JP2010162051A - ペプチドを直接発現させるための改良型細菌宿主細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 遺伝子操作された宿主細胞を増殖させている培養培地の中にペプチド産物を直接発現させるための発現系が開示される。目的とするペプチドをコードするコーディング領域から上流にある、シグナルペプチドをコードするコーディング領域に機能できるよう連結した多数のプロモーターがある調節領域を含む発現ベクターを調製するための特別な汎用クローニングベクターが提供される。また、收率を上げるために多数の転写カセットも使用される。発現系を用いるアミド化ペプチド生産法も開示される。
【選択図】図4
Description
本発明は、ペプチド産物を発現する遺伝子操作された宿主細胞の培養培地の中にそのペプチド産物を直接発現させることに関する。より具体的には、本発明は、クローニングベクター、発現ベクター、宿主細胞、および/または高い收率で宿主から培地の中に排出されるペプチド産物を生産する発酵方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、C末端にグリシンをもつが、後に、該グリシンの代わりにアミノ基を有するアミド化ペプチドに変換されるペプチド産物を直接的に発現させることに関する。
ペプチド産物、すなわち、ペプチド結合によって連結された複数のアミノ酸を含む分子構造を有する任意の化合物を組換えによって生産するための多様な技術が存在する。外来のペプチド産物が小さいときの問題点は、しばしば、そのペプチドを発現させるのに用いた宿主細胞の細胞質または周辺質において内生するプロテアーゼによって直ちに分解されてしまうことである。その他の問題点は、十分な收率を得ること、および、ペプチドを、その3次構造を変える(基本的機能を行う能力を低下させる可能性がある)ことなく比較的純粋な形で回収することなどである。サイズが小さいという問題点を解決するために、先行技術では、しばしば、目的とするペプチド産物を別の(通常より大きな)ペプチドとの融合タンパク質として発現させ、この融合タンパク質を細胞質の中に蓄積させてきた。この別のペプチドは、例えば、目的とするペプチドを宿主の細胞質に存在するプロテアーゼに曝露されることから保護するなど、いくつかの役割を担うことが可能である。このような発現系は、Rayら、Biol Technology, Vol. 11, pages 64‐70、(1993)に記載されている。
従って、ペプチド産生宿主細胞が増殖している培地の中に、ペプチド産物を良好な収率で蓄積させることが本発明の目的である。これは、培地に多くの細胞ペプチドの汚染物がない点で有利である。
本発明は、培地1リットル当り100 mgを超えるペプチド産生を可能にする。これは、新規の宿主(本発明により形質転換、形質導入、または使用されたもの)、新規の発酵方法、またはこれらを2つ以上組み合わせたものを用いて行われる。
本発明は、本発明に係る任意のベクターによって形質転換または形質導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、組換え体タンパク質およびプロテアーゼIIIをそれぞれコードする染色体遺伝子rec Aおよびptrに欠損がある、遺伝子操作された大腸菌である。
本発明は、以下に記載するような本発明に係る好適な発現ベクターなどの発現ベクターを簡単に構築することが可能になる汎用クローニングベクターも提供する。
1つの好適な汎用クローニングベクターは、ペプチドをコードする遺伝子をクローニングするために設計されているpUSEC‐05IQプラスミドである。pUSEC‐05IQベクター(図3C)は、tacおよびlacの2重のプロモーターブロックと、それに続くompAシグナル配列を含んでいる。シグナル配列に直接隣接するのは、シグナル配列と同じフレームでペプチドをコードする遺伝子のクローニングを可能にする固有の制限酵素部位Stu IおよびNco Iである。多重クローニング部位の下流には2重のrrnB T1 T2転写終結因子がある。このベクターは、tacおよびlacプロモーターを制御するためのLacIQリプレッサーをコードする遺伝子のコピーも持っている。このプラスミドは、選抜用にアンピシリン耐性遺伝子を持っている。このベクターは、pUC複製開始点を有するpSP72を基本プラスミドとして用いて構築された。2重プロモーター、ompAシグナル、クローン化されたペプチド遺伝子、および転写終結因子を含む発現カセットを、カセットの上流および下流に位置する3つの固有の制限酵素部位を用いてベクターから切り出すことができる。
別の好適な汎用クローニングベクターは、pUSEC‐05IQの中にクローニングされた発現カセットを最大3つのコピーまでクローニングするための分泌促進産生用ベクターとして作用するpUSEC‐06プラスミドである。図2に示したpUSEC‐06ベクターは、pUSEC‐05IQに存在する発現カセットに隣接する同一の6つの固有の制限部位を含む。6つの部位は、発現カセットの別々のコピーを個々にクローニングするために用いることができる3組の対にグループ化される。ベクターは、分泌因子SecEおよびprlA‐4(SecYの変異対立遺伝子)をコードする遺伝子を含む。lacプロモーターはSecE遺伝子の発現を調節し、trpAプロモーターはprlA‐4遺伝子の発現を調節する。タンデムに並んだT1 T2転写終結因子が、SecEおよびprlA‐4遺伝子の下流に位置している。このプラスミドは、lacオペレーター配列を用いてプロモーターを制御するためにLacIQリプレッサーのコピーを持っている。カナマイシン耐性遺伝子が、選択のためにベクター上にコードされている。pUSEC‐05IQと同様に、pUSEC‐06の基本ベクターは、pUCの複製起点を保持するpSP72であった。
本発明は、上記の好適な汎用クローニングベクターを用いて容易に構築することができるコーディング領域および調節領域を含む発現ベクターをさらに提供する(図3A〜3C)。コーディング領域は、シグナルペプチドをコードする核酸から下流で同じ読み枠で結合している、目的とするペプチド産物に対する核酸を含む。調節領域はコーディング領域と機能できるように連結していて、複数のプロモーターおよび少なくとも1つのリボソーム結合部位を含み、プロモーターの少なくとも1つが、tacおよびlacからなるグループから選択される。
調節領域はコーディング領域に機能できるよう連結されており、プロモーターの少なくとも1つがlacおよびtacからなるグループから選択される複数のプロモーター、および少なくとも1つのリボゾーム結合部位を含む。意外にも、単一の調節領域においてプロモーターを前記した通りに組み合わせると、(より詳細には本明細書に記載されているように)コーディング領域によって産生されるペプチド産物の収率が増加することが分かっている。このような2つのプロモーターは、概して重複した機能を提供するが、付加的または相乗的効果をもたらさないと予想されていた。意外なことに、本出願人らによって行われた実験により、請求の範囲に記載されたプロモーターを組み合わせて用いると相乗効果が示された。他のプロモーターも当技術分野において知られており、本発明に従って、tacおよびlacプロモーターと組合せて用いることができる。このようなプロモーターにはlpp、ara B、trpE、gal Kなどがあるが、これらに限定されるものではない。
コーディング領域は、シグナルペプチドをコードする核酸から下流方向に同じ読み枠内で結合している目的のペプチド産物をコードする核酸を含み、それによって、このコーディング領域は、N末端からC末端までそれぞれ、シグナルおよびペプチド産物を含むペプチドをコードしている。理論に拘束されるわけではないが、シグナルは、ペプチド産物を周辺質に分泌するのに関与することに加えて、タンパク質分解からペプチド産物をある程度保護することができると考えられている。
場合によって、本発明の好適なベクターは、少なくとも1つのプロモーターによって制御される発現を抑制する能力をもつリプレッサーペプチドをコードする核酸を含むことができる。しかし、あるいは、リプレッサーペプチドをコードする核酸は、本発明のベクターをもつ宿主細胞の中で別のベクター上に存在することもできる。多数のオペレーターに対して適当なリプレッサーが当技術分野において知られている。そのどちらか少なくとも一方が本発明に係る好適なベクターの中に常に存在するtacおよびlacプロモーターとともに含まれるlacオペレーターを抑制することから、好適には、本発明の好適な実施形態において、リプレッサーをコードする核酸はlacリプレッサーをコードする。
多数の選択マーカー遺伝子(例えば、カナマイシン耐性をコードする遺伝子)の任意のものが、本発明のベクターの中に存在することが好ましい。これによって、本発明の新規ベクターによって効率的に形質転換または形質移入された宿主細胞を適切に特異的に選択することが可能となる。
少なくとも1つの分泌促進ペプチドをコードする核酸が、場合によっては、本発明のベクター中に存在していてもよい。あるいは、分泌促進ペプチドをコードする核酸は、ペプチド産物をコードするベクターと同じ宿主細胞内で発現される別のベクター上に存在することも可能である。好適には、分泌促進ペプチドはSecY (prlA)またはprlA‐4からなるグループから選択される。SecYおよびprlAは同一のものであり、当技術分野において同義語として用いられていることが指摘されている。prlA‐4はprlAの公知の改変体であり、同様の機能を持っている。別の好適な分泌促進ペプチドは、「SecE」の同義語として用いられる用語である「prlG」としても知られるSecEである。最も好適には、少なくともその1つがSecEであり、他方がSecY (prlA)およびprlA‐4からなるグループから選択される複数の分泌促進ペプチドがコードされている。この2つのものは相互作用して、ペプチド産物が細胞質から周辺質へ移行するのを補助すると考えられている。理論に拘束されるわけではないが、これらの分泌促進ペプチドは、分泌促進機能に加えて、ペプチド産物を細胞質プロテアーゼから保護するのに役立つ可能性もある。
ペプチド産物が高収率で培養培地に拡散または排出されるのを可能にする培養条件下で、非常に高い細胞密度まで宿主細胞を増殖させる新規の発酵条件が提供される。
本発明は、宿主細胞を培養培地から分離する工程、および、その後、培養培地を、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー(ペプチドがカルシトニンである場合は、好適には陽イオン交換クロマトグラフィー)、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーからなるグループから選択される少なくとも1種類のクロマトグラフィーにかける工程を含む、ペプチド産物を回収する方法をさらに提供する。システイン残基を含有するペプチドにおいては、ペプチドの凝集を阻止して単量体ペプチドの収率を増大させるために、精製工程の前またはそれと同時にS‐スルホン化を行うことができる。好適には、3つのクロマトグラフィー工程を、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および別のイオン交換クロマトグラフィーという順に用いる。
概要
以下に説明する通り、本出願人らは、sCTgly直接発現発酵プロトコルの誘導期後18〜26時間の間、1時間当り最大25%の割合で細胞外sCTglyを分解するのに関与する大腸菌メタロプロテアーゼを同定した。sCTglyの分解は、17時間より前でも未定の割合で生じる。以下に詳述する実験によって、sCTglyの分解に関与するプロテアーゼが、大腸菌のptr遺伝子に由来するプロテアーゼIIIであることが示された。
プロテアーゼIIIは、12 kDaよりも小さなペプチドを選択的に分解する107 kDaの亜鉛メタロプロテアーゼである。文献によれば、プロテアーゼIIIの活性は、キモトリプシンの性質に似ていることが示されている。プロテアーゼIIIは、インスリンのB鎖をTyr‐Leuの間、およびPhe‐Tyrの間でゆっくりと切断する。プロテアーゼIIIには重要な生理学的役割はないと考えられているため、それを欠失させても、宿主の増殖に有害な効果をもたらさない(Dykstra et al. J. Bacteriol. 163: 1055‐1059; 1985)。特に、分泌増加期の間、プロテアーゼIIIの活性が増殖培地中にしばしば見られた(Diaz‐Torres et al. Can. J. Microbiol. 37: 718‐721; 1991)。本実験では、発酵過程で培養培地におけるタンパク質分解活性が原因となって我々のモデルペプチドであるsCTglyが消失することを調べる実験、およびプロテアーゼIIIの活性を除去するための大腸菌株の変異誘発についてまとめる。
条件培地におけるsCTglyの分解
細胞を除去し、sCTglyを添加した培地を30℃でインキュベートした後のsCTglyの減少について、UGL165(pSCT 029によって形質転換された大腸菌BLR)およびUGL703(pSCT 038によって形質転換された大腸菌BLR)の2つの直接発現発酵物から得た条件培地サンプルを試験した。条件発酵培地中のsCTgly濃度をCEX HPLCによって測定した。表2は、UGL703の発酵物から回収された26時間目の培地サンプルから、sCTgly分解を標準的に試験したデータを示している。ベスタチン(Bestatin)、PMSF、α2‐マクログロブリン、およびEDTAを含む、さまざまなプロテアーゼインヒビターを、sCTglyのタンパク質分解を低下または消滅させる能力について調べた。EDTAだけがsCTglyのタンパク質分解を低下させることができた。EDTAは、活性に必要とされる2価陽イオンに結合することによってメタロプロテアーゼを不活性化する。EDTAは、sCTglyのタンパク質分解を低下させることができたが、活性がより低い別のプロテアーゼまたは残存プロテアーゼIII活性の結果であるらしい残存sCTgly分解がいくらかあった。
以前の実験によって、sCTglyの一次分解に関与するプロテアーゼがメタロプロテアーゼであることが示された。大腸菌プロテアーゼIIIは、周辺質/細胞外の亜鉛メタロプロテアーゼである(宿主(Dykstra et al. J. Bacteriol. 163: 1055‐1059, 1985;分泌(Diaz‐Torres et al. Can. J. Microbiol. 37: 718‐721,1991)。他の2価陽イオンであるマグネシウムと比較したときの亜鉛に対する選好性を試験した。発酵培地サンプルを50 mM EDTAとともに20分間予め保温した後、sCTglyを最終濃度が約250 mg/Lになるようサンプルに加えた。15 mMのMgCl2またはZnCl2を別々のサンプルに加えて、30℃で4時間保温した。sCTglyの濃度を上記したように測定し、その結果を表4に示す。
30℃でUGL703(BLR中のpSCT038)を発酵させる間、1時間当り20%という控え目なsCTglyの減少量を仮定すると、発酵のその後の段階で減少するsCTglyの総量を計算することが可能になる。この見積もりは、誘導後17から26時間までの発酵2301‐9004から得たsCTgly産生データに基づいていた。連続した時間の各組合せのsCTgly濃度を平均した。そして、1時間当りの平均分解割合を20%と仮定し、平均sCTgly濃度に0.2を乗じて、分解されるsCTglyの量を計算した。1時間ごとに、9時間にわたって失われるsCTglyの量が累積すると仮定して、1時間当りに失われるsCTglyの量を推定することができよう。この推定結果を表7に示す。
大腸菌BL21におけるptrおよびrecAの機能の破壊
プロテアーゼIIIをコードするptr遺伝子、およびrecA遺伝子のコーディング領域を破壊して大腸菌BL21を改変した。P1による形質導入を用いて、大腸菌SF 103のDNAをP1バクテリオファージにパッケージングして、大腸菌BL21の細胞に感染させるために用いた。ファージと細胞の混合液を、クロラムフェニコールを含むLB寒天平面培地で平面培養したが、クロラムフェニコール破壊ptr遺伝子を含む細胞だけが、クロラムフェニコール存在下で増殖することができるはずである。10個のクロラムフェニコール耐性形質導入体が、例えば、ラクトース上で増殖する能力およびストレプトマイシン感受性のようなBL21の遺伝子マーカーについても確認された。得られた菌株BL21Δptrを、recA‐遺伝子型をもつ大腸菌株BLRを用いたP1形質転換法によってさらに改変した。BLR由来のテトラサイクリン破壊recA‐遺伝子をBL21Δptrに形質導入するために用いて、BL21ptr‐ recA‐菌株を作出した。20個のBL21 ptr‐ recA‐形質導入体を同定した。20個の単離株にはBLM1〜20の名前が付与された。
8つの大腸菌BLM菌株BLM1〜8を、sCTgly発現ベクターpSCT‐038で形質転換し、UGL801と名づけた。振とうフラスコの中で、sCTglyの発現について、各形質転換から2つの単離株をスクリーニングした。50 ug/mLのカナマイシンを含む25 mLのCPM接種用培地Iに、各クローンを一晩培養したものから700μLを採って接種した。OD 600 nmが2〜3になるまで培養液を増殖させてから150μMのIPTGにより誘導し、さらに4時間増殖させた。4時間後のサンプルおよびUGL703対照についての結果を表8に示す。UGL801クローンのうち6個は、CBK. 025に概説されている直接発現用プロトコルを用いて、1.25リットルの発酵液の中でもスクリーニングした。各発酵液から選択されたサンプルから得られた結果を表9に示す。
上記したとおり、プラスミドベクターpSCT038を用いてBLM‐6宿主菌株を形質転換してUGL801組換え細胞株を得た。新しい細胞株UGL801のために最適化された発酵条件の開発を、UGL703の直接発現(Direct Expression)条件(細胞株UGL703は、プラスミドpSCT038を含有する大腸菌BLRである)を用いて、sCTglyを生産するためのUGL801細胞株を評価することから開始した。この条件は、UGL703のために開発された培地の中で、30℃、pH6.6、dO2≧70%、26時間にわたる誘導供給(induced feed)して行われる基質制限された流加発酵である。開始時のDE発酵プロトコルでは、容量收率が200 mg/Lよりも低く、特異的收率は、細胞の湿細胞重量1グラム当り約1. 3 mgという結果であった。宿主細胞の改変によって宿主細胞BLM‐6と、組換え細胞株であるUGL801がもたらされ、UGL703の発酵条件下で試験すると、誘導後26時間で約1.3倍に容量増加を示して、200 mg/Lを上回り、かつ、特異的收率が、誘導後26時間で1.2倍の増加を示した。これらのデータを表10に示す。プロテアーゼのバックグラウンドが低下しており、かつ、増殖して発酵初期に未分解の組換えタンパク質を産生することができるUGL801細胞株を導入することで、收率および処理の信頼性が顕著に改善された。
新規宿主細胞BLM‐6を開発している過程で、発酵温度でのプロテアーゼ分解の特徴を調べたところ、先祖である宿主細胞BLRを用いると、30℃より高い温度でグリシン伸長されたペプチドが速やかに分解されることが示された。新しいプロテアーゼ欠損株のBLM‐6は、低い細胞外プロテアーゼアレイを示し、より高い温度で増殖して、場合によってはより大きな細胞塊およびより多い産物を産生することができるかもしれないことを示唆した。発酵pHを6.6で維持すると、両バッチおよび流加段階の全発酵の温度が32℃に上昇した。BLM‐6に基づく新規の組換え細胞株であるUGL801は、高い温度で良好に増殖してsCTglyを発現させた。表11から分かるように、発酵温度を上げると、新規の細胞株の容量生産性および特異的生産性が上昇した。
細胞当りの生産性を高める目的で、UGL703(BLR::pSCT038)の直接発現発酵法のために開発された指数関数的供給プログラムを変更した。供給用培地を供給する速度を、誘導後20時間目の供給速度で誘導後26時間が経過するまで一定に保った。この変更の結果を表12に示す。
酵母抽出物を添加することで、細胞増殖に必要なビタミンおよび微量成分のほとんどが提供されると、一般的には仮定されている。しかし、これらの組換え細胞に対するタンパク質合成の要求が高まると、さらなるビタミンおよび微量成分が必要であることが認識された。供給用培地にビタミン/微量成分混合物を補ったところ、発酵実験の結果、この混合物を加えることで、発酵生産性に一定の安定性がもたらされることが示された。ビタミン/微量成分混合物の添加による生産性および再現性は、定常的供給時間を26時間よりも長くできるかもしれないことを示唆した。
流加および誘導の発酵時間を延長することの実行可能性を評価した。延長の基礎となったのは、26時間まで延長したときに、細胞湿重量の増加が最低のままで細胞外ペプチドを定常的産生した20時間目での供給速度であった。供給用培地にビタミン/微量成分を補給したことにより、誘導時間の長さを26時間以上にしても発酵が十分に安定であることが示唆された。発酵の供給/誘導時間を徐々に29時間まで延長した。別のデータでは、29時間が、タンパク質の消失または細胞溶解の証拠なしに発酵物を生産する期間の限界であることが示唆されていた。20時間目に成立した一定の供給速度で、発酵供給/誘導時間を29時間まで延長した。
直接発現発酵プロトコルでは、UGL703は細胞外sCTglyを、容量レベルで200 mg/Lよりも少なく、細胞の湿細胞重量1グラム当り約1. 3 mgのペプチドという特異的生産性で産生した。宿主細胞BLM‐6の作出は、プロテアーゼのバックグラウンド量を低下させることによって生産性の第1の改善をもたらした。BLM‐6を、元のプラスミドベクターであるpSCT038の宿主として用いたところ、生産性が20〜30%改善されているUGL801が得られた。本書面に記載されている更なる改良は、容量および特異的な生産性を最適化するため発酵プロトコルに対して行われた。以下の表は、UGL703で開始し、新規の細胞株UGL801によって進められたもの、および、発酵プロトコルを最適化するために行われた4つの改良点の容量生産性および特異的生産性の比較を要約したものである。誘導後26時間のデータを比較すると、発酵法の改良点を合わせたものは、誘導後26時間のデータで比較すると、UGL801の容量生産性を2.2倍に上昇させた一方、誘導後26時間目の特異的生産性は3倍よりも大きく増加した(3.2倍)。時間を29時間まで延長したところ、約12%の容量増加があった。UGL703の26時間目の特異的生産性と比較すると、誘導後29時間目のUGL801の最終的な発酵プロトコルの特異的生産性が3.46倍上昇した。
Claims (55)
- (a)少なくとも2つのプロモーターを含む調節領域
(b)シグナル配列をコードする核酸
(c)該シグナル配列と同一の読み枠にあって、該調節領域に機能できるよう連結しているペプチドをコードする遺伝子のクローニングを可能にする2つの遺伝子クローニング用酵素制限部位、
(d)該遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側にある、少なくとも2つのカセットクローニング酵素制限部位、および
(e)該調節領域から5’側にある、少なくとも2つのカセットクローニング酵素制限部位を含むクローニングベクターであって、該制限酵素部位はすべて、互いに異なっており、該ベクター内において固有のクローニングベクター。 - 調節領域がまさに2つのプロモーターを有する、請求項1記載のクローニングベクター。
- 1つのプロモーターがtacプロモーターであり、調節領域内でもう1つのプロモーターの5’側にある、請求項2記載のベクター。
- 調節領域が、tacプロモーターおよびlacプロモーターの両方を含む、請求項2記載のベクター。
- lacプロモーターが、tacプロモーターの3’側にある、請求項4記載のベクター。
- シグナルペプチドをコードする核酸が、分泌性細菌タンパク質のシグナルペプチドをコードする、請求項1記載のベクター。
- シグナルがOmpAシグナルペプチドである、請求項6記載のベクター。
- ペプチドをコードする遺伝子のクローニングを可能にする2つの遺伝子クローニング用酵素制限部位がStu IおよびNco Iである、請求項1記載のクローニングベクター。
- 遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側に3つのカセットクローニング酵素制限部位、およびプロモーター領域から5’側に3つのカセットクローニング酵素制限部位を有する、請求項1記載のクローニングベクター。
- 遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側にある3つのカセットクローニング酵素制限部位がAsc I、Mfe I、およびBlp Iである、請求項9記載のクローニングベクター。
- プロモーター領域から5’側にある3つのカセットクローニング酵素制限部位がBsp EI、Afl II、およびSac IIである、請求項9記載のクローニングベクター。
- プロモーターの少なくとも1つによって調節される発現を抑制することができるリプレッサーペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項2記載のベクター。
- リプレッサーをコードする核酸がlacリプレッサーをコードする、請求項12記載のベクター。
- 遺伝子クローニング用酵素制限部位から5’側、および、該遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側にあるカセットクローニング酵素制限部位から3’側に転写終結因子をさらに含む、請求項2記載のベクター。
- 転写終結部位が2重のrrnB T1 T2転写終結因子である、請求項14記載のベクター。
- 2つの遺伝子クローニング用酵素制限部位を用いて、シグナルペプチドをコードする核酸の3’側に同じ読み枠でクローニングされているペプチド産物をコードする核酸をもつコーディング領域をさらに含む、請求項2記載のベクター。
- ペプチド産物が、10 KDaよりも少ない分子量を有する、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物のC末端アミノ酸がグリシンである、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物が、ヒトグルカゴン様ペプチド1、ヒトグルカゴン様ペプチド2、またはそのアナログである、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物がサケカルシトニンである、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物がインスリンである、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物が、ヒト副甲状腺ホルモンまたはそのアナログである、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物が、ヒト副甲状腺ホルモンアナログPTH 1‐34またはPTH 1‐34アミドである、請求項16記載のベクター。
- ペプチド産物が、ヒト副甲状腺ホルモンアナログPTH 1‐31またはPTH 1‐31アミドである、請求項16記載のベクター。
- 請求項2記載のベクターによって形質転換または形質導入された宿主細胞。
- 細菌細胞である、請求項25記載の宿主細胞。
- 細菌細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項26記載の宿主細胞。
- 細菌細胞が大腸菌である、請求項27記載の宿主細胞。
- 大腸菌が菌株BLRである、請求項28記載の宿主細胞。
- 大腸菌の宿主細胞菌株が、プロテアーゼIIIをコードする染色体遺伝子ptrに欠損があるよう遺伝子操作されている、請求項28記載の宿主細胞。
- ATCCアクセッション番号がPTA‐5567である、pUSEC‐05IQクローニングベクター。
- 複数の転写カセットを含有する発現ベクターを調製する方法であって、各カセットが、
(1)ペプチド産物をコードする核酸によるコーディング領域であって、シグナルペプチドをコードする核酸の3’側に同一の読み枠で結合した領域、および
(2)このコーディング領域に機能できるよう連結している調節領域であって、複数のプロモーターを含む領域を含み、
該方法が、
(a)2つの遺伝子クローニング用酵素制限部位を用いて、シグナルペプチドをコードする核酸の3’側に、同一の読み枠でペプチド産物をコードする核酸をもつコーディング領域を請求項4記載のクローニングベクターの中にクローニングして、クローニングベクター内に発現カセットを形成する工程、
(b)該遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側にあるカセットクローニング酵素制限部位で切断する第1の制限酵素、および該遺伝子クローニング用酵素制限部位から5’側にあるカセットクローニング酵素制限部位で切断する第2の制限酵素を用いて、クローニングベクターから発現カセットを切り出す工程、
(c)発現カセットを、工程(b)のカセットクローニング酵素制限部位を含む鋳型発現用ベクターの中に、第1の制限酵素部位が第2の制限酵素部位の3’側になるようライゲーションする工程であって、該鋳型発現用ベクターが、
(i)第1および第2の制限酵素によってライゲーションされており、かつ
(ii)少なくとも1組以上のカセットクローニング酵素制限部位、例えば、該組の第1の部位が、請求項4記載の該遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側にあるカセットクローニング酵素制限部位と同一であり、該組の第2の部位が、請求項4記載の該遺伝子クローニング用酵素制限部位から5’側にあるカセットクローニング酵素制限部位と同一であって、該組の第1の部位が、該組の第2の部位から3’側にあって、各カセットクローニング酵素制限部位が鋳型ベクターに対してユニークであり、それ以外の請求項4記載のカセットクローニング酵素制限部位が、第1のカセットクローニング酵素制限部位の5’側の領域、および第2のカセットクローニング酵素制限部位の3’側の領域にないか、または、カセットクローニング酵素制限部位の該組の第1の部位の5’側の領域および第2の部位の3’側の領域にないものなどを含んでいる工程、および
(d)工程(b)および(c)を1回以上繰り返す工程であるが、ただし、工程(b)の第1および第2の制限酵素ではなく、カセットクローニング酵素制限部位のいずれか1組の第1の部位および第2の部位を切断する制限酵素を用いる工程。 - クローニングベクター上に、Asc I、Mfe I、およびBlp Iである、遺伝子クローニング用酵素制限部位から3’側にある3つのカセットクローニング酵素制限部位がある、請求項32記載の方法。
- クローニングベクター上に、Bsp EI、Afl II、およびSac IIである、遺伝子クローニング用酵素制限部位から5’側にある3つのカセットクローニング酵素制限部位がある、請求項32記載の方法。
- 調節領域がまさに2つのプロモーターを有する、請求項32記載方法。
- 1つのプロモーターが、調節領域内の別のプロモーターの5’側にあるtacプロモーターである、請求項32記載の方法。
- 調節領域が、tacプロモーターおよびlacプロモーターの両方を含む、請求項35記載の方法。
- lacプロモーターが、tacプロモーターの3’側にある、請求項36記載の方法。
- シグナルペプチドをコードする核酸が、分泌性細菌タンパク質のシグナルペプチドをコードする、請求項32記載の方法。
- シグナルがOmpAシグナルペプチドである、請求項39記載の方法。
- 2つの遺伝子クローニング用酵素制限部位がStu IおよびNco Iである、請求項32記載の方法。
- 鋳型発現用ベクターが、プロモーターの少なくとも1つによって調節される発現を抑制することができるリプレッサーペプチドをコードする核酸を含む、請求項32記載の方法。
- リプレッサーをコードする核酸がlacリプレッサーをコードする、請求項42記載の方法。
- 鋳型発現用ベクターが、分泌因子をコードする核酸を含む、請求項32記載の方法。
- 分泌因子がSecEおよびprlA‐4である、請求項44記載の方法。
- 鋳型発現用ベクターが、分泌因子をコードする塩基配列の5’側の転写終結部位を含む、請求項44記載の方法。
- 転写終結部位が2重のrrnB T1 T2転写終結因子である、請求項46記載の方法。
- ペプチド産物が、10 KDaよりも少ない分子量を有する、請求項32記載の方法。
- ペプチド産物のC末端アミノ酸がグリシンである、請求項48記載の方法。
- ペプチド産物が、ヒトグルカゴン様ペプチド1、ヒトグルカゴン様ペプチド2、またはそのアナログである、請求項32記載の方法。
- ペプチド産物がサケカルシトニンである、請求項32記載の方法。
- ペプチド産物がインスリンである、請求項32記載の方法。
- ペプチド産物が、ヒト副甲状腺ホルモンまたはそのアナログである、請求項32記載の方法。
- ペプチド産物が、ヒト副甲状腺ホルモンアナログPTH 1‐34またはPTH 1‐34アミドである、請求項32記載の方法。
- ペプチド産物が、ヒト副甲状腺ホルモンアナログPTH 1‐31またはPTH 1‐31アミドである、請求項32記載の方法。
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