, menor do que 10 Kda, em E. coli.

A presente invenção propicia um processo altamenteeficiente para termoregulação da produção de proteínas hete-rólogas em E. coli e em outras bactérias Gram-negativas, depreferência para produção de pró-insulina humana.

0 método da presente invenção para produção efici-ente termo-regulada de proteínas heterólogas em E. coli eoutras bactérias Gram-negativas, inclui a indução térmica deuma cultura de bactérias contendo o plasmídeo pLMT8.5 e ogene para clonagem, em que o plasmídeo pLMT8.5 é preparadode acordo com o processo aqui descrito e a clonagem é conse-guida sem fusão genética. Numa modalidade preferida, a pro-teína heteróloga se trata de pró-insulina de gene sintéticopara pró-insulina.

Célula de E. coli recombinantes quase sempre ex-pressam a proteína heteróloga na forma de corpos de inclusãocitoplasmáticos insolúveis. Em outras palavras, a proteínarecombinante não é excretada no meio de cultura. Uma carac-terística adicional de E. coli recombinante é o acúmulo degrandes quantidades de acetato no meio, principalmente du-rante a fase de indução. O efeito prejudicial do acúmulo deacetato (>5g/l) no crescimento celular e expressão da prote-ína recombinante é bem documentado na literatura.

Além disso, a respeito do acúmulo de altas concen-trações de acetato nomeio, que é uma conseqüência genéricade operação com E. coli a presente invenção facilita o des-envolvimento de condições de fermentação, em que são conse-guidos, tanto o alto acúmulo da biomassa (>70 g/peso seco/l)como a manutenção de baixa concentração de acetato (<2,0g/l), enquanto a produção de uma concentração maior de pro-teína recombinante expressada é obtida.

Com relação ao método aqui apresentado, para puri-ficação de proteína isolada de corpos de inclusão, será en-tendido que modificações menores no protocolo de purificaçãopodem ser feitas, sem que se afaste do espírito ou escopo dainvenção, ou seja, de modo específico, com relação da esco-lha de solventes, tampões, detergentes, desnaturantes, enzi-mas proteolíticas, métodos de separação e meio cromatográfi-co. Será entendido da discussão, que, embora o detergentepreferido para uso no método da presente invenção seja Tri-ton X-100, um de prática comum na técnica poderá empregarquaisquer detergentes não iônicos para praticar a presenteinvenção. De modo similar, com relação à escolha das enzimasproteolíticas, embora a tripsina e carboxipeptidase B sejampreferidas, pode-se substituir qualquer enzima proteolíticaapropriada, por exemplo, a substituição de EndoproteinaseLys-C por tripsina, de modo a converter pró-insulina em in-sulina, e uma tal substituição está dentro da percepção doconhecimento dos peritos na técnica informados com as prepa-rações de enzima proteolítica disponíveis e suas respectivasespecificidades.

Um melhor entendimento da presente invenção e desuas inúmeras vantagens será fornecido a partir dos Exemplosnão limitantes, oferecidos à guisa de ilustração.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - PREPARAÇÃO DO VETOR

O processo inventivo para a construção de um vetorpara uso na produção termo-regulada de proteínas heterólogasem E. coli e a construção de um vetor inventivo da invençãofoi composta dos seguintes estágios:

i. Construção do plasmídeo pULTDK7.1 (figura 1

A construção do pULTDK7.1 foi iniciada pelo isola-mento do fragmento contendo o promotor Pl do fago lambda.Este fragmento se estende do sítio HindIII ao sítio HpaI dofago e foi clonado nos sítios HindIII e SmaI do poliligantede pUC19, formando o plasmídeo recombinante pUCPL2.7. Oli-gonucleotídeos 011929 e 011930, que contém a região de Shi-ne-Dalgarno do gene 10 do fago T7 foram amolecidos e ligadosao sítio EcoRI de pUCP2.7, formando o plasmídeo pULT7.2.4.O plasmídeo pULT7.2.4 foi clivado nos sítios BspEI e XbaI,tratados com DNA polimerase I e fragmento Klenow e relega-dos, resultando numa supressão da região de codificação dogene N do fago lambda e formação do plasmídeo pULTDK7.1.Oligo 011929

EcoRI

NcoI

5' AATTTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGGTG3'3'

AGATCTTTATTAAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATAGGTACCACTTAA 5'

Oligo 011930

(SEQ ID NOS: )

ii) construção do plasmídeo pUTC6 (figura 2)

A construção de pUTC6 começou pelo isolamento dogene para resistência à tetraciclina (Tc) por meio da diges-tão do plasmídeo pRP4 com BglII e StuI, que liberou um frag-mento de 1,4 kb, que foi clonado no sítios BamRI e SmaI doplasmídeo pUC8, formando o plasmídeo pUTl. Um fragmento de0,9 kb pUC8 foi liberado por digestão com DraI e PvuII e li-gado ao pUTl após digestão com PstI, tratamento com Sl nu-clease, digerido com EcoRI e tratado com Klenow, para obtero plasmídeo pUTC6, que mantém o sítio EcoRI e contém a ori-gem de replicação do gene para resistência à Tc.

iii. Construção do Plasmídeo pLMC8.1 (Figura 3)

Oligonucleotídeos amolecidos 1 e 2 foram li-gados ao sítio EeoRI de pUTC6 para formar o plasmídeo pMC8,contendo uma região de sítios de restrição para clonagem mo-lecular. Subseqüentemente pULTDK7.1 foi liberado por diges-tão com o HindIII e EeoRI e ligado ao pMC8, também digeridocom HindIII e EcoRI, para produzir o plasmídeo recombinantepLMC8.1, contendo o gene para resistência à Tcf a origem dereplicação, o promotor PL> a região de Shine-Dalgarno e umpoliligador para clonagem molecular.

iv. Construção do plasmídeo pLMT8,5 (figura 4)

Um terminador de transcrição eficiente foi inseri-do de oligonucleotídeos 12 e 13, que foram amolecidos e li-gados ao sítio BamHI do plasmídeo pLMC8.1, preservando o sí-tio na extremidade 5' do oligonucleotídeo e criando um sítioHindIII na extremidade 3', produzindo um vetor de expressãopLMT8.5 para E. coli e outras bactérias gram-negativas.

Oligo 01

HindIII EcoRI

StuI

5' AATTAAGCTTTTCGCGAATTCTGAGGCCTGCAGGATCC 3'

3' TTCGAAAAGCGCTTAAGACTCCGGACGTCCTAGGTTAA 5'

NruI

PstI

Oligo 02Oligo 12

BamHI

HindIII

5' GATCCGGAAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTAAGCTT 3'

3 ' GCCTTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAATTCGAACTAG 5 '

BspEI

oligo 13

(SEQ ID NOS: ).

Portanto, o pLMT8.5, preparado de acordo como mé-todo descrito acima contém: (1) origem de replicação depUC8; (2) o gene para resistência à tetraciclina de pRP4;(3) o promotor Pl do fago lambda; (4) a região SD do gene 10do fago T7; (5) sítios de clonagem múltiplos para clonagemsem fusão; e (6) terminador de transcrição Rho-independente(ver figuras 1-5, 10A-M, 11A-F).

Para obter um vetor expressando pró-insulina, DNAde codificação para ela, foi inserido em um sítio de restri-ção dos sítios de clonagem múltiplos' do plasmídeo vetorpLMT8.5. Em particular, o gene sintético para pró-insulinafoi clonado em um poliligante produzindo plasmídeo vetorpPTAl (pLMT8.5 + pró-insulina). 0 vetor foi a seguir inseri-do em E. coli e s culturas dele foram cultivadas para ex-pressão de pró-insulina (por exemplo, linhagem N4830-1(cl857) ; ver Exemplos abaixo).

ν. construção dos plasmídeos pLA7 e pHIS

Um fragmento de pLA7 contendo a seqüência de pró-insulina e um rótulo de histidina foi inserido no sítio derestrição dos sítios de clonagem múltiplos do plasmídeo ve-tor pLMT8.5 produzindo plasmídeo vetor pHIS. A estratégiade clonagem é ilustrada nas Figuras 12 e 13. 0 vetor foientão inserido em E.coli e as culturas deste foram crescidaspara expressão de pró-insulina (por exemplo, linhagem N4830-1 (cl857); ver Exemplos abaixo). pHis contém o gene pró-insulina com o oligo codificando uma inserção (HIS)6 (Met-Ala-His-His-His-His-His-His-Met-Gly-Arg).

0 gene sintético para pró-insulina, construído pe-los inventores usando oligonucleotídeos foi clonado nos sí-tios NcoI e BaMlI na região do poliligante do vetor pLMT8.5para produzir o vetor de expressão da pró-insulina pPTAl epHIS, ver Exemplo 8.

Exemplo 2 - Alta Formação de Biomassa com BaixoAcúmulo de Acetato

Resultados experimentais mostraram que, as adiçõesprogramadas de extrato de levedura foram necessárias para aalta formação de biomassa. Para manter a concentração deacetato em baixos níveis, o pH da fermentação foi controladoautomaticamente por um Ioop de glicose. Sob essas condiçõesnão só pode o pH ser controlado em qualquer valor desejável(por exemplo, 6,8 ou mais baixo) mas também o nível de gli-cose no caldo de fermentação pôde ser mantido em níveis mui-to baixo (< 0,10 g/l) por toda a fermentação evitando o acú-mulo de acetato.

Sob tais condições foram obtidos os pesos secos dacélula de até 95 g/l e expressão de 194 mg de proteína defusão por grama de peso seco da célula.

Exemplo 3 - Permeabilização e Solubilização dosCorpos de Inclusão Contendo Pró-Insulina

Como regra, os corpos de inclusão são recuperadosdo organismos hospedeiro por dois procedimentos: (a) rupturamecânica ou física da membrana celular passando a pasta decélula por uma prensa Manton-Gaulin ou por trituração dasuspensão celular num moinho coloidal como um Dyno-Mill; e(b) Digestão da membrana celular por tratamento com lisozi-ma. Contudo, ambas as técnicas supra-identificadas são one-rosas, e potencialmente prejudiciais ao rendimento globalda proteína desejada.Daí, o método da presente invenção empregar méto-dos alternativos para purificação e solubilização direta doscorpos de inclusão.

Células de E. coli (linhagem K-12 N 4830-1 conten-do o gene da pró-insulina sob o controle do promotor PL;plasmídeos pPTAl e pHIS, ver Exemplo 1) foram cultivados em10 litro de meio contendo extrato de levedura (20 g/l) ,peptona (6,0 g/l), NaCl (5,0 g/l), glicose (10,0 g/l) anti-espumante A (2,0 g/l) e ampicilina (100 ug/ml), pH 6,8 (apósesterilização). O meio foi inoculado a 105 de volume comuma pré-cultura preparada de uma colônia isolada crescidadurante a noite no mesmo meio. A uma densidade óptica deaproximadamente 6,0 a 540 nm, a síntese da pró-insulina foiinduzida elevando-se a temperatura de 30 para 38°C. A in-dução pode também ser iniciada a temperaturas de 40 a 42°C.

As células foram coletadas após 2 a 5 horas de indução. Aformação do corpo de inclusão foi monitorada por microscopiade contraste de fase.

As células foram colhidas por centrifugação, res-suspensas duas vezes em água desionizada e recuperadas porcentrifugação. Quantidades conhecidas da torta úmida de cé-lula foram ressuspensas em Tris-HCl 0,1M, pH8,5 e quantida-des adequadas de compostos de permeabilização, sozinhos, ouem combinação, foram adicionados a uma concentração de atédez vezes o volume do peso da torta úmida de célula, comomostrado na Tabela 1. Após agitação durante a noite, à tem-peratura ambiente, as células foram recuperadas por centri-fugação, foi tirado o peso úmido das tortas de célula e apelota úmida foi homogenizada em 10 vezes seu peso de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5 contendo uréia 8M, e continuou-se a agita-ção à temperatura ambiente por até 24 horas. Os sobrenadan-tes foram recuperados por centrifugação e as pelotas de cé-lula foram lavadas por centrifugação. Concentrações de pro-teína em fusão foram determinadas por análise SDS-PAGE usan-do, tanto o sobrenadante como as pelotas após a etapa de la-vagem. A determinação do peso feita com as pelotas úmidasantes da etapa de pré-tratamento, após pré-tratamento e apóstratamento com uréia 8M mostrou, que uma perda de peso subs-tancial ocorreu, como se vê da Tabela 1.

Tabela 1 - Efeito de alguns pré-tratamentos naperda de peso das pelotas de célula

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Exemplo 4 - Permeabilização e Solubilização Conco-mitante dos Corpos de Inclusão Contendo Pró-Insulina

Nos experimentos, preliminares, as células pré-tratadas foram limpas das proteínas citoplasmáticas e de ou-tro material contaminante extraído das células (cultivadascomo no Exemplo 3)por centrifugação, seguido por ressuspen-são das células pré-tratadas e lavadas em tampão contendouréia 8M.

Alíquotas de 1 litro de um caldo de fermentação,preparadas como no Exemplo 3, foram concentradas até 100 mlpor filtração de fluxo cruzado. Alíquotas da suspensão ce-lular concentrada foram filtradas por diálise com 10 volumesde tampão Tris HCl 0,1 M, pH 8,5 contendo ou 5 Mm de EDTA,1% tolueno ou água desionizada. Uréia sólida foi adicionadaa uma concentração final de 8M e o volume foi elevado a2 00ml com tampão As amostras retiradas em intervalos de tempodiferentes de até 24 horas, foram analisadas por SDS-PAGE.

Uma purificação e solubilização altamente eficaz dos corposde inclusão foi obtida em um curto prazo de 6 horas de tra-15 tamento com uréia, como se vê da Figura 6.

Exemplo 5 - Procedimento de permeabilização Celu-lar usando Triton X-100 a 20%

Culturas celulares crescidas como no Exemplo 4 fo-ram colhidas por centrifugação, ressuspensas duas vezes emágua desionizada e recuperadas por centrifugação. Quantida-des conhecidas da torta de célula úmida foram ressuspensasem Tris-Hcl 0,1M, pH 8,5, contendo Triton X-100 20% e as so-luções foram agitadas durante a noite à temperatura ambien-te. Concentrações de proteína de fusão foram determinadaspor análise SDS-PAGE e encontrou-se que, sob essas condi-ções, uma quantidade substancial de material citoplásmicodispersa-se para fora da célula, deixando um envoltório va-zio contendo essencialmente o corpo de inclusão com poucasproteínas celulares contaminantes.

Exemplo 6 - Purificação e Concentração dos Corposde Inclusão Solubilizados por Precipitação de pH

Culturas celulares são crescidas e pré-tratadas eos corpos de inclusão solubilizados como os exemplos 3 ou 4.

A solução dos corpos de inclusão solubilizados foi dialisadaou ultrafiltrada, para eliminar a uréia. Uma etapa de pre-cipitação do pH fracional resultou em maior pureza da prote-ína solubilizada. O pH da solução de proteína foi baixado,seja por adição de ácidos minerais, ou seja, cloridrato ouácidos sulfúricos, ou por ácidos orgânicos, ou seja, ácidoacético. O pH foi baixado para 6,0 por este método e o pre-cipitado foi removido por centrifugação. A proteína de fusãofoi precipitada da solução baixando-se o pH para 5,0 pelomesmo método. Conseguiu-se uma completa recuperação da pro-teína de fusão. A proteína de fusão precipitada foi dissol-vida em tampão alcalino a pH 8,5. A purificação da proteínapor precipitação do pH fracional é demonstrada na Figura 7.

Exemplo 7 - Purificação e Isolamento da Insulina

Os corpos de inclusão isolados ou todas as célulaspré-tratadas de células contendo e expressando plasmídeopHIS foram lavadas duas vezes com tampão de acetato de amô-nio 50 mM, pH 9,0 e centrifugadas. 0 precipitado foi dis-solvido em tampão de acetato de amônio 50 mM, pH 9,0 conten-do uréia 8M e sulfito de sódio (1,25 g/g da amostra) e te-tratioato de sódio (0,55 g/g da amostra) foram adicionados.

A amostra foi agitada, à temperatura ambiente. A reação desulfitólise foi monitorada por análise das alíquotas em umacoluna Mono-Q. Após 24 a 48 horas, a amostra foi diluída 3vezes com água desionizada, centrifugada e o sobrenadantefoi filtrado para dar uma solução límpida.

O sobrenadante filtrado foi aplicado a uma colunaFF de sefarose de quelação com Nitrogênio (Pharmacia Bio-tech, Upsala Sweden), equilibrada com fosfato de sódio 0,1M. 50 mM de NaCl, pH 7,3. A amostra foi eluída num gradientepor etapas, com tampão de equilíbrio contendo uréia 8M e0,08 M de imidazol, seguido por lavagem com tampão de equi-líbrio contendo uréia 8M e imidazol 0,3 Μ. A separação cro-matográfica foi monitorada por medição de absorbância a 280nm. O tampão da solução contendo proteína S-sulfonada puraisolada por cromatografia de afinidade metálica foi alteradopara glicina 10 mM, pH 10,0 por cromatograf ia de filtraçãopor gel em Sephadex G-25.

A proteína pura sulfonada foi renaturada (0,5 mgproteína/ml) com adição de cistina 0,5mM e beta-mercaptoetanol 0,5mM, com agitação por 18 a 24 horas a 4 a8°C e a reação foi monitorada por injeção de alíquotas damistura de reação em HPLC equipado com uma coluna AquaporeRP-300. As amostras renaturadas (reconstituídas) foram con-centradas e o tampão foi alterado por diafiltração.

A 1,0 ml da amostra renaturada (8 mg/ml) em Tris-Hcl 0,1 M pH 7,5 contendo EDTA 0,01 M foi adicionado 35 ugde tripsina e 0,6 ug de carboxipeptidase Β. A reação foi mo-nitorada por análise HPLC em uma coluna Aquapore RP-300 e areação completou-se após 1 hora a 37°C. A mistura de reaçãofoi diluída 3 vezes com água e purificada por cromatografiade troca de íon e HPLC de fase reversa.

Exemplo 8 - Teste da Eficiência do Vetor de Ex-pressão Um gene sintético para pró-insulina, construído pe-Ios inventores, usando oligonucleotídeos foi clonado nos sí-tios NcoI e BarriH.1 na região de poliligação do vetor pLMT8.5para produzir os vetores de expressão pró-insulina pPTAl epHIS (ver Exemplo 1). Nos testes encontrou-se que, após in-dução térmica de uma cultura de E. coli N4830-1 cepa cl875)contendo o plasmídeo pPTAl (pLMT8,5 + pró-insulina) houveindução da proteína recombinante de aproximadamente 10 Kda,numa fração de 2 0% das proteínas totais da bactéria duranteum período de 90 minutos, e que ela perde a capacidade em semultiplicar durante o choque térmico deixando-a apenas com aprodução da proteína recombinante como se vê da Figura 4. 0plasmídeo pPLT4 também foi usado neste teste. Este plasmí-deo é um derivado do plasmídeo pPLc28 (Remaut e al. , 1981)modificado pelos inventores, em que o mesmo sítio sintéticode Shine-Dalgarno e o gene da pró-insulina dos plasmídeospLMT8,5 e pPTl foram clonados. Em comparação com este plas-mídeo, mostrando uma indução da proteína de 11% e crescimen-to celular durante o choque térmico, descobriu-se que, du-rante um período de 90 minutos, pLMT8,5 era 100% mais efici-ente (Ver figura 9).

Desta maneira, um vetor de hiper-expressão para E.coli indicou que pLMT8.5 foi obtido. Quando testado na pro-dução de pró-insulna humana do gene sintético, encontraram-se altos níveis de expressão de proteína para indução a par-tir deste gene.

Os plasmídeos pLMT8.5, pPLT4, pHIS, e pPTAl foramdepositados em 24 de junho de 1997 com American Type CultureCollection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Ma-ryland, 20852, USA, sob números de acesso ATCC 98474, 98475,98476 e 98473.

Exemplo 9 - Vetores de Expressão Adicionais

Um gene para quaisquer de: um epitopo de interes-se, um modulador de resposta biológica, um fator de cresci-mento, uma seqüência de reconhecimento, um gene terapêutico,uma proteína de fusão ou outras proteínas de interesse oucombinações destas, (conforme discutido na Descrição Deta-lhada) clonados em um poliligador e inseridos no plasmídeodo exemplo 1, por exemplo, pLMT8.5, pHIS e pPTAl; e, plasmí-deos resultantes dos mesmos, são inseridos em E. coli, porexemplo linhagem N4830-1 (cl857) (contendo o plasmídeoρLMT8.5 + gene). Após indução térmica, há indução da proteí-na recombinante aparentada àquela observada no Exemplo 8,mostrando que, pLMT8.5 é extremamente eficiente.

Desta forma, obteve-se um vetor de hiper-expressãopara E. coli indicado por pLMT8.5. Quando testado na produ-ção de pró-insulina humana do gene sintético, altos níveisde expressão proteína foram encontrados como induzidos destegene; e, pode-se obter altos níveis de expressão do uso doplasmídeo vetor ρLMT8.5 e outros genes exógenos. Como vistoantes, o marcador de seleção pode ser omitido de pLMT8.5 oude seus derivados, por exemplo, pHIS e pPTAl e a seleçãopode ser baseada na expressão de um produto genético, porexemplo, de insulina ou de insulina com um rótulo His. Méto-dos para seleção com base na expressão de uma seqüência decodificação são conhecidos na técnica e podem incluir imuno-precipitação ou outros métodos de seleção com base em anti-corpo, que emprega anticorpos que se ligam ao produto de ex-pressão, ou meio seletivo com relação ao produto de expres-são (ver por exemplo, a Patente U.S. 4.769.330, 4.603, 112,5.110.587, no tocante à seleção usando meio seletivo com re-lação a um produto de expressão; a Patente U.S. n° 5.4 94.807relaciona seleção usando métodos selecionáveis à base de an-ticorpo).

Exemplo 10 - Manipulação de condições de fermenta-ção para intensificar a expressão de proteína

A capacidade produtiva do fermentador pode ser au-mentada substancialmente (< 40% ) retirando-se aproximada-mente 70% do volume do caldo, após um período de indução de420C por 5 horas, adicionando-se meio fresco, voltando-se atemperatura para 30°C por um período adicional de 5 horas,seguido por mais 5 horas de indução a 42°C.Desta foram, semaumentar o tempo de fermentação geral, (20-22 horasO, umvolume maior de biomassa e proteína recombinante são obtidos.

Assim, alternando-se 5 horas de fermentação a 30°Ccom 5 horas de indução a 42°C, resultou numa maior percenta-gem de expressão da proteína recombinante do que quando doinício da indução após fermentação prolongada (aproximada-mente 17 horas) a 30°C.Descobriu-se, que, inativação por calor, influ-encia, negativamente as etapas de purificação do corpo deinclusão, devido a uma coagulação considerável das proteínascitoplasmáticas na temperatura de inativação com calor de80°C.

A inativação e permeabilização celular foi reali-zada ao mesmo tempo, por tratamento noturno das células co-lhidas com tolueno a 11 e 50 mM de EDTA. Purificação adici-onal foi realizada por ressuspensão da biomassa recuperadaem tampão Tris 0,1 M, pH 8,5, contendo Triton X-100 1% eagitando-se por 5 horas ou durante a noite. As células pré-tratadas desta maneira após centrifugação, podem ser usadasdiretamente nas etapas de purificação seguintes.

Adicionalmente, por tratamento adicional com Iiso-zima, uma suspensão de corpos de inclusão isolados pode serobtida, que pode ser separada dos restos de célula por cen-trifugação, em um estado altamente purificado.

Tendo sido descrita, em detalhe, as modalidadespreferidas da presente invenção, deve ficar entendido que, ainvenção definida pelas reivindicações apensas, não deve serlimitada aos detalhes particulares expostos na descrição su-pra, na medida em que muitas variações óbvias da mesma sãopossíveis sem que se afaste do espírito ou escopo da presen-te invenção.

REFERÊNCIAS

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Claims (11)

1. Vetor de expressão para transformar bactériaGram negativa para expressão de pelo menos uma proteína queé heteróloga à bactéria Gram negativa, CARACTERIZADO pelofato de que contém:(a) uma seqüência que codifica uma origem de regi-ão de replicação de pUC8;(b) uma seqüência para resistência à tetraciclina;(c) um fragmento HindIII-HpaI do fago lâmbda con-tendo uma seqüência para o promotor PL do fago lambda;(d) uma região Shine-Dalgarno de genes 10 do fago T7;(e) uma seqüência, para pelo menos um sítio de res-trição para inserção de DNA heterólogo que codifica pelo me-nos uma proteína; e(f) uma seqüência para um terminador de transcri-ção Rho-independente.

2. Vetor de expressão, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADO pelo fato de que inclui pelo menos umaseqüência de DNA que codifica pelo menos uma proteína hete-róloga.

3. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a bacté-ria Gram negativa é selecionada de E.coli e cepa de E.coliN4830-1 (cl289) quando a proteína heteróloga é pró-insulina.

4. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteí-na heteróloga é pró-insulina ou pró-insulina incluindo umacauda.

5. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor éselecionado do grupo consistindo em ATCC98474 (pLMT8.5),ATCC98473 (pPTAl) e ATCC98476 (pHIS).

6. Método para produzir uma proteína heteróloga deum vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindica-ções precedentes, pela extração de uma proteína heterólogade dentro de uma bactéria Gram negativa tendo uma membranade célula sem lisar a bactéria, CARACTERIZADO pelo fato com-preender as etapas de:(a) permeabilizar a membrana de célula por contatoda bactéria com um detergente para separar as proteínas decélulas nativas da membrana celular sem separar a proteínarecombinante da membrana celular;(b) solubilizar a proteína recombinante e a mem-brana celular; e(c) separar a proteína recombinante da membranacelular.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARAC-TERIZADO pelo fato de que o detergente da etapa (a) é TritonX-100.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (a) inclui separar asproteínas de células nativas da membrana celular por centri-fugação, em que o pellet resultante contém a proteína recom-binante dentro da membrana celular.

9. Método, de acordo com as reivindicações 6 a 8rCARACTERIZADO pelo fato de que a solubilização da etapa (b)é por contato da proteína recombinante dentro da membranacelular da etapa (b) com uréia.

10. Método, de acordo com as reivindicações 6 a 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a separação da etapa (c é porcentrifugação e o sobrenadante resultante contém a proteínarecombinante.

11. Método, de acordo com as reivindicações 6 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína heteróloga épró-insulina humana recombinante His-tag e a proteína recom-binante separada da etapa (c) é submetida à sulfitólise, umlíquido é separado da mesma, o produto líquido é subseqüen-temente submetido à coluna de quelação com níquel, o eluatoda mesma é recuperado e renaturado, o produto renaturado éconvertido com tripsina e carboxipeptidase Beo produto re-sultante é submetido à cromatografia para purificar a insu-lina humana recombinante isolada.