CN102337241B - 用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞。本发明还涉及表达系统，用于将产物直接表达到遗传工程化宿主细胞所生长的培养基中。用特殊选择的宿主和/或发酵工艺获得了高产量，发酵工艺包括小心控制细胞生长速度、在生长速度期间使用诱导物以及在生长阶段期间使用诱导物。提供了用于制备表达载体的特殊的通用克隆载体，其包括具有可操作地与编码信号肽的编码区连接的多个启动子的控制区，该信号肽编码区位于编码所感兴趣的肽的编码区的上游。也使用多种转录盒来增加产量。也公开了使用表达系统来生产酰胺化的肽。

Description

用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞
本申请是申请日为2005年3月10日的中国专利申请200580007801.X“用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞”的分案申请。 
技术领域
本发明涉及直接表达肽产物到表达该肽产物的遗传工程化宿主细胞的培养基中。更特别地，本发明涉及克隆载体、表达载体、宿主细胞和/或用于高产量生产从宿主分泌出并进入培养基中的肽产物的发酵方法。在一些实施方案中，本发明涉及直接表达具有C-末端甘氨酸的肽产物，它在此后被转化为具有代替所述甘氨酸的氨基的酰胺化肽。 
背景技术
存在各种用于重组生产肽产物的技术，肽产物就是任何其分子结构包括多个通过肽键连接的氨基酸的化合物。当外源肽产物较小时的问题就是它们经常容易被表达该肽的宿主细胞的细胞质或周质中的内源蛋白酶降解。其它问题包括不改变其三级结构(它可能不令人期望的减少了发挥其基本功能的能力)而得到足够的产量并以相当纯的形式回收该肽。要解决大小较小的问题，现有技术中已经频繁地将所感兴趣的肽产物与另一(通常更大的)肽作为融合蛋白来表达，并在细胞质中积累这种融合蛋白。另一肽可能提供几种功能，例如保护所感兴趣的肽不暴露给宿主细胞的细胞质中存在的蛋白酶。一种这样的表达系统在Ray et al.，Bio/Technology，Vol.11，pages 64-70，(1993)中描述过。 
但是，用这种技术分离肽产物需要切割融合蛋白质并从宿主细胞质中正常存在的所有肽中纯化出来。这可能使许多其它可能降低方法的总效率的步骤成为必要。例如现有技术的融合蛋白在细胞质中积累时，必须经常收获并裂解细胞，在澄清步骤中去除细胞碎片。根据本发明，所有这些都被避免，其中所感兴趣的肽产物被直接表达到培养基中并从培养基中回收。 
在现有技术中，经常有必要使用亲合层析步骤来纯化融合蛋白， 这还是必须经历切割来将所感兴趣的肽与其融合配偶体分开。例如，在上述Biol Technology论文中，用溴化氰将鲑鱼降钙素前体从其融合配偶体上切割下来。这个切割步骤还是需要额外的步骤来保护鲑鱼降钙素前体1位和7位的半胱氨酸巯基基团。利用磺化作用为半胱氨酸提供保护基团。这随后又改变了鲑鱼降钙素前体的三级结构，需要在随后复性前体(当然还要除去保护基团)。 
本发明的肽产物只表达为带有信号序列，不与大的融合配偶体一起表达。本发明产生了“直接表达”。它最初表达为带有加入到N-末端侧的信号区域。然而，该信号区域是在肽产物分泌到细胞周质期间被翻译后切除的。其后，肽产物从周质扩散或者分泌到细胞外的培养基中，在此它可能以适当的三级结构被回收。它不与任何融合配偶体连接，后者的除去可能首先需要细胞裂解变性或修饰，尽管在本发明的一些实施方案中，使用了磺化来保护肽产物纯化期间的半胱氨酸巯基基团。 
现有技术中在细胞内累积肽产物的另一问题是，累积产物可能对细胞有毒，可能因此限制了可被合成的融合蛋白的量。该方法的另一个问题是，大多数产物通常是由较大的融合配偶体构成的。例如，90％的产物可能是较大的融合配偶体，这就导致只有10％的产物属于所感兴趣的肽。该方法还有另一问题是，融合蛋白可能在细胞内形成不溶的包含体，在裂解之后包含体的溶解可能不产生有生物活性的肽。 
现有技术中试图将肽与附加在N-末端上的信号肽一起表达以引导期望的肽产物分泌到周质中(参见EP 177,343，Genentech Inc.)。几个信号肽已经被鉴别(参见Watson，M.Nucleic Acids Research，Vol 12，No.13，pp：5145-5164)。例如，Hsiung et al.(Biotechnology，Vol 4，November 1986，pp：991-995)使用大肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)的信号肽来引导某些肽进入周质中。最经常的是，分泌到周质中的肽常常倾向于保持在那里而最少地分泌到培养基中。可能需要并不期望的进一步的步骤来破坏或通透外膜以释放足量的周质组分。一些现有技术试图将肽从周质分泌到细胞外的培养基中，包括破坏外膜屏障的完整性，其通过让宿主细胞同时表达含有信号肽的期望的肽产物与能使外膜成为可通透的或渗漏的溶胞肽蛋白(美国专利No.4,595,658)。然而，人们需要小心溶胞肽蛋白的量，以便不会破坏细胞的完整性并杀死细 胞。通过这种技术也可能使得所感兴趣的肽的纯化变得更加困难。 
除了上述破坏外膜稳定性的技术外，还有不这么严格的使革兰氏阴性细菌外膜通透的方法。这些方法不会引起不必要的能导致细胞生存力降低的外膜的破坏。这些方法包括但不限于使用阳离子试剂(Martti Vaara，Microbiological Reviews，Vol.56，pages 395-411(1992))和甘氨酸(Kaderbhai et al.，Biotech.Appl.Biochem，Vol.25，pages53-61(1997))。阳离子试剂通过与外膜的脂多糖主链相互作用并引起脂多糖主链的损伤来使外膜通透。损伤和破坏的量可以是非致死的或致死的，这取决于所使用的浓度。甘氨酸可取代肽聚糖的肽组分中的丙氨酸残基。肽聚糖是革兰氏阴性细菌外细胞壁的结构组分之一。在高浓度的甘氨酸中培养大肠杆菌会提高甘氨酸-丙氨酸的取代频率，这将导致细胞壁的缺陷，从而增加通透性。 
使期望的肽产物分泌的另一现有技术方法包括将产物融合到正常地被分泌到培养基(溶血素)中的载体蛋白上或者融合到在外膜上表达的完整蛋白质上(如ompF蛋白质)。例如，当结合了ompF蛋白片段时，人β-内啡肽可以通过大肠杆菌细胞作为融合蛋白被分泌(EMBOJ.，Vol 4，No.13A，pp：3589-3592，1987)。然而所期望的肽产物的分离很困难，因为必须将它们与载体肽分开，并且包括一些(虽然不是全部)与在细胞质中的融合肽的表达有关的缺点。 
还有另一现有技术方法，就是在遗传上改变宿主细胞以产生具有相对不能保留周质的肽和蛋白质的可通透性外膜的新菌株。然而这些新菌株很难维持，可能需要严格的条件，这反过来又影响了所期望的肽产物的产量。 
Raymond Wong et al.(美国专利No.5,223,407)设计了另一分泌肽产物的方法，其通过制造包括编码异源蛋白的DNA的重组DNA构建体，该DNA在读码框内与编码ompA信号肽的DNA以及包括tac启动子的控制区域连接。据报道，该系统的产量明显少于用本发明所能得到的产量。 
虽然现有技术可能允许蛋白质从周质输出到培养基中，但是这可能导致不健康的细胞，其不容易培养到所期望的高密度，从而又影响了产物的产量。 
更近来，Mehta et al.(美国专利No.6,210,925)披露了用于将肽产 物直接表达到培养遗传工程化宿主细胞的培养基中的表达系统。高产量的获得在于用了新载体、特殊的宿主选择、和/或包括小心控制细胞生长速度的发酵工艺、以及在生长期使用诱导物。提供了特殊的载体，其包括具有多个启动子的并与编码信号肽的编码区域可操作地连接的控制区域，该信号肽编码区域位于编码所感兴趣的肽的编码区的上游。也使用多个转录盒来增加产量。 
本发明设法使用新的遗传工程化宿主细胞来用有效的表达载体生产更高产量的肽。本发明也设法使用新的通用克隆载体来生产有效的表达载体。 
发明内容
因此，本发明的目标就是让肽产物在培养产生肽的宿主细胞的培养基中以高产率累积。这是有利的，因为培养基相对不受许多细胞肽的污染。 
本发明的另一目标是提供遗传工程化宿主细胞，其在表达发明的新的表达载体并使肽产物在培养产生肽的宿主细胞的培养基中以高产率累积方面特别有用。 
本发明的另一目标是提供改进的发酵工艺，用来增加通过遗传工程化宿主细胞表达的肽产物的产率。 
本发明进一步的目标是提供改进的方法，其利用具有C-末端甘氨酸的前体肽来生产酰胺化的肽，该前体在直接表达到根据本发明的培养基后被酰胺化。 
因此，本发明提供了缺乏分别编码重组蛋白A和蛋白酶III的染色体基因recA和ptr的遗传工程化大肠杆菌细菌。 
本发明也提供了克隆载体，包括：(a)包括至少两个启动子的控制区；(b)编码信号序列的核酸；(c)两个基因克隆酶限制位点，其允许符合所述信号序列读码框编码地克隆肽的基因，并与所述控制区可操作地连接；(d)至少两个盒克隆酶限制位点，位于所述基因克隆酶限制位点的3′；以及(e)至少两个盒克隆酶限制位点，位于所述控制区的5′，其中所有所述的限制酶位点互不相同，并在所述载体中是独特的。 
本发明进一步提供了制备含有多个转录盒的表达载体的方法，每个盒包括：(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接 到编码信号肽的核酸3′；以及(2)可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子，所述方法包括：(a)使用两种基因克隆酶限制位点将所述带有编码肽产物的核酸的编码区符合读码框地克隆到本发明克隆载体中编码信号肽的核酸的3′，从而形成克隆载体中的表达盒；(b)使用在所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点处进行切割的第一限制酶和在所述基因克隆酶限制位点5′的盒式克隆酶限制位点处进行切割的第二限制酶将表达盒从克隆载体上切割下来；(c)将表达盒连接到含有步骤(b)的盒克隆酶限制位点的模板表达载体中，这样第一限制酶位点就在第二限制酶位点的3′，其中所述模板表达载体：(i)已经用第一和第二限制酶连接，以及(ii)含有至少多一对的盒克隆酶限制位点，例如位点对的第一成员与权利要求4的位于所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点相同，而位点对的第二成员与权利要求4的位于所述基因克隆酶限制位点5′的盒克隆酶限制位点相同，其中位点对的第一成员在位点对的第二成员3′，每个盒克隆酶限制位点是模板载体上独特的，没有其它的权利要求4的盒克隆酶限制位点落在第一盒克隆酶限制位点5′的区域和第二盒式可能性酶限制位点3′的区域中，或者落在盒克隆酶限制位点对第一成员5′和盒克隆酶限制位点对第二成员3′的区域中；以及(d)至少重复一次步骤(b)和(c)，但是使用切割盒克隆酶限制位点对任一第一成员和第二成员的限制酶，而不是步骤(b)的第一和第二限制酶。 
本发明也提供缺乏分别编码重组蛋白A和蛋白酶III的染色体基因rec A和ptr的大肠杆菌宿主细胞，所述宿主含有并表达包括多个串联式转录盒的表达载体，每个盒包括：(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3′；以及(2)可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子。 
本发明进一步提供生产肽产物的方法，包括在培养基中培养用本发明表达载体转化或转染的本发明的宿主细胞，然后从培养宿主细胞的培养基中回收肽产物。 
本发明也提供生产酰胺化肽产物的方法，包括步骤：(a)在培养基中培养用本发明表达载体转化或转染的本发明的宿主细胞，其中肽产物包括C-末端甘氨酸；(b)从所述培养基中回收所述肽产物；以及(c)通过将所述C-末端甘氨酸转化为氨基而将所述肽产物转变为酰胺化的肽。 
生物保藏 
以下生物材料保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，具有以下分类名称、保藏号和保藏日。 
  生物材料   保藏号   保藏日
  Escherichia coli：BLM-6   PTA-5500   2003年9月11日
  Recombinant Escherichia coli：UGL801   PTA-5501   2003年9月11日
  Recombinant Escherichia coli：UGL810   PTA-5502   2003年9月11日
  Plasmid vector：pUSEC-051Q   PTA-5567   2003年10月9日
  Plasmid vector：pUSEC-06   PTA-5568   2003年10月9日
  Recombinant E.coli cell line：UGL820   PTA-5569   2003年10月9日
附图说明
图1A、1B和1C显示了pUSEC-03载体(1A)的构建示意图，其用于pUSEC-05载体(1B)的构建，而后者又用于载体pUSEC-05IQ(1C)(ATCC保藏号PTA-5567)的构建。 
图2A和2B显示了pCPM-00载体(2A)的构建示意图，其用于pUSEC-06载体(2B)(ATCC保藏号PTA-5568)的构建。 
图3A、3B和3C显示了示意图，将统称为肽X的肽连接到分泌表达载体pUSEC-05IQ(3A)中以产生载体pPEPX-01，后者与载体pUSEC-06一起用来构建单基因生产载体pPEPX-02(3B)，pPEPX-02(3B)用于构建双基因生产载体pPEPX-03。 
图4显示了pSCT-038载体的构建示意图。pSCT-038用于转化大肠杆菌BLR和BLM-6，并分别产生双基因UGL 703和UGL801克隆。 
发明详述 
本发明使得产率超过每升培养基100mg的肽产物。它是这样实现的，用新的宿主(如根据本发明那样转化、转染或者使用)、新的发酵工艺、或者两种或更多前述手段的结合。 
宿主细胞 
本发明提供了转化或转染了本发明任何载体的宿主细胞。宿主细胞是缺乏分别编码重组蛋白A和蛋白酶III的染色体基因recA和ptr的遗传工程化大肠杆菌细菌。 
优选地，遗传工程化大肠杆菌细菌是已经缺乏染色体基因recA的BLR菌株。更优选地，本发明的宿主细胞是具有ATCC保藏号PTA-5500的突变体BLR菌株BLM6。 
优选的通用克隆载体概述 
本发明也提供了通用克隆载体，其使得诸如下文中提到的本发明优选表达载体的表达载体能够简单构建。 
pUSEC-05IQ载体 
一种优选的通用克隆载体是pUSEC-05IQ质粒，它被设计来克隆编码肽的基因。pUSEC-05IQ载体(图3C)含有tac和lac的双重启动子区，接下来是ompA信号序列。与信号序列直接相邻的是允许符合信号序列读码框地克隆编码肽的基因的独特限制位点Stu I和Nco I。多克隆位点的下游是双重rrnBT1T2转录终止子。载体也携带了编码调节tac和lac启动子的LacIQ阻遏物的基因的拷贝。质粒携带了氨苄青霉素抗性基因用于选择。载体是使用pSP72作为基础质粒构建的，其携带pUC复制起始位点。含有双重启动子、ompA信号、克隆的肽基因和转录终止子的表达盒可以用位于盒上游和下游的三个独特的限制位点从载体上切割下来。 
该载体的有用性有两个部分。第一个有用性部分是将该载体作为分泌异源多肽的通用表达载体使用。使用符合ompA信号序列读码框地连接的克隆位点，任何异源基因都可被克隆并表达为分泌产物。该功能可用于快速筛选潜在的基因靶，而不需要裂解细胞去寻找表达。这个有用性是以克隆和表达的肽的期望功能为基础的，这些肽通过扩散到培养基中而被表达、分泌并转运。第二个有用性部分在于表达盒的切除所使用的六个限制位点的用途。这些位点与第二载体一起被结合使用，用于表达盒多重拷贝的克隆以增加表达水平。 
pUSEC-06载体 
另一优选的通用克隆载体是pUSEC-06质粒，它用作分泌增强型生产载体用于克隆最多三个拷贝的被克隆到pUSEC-05IQ中的表达盒。在图2中显示的pUSEC-06载体含有在pUSEC-05IQ中发现的位于表达盒侧翼的相同的六个独特的限制位点。这六个位点组成三对，可被用于单独克隆表达盒的各个拷贝。载体包含编码分泌因子SecE和prlA-4的基因(SecY的突变等位基因)。Lac启动子控制SecE基因表达，trpA启动子控制prlA-4基因的表达。串联式rrnBT1T2转录终止子位于SecE和prlA-4基因的下游。质粒携带了使用lac操纵子序列调节启动子的一个拷见的LacIQ阻遏物。卡那霉素抗性基因被编码在载体用于选择。与pUSEC-05IQ一样，pUSEC-06的基础载体是携带pUC复制起始位点的pSP72。 
与pUSEC-05IQ一样，pUSEC-06的有用性有两个部分。pUSEC-06载体用作生产载体来增加分泌蛋白质的表达。SecE和prlA-4基因的存在通过增加Sec机制的两个组成部分而增强了分泌速度。SecE和SecY(prlA)形成了蛋白质分泌的转运结构域，从而增加这两个因子的水平就增加了转运结构域的数量。由于转运能力的增加，过表达的分泌靶蛋白就能以更高的效率分泌通过周质膜。最终结果就是来自条件培养基的更多的累积以及加工过的肽的回收。 
第二个有用性涉及pUSEC-05IQ。pUSEC-05IQ和pUSEC-06两者内的六个独特的限制位点形成了克隆多个表达盒的基础。根据所附示意图描述的方法，最多三个拷贝的分泌表达盒能够被克隆而产生单、双和三基因的表达克隆。示意图表示了肽的完整克隆，其通过形成双基因表达载体。这种在载体上增加基因数量的新方法也可被应用到其它表达系统中。 
表1给出了pUSEC-05IQ和pUSEC-06的所有基因组分的列表。 
表1-pUSEC-05IQ和pUSEC-06的所有基因组分 
＊PRLA-基因是prlA(SecY)基因的突变等位基因。 
优选表达载体的概述 
本发明进一步提供包括能容易地使用上述优选的通用克隆载体(图3A-3C)构建的编码区和控制区的表达载体。编码区包含所感兴趣的肽产物的核酸，其符合读码框地连接在编码信号肽的核酸的下游。控制区可操作地与编码区连接，包括多个启动子以及至少一个核糖体结合位点，其中至少一个启动子选自tac和lac。 
优选地，载体包含多个串联排列的转录盒，每个盒具有本发明的控制区和编码区。据信这样的双基因载体或多基因载体能比双顺反子或多顺反子表达载体提供更好的表达。这是胜过双顺反子或多顺反子表达的惊人改进，据信没有现有技术暗示过。 
载体可任选进一步包括编码阻遏与控制区中一个或多个启动子有关的操纵子的阻遏肽的核酸，转录终止子区，选择标记区，和/或编码至少一种分泌增强肽的区域。可替代地，在一些实施方案中，编码阻遏肽和分泌增强肽的核酸可存在于分开的载体上，其在与表达肽产物的载体相同的宿主细胞中共表达。 
所构建的表达载体的特殊例子以及构建这些表达载体的方法在此阐明。许多商业上可获得的载体可用来作为本发明优选载体的起始载体。本发明载体的一些优选区域可以是已经包括在起始载体中的，这样为获得本发明载体所需要的修饰的数量就相当少了。优选的起始载体包括但不限于pSP72和pKK233-2。然而，最优选的起始载体是本发明的克隆载体，包括pUSEC-05IQ和pUSEC-06通用的直接表达克隆载体，如下文所述。 
据信本发明的新载体具有固有的优点，即使在不是这里所确定的特别有用的特定宿主的宿主细胞中利用载体，那些出乎意料的优点将仍然存在，不管是否利用了这里描述的改进的发酵工艺。 
由于发酵工艺具有的固有优点，据信新发酵工艺会提供增加的产率。据信当利用这里描述的优选宿主细胞和/或新载体的时候，这些优点尤为显著。 
尽管如此，本发明的一个优选实施方案同时利用了转化到本发明特别确定的宿主细胞中的本发明的改进的表达载体，以及利用这里描述的优选发酵发明来表达。当所有这三个发明组合使用时，相对于现有技术来讲，据信产物的产率和回收都可获得显著增强。 
控制区 
控制区可操作地与编码区连接，包括多个启动子和至少一个核糖体结合位点，其中至少一个启动子选自lac和tac。已经令人惊讶地发现前述启动子在单一控制区内的组合极大的增加了由编码区产生的肽产物的产量(如内文更详细的描述)。已经期望两个这样的启动子会很大程度上提供冗余功能，而不提供任何加和的或协同的效应。申请人的实验令人惊讶地显示了在使用所要求保护的启动子组合中的协同效应。其它启动子在现有技术中是已知的，可以用于与根据本发明的tac或lac组合。这种启动子包括但不限于lpp、ara B、trpE、gal K。 
优选地，控制区正好包括两个启动子。当一个启动子是tac时，优选tac启动子在控制区的另一启动子的5′。当一个启动子是lac时，优选lac启动子在控制区的另一启动子的3′。在一个实施方案中，控制区包括tac和lac启动子两者，优选lac启动子在tac启动子的3′。 
编码区 
编码区包括编码所感兴趣的肽产物的核酸，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸的下游，这样编码区编码的肽分别包括从N末端到C末端的信号肽和肽产物。不打算受限于理论，据信信号肽除了参与肽产物分泌到周质中，还可以给肽产物提供一些保护免受蛋白水解降解。 
许多肽信号序列是已知的，可根据本发明使用。这些序列包括公知的宿主细胞的外膜蛋白的信号序列，以及任何能够将肽产物转运到周质并作为转运结果而被宿主细胞翻译后切割的序列。有用的信号肽包括但不限于Omp A、pel B、Omp C、Omp F、Omp T、β-1a、Pho A、Pho S和Staph A。 
肽产物优选足够小，以至于没有本发明的话，使用现有技术中的技术它就通常需要有一个融合配偶体。典型地，肽产物具有小于10Kda的分子量。更优选地，肽产物具有C末端甘氨酸，其用作酶学酰胺化反应的前体将C末端甘氨酸转化为氨基，从而得到酰胺化的肽。这样的转化在下文中更加详细地描述。许多在生物学上重要的肽激素和神经递质是该类型的酰胺化肽。例如，由编码区编码的肽产物可以是鲑鱼降钙素前体或与降钙素基因相关的肽前体，它们两者都具有C末端甘氨酸并且都可被酶学酰胺化为成熟的鲑鱼降钙素或与成熟的降钙素基因相关的肽。其它可根据本发明生产的酰胺化肽包括但不限于生长激素释放因子、血管活性肠肽和甘丙肽。其它酰胺化肽是现有技术中公知的。 
甲状旁腺激素的类似物也可根据本发明生产。例如，具有甲状旁腺激素的前34个氨基酸的肽可提供类似于甲状旁腺激素本身的功能，正如34个氨基酸类似物的酰胺化形式是可以的。后者可根据这里所描述的一种或多种表达系统和方法，通过表达甲状旁腺激素的前34个氨基酸接着表达甘氨酸-35而产生。如这里披露的酶学酰胺化则能够将甘氨酸转化为氨基。其它甲状旁腺激素类似物也是优选的，诸如酰胺化或者非酰胺形式的人甲状旁腺激素类似物PTH 1-30和PTH 1-31。 
尽管这里描述的直接表达系统的优选实施方案产生了具有C末端甘氨酸的肽，据信利用这里所描述的载体、宿主细胞和/或发酵技术，任何肽都将具有高产率并容易回收。 
本发明优选载体或者本发明阻遏物载体所在的同一宿主中表达的其它载体的其它任选方面 
任选地，本发明的优选载体可包含编码能够阻遏至少一个启动子所控制的表达的阻遏肽的核酸。然而可替代地，编码阻遏肽的核酸可存在于宿主细胞中与本发明载体相分开的载体上。对许多操作人员来说，合适的阻遏物是现有技术中公知的。优选地，编码阻遏物的核酸编码本发明优选实施方案中的lac阻遏物，因为它阻遏包括了tac和lac启动子两者的lac操纵子，至少一个启动子总是存在于本发明的优选载体中。 
可选择标记物 
优选的是，大量可选择标记物基因的任何一个(如编码卡那霉素抗性的基因)存在于本发明的载体中。这将使得有效转化或转染了本发明新载体的宿主细胞能够进行合适的专一选择。 
分泌增强肽 
编码至少一种分泌增强肽的核酸任选存在于本发明的载体中。可替代地，编码分泌增强肽的核酸可存在于分开的载体上，其在与编码肽产物的载体相同的宿主细胞内表达。优选地，分泌增强肽选自SecY(prlA)或prlA-4。有人指出SecY和prlA是同样的，这两个术语在现有技术中作为同义词使用。prlA-4是prlA的已知修饰并且具有相似的功能。另一优选的分泌增强肽是SecE，也叫“prlG”，是作为“SecE”的同义词使用的术语。最优选地，许多分泌增强肽被编码，至少其中一种是SecE，另一种选自SecY(prlA)和prlA-4。据信这两者相互作用以将肽产物从细胞质转运到周质。不打算受限于理论，这些分泌增强肽除了它们的分泌增强功能外，也可辅助保护肽产物免于细胞质蛋白酶降解。 
生产异源肽的方法 
提供了新的发酵工艺来培养宿主细胞到非常高的细胞密度，其培养条件使得肽产物能够扩散或分泌到培养基中。 
在新发酵方法中有用的宿主细胞包括但不限于之前所讨论的宿主细胞，和/或转化或者转染了一个或多个之前讨论的新表达载体的宿主细胞。可以使用一起表达肽产物与信号区的其它遗传工程化宿主细胞。将细胞置于发酵罐中，优选包括进料空气或其它气体、碳源和其它成分到培养基中的合适装置以及诱导促进物的装置。监测氧含量、细胞密度、pH以及类似参数的合适装置也是优选的。 
申请人已经发现，通过将平均细胞生长速度严格控制在每小时0.05到0.20次加倍的临界范围内，获得了明显改善的直接表达到培养基中的肽产物产量。优选的是，这种控制培养开始于培养物的早期延迟阶段。更优选在发酵期间(也就是这里所说的生长被控制的期间)将平均细胞生长速度维持在每小时0.10到0.15次加倍，最优选每小时0.13次加倍。生长速度可通过调节在下文名为“sCTgly的生产(发酵)”部分所述的任何参数来控制，特别是进料速度“Q”与许多其它参数相平衡的方程。申请人已经发现改变发酵中细胞的碳源进料速度是将生长速度维持在临界范围内的有利方法。为了将生长速度维持相对恒定，进料给发酵罐的碳源的量注意要与细胞数量的增长成比例增加。 
申请人也已经发现，通过在所述受控生长发酵期间提供诱导物和维生素，可获得明显改善的产率。象碳源一样，进料适当量的诱导物包括与细胞数量的增长成比例地增加进料速度。因为碳源和诱导物两者的进料都优选与细胞生长相关联的方式增加，申请人已经发现有利的是将进料物与诱导物混合在一起并将两者的混合物以适当速度进料来控制细胞生长(与碳源一起)，这样就同时维持了诱导物的连续进料，该诱导物保持相对于碳源量的恒定比。然而，分开进料碳源和诱导物当然也是可能的。然而尽管如此，如果大量使用了可能对细胞有毒的化学诱导物，可取的是在培养的每小时期间加入诱导物和碳源，加入的量使得在任何特定小时中加入的诱导物与同一小时中加入的碳源的重量比变化不超过整个发酵过程(受控生长期)中加入的诱导物量与整个发酵过程中加入的碳源量之比的50％。50％变化是由所比较的两个比值中较低的比值来测定的。例如，当整个发酵中碳源与诱导物的比是2比1时，在任何特定小时中的比优选不高于3比1且不低于1.333比1。在生长期间通过其它手段诱导一种或多种促进物也是可能的，诸如培养温度的改变或者改变特定化合物或营养物的浓度。 
当使用外部碳源进料作为控制细胞生长的方法时，有利的是等到培养基中的任何初始碳源(进料外部碳源之前)已经消耗到不开始外部碳源进料就不再能支持细胞生长的点。这确保了外部进料更直接地控制细胞生长，而不会受到初始(没有进料)碳源的显著干扰。优选连续进料氧源到发酵培养基中，测定溶解氧的水平。氧水平向上的尖峰表明细胞生长的明显下降，这又可表明初始碳源的耗尽并意味着该开始外部进料了。 
已经出乎意料地发现，当发酵培养基的氧饱和度增加时，肽产物产率增加了。即使在足够维持细胞生长的较低的氧饱和度水平也是这样。因此，在整个发酵过程期间，优选进料氧气或富含氧的源到发酵培养基中，达到至少20％以及优选至少50％的氧饱和度。如这里使用的，“氧饱和度”意指培养基用普通空气完全饱和时的发酵培养基中的氧百分比。换句话说，用空气饱和的发酵培养基具有100％的“氧饱和度”。尽管很难维持发酵培养基的氧饱和度在100％以上，即超过空气的氧含量，不过这是可能的，考虑到更高的氧含量提供更高的产率，这甚至是理想的。这可以通过用比空气具有更高氧含量的气体对培养基进行喷气而实现。 
通过维持发酵培养基中的氧饱和度不低于70％，特别是不低于80％，可获得明显的产率改善。那些水平是相当容易维持的。 
更快的搅拌可以有助于增加氧饱和度。一旦发酵培养基开始变稠，就变得更难维持氧饱和度了，建议至少在这个阶段进料具有比空气更高的氧含量的气体。申请人已经发现，普通空气可足以维持良好的氧饱和度直到发酵期的相当后期。申请人已经在发酵期的后期补充具有50％氧供给或者100％氧供给的空气供给。优选地，培养宿主细胞20到32小时的时间段(开始受控生长以后)，更优选22到27小时，更优选大约23-26小时以及最优选大约24小时。受控生长期间的培养期分为两个阶段：碳源梯度进料阶段，接着是碳源的碳源恒定进料阶段。在两个阶段期间总是都加入诱导物和维生素。梯度进料阶段优选进行大约12到18小时，更优选大约15小时，而恒定进料阶段优选进行大约7到11小时，更优选大约9小时。 
优选地，在20到35℃的温度培养宿主细胞，更优选28到34℃，更优选31.5到32.5℃。由申请人进行的几次发酵中，已经发现32℃的 温度最佳。 
优选地，培养基的pH在6.0到7.5，更优选在6.6到7.0，6.78-6.83(例如6.8)是特别优选的。 
在优选实施方案中，使用表达载体转化的宿主来进行发酵，该表达载体具有包括tac和lac启动子两者的控制区，并具有包括位于编码鲑鱼降钙素前体的核苷酸上游的、编码信号肽的核苷酸的编码区。这样的表达载体优选包括多个特别是两个串联式的转录盒。如这里使用的，术语“串联式的转录盒”意指控制区和编码区之后接着至少一个另外的控制区和至少一个另外的编码区，该编码区编码与第一编码区同样的肽产物。这不同于双顺反子表达，后者是单个控制区控制两个拷贝的编码区的表达。该定义将允许编码区中与肽产物无关的改变，例如在第二转录盒中插入编码与第一转录盒中所编码信号肽不同的信号肽的核苷酸。 
许多碳源是现有技术中公知的。已经发现甘油是有效的。优选的诱导方法包括加入诸如IPTG和/或乳糖这样的化学诱导物。可以使用其它方法，诸如温度改变或者营养物水平变化。也可以使用对控制区中的操纵子或启动子(或者当控制区中出现超过一个的启动子时，就是使用中的多个启动子之一)来说合适的其它诱导技术。 
典型的是，在发酵培养基中的细胞生长变得不能维持在上述优选生长速度之内的大约同一时间，肽产物的产生明显下降。在那个点，发酵就停止了，停止碳源和诱导物进料以及氧气流。优选地，快速冷却培养物以抑制蛋白酶活性，从而减少肽产物的降解。将pH调节到充分降低蛋白水解活性的水平也是理想的。当使用本发明的优选载体和宿主细胞生产鲑鱼降钙素前体时，随着pH降低，蛋白水解活性减少了。这种酸化优选与培养基冷却同时进行。优选pH范围在下文中更详细地讨论。可以使用与测定发酵产物所使用的同样分析来测定不同pH水平下的降解，从而确定对特定的肽及其杂质来说最适宜的pH。 
异源肽的回收 
本发明进一步提供了回收肽产物的方法，包括将宿主细胞与培养基分开，然后对培养基进行至少一类选自凝胶过滤、离子交换(当肽是降钙素时优选阳离子交换)、反相层析、亲和层析以及疏水相互作 用层析的层析。在含有半胱氨酸残基的肽中，可以在纯化步骤之前或者期间进行S-磺化以防止肽的凝聚，从而增加了单体肽的产量。优选地，按如下顺序使用三个层析步骤：离子交换层析、反相层析和另一离子交换层析。 
在发酵完成之后，任选改变培养基的pH以降低蛋白水解活性。用于测定产物产量的分析也可用于测定产物降解并确定适合稳定性的最佳pH。当根据本发明生产鲑鱼降钙素前体时，2.5到4.0的pH是优选的，特别是3.0到3.5。据信这些pH范围也有助于将鲑鱼降钙素前体保持在阳离子交换柱上，从而在这里描述的优选纯化技术期间提供更好的纯化。 
也任选地，在发酵完成后，将培养基温度降低到低于10℃的温度，优选3℃到5℃，最优选4℃。据信这也降低了不期望的蛋白酶活性。 
本发明进一步提供了生产酰胺化肽产物的方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的任何宿主细胞，其表达具有C末端甘氨酸的肽产物；从所述培养基中回收所述肽产物；通过将所述肽产物在肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶或者肽基甘氨酸α-羟化单加氧酶存在下与氧气和还原剂接触而酰胺化所述肽产物。如果在上面不使用肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶，并且如果反应混合物已经不是碱性的，则升高反应混合物的pH直到它是碱性的。其后可从反应混合物中回收酰胺化的肽。 
实施例1-鉴别宿主细胞中负责胞外肽产物降解的靶基因 
概要 
申请人如下所述地鉴别到了负责胞外sCTgly降解的大肠杆菌金属蛋白酶，其在sCTgly直接表达发酵方案的诱导期之后18-26小时期间以最高达每小时25％的速度降解。sCTgly的降解也以未确定的速度存在于17小时之前。下面详述的实验表明负责sCTgly降解的蛋白酶是来自大肠杆菌的ptr基因的蛋白酶III。 
简介 
蛋白酶III是107kDa的锌金属蛋白酶，优先降解＜12kDa的肽。文献表明蛋白酶III的活性类似胰凝乳蛋白酶的性质。蛋白酶III以降低的速度在Tyr-Leu之间和Phe-Tyr之间切割胰岛素B链。蛋白酶III 似乎没有关键的生理作用，它的缺失不会引起宿主生长的有害作用(Dykstra et al.J.Bacteriol.163：1055-1059；1985)。蛋白酶III活性在培养基中经常被发现，特别是在增加分泌期间(Diaz-Torres et al.Can.J.Microbiol.37：718-721；1991)。本研究总结了实验来检查我们的模型肽sCTgly由于发酵期间培养基中的蛋白水解活性所引起的损失，以及为消除蛋白酶III活性而诱变大肠杆菌菌株。 
蛋白水解降解以及条件培养基中sCTgly降解的鉴别 
测试了来自UGL165(pSCT 029转化的大肠杆菌BLR)和UGL703(pSCT 038转化的大肠杆菌BLR)条件培养基样品的直接表达发酵中sCTgly的损失，该测试是在去除细胞并加入sCTgly在30℃下培养培养基之后。通过CEX HPLC测定条件发酵培养基中的sCTgly浓度。表2显示了从UGL703发酵物收获的26小时培养基样品中sCTgly降解的典型测试的数据。测试了各种蛋白酶抑制剂包括Bestatin、PMSF、α2-巨球蛋白和EDTA降低或消除sCTgly蛋白水解降解的能力。只有EDTA能够降低sCTgly的蛋白水解降解。EDTA通过结合酶活性所需要的二价阳离子而灭活金属蛋白酶。尽管能够降低sCTgly的蛋白水解降解，然而还有一些残留的sCTgly降解，其可能是其它较小活性的蛋白酶的结果或者是通过残留的蛋白酶III活性引起的。 
表2-EDTA对蛋白水解降解的抑制 
也检查了来自1.25L发酵物诱导后约18小时时的sCTgly降解速度。将重组sCTgly添加到诱导后18小时收获的培养基中以将sCTgly浓度从37mg/L增加到约200mg/L，在30℃培养4小时，然后如上所 述分析sCTgly。结果列在表3中。 
表3-发酵期间sCTgly的降解 
  30℃的培养时间   sCTgly浓度(mg/L)
  0.0小时   185
  2.0小时   99
  4.0小时   65
到4小时结束时，所测试的18小时样品中sCTgly的每小时平均降解是21％，这类似于收获的发酵培养基中发现的sCTgly降解速度。这个结果表明，来自诱导后18小时的发酵培养基中的sCTgly降解可能是恒定的。 
主要胞外蛋白酶的鉴别 
前面的实验表明负责sCTgly主要降解的蛋白酶是金属蛋白酶。大肠杆菌蛋白酶III是周质/胞外的锌金属蛋白酶(宿主(Dykstra et al.J.Bacteriol.163：1055-1059，1985；分泌(Diaz-Torres et al.Can.J.Microbiol.37：718-721，1991)。测试了与另外的二价阳离子镁相比对锌的偏爱。将发酵培养基样品用50mM EDTA预培养20分钟，然后将sCTgly加入到样品中，到终浓度约250mg/L。将15mM的MgCl2或ZnCl2加入到不同样品中，在30℃培养4小时。如上所述测定sCTgly的浓度，结果列在表4中。 
表4-二价阳离子特异性 
在4小时培养时间后，加入到未经处理的对照培养基中的sCTgly降解了87％。在加入sCTgly之前用EDTA预处理的条件培养基导致 了34％的损失。加入MgCl2和ZnCl2分别导致27％和72％的肽损失。降解结果的图表显示对照和ZnCl2样品具有类似的降解速度，而且EDTA和MgCl2处理的样品具有类似的速度。为重激活蛋白水解活性而加入两种二价阳离子显示出锌是有效的，但是镁是无效的。 
除了测试正讨论中的蛋白酶的二价阳离子特异性之外，还使用了大肠杆菌菌株KS272和SF103来进行实验。大肠杆菌SF103是ptr基因被破坏的K12菌株(如上所述)。KS272是SF103的亲本株，其携带野生型ptr基因。进行了发酵实验来测试UGL177(KS272+pSCT 029)和UGL178(SF103+pSCT 029)中表达的sCTgly的蛋白水解降解。 
在第一实验中，将sCTgly在进料时间t＝0时加入到0.5L未诱导的UGL177和178发酵物中到200mg/L的浓度。也进行了不加入sCTgly的每种菌株的对照发酵。在开始进料后第4、18和20小时时收集来自四种发酵物的条件培养基样品。到取出18小时样品这个时间时，两种培养物都已经停止生长并显示出细胞死亡和裂解的迹象。由于生长问题，只测试了来自UGL177和178发酵物的进料后4小时时间点的培养基的蛋白水解活性。四种所收集的4小时时间点的培养基样品中都加入sCTgly到200mg/L。将加入sCTgly的样品分开，一组用50mMEDTA处理，作为对照。将8个样品在室温培养20小时(由于诱导后4小时的细胞密度低，使用延长培养)。培养结果列在表5中。由于初始sCTgly加入到发酵物中，四种培养基样品的sCTgly浓度提高了。 
表5-来自大肠杆菌KS272和SF103的sCTgly的蛋白水解降解 
＊发酵培养基样品加入了sCTgly 
数据显示了没有蛋白酶III的菌株与亲本菌株相比在条件培养基中的sCTgly降解量的不同。与没有蛋白酶III的菌株相比，亲本菌株显示了差不多四倍的sCTgly在条件培养基中的损失。即使用EDTA处理，亲本菌株中sCTgly的降解比没有蛋白酶III的菌株大约还多两倍，暗示EDTA处理的样品中的降解可能是部分的，因为蛋白酶III的不完全失活。 
第二实验测试了每种菌株持续表达sCTgly的能力。使用类似于CBK.025的直接表达发酵方案，生长并诱导两种大肠杆菌菌株UGL177和178。在诱导后10、12、14、16和17小时收集条件培养基样品用于分析。两种发酵培养物具有类似的生长速度，确认了ptr基因的缺失没有影响培养物的存活。然而，如上面的实验中一样，两种培养物在诱导后16和17小时之间都死亡了。前面的实验中大肠杆菌K-12菌株在高细胞密度下的直接表达发酵方案显示了发酵方案的中期阶段期间培养物存活的减少。来自每种培养物在收集时间点的sCTgly的产量列在表6中。 
表6-UGL177和UGL178中sCTgly的表达 
表V中列出的结果显示，只有ptr基因缺失的菌株才能够累积可定量水平的sCTgly。上面的结果暗示抑制或者消除大肠杆菌生产菌株中的大肠杆菌蛋白酶III应该在sCTgly的生产中提供好处。 
估计sCTgly由于蛋白水解活性的损失 
通过假定UGL703(BLR中的pSCT038)在30℃发酵期间sCTgly每小时恒定损失20％，计算发酵后期的sCTgly损失总量是可能的。这个估计是基于发酵物2301-9004在诱导后17到26小时之间的sCTgly产 量数据。平均了每个连续小时对的sCTgly浓度。然后将平均sCTgly浓度乘以0.2以计算将被降解的sCTgly的量，假定平均降解速度是每小时20％。假定每小时期间的sCTgly损失量是累积的，就能够外推每小时以及整个九小时阶段的过程中sCTgly的损失量。该推断结果列在表7中。 
表7-发酵期间sCTgly的估计损失 
仅仅估计了条件培养基的降解水平；不能计算发生在细胞内部的降解，并且不包括在内。表7中显示的结果表明在整个发酵过程中sCTgly的损失最高达171.5mg/L。如果没有发生20％的降解，已经产生的总sCTgly可被估计在360mg/l，比使用细胞系UGL703的现有生产能力大约高出91％。 
实施例2-缺乏蛋白酶的大肠杆菌的构建 
破坏大肠杆菌BL21中的ptr和recA功能 
通过在编码蛋白酶III的ptr基因编码区以及recA基因编码区中引入破坏来修饰大肠杆菌BL21。使用P1转导，将大肠杆菌SF 103的DNA包装到P1噬菌体中，用来感染大肠杆菌BL21细胞。将噬菌体细胞混合物置于含有氯霉素的LB琼脂平板上；只有含有破坏氯霉素的ptr基因的细胞才应当具有在氯霉素存在下生长的能力。也鉴定了十个氯霉素抗性的转导子的BL21遗传标志，诸如在乳糖上生长的能力以及链霉素敏感性。通过用大肠杆菌菌株BLR的P1转导进一步修饰所得菌株BL21Δptr，该BLR携带recA-基因型。使用来自BLR的破坏四环素的recA-基因来转导BL21Δptr，产生了BL21ptr-recA-菌株。 鉴别了二十个BL21ptr-recA-转导子。给二十个分离菌命名为BLM1-20。 
使用大肠杆菌BLM菌株的表达分析 
用sCTgly表达载体pSCT-038转化八个大肠杆菌BLM菌株BLM1-8，给予UGL801的名称。将每种转化的两个分离菌在摇瓶中筛选sCTgly的表达。用每个克隆的700μl过夜培养物接种25mL的CPM接种培养基I，该培养基含有50ug/mL卡那霉素。将培养物生长到2-3的OD 600，然后用150μM IPTG诱导并再生长4小时。4小时样品和UGL703对照的结果列在表8中。使用CBK.025中概述的直接表达方案在1.25升发酵物中也筛选到了六个UGL801克隆。每种发酵物的所选样品的结果列在表9中。 
摇瓶实验的条件培养基中有十二个克隆产生了可检测水平的sCTgly。在诱导后3小时到4小时，十二个克隆的sCTgly水平增加了。相反，UGL703对照在诱导后3小时到4小时没有显示出增加。十二个克隆的生长是相似的，除了两个UGL801-6克隆，它们得到了显著更低的细胞密度。 
表8-UGL801克隆的摇瓶实验结果 
使用直接表达发酵方案在1.25L发酵物中测试了六个克隆(UGL801-1a、2a、3a、4a、5a和6a)的sCTgly表达。所有发酵物都产生了170mg/L以上水平的sCTgly，达到的最大产量为200+mg/L。在诱导后26小时的发酵方案结束之前，除了UGL801-6a的所有克隆都产生了最大水平的sCTgly(见表9)。这些发酵物样品在如经标准程序那样将pH调节到3.0之后含有了大量沉淀。这个现象的独特例外是UGL801-6a，它一直到诱导后26小时才产生sCTgly且在调节到pH 3.0的培养基样品中没有显示沉淀。UGL801-6a在诱导后26小时的条件培养基中也产生了最高表达水平的sCTgly，达到256mg/L。在表9中列出的所有结果中，UGL801-6a也具有最高的细胞湿重。基于测试发酵物获得的数据，选择了UGL801-6a来进一步发展sCTgly生产。使用相应的宿主菌株BLM-6(ATCC保藏号PTA-5500)作为优选细胞系来插入含有质粒的其它肽基因。 
表9-UGL801发酵物的产出结果 
现在将UGL801-6a命名为UGL801(ATCC保藏号PTA-5501)，并选择来进一步开发和按比例增加生产。将UGL801的宿主大肠杆菌宿主菌株BLM-6(F-ompT hsdSB(rB -mB -)gal dcm Δ(srl-recA)306::Tn10(TcR)ptr32::ΩcatR)(ATCC保藏号PTA-5500)用作表达细胞系的优选宿主。因此，BLM-6被用来插入表达PTH 1-31gly和PTH1-34gly的表达载体，分别产生细胞系UGL810(ATCC保藏号PTA-5502)和UGL820(ATCC保藏号PTA 5569)。 
实施例3-UGL801的发酵方案 
如上所述，使用质粒载体pSCT038来转化BLM-6宿主菌株以产生UGL801重组细胞系。对新细胞系UGL801优化发酵条件的开发是以评估UGL801细胞系生产sCTgly开始的，其使用UGL703(细胞系UGL703是具有质粒pSCT038的大肠杆菌BLR)直接表达条件：底物限制的进料分批发酵，在30℃、pH6.6、dO2≥70％下进行，在为UGL703开发的培养基中诱导进料26小时。在初始DE发酵方案中的UGL703导致了细胞的＜200mg/L的体积生产率和每克细胞湿重约1.3mg胞外sCTgly的比生产率。宿主细胞修饰导致了宿主细胞BLM-6和重组细胞系UGL801，当其在UGL703发酵条件下测试时，显示了在诱导后26小时约1.3X的体积生产率增加，增加到大于200mg/L以及在诱导后26小时1.2X的比产率增加。这些数据显示在表10中。在UGL801细胞系中引入降低的蛋白酶背景以及在发酵中的早期生长和产生不降解重组蛋白的能力，这是产率和方法可靠性方面的显著改进。 
表10-不改变发酵条件，UGL703和UGL801的比生产率和体积生产率的比较。 
在直接比较了两种细胞系在同一发酵方案中的结果后，对发酵参数进行了一系列优化研究，包括：增加温度；进料/诱导程序的改变； 加入新的培养基组分；以及延长进料/诱导期。 
增加温度 
在开发新宿主细胞BLM-6期间，对发酵温度下蛋白酶降解特征的研究已经显示，当使用祖细胞宿主细胞BLR时，甘氨酸延伸肽在＞30℃时快速降解。这种新的蛋白酶缺乏的菌株BLM-6具有降低的胞外蛋白酶族，暗示了可以在更高的温度生长以生产潜在地更多的质量和更多的产物。尽管将发酵pH维持在6.6，但是在整个发酵的分批阶段和分批进料阶段的温度都增加到32℃。新的BLM-6为基础的重组细胞系UGL801在增加的温度下生长良好并表达sCTgly。如在表11中所见，新细胞系的体积和比生产率在增加的发酵温度下都增加了。 
表11-增加温度(32℃)的UGL801发酵的生产率值与根据UGL703DE发酵条件进行的初始UGL801发酵的比较。也显示了随温度增加的比生产率的增加倍数 
如在图2的曲线图中可看见的，增加温度时的生产率在发酵方案整个分批进料(诱导)期中是不稳定的。这表明需要进一步的发展研究。 
进料/诱导程序中的改变 
将为UGL703(BLR::pSCT038)的直接表达发酵程序而开发的指数进料程序进行改变，以尝试增加每个细胞的生产率。进料培养基添加的速度在诱导时间之后20小时时的进料速度保持恒定，直到诱导后 26小时的运行结束。该变化的结果显示在表12中。 
表12：改变进料程序以允许诱导后20和26小时之间的恒定进料速度，此时的UGL801生产率的比较。也显示了改进带来的增加倍数 
添加新的培养基组分 
通常认为细胞生长所必需的大多数维生素和微量元素是通过添加酵母提取物来提供给细胞的。然而，由于这些重组细胞对蛋白质合成的需要增加了，公认需要额外的维生素和微量元素。将进料培养基补充维生素/微量元素混合物；发酵实验的结果显示，混合物的加入提供了发酵生产率的稳定水平。随着维生素/微量元素混合物的加入，生产率和再现性暗示了恒定进料期可延长超过26小时。 
表13：在26小时的整个进料/诱导期添加维生素和微量元素混合物，此时的UGL801生产率的比较。也显示了改进带来的增加倍数 
延长进料/诱导期 
评估了延长分批进料发酵期的可行性。延长的基础是当20小时的进料速度延长到26小时显示了胞外肽的恒定产出，细胞湿重只有最小限度的增加。进料培养基中维生素/微量元素的补充暗示了发酵物是足够稳定的，可将诱导期的长度延长到超过26小时。将发酵进料/诱导期延长逐渐增加到29小时。其它数据暗示，29小时可能是在不损失蛋白质或者没有细胞裂解迹象时发酵生产期的极限。将发酵进料/诱导期在20小时所确定的恒定进料速度下延长到29小时。 
表14-延长的进料/诱导期增加时的生产率。延长之前的增加倍数是恒定的，然而额外的三个小时期间，产率继续增加了大约20％ 
当在UGL703条件下的细胞系生产率与UGL801的最终优化生产率直接比较时，对UGL801即大肠杆菌BLM-6::pSCT038的发酵发展和优化导致了每克细胞重量(细胞湿重)的胞外sCTgly生产2.6倍的增加。 
下面的表15列出了不同发酵中使用的培养基成分。 
表15 
结论 
直接表达发酵方案中的UGL703产生了胞外sCTgly，体积生产率水平＜200mg/L，比生产率约1.3mg肽每克细胞湿重。宿主细胞BLM-6的形成通过降低蛋白酶背景水平而提供了生产率的第一次改进。当BLM-6用作原始质粒载体pSCT038的宿主时，结果就是具有20-30％生产率改进的UGL801。对发酵方案进行了本文件中所描述的另外的改进，以优化体积和比生产率。下面的表格就是体积和比生产率的汇总比较，以UGL703开始，进展到新细胞系UGL801，并且进行了四种改进以优化发酵方案。总的发酵改进增加了UGL801的体积生产率2.2倍，这是与诱导后26小时的数据相比较的，而26小时pi的比生产率 增加了超过3倍(3.2)。运行延长到29小时引起了约12％的体积生产率增加。当与UGL703在26小时的比生产率相比时，UGL801在诱导后29小时的最终发酵方案的比生产率具有3.46倍的增加。 
表16-从UGL703到优化的UGL801的体积生产率 
表17-从UGL703到优化的UGL801的比生产率 
尽管本发明已经描述了与特定实施方案相关的内容，但是许多其它的变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此本发明不受这里的特定公开内容所限制，而只由所附的权利要求来限制。 

Claims (3)

1.缺乏分别编码重组蛋白和蛋白酶III的染色体基因rec A和ptr的大肠杆菌BLR宿主细胞，所述宿主含有并表达包括多个串联式转录盒的表达载体，每个盒由以下组成：
(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3′端；和
(2)可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子；以及
(3)转录终止子。
2.权利要求1的宿主细胞，其中所述表达载体编码鲑鱼降钙素的基因以得到具有ATCC保藏号PTA-5501的重组细胞系UGL801。
3.权利要求1的宿主细胞，其中所述表达载体是具有ATCC保藏号PTA-5567的pUSEC-05IQ克隆载体。
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