CN114875063A - 一种提高植物基础抗逆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高植物抗逆性的方法。本发明将含有CSD1+CCS双基因的表达载体和CSD1+反义CCS双基因的表达载体转化植物，得到抗寒、抗盐和抗镉胁迫的植物。本发明通过在植物细胞中用载体引入CSD1+CCS双基因和CSD1+反义CCS双基因，来提高铜锌超氧化物歧化酶的活性从而提高植物的抗逆性，为培育高抗的植物提供了一条重要途径。

Description

一种提高植物基础抗逆的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域中提高植物基础抗逆的一种方法。
背景技术
植物遭受到严重的环境胁迫时，会产生大量的ROS(活性氧)，当细胞利用活性氧的能力低于活性氧的生成量时，就会产生氧化胁迫。植物可以通过产生抗氧化剂来清除ROS。超氧化物歧化酶(SOD)是一种普遍存在的金属酶，能有效的清除ROS。目前发现的SOD有以下几种：Cu/ZnSOD、MnSOD、FeSOD以及NiSOD。其中Cu/ZnSOD(SOD1)是生物体中主要的超氧化物清除剂。CCS是一种铜伴侣蛋白，它能将铜输送到Cu/ZnSOD并催化其形成分子内二硫键，从而使Cu/ZnSOD成熟且具有活性。
Cu/ZnSOD是植物中线粒体、细胞核和细胞质主要的超氧化物清除剂，从原核生物到真核生物都有关于Cu/ZnSOD在氧化应激反应中的作用的研究，在植物中也发现了Cu/ZnSOD 在参与氧化应激反应中的积极作用。Chrystalla等人发现藜苜蓿在遭受到干旱胁迫和螨虫侵染时，Cu/ZnSOD的表达会增加以响应胁迫，参与抗逆反应；在微藻中发现了两种类型的 Cu/ZnSOD：没有信号肽的胞质Cu/ZnSOD和具有N-末端信号肽的叶绿体表达的Cu/ZnSOD，且Cu/ZnSOD在抗逆中具有重要的生理作用；在海洋甲藻中鉴定出了全长Cu/ZnSOD基因 (PmCu/ZnSOD)，当海洋甲藻中铜过量和ROS增加时，PmCu/ZnSOD转录物和SOD活性会显著增加，参与氧化应激，维持海洋甲藻正常生存；在探究盐生植物Cakile maritima受到机械伤害时的氧化应激反应时，也发现了当组织受到伤害时，会诱导Cu/ZnSOD高表达，参加植物的氧化应激调节；在探究银纳米粒子(AgNPs)对水稻的毒性影响时，发现在低浓度的 AgNPs中，Cu/ZnSOD表达无显著上调，但当AgNPs浓度的增加时，Cu/ZnSOD表达显著提高参与水稻的氧化应激；在储存甘薯根块时进行低温调节，发现低温处理后，甘薯根块中的 Cu/ZnSOD表达水平会升高以响应氧化应激；当大蒜受到高浓度砷胁迫时，也检测到了大蒜根中Cu/ZnSOD表达水平升高参与抗胁迫反应。
Cu/ZnSOD在参与植物抗逆过程中具有重要作用，因此有很多过量表达Cu/ZnSOD以增强植物的抗逆性研究。在甘薯中过量表达Cu/ZnSOD时，当使用100mM NaCl处理茎插条时，与野生型(WT)植物相比，转基因植物具有更强抗盐胁迫耐受性，且相比WT植物中生根延迟，所有转基因植物在盐胁迫下根生长也显著增强了，与非转基因植物相比，Cu/ZnSOD的过表达也能导致转基因植物在氧化应激、低温和二氧化硫暴露中抗逆性增强；Cu/ZnSOD在叶绿体中过表达，增强了烟草、马铃薯和拟南芥对甲基紫精(MV)胁迫的耐受能力；研究发现，将花生中的AhCu/ZnSOD转入烟草中后，增强了烟草的抗旱和抗盐能力。将EuCu/ZnSOD 转入巨尾桉中，巨尾桉组培苗可以耐受-13.5℃下5h的低温且没有明显冻害。
然而，在仅表达Cu/ZnSOD的植物研究中发现，虽然转基因植物在低温逆境中Cu/ZnSOD 表达量增加，但是其酶活性提高与表达量不成比例，在一定程度上影响了植物的抗逆能力。
发明内容
本发明的目的是提供提高植物基础抗逆的一种方法
本发明所提供的提高植物基础抗逆的一种方法，是将含有Cu/ZnSOD+CCS双基因的表达载体转化植物，得到抗逆性提高的植物；将含有Cu/ZnSOD+反义CCS双基因的表达载体转化植物，得到某些抗逆性提高的植物。
所述Cu/ZnSOD+CCS是具有序列表中序列1的多核苷酸序列，所述Cu/ZnSOD+反义CCS 基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。
序列表中的序列1由2367个碱基组成，序列2由2367个碱基组成。
用于构建所述含有Cu/ZnSOD+CCS基因的表达载体和含有Cu/ZnSOD+反义CCS基因的表达载体的出发载体可为Ti类质粒载体。
所述的Ti质粒载体优选为二元双基因表达载体，PBDGR。所述含有Cu/ZnSOD+CCS基因的表达载体优选为pBD-EuCSD1+CCS；所述含有Cu/ZnSOD+反义CCS基因的表达载体优选为pBD-EuCSD1+antiCCS。
所述转化方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选农杆菌介导转化法。
本发明方法中，所述植物可为草本植物或木本植物，其中，所述木本植物优选为桉树。
铜伴侣蛋白是一类新型的蛋白质，涉及细胞内铜运输和向含铜蛋白质的运送。例如，酵母中有关运输铜的蛋白质是Lys7和COX17。Lys7是三者中分子量最大的，它将铜插入Cu/ZnSOD中因此被命名为SOD铜伴侣(CCS)。CCS拥有三个功能不同的蛋白质结构域。 N-末端ATX1样结构域与ATX1具有同源性并且含有ATX1MXCXXC铜结合位点，这使得 CCS即使在生物体中铜含量极低的情况下也能捕获到铜。
目前为止，并没有将CCS导入植物中的报道，更没有CCS在植物转基因中的研究报道。本发明通过在植物细胞中用载体引入Cu/ZnSOD+CCS基因和Cu/ZnSOD+反义CCS基因，成功将CCS基因导入植物，并提高了植物基础的抗逆能力，特别是抗寒、耐盐和耐重金属镉的能力，为培育多抗植物改良树木耐逆能力提供了一条重要的途径。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为pBD-EuCSD1-CCS植物二元双基因表达载体构建示意图
图2为pBD-EuCSD1-CCS XbaI和SmaI双酶切验证图
左图为pBD-EuCSD1 XhoI和HpaI双酶切，右图为pBD-EuCSD1-CCS XbaI和SmaI双酶切
图3为EuCSD1+CCS转化巨尾桉再生图
A：茎段芽分化培养B：分化出芽点C：芽生长培养D：分化出根E：组培再生苗F：温室苗
图4为转EuCSD1+CCS巨尾桉PCR验证图
M：DL2000 DNA Marker；阳：pBD-EuCSD1+CCS质粒；阴：普通植株；1-16：转EuCSD1+CCS基因巨尾桉
图5为pBD-EuCSD1+CCS转基因巨尾桉在4℃低温胁迫下SOD酶比活力、SOD酶相对比活力
图6为-15℃冻害胁迫6h后转EuCSD1+CCS基因巨尾桉生理表型恢复图
图7为不同盐胁迫下转EuCSD1+CCS巨尾桉3个月的生长观察
图8为不同镉胁迫下转EuCSD1+CCS巨尾桉5个月的生长观察
A 10mg/kg镉胁迫；B 15mg/kg镉胁迫
图9为pBD-EuCSD1-antiCCS植物二元双基因表达载体的构建示意图
图10为pBD-EuCSD1-antiCCS XbaI和SmaI双酶切验证
图11为EuCSD1+antiCCS转化巨尾桉再生情况图
A：茎段芽分化培养B：分化出芽点C：芽生长培养D：分化出根E：组培再生苗F：盆栽苗
图12为转EuCSD1+antiCCS巨尾桉PCR验证图
M：DL2000 DNA Marker；阳：pBD-EuCSD1+antiCCS质粒；阴：普通植株；1-10：转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉
图13为pBD-EuCSD1+antiCCS转基因巨尾桉植株SOD酶比活力(左)、SOD酶相对比活力(右)
图14为EuCSD1+antiCCS巨尾桉-15℃冻害胁迫6h后生长状态
图15为不同盐胁迫3个月EuCSD1+antiCCS巨尾桉的耐受性图片
图16为20mg/kg镉胁迫5个月EuCSD1+antiCCS巨尾桉耐受性图
A F-6；B F-7；C F-8 D F-9
具体实施方式
实施例1、培育高抗多抗的转基因桉树
1、pBD-EuCSD1+CCS植物二元表达载体的构建
植物二元表达载体选用pBDGR(质粒构建过程见文章：双向启动子构建及在毛白杨中瞬时表达研究，《北京林业大学学报》，2007，29(1)：4)，具体操作过程如图1，将pBDGR和pMD-EuCSD1(EuCSD1基因为本实验室克隆并保存，GenBank:JX138573.1，已发表于《华侨大学学报》，2015，36(3):693-697)的质粒用XhoI和HpaI进行双酶切，使用OMEGA 公司的玻璃奶凝胶回收试剂盒对pBDGR和pMD-EuCSD1质粒双酶切产物的回收，在已灭菌的0.2ml的PCR管中依次加入pBDGR 2ul,EuCSD1 6ul,T4DNA ligase 1ul,连接缓冲液1ul， 14℃连接过夜，热激法转化大肠杆菌后平板培养12小时，挑取pBD-EuCSD1转化液涂布的 LB平板中单菌落10个，分别接种于5ml含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇床培养14-16h。提取pBD-EuCSD1质粒，经XhoI和HpaI双酶切凝胶检测载体 pBDGR为15.1kb和目的片段CSD为500bp，说明载体构建成功如图2。
PCR扩增以实验室保存的pMD-EuCCS(EuCCS基因为本实验室克隆并保存，GenBank:KJ755351.1，已发表《华侨大学学报》，2017，38(3):274-378)的质粒为模板，和引物LoCS1：5’CTCT AGAATGGCATTTCTGAGGT 3’(SEQ ID NO:1)，LoCS2：5’ CCCCGGGTCAGACTTTGCTG GTG3’(SEQ ID NO:2)，凝胶回收ZCCS片段与pMD-18T (购自Takara公司)连接并转化JM109大肠杆菌感受态，筛选菌株进行质粒PCR验证，并将阳性菌株命名为pMD-ZCCS。将pBD-EuCSD1和pMD-ZCCS质粒用SmaI和XbaI双酶切及酶切产物的回收，之后16℃连接过夜，载体与目的片段连接后转化大肠杆菌感受态，提取菌株质粒，选取4个SmaI和XbaI筛选阳性质粒，如图3有约1kb和15.9kb的两条条带，命名为pBD-EuCSD1-CCS。pBD-EuCSD1-CCS的具体序列见SEQ IDNO:1
SEQ ID NO:3
GTTAACTTAGCCTTGCAGACCAATAATACCGCAAGCTACTCTACCACCAGCATTTCCGGTGCTTTTGCTAAGCTCGTGCC CCCCCTTGCCAAGGTCATCCGGATCAGCATGGACAACGACCGCTCTTCCAATAATGGAGTGTGGCCCGGAGAGAGGAATC TGTTTGTCGACAATAGAGAAACTCGCAGAGCCATCAGCACCAACAGTGACATTTCCTAGATCACCAGCATGGCGATTCAC ATCTTCAGGAGCACCATGCCCTTTTCCAGCAGGATTGAAGTGAGGTCCTGTTGACATGCAACCATTTGTTGTGTCCCCTA GGGCATGAACATGCAAACCCTGCAGGCCGGGCTTAAGACCAGAAAGCTTTCCGGTCACCGTTGTAGGTCCCTCTCCATCC TGTGAGAAGAATTCAGTCCCTCTTTCTCCATCCTTTCTACCGAGGACGGCAACGGCCTTCACCATCTCGAGGTCCTCTCC AAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGGGTACCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCCCAGATTA GCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTAC CCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCAT CAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAAC CAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATA GAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAAT CTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAA TTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAG TGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAA GGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGCATTTCTGAGGTCGGTGGCCACAGCAGCAGCGACC GCAACAACTACAACAGCAGTAGCTGCCTTTGCCTTGTCTTCAATTTCGTCATCAAAATCTCCTCCGACCAAACCCCCCTC ACAAAATTTGTCCGTTTTCTCTCCACAGTCCCTTTCACTTAGATTGCCTCTTGTCAAAAACTTCACCAATTCACCTTCCG CTCTTCACATGGACGCGCCCACATCCAATCAGCAGGATGATCATCAAGTCTTGCCTGAGCTACTTACTGAATATATGGTG GACATGAAGTGTGAGGGCTGTGTTAATGCGGTCAAGAACAAGTTACAGACTGTTAATGGAGTGAAGAATGTTGAGGTGGA CTTGAGCAATCAAGTTGTGAGAATTTTGGGTTGGTCACCTGTGAAGACCATGACCGAAGCCTTAGAGCAAACAGGGAGAA AAGCTCGGCTGATTGGCCAGGGGGTACCTGAAGATTTTTTAGTTTCTGCTGCCGTTGCTGAATTCAAAGGTCCGGATATT TTTGGTGTGGTTCGTCTGGCTCAAGTGAATATGGAATTGGCTAGGGTTGAAGCCAACTTTACTGGGCTGTCGCCTGGAAA ACATGGTTGGTCAATCAATGAATATGGTGATCTAACAAACGGTGCAGCAAGCACTGGAAAAGTTTATAATCCTACAAGTC TTGAAACTGCTAAAGAGCCACTTGGCGACCTGGGAACATTAGAAGTAGATGACAAAGGGGAGGCCTTCTTCTCAGGTGTC AAAGAGAAGCTGAGAGTTGTGGATCTGATTGGACGATCCATATTTGTATATGGATCTGAAGATAAATCAGATTCAGGTAT CACAGCTGCTGTAATTGCTAGAAGTGCAGGAATCGGTGAGAACTACAAAAAACTTTGTACATGTGATGGAACCACCATAT GGGAATCAAGTAACAATGATTTCGTCACCAGCAAAGTCTGAGAGCTC
2、桉树的转化和初步筛选
将pBD-EuCSD1+CCS质粒加入农杆菌LBA4404感受态细胞中，冰浴5min之后-70℃静置 8min，取出试管在37℃恒温水浴锅中温浴5min，再冰浴1-2min后加入800ul 28℃预热的YEB 液体培养基中，28℃，160rpm摇床培养4-5h，将混合液均匀涂布于含有100mg/L卡那霉素的YEB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中进行筛选培养，挑取单克隆，提取质粒进行酶切验证。
用剪刀剪下巨尾桉组培苗的茎段，放在土壤农杆菌菌液中侵染5min，将侵染后的茎段水平放置在共培养培养基中，共培养培养基配方为1/2MS基础培养基添加0.15mg/L的KT和 0.2mg/L的NAA，pH 6.0，避光培养4-6天，直到茎段周围可见明显得白色菌落。将共培养后的茎段置于芽分化培养基中，芽分化培养基配方为1/2MS基础培养基添加0.05mg/L的TDZ 和0.5mg/L的NAA，pH6.0，28℃，16h/d光照培养，直至芽长到2cm以上，截取2cm以上的芽插入根生长培养基中，根生长培养基为1/2MS培养基，经卡那霉素5mg/L初步筛选转基因桉树植株，转入根生长培养基后生长状况良好的巨尾桉再生植株为经过初步筛选的阳性植株。
3、转EuCSD1+CCS双基因桉树的PCR检测
2×CTAB法提取转基因巨尾桉基因组DNA。将提取的未转基因巨尾桉CK的基因组DNA 作为阴性对照，将提取的pBD-EuCSD1+CCS质粒作为阳性对照，和转基因巨尾桉的基因组 DNA以引物LoCS1:5’-CTCTAGAATGGCATTTCTG AGGT-3’(SEQ ID NO:4)，LoCS2: 5’-CCCCGGGTCAGACTTTGCTGGTG-3’(SEQ ID NO:5)进行PCR检测，目的基因的片段大小为960bp，若为阳性转基因巨尾桉，最后进行基因组DNA的PCR扩增后，得到的条带位于750bp与1000bp之间。最后共筛选得到16株EuCSD1+CCS转基因阳性巨尾桉。
4、转EuCSD1+CCS双基因桉树的SOD酶活性检测
取未转基因的巨尾桉以及转EuCSD1+CCS巨尾抗冻能力较好Z-2、Z-5、Z-6、Z-7、Z-10、 Z-11、Z-14、Z-15、Z-16进行SOD酶活测定。称取巨尾桉叶片0.1g加入5mL预冷的PBS研磨，转入10mL离心管中，4℃，4000r/min，离心20min，上清即为粗酶液。NBT法检测SOD 酶活，Bradford法测定巨尾桉总蛋白。将巨尾桉放在气候培养箱中培养，温度为4℃、湿度为70％、光照时间14小时每天。分别于0h、24h、36h检测转EuCSD1+CCS基因巨尾桉中 SOD酶活和SOD比酶活。
结果表明，巨尾桉进行低温胁迫后，SOD酶比活力呈先升高再下降或者持续升高趋势，转入了EuCSD1+CCS的转基因巨尾桉大部分中的SOD酶比活力高于CK中SOD酶比活力，而且在进行连续低温时发现未转基因的CK在12h后茎尖开始下垂、叶片开始萎蔫，而转基因巨尾桉的茎尖和叶片仍能正常生长，说明EuCSD1+CCS的转入有助于提高巨尾桉抗冻胁迫能力。
5、转基因桉树的抗冻性检测
将生长时间相同，生长情况相同的转基因组培苗、CK、及未成功转入基因的阴性苗，放在-15℃冰箱进行冻害胁迫6h。处理结束后置于组培室进行恢复培养。7天后观察转基因组培苗、CK、及未成功转入基因的阴性苗的生长情况，拍照记录。再经过15天、30天、45天、60天……直到100天后植株生长情况没有变化为止。
冻害胁迫之后的结果是，CK和转基因阴性巨尾桉均完全死亡，转EuCSD1+CCS基因巨尾桉有9株完全存活(Z-2、Z-5、Z-6、Z-7、Z-10、Z-11、Z-14、Z-15、Z-16)，3株有1/2存活，4株有1/3存活，100天后，1/2存活和1/3存活的均能重生，之前完全存活的9株转 EuCSD1+CCS基因巨尾桉没有损伤，仍能正常生长。
而EuCu/ZnSOD转入巨尾桉中，巨尾桉组培苗能耐受-13.5℃下5h的低温且没有明显冻害(只转化了EuCSD1的PBI52，单基因的构建和转化详见文章：过表达EuCuZnSOD提高巨尾桉的耐寒性研究，《广西植物》，2018，38(1):101-108))，而EuCSD1+CCS基因转入巨尾桉后能耐受-15度6小时的冻害，说明CCS的转入显著增强桉树的抗冻能力。
表1 -15℃冷冻处理6h后转EuCSD1+CCS巨尾桉生长状态
Figure BDA0003523882090000051
6、转基因桉树的耐盐筛选
将生长时间相同，生长情况相同的转基因组培苗、CK和只转化了EuCSD1的PBI52(单基因的构建和转化详见文章：过表达EuCuZnSOD提高巨尾桉的耐寒性研究，《广西植物》，2018，38(1):101-108)，在含有0.4％，0.6％和0.8％盐浓度的培养基中连续培养和观察。分别在30天、60天90天和120天，150天观察在盐胁迫下的生长情况，并拍照记录结果，以生根时间，生长量变化，和叶片颜色为主要生理指标。
盐胁迫的结果是，CK巨尾桉完全死亡或者生长受到抑制，只转化了EuCSD1的PBI52在 0.4％，0.6％和0.8％盐浓度的培养基均有生根，但是生长均受到抑制。转EuCSD1+CCS基因巨尾桉在0.4％盐胁迫中转基因植株Z-1、Z-5、Z-6、Z-15生长量正常，生根正常，无黄叶现象，2株Z-2，Z-9，Z-14的生长受到抑制，有生根，无黄叶存活，其它植株死亡。在0.6％的盐胁迫下转EuCSD1+CCS基因巨尾桉Z-10，Z-11生长量正常，生根正常，无黄叶现象， Z-4、Z-5、Z-14生根正常，但是生长受到抑制，其他实验植株均死亡。在0.8％的盐胁迫下转EuCSD1+CCS基因巨尾桉Z-5、Z-9生根正常，但是生长受到抑制，其他实验植株均死亡。通过盐胁迫筛选，获得了耐盐0.6％的Z-10，Z-11转基因巨尾桉。
表2不同盐胁迫下转EuCSD1+CCS巨尾桉3个月的生长观察
Figure BDA0003523882090000061
7、转基因桉树的耐镉筛选
将生长时间相同，生长情况相同的转基因组培苗、CK和只转化了EuCSD1的PBI52(单基因的构建和转化详见文章：过表达EuCuZnSOD提高巨尾桉的耐寒性研究，《广西植物》，2018，38(1):101-108)在添加10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg镉的培养基上培养和观察。分别在30天、60天、90天和120天，150天观察在镉胁迫下的生长情况，并拍照记录结果，以生根时间，生长量变化，和叶片颜色为主要生理指标。
镉胁迫的结果是，CK巨尾桉完全死亡或者生长受到抑制，只转化了EuCSD1的PBI52在10mg/kg镉的培养基上三个月后植株死亡，在15mg/kg镉的培养基上三个月后植株死亡，20mg/kg镉的培养基上有生根，但生长受到抑制。转EuCSD1+CCS基因巨尾桉在10mg/kg 镉浓度胁迫中转基因植株Z-1、Z-4、Z-5、Z-6、Z-16生长量正常，生根正常，无黄叶现象，其它植株死亡。在15mg/kg镉浓度胁迫下转EuCSD1+CCS基因巨尾桉Z-16生长量正常，生根正常，无黄叶现象，Z-9生根正常，但是生长受到抑制，其他实验植株均死亡。具体生长情况如表3和图8。通过盐胁迫筛选，获得了耐15mg/kg镉浓度的Z-16转基因巨尾桉。
表3不同镉胁迫下转EuCSD1+CCS巨尾桉5个月的生长观察
Figure BDA0003523882090000071
实施例2、耐逆能力提高的转基因桉树
1、构建pBD-EuCSD1+antiCCS植物二元双基因表达载体
反义CCS与Cu/ZnSOD植物二元双基因表达载体的构建过程如图9所示，PCR扩增以实验室保存的pMD-EuCCS(EuCCS基因为本实验室克隆并保存，GenBank:KJ755351.1，已发表《华侨大学学报》，2017，38(3):274-378)质粒为模板，和引物LoCS3：5’CTCTAGATCAGACTTTGCTGGTG 3’(SEQ ID NO:6)，LoCS4：5’CCCCGGGATGGCATTTCTGAGGT 3’(SEQ IDNO:7)，凝胶回收antiCCS片段与pMD-18T(购自takara公司)连接并转化JM109 大肠杆菌感受态，筛选菌株进行质粒PCR验证，并将阳性菌株命名为pMD-antiCCS。将pBD- EuCSD1和pMD-antiCCS质粒用SmaI和XbaI双酶切及酶切产物的回收，之后16℃连接过夜，载体与目的片段连接后转化大肠杆菌感受态，提取菌株质粒，选取2个SmaI和XbaI筛选阳性质粒，如图10有约1kb和15.9kb的两条条带，命名为pBD-EuCSD1-antiCCS。 pBD-EuCSD1-antiCCS的具体序列见SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:8
GTTAACTTAGCCTTGCAGACCAATAATACCGCAAGCTACTCTACCACCAGCATTTCCGGTGCTTTTGCTAAGCTCGTGCC CCCCCTTGCCAAGGTCATCCGGATCAGCATGGACAACGACCGCTCTTCCAATAATGGAGTGTGGCCCGGAGAGAGGAATC TGTTTGTCGACAATAGAGAAACTCGCAGAGCCATCAGCACCAACAGTGACATTTCCTAGATCACCAGCATGGCGATTCAC ATCTTCAGGAGCACCATGCCCTTTTCCAGCAGGATTGAAGTGAGGTCCTGTTGACATGCAACCATTTGTTGTGTCCCCTA GGGCATGAACATGCAAACCCTGCAGGCCGGGCTTAAGACCAGAAAGCTTTCCGGTCACCGTTGTAGGTCCCTCTCCATCC TGTGAGAAGAATTCAGTCCCTCTTTCTCCATCCTTTCTACCGAGGACGGCAACGGCCTTCACCATCTCGAGGTCCTCTCC AAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGGGTACCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCCCAGATTA GCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTAC CCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCAT CAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAAC CAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATA GAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAAT CTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAA TTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAG TGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAA GGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGATCAGACTTTGCTGGTGACGAAATCATTGTTACTTGATTC CCATATGGTGGTTCCATCACATGTACAAAGTTTTTTGTAGTTCTCACCGATTCCTGCACTTCTAGCAATTACAGCAGCTG TGATACCTGAATCTGATTTATCTTCAGATCCATATACAAATATGGATCGTCCAATCAGATCCACAACTCTCAGCTTCTCT TTGACACCTGAGAAGAAGGCCTCCCCTTTGTCATCTACTTCTAATGTTCCCAGGTCGCCAAGTGGCTCTTTAGCAGTTTC AAGACTTGTAGGATTATAAACTTTTCCAGTGCTTGCTGCACCGTTTGTTAGATCACCATATTCATTGATTGACCAACCAT GTTTTCCAGGCGACAGCCCAGTAAAGTTGGCTTCAACCCTAGCCAATTCCATATTCACTTGAGCCAGACGAACCACACCA AAAATATCCGGACCTTTGAATTCAGCAACGGCAGCAGAAACTAAAAAATCTTCAGGTACCCCCTGGCCAATCAGCCGAGC TTTTCTCCCTGTTTGCTCTAAGGCTTCGGTCATGGTCTTCACAGGTGACCAACCCAAAATTCTCACAACTTGATTGCTCA AGTCCACCTCAACATTCTTCACTCCATTAACAGTCTGTAACTTGTTCTTGACCGCATTAACACAGCCCTCACACTTCATG TCCACCATATATTCAGTAAGTAGCTCAGGCAAGACTTGATGATCATCCTGCTGATTGGATGTGGGCGCGTCCATGTGAAG AGCGGAAGGTGAATTGGTGAAGTTTTTGACAAGAGGCAATCTAAGTGAAAGGGACTGTGGAGAGAAAACGGACAAATTTT GTGAGGGGGGTTTGGTCGGAGGAGATTTTGATGACGAAATTGAAGACAAGGCAAAGGCAGCTACTGCTGTTGTAGTTGTT GCGGTCGCTGCTGCTGTGGCCACCGACCTCAGAAATGCCATGAGCTC
2、桉树的转化和鉴定分析
按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在卡那霉素50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切验证。
用剪刀剪下巨尾桉组培苗的茎段，放在土壤农杆菌菌液中侵染5min，将侵染后的茎段水平放置在共培养培养基中，共培养培养基配方为1/2MS基础培养基添加0.15mg/L的KT和 0.2mg/L的NAA，pH 6.0，避光培养4-6天，直到茎段周围可见明显得白色菌落。将共培养后的茎段置于芽分化培养基中，芽分化培养基配方为1/2MS基础培养基添加0.05mg/L的TDZ 和0.5mg/L的NAA，pH6.0，28℃，16h/d光照培养，直至芽长到2cm以上，截取2cm以上的芽插入根生长培养基中，根生长培养基为1/2MS培养基，经卡那霉素5mg/L初步筛选转基因桉树植株，转入根生长培养基后生长状况良好的巨尾桉再生植株为经过初步筛选的阳性植株。
3、转基因桉树的PCR检测
2×CTAB法提取转基因巨尾桉基因组DNA。将提取的未转基因巨尾桉CK的基因组DNA 作为阴性对照，将提取的pBD-EuCSD1+antiCCS质粒作为阳性对照，和转基因巨尾桉的基因组DNA以引物LoCS3:5’-TCATCAAGTCT TGCCTGAGC-3’(SEQ ID NO:9)， LoCS4:5’-GCTCAAGTCCAC CTCAACAT-3’(SEQ ID NO:10)，进行PCR检测，目的基因的片段大小为960bp，若为阳性转基因巨尾桉，最后进行基因组DNA的PCR扩增后，得到的条带位于750bp与1000bp之间。最后共筛选得到10株EuCSD1+antiCCS转基因阳性巨尾桉。
4、转基因桉树的SOD酶活性检测
取同期驯化的未转基因巨尾桉CK以及转入EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉：F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、F-6、F-7、F-8、F-9、F-10进行SOD酶活测定。将进行SOD酶活检测的巨尾桉放在气候培养箱中培养，温度为4℃、湿度为70％、光照时间为14小时每天。分别于0h、 24h、36h检测其SOD酶活和SOD比酶活。NBT法检测SOD酶活，Bradford法测定巨尾桉总蛋白。
常温下，转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉的SOD酶相对比酶活高于CK，其SOD酶比活力大小为：F-9>F-1>F-5>F-3>F-10>F-2>F-4>F-7>F-6>F-8>CK。随着EuCSD1+antiCCS的转入， SOD比酶活增加了。通过测定室温下、4℃低温胁迫24h、4℃低温胁迫36h下的SOD酶活，SOD酶比活力大致呈先升高后降低趋势，F-9、F-4为一直降低(在冷冻耐受试验中100天恢复培养后，F-4死亡)。可见低温处理后，SOD表达增加以响应低温胁迫，参与巨尾桉抗逆反应，而在遭受低温胁迫后SOD酶比活力未增加的其抗逆性较差，如F-4。
5、转基因桉树的抗冻性检测
将生长时间相同，生长情况相同的转基因组培苗、CK、及未成功转入基因的阴性苗，放在-15℃冰箱进行冻害胁迫6h。处理结束后置于组培室进行恢复培养。7天后观察转基因组培苗、CK、及未成功转入基因的阴性苗的生长情况，拍照记录。再经过15天、30天、45天、60天……直到100天后植株生长情况没有变化为止。将培养了2个月大的转EuCSD1+antiCCS巨尾桉，进行-15℃冻害胁迫，6h后CK和转基因阴性巨尾桉均完全死亡；转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉有1株(F-10)完全存活；2株有1/2存活；7株有1/3存活；100天后，除F-4 未能再生外，其余1/2存活和1/3存活的均重生。
表4转EuCSD1+antiCCS巨尾桉-15℃冻害胁迫6h后生长状态
Figure BDA0003523882090000091
6、转基因桉树的耐盐检测
将生长时间相同，生长情况相同的转基因组培苗、CK，在含有0.4％，0.6％和0.8％盐浓度的培养基中连续培养和观察。分别在30天、60天90天和120天，150天观察在盐胁迫下的生长情况，并拍照记录结果，以生根时间，生长量变化，和叶片颜色为主要生理指标。
盐胁迫的结果是，CK巨尾桉完全死亡或者生长受到抑制，转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉在0.4％盐胁迫中全存活4株其中F-3、F-4、F-7、F-8生长量正常，生根正常，无黄叶现象，2株F-6，F-9的生长受到抑制，有生根，无黄叶存活，其他植株死亡。在0.6％的盐胁迫下转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉F-7、F-8生长量正常，生根正常，无黄叶现象，其他实验植株均死亡。通过盐胁迫筛选，获得了耐盐0.6％的F-7、F-8巨尾桉。
表5 EuCSD1+antiCCS巨尾桉盐胁迫耐受性筛选结果
Figure BDA0003523882090000092
Figure BDA0003523882090000101
7、转基因桉树的耐镉检测
将生长时间相同，生长情况相同的转基因组培苗、CK，在添加10mg/kg，15mg/kg，20mg/kg镉的培养基上培养和观察。分别在30天、60天90天和120天，150天观察在镉胁迫下的生长情况，并拍照记录结果，以生根时间，生长量变化，和叶片颜色为主要生理指标。
镉胁迫的结果是，CK巨尾桉完全死亡或者生长受到抑制，转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉在10mg/kg镉浓度胁迫中转基因植株共6株包括F-1、F-3、F-6、F-7、F-8、F-10生长量正常，生根正常，无黄叶现象，其它植株死亡。在15mg/kg镉浓度胁迫下转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉F-3生长量正常，生根正常，无黄叶现象，Z-9生根正常，但是生长受到抑制，其他实验植株均死亡。在20mg/kg镉浓度胁迫下转EuCSD1+antiCCS基因巨尾桉F-6生长量正常，生根正常，无黄叶现象。通过盐胁迫筛选，获得了耐20mg/kg镉浓度的F-6转基因巨尾桉。
表6不同镉胁迫5个月EuCSD1+antiCCS巨尾桉耐受性筛选结果
Figure BDA0003523882090000102
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种提高植物抗逆性的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctagaatg gcatttctga ggt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccgggtca gactttgctg gtg 23
<210> 3
<211> 2367
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttaacttag ccttgcagac caataatacc gcaagctact ctaccaccag catttccggt 60
gcttttgcta agctcgtgcc cccccttgcc aaggtcatcc ggatcagcat ggacaacgac 120
cgctcttcca ataatggagt gtggcccgga gagaggaatc tgtttgtcga caatagagaa 180
actcgcagag ccatcagcac caacagtgac atttcctaga tcaccagcat ggcgattcac 240
atcttcagga gcaccatgcc cttttccagc aggattgaag tgaggtcctg ttgacatgca 300
accatttgtt gtgtccccta gggcatgaac atgcaaaccc tgcaggccgg gcttaagacc 360
agaaagcttt ccggtcaccg ttgtaggtcc ctctccatcc tgtgagaaga attcagtccc 420
tctttctcca tcctttctac cgaggacggc aacggccttc accatctcga ggtcctctcc 480
aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa gggtcttgcg aaggggtacc aagcttgcat 540
gcctgcaggt ccccagatta gccttttcaa tttcagaaag aatgctaacc cacagatggt 600
tagagaggct tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagcaata atctccagga 660
aatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaactgcat 720
caagaacaca gagaaagata tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat 780
tcaaggcttg cttcacaaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt 840
tcccactgaa tcaaaggcca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa cagaactcgc 900
cgtaaagact ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca agaagaaaat 960
cttcgtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt 1020
ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct 1080
cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg 1140
ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga 1200
cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc 1260
aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc 1320
acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga 1380
gagaacacgg gggactctag aatggcattt ctgaggtcgg tggccacagc agcagcgacc 1440
gcaacaacta caacagcagt agctgccttt gccttgtctt caatttcgtc atcaaaatct 1500
cctccgacca aacccccctc acaaaatttg tccgttttct ctccacagtc cctttcactt 1560
agattgcctc ttgtcaaaaa cttcaccaat tcaccttccg ctcttcacat ggacgcgccc 1620
acatccaatc agcaggatga tcatcaagtc ttgcctgagc tacttactga atatatggtg 1680
gacatgaagt gtgagggctg tgttaatgcg gtcaagaaca agttacagac tgttaatgga 1740
gtgaagaatg ttgaggtgga cttgagcaat caagttgtga gaattttggg ttggtcacct 1800
gtgaagacca tgaccgaagc cttagagcaa acagggagaa aagctcggct gattggccag 1860
ggggtacctg aagatttttt agtttctgct gccgttgctg aattcaaagg tccggatatt 1920
tttggtgtgg ttcgtctggc tcaagtgaat atggaattgg ctagggttga agccaacttt 1980
actgggctgt cgcctggaaa acatggttgg tcaatcaatg aatatggtga tctaacaaac 2040
ggtgcagcaa gcactggaaa agtttataat cctacaagtc ttgaaactgc taaagagcca 2100
cttggcgacc tgggaacatt agaagtagat gacaaagggg aggccttctt ctcaggtgtc 2160
aaagagaagc tgagagttgt ggatctgatt ggacgatcca tatttgtata tggatctgaa 2220
gataaatcag attcaggtat cacagctgct gtaattgcta gaagtgcagg aatcggtgag 2280
aactacaaaa aactttgtac atgtgatgga accaccatat gggaatcaag taacaatgat 2340
ttcgtcacca gcaaagtctg agagctc 2367
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctctagaatg gcatttctga ggt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccccgggtca gactttgctg gtg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctagatca gactttgctg gtg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccgggatg gcatttctga ggt 23
<210> 8
<211> 2367
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttaacttag ccttgcagac caataatacc gcaagctact ctaccaccag catttccggt 60
gcttttgcta agctcgtgcc cccccttgcc aaggtcatcc ggatcagcat ggacaacgac 120
cgctcttcca ataatggagt gtggcccgga gagaggaatc tgtttgtcga caatagagaa 180
actcgcagag ccatcagcac caacagtgac atttcctaga tcaccagcat ggcgattcac 240
atcttcagga gcaccatgcc cttttccagc aggattgaag tgaggtcctg ttgacatgca 300
accatttgtt gtgtccccta gggcatgaac atgcaaaccc tgcaggccgg gcttaagacc 360
agaaagcttt ccggtcaccg ttgtaggtcc ctctccatcc tgtgagaaga attcagtccc 420
tctttctcca tcctttctac cgaggacggc aacggccttc accatctcga ggtcctctcc 480
aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa gggtcttgcg aaggggtacc aagcttgcat 540
gcctgcaggt ccccagatta gccttttcaa tttcagaaag aatgctaacc cacagatggt 600
tagagaggct tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagcaata atctccagga 660
aatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaactgcat 720
caagaacaca gagaaagata tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat 780
tcaaggcttg cttcacaaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt 840
tcccactgaa tcaaaggcca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa cagaactcgc 900
cgtaaagact ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca agaagaaaat 960
cttcgtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt 1020
ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct 1080
cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg 1140
ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga 1200
cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc 1260
aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc 1320
acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga 1380
gagaacacgg gggactctag atcagacttt gctggtgacg aaatcattgt tacttgattc 1440
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tctagcaatt acagcagctg tgatacctga atctgattta tcttcagatc catatacaaa 1560
tatggatcgt ccaatcagat ccacaactct cagcttctct ttgacacctg agaagaaggc 1620
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aagacttgta ggattataaa cttttccagt gcttgctgca ccgtttgtta gatcaccata 1740
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agccaattcc atattcactt gagccagacg aaccacacca aaaatatccg gacctttgaa 1860
ttcagcaacg gcagcagaaa ctaaaaaatc ttcaggtacc ccctggccaa tcagccgagc 1920
ttttctccct gtttgctcta aggcttcggt catggtcttc acaggtgacc aacccaaaat 1980
tctcacaact tgattgctca agtccacctc aacattcttc actccattaa cagtctgtaa 2040
cttgttcttg accgcattaa cacagccctc acacttcatg tccaccatat attcagtaag 2100
tagctcaggc aagacttgat gatcatcctg ctgattggat gtgggcgcgt ccatgtgaag 2160
agcggaaggt gaattggtga agtttttgac aagaggcaat ctaagtgaaa gggactgtgg 2220
agagaaaacg gacaaatttt gtgagggggg tttggtcgga ggagattttg atgacgaaat 2280
tgaagacaag gcaaaggcag ctactgctgt tgtagttgtt gcggtcgctg ctgctgtggc 2340
caccgacctc agaaatgcca tgagctc 2367
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcatcaagtc ttgcctgagc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctcaagtcc acctcaacat 20

Claims (11)

1.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：将含有Cu/ZnSOD+CCS双基因的表达载体和/或将含有Cu/ZnSOD+反义CCS双基因的植物表达载体转化植物，得到抗逆性提高的植物。
2.根据权利要求1所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述Cu/ZnSOD+CCS是具有SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述Cu/ZnSOD+反义CCS基因是具有SEQ ID NO:8的多核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：表达载体的出发载体为Ti类质粒载体。
5.根据权利要求4所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述的Ti质粒载体为植物二元双基因表达载体PBDGR。
6.根据权利要求1所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述含有Cu/ZnSOD+CCS基因的表达载体为pBD-EuCSD1+CCS；所述含有Cu/ZnSOD+反义CCS基因的表达载体为pBD-EuCSD1+antiCCS。
7.根据权利要求1所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：转化方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法。
8.根据权利要求1所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述植物为草本植物或木本植物。
9.根据权利要求8所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述木本植物为桉树。
10.根据权利要求1至9任一项所述的一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述的抗逆包括抗寒、耐盐和耐重金属镉中的至少一种。
11.一种提高植物抗逆性的方法，包括如下步骤：
1)pBD-EuCSD1+CCS植物二元表达载体的构建
植物二元表达载体选用pBDGR，将pBDGR和pMD-EuCSD1的质粒用XhoI和HpaI进行双酶切，回收pBDGR和pMD-EuCSD1质粒双酶切产物，10-15℃连接过夜，热激法转化大肠杆菌后平板培养，挑取pBD-EuCSD1转化液涂布的LB平板中单菌落，接种于含有40-60mg/L的Kan的LB液体培养基中，35-37℃150-250rpm摇床培养14-16h；提取pBD-EuCSD1质粒，经XhoI和HpaI双酶切凝胶检测载体是否构建成功；
PCR扩增ZCCS的质粒为模板，和引物LoCS1：5’CTCT AGAATGGCATTTCTGAGGT 3’，LoCS2：5’CCCCGGGTCAGACTTTGCTG GTG 3’，凝胶回收ZCCS片段与pMD-18T连接并转化JM109大肠杆菌感受态，筛选菌株进行质粒PCR验证，并将阳性菌株命名为pMD-ZCCS；将pBD-EuCSD1和pMD-ZCCS质粒用SmaI和XbaI双酶切及酶切产物的回收，之后15-20℃连接过夜，载体与目的片段连接后转化大肠杆菌感受态，提取菌株质粒，选取SmaI和XbaI筛选阳性质粒，命名为pBD-EuCSD1-CCS；
2)将pBD-EuCSD1-CCS转化农杆菌LBA4404；
3)将植物与转化后的农杆菌LBA4404接触，获得转基因植物。
或
1)反义CCS与Cu/ZnSOD植物二元双基因表达载体的构建，
植物二元表达载体选用pBDGR，将pBDGR和pMD-EuCSD1的质粒用XhoI和HpaI进行双酶切，回收pBDGR和pMD-EuCSD1质粒双酶切产物，10-15℃连接过夜，热激法转化大肠杆菌后平板培养，挑取pBD-EuCSD1转化液涂布的LB平板中单菌落，接种于含有40-60mg/L的Kan的LB液体培养基中，35-37℃150-250rpm摇床培养14-16h；提取pBD-EuCSD1质粒，经XhoI和HpaI双酶切凝胶检测载体是否构建成功；
PCR扩增以CCS的质粒为模板，和引物LoCS3：5’CTCTAGA TCAGACTTTGCTGGTG 3’，LoCS4：5’CCCCGGGATGGCATTTCTGAGGT 3’，凝胶回收antiCCS片段与pMD-18T连接并转化JM109大肠杆菌感受态，筛选菌株进行质粒PCR验证，并将阳性菌株命名为pMD-antiCCS；将pBD-EuCSD1和pMD-antiCCS质粒用SmaI和XbaI双酶切及酶切产物的回收，之后15-20℃连接过夜，载体与目的片段连接后转化大肠杆菌感受态，提取菌株质粒，选取SmaI和XbaI筛选阳性质粒，命名为pBD-EuCSD1-antiCCS；
2)将pBD-EuCSD1-antiCCS转化农杆菌LBA4404；
3)将植物与转化后的农杆菌LBA4404接触，获得转基因植物。
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