CN116144702A - 一种向日葵HaWRKY29转录因子基因在提高植物耐盐胁迫能力中的应用 - Google Patents

Abstract

一种向日葵HaWRKY29转录因子基因在提高植物耐盐胁迫能力中的应用，属于基因工程技术领域。为了挖掘能够提高植物耐盐胁迫能力的转录因子，本发明通过克隆向日葵基因HaWRKY29，荧光定量PCR分析盐胁迫下向日葵根和叶中HaWRKY29表达量，亚细胞定位分析及转录活性分析，构建过表达HaWRKY29拟南芥，荧光定量PCR分析NaCl胁迫下转基因拟南芥中盐胁迫应答标记基因表达水平，及分析HaWRKY29可以结合的启动子元件，发现基因HaWRKY29能够作为转录因子基因用于提高植物的耐盐性，还能够参与盐胁迫下的脱落酸信号转导途径及渗透平衡调节，同时本发明还发现了HaWRKY29可以结合的DNA序列。

Description

一种向日葵HaWRKY29转录因子基因在提高植物耐盐胁迫能力 中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种向日葵HaWRKY29转录因子基因在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

背景技术

盐胁迫会引起渗透胁迫、离子毒性和氧化应激，是限制植物生长、作物产量和威胁粮食安全最有害的环境因子之一。WRKY转录因子已被广泛证明在植物抵抗盐胁迫的过程中发挥关键作用，参与到多种植物的耐盐性调节中。例如，菊花转录因子基因DgWRKY2和DgWRKY4在菊花中的超表达能够调控下游抗氧化酶基因DgCAT、DgAPX和DgZnSOD以及脯氨酸合成基因DgP5CS的表达，通过维持活性氧平衡和渗透平衡来增强转基因菊花的耐盐性(HeL,Wu Y H,Zhao Q,et al.Chrysanthemum DgWRKY2 gene enhances tolerance to saltstress in transgenic Chrysanthemum[J].Int J Mol Sci,2018,19(7):2062.)(Wang K,Wu Y H,Tian X Q,et al.Overexpression of DgWRKY4 enhances salt tolerance inChrysanthemum seedlings[J].FrontPlant Sci,2017,8:1592.)。长叶红砂(Reaumuriatrigyna)转录因子基因RtWRKY1在拟南芥中的超表达上调了脯氨酸合成基因AtP5CS1和AtP5CS2的表达，下调了脯氨酸降解基因AtPRODH1和AtPRODH2的表达，通过提高脯氨酸的合成并抑制其降解来增加脯氨酸含量，从而增强转基因拟南芥在盐胁迫下的渗透调节能力(Du C,Zhao P P,Zhang H R,et al.The Reaumuria trigyna transcription factorRtWRKY1 confers tolerance to salt stress in transgenic Arabidopsis[J].J PlantPhysiol,2017,215:48～58.)。相比之下，银腺杨(Populus alba×P.glandulosa)转录因子基因PagWRKY75被证明在盐胁迫应答过程中起负调控作用，通过抑制超表达杨树中脯氨酸合成基因PagP5CS1的表达，进而降低杨树体内脯氨酸的积累，导致耐盐性降低(Zhao K,Zhang D W,Lv K W,et al.Functional characterization ofpoplarWRKY75 in saltandosmotic tolerance[J].Plant Sci,2019,289:110259.)。

向日葵可以分为油用向日葵、食用向日葵以及观赏向日葵，其中油用向日葵是世界上重要的油料作物之一，食用向日葵是人类的主要休闲食品，观赏向日葵被用于美化环境。向日葵对盐碱有较强的耐性。此外，向日葵还具有使土壤脱盐的能力，是开发盐碱地及生物治理盐碱的首选作物。水分亏缺和水分过剩是影响植物生长的主要非生物胁迫。向日葵(Helianthus annuus)转录因子基因HaWRKY76在拟南芥中的的超表达通过诱导气孔关闭提高转基因拟南芥的耐旱性，通过降低蔗糖合酶基因AtSUS1和乙醇脱氢酶基因AtADH的表达，抑制发酵途径实现碳水化合物(蔗糖和淀粉)的保存来提高转基因拟南芥的耐涝能力(Raineri J,Ribichich K F,Chan R L.The sunflower transcription factorHaWRKY76confers drought and flood tolerance to Arabidopsis thaliana plantswithout yield penalty[J].Plant Cell Rep,2015,34(12):2065～2080.)。MicroRNAs(miRNAs)通过结合互补mRNA序列，降解mRNA或抑制翻译来发挥调节功能(Filipowicz W,Bhattacharyya S N,Sonenberg N.Mechanisms ofpost-transcriptional regulation bymicroRNAs:are the answers in sight[J].Nat Rev Genet,2008,9(2):102～114.)。向日葵miR396通过调控转录因子HaWRKY6的表达，帮助转基因拟南芥抵抗高温胁迫(GiacomelliJ I,Weigel D,Chan R L,et al.Role of recently evolved miRNA regulation ofsunflower HaWRKY6 in response to temperature damage[J].New Phytol,2012,195(4):766～773.)。盐胁迫应答WRKY转录因子在多种植物中被广泛研究，但向日葵中响应盐胁迫的WRKY基因及机制的研究比较少，因此，筛选向日葵盐胁迫应答关键WRKY基因，解析其功能机制，可为向日葵的分子育种及应用提供重要基础。

发明内容

为了在向日葵中挖掘能够提高植物耐盐胁迫能力的转录因子，本发明提供了一种向日葵HaWRKY29转录因子基因在提高植物耐盐胁迫能力中的应用，所述HaWRKY29转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HaWRKY29转录因子基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含有上述HaWRKY29转录因子基因的重组载体在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

本发明还提供了含上述HaWRKY29转录因子基因的工程菌在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

进一步地限定，所述工程菌包括大肠杆菌、农杆菌和酵母菌。

本发明还提供了含有上述HaWRKY29转录因子基因的细胞系在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

进一步地限定，所述细胞系为植物细胞系。

本发明还提供了一种提高植物耐盐胁迫能力的方法，所述方法包括构建含有如权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因的植物表达载体，将所得植物表达载体转入植物细胞中，培育获得具有耐盐性的转基因植物。

进一步地限定，所述植物为拟南芥。

本发明还提供了上述HaWRKY29转录因子基因在盐胁迫下参与脱落酸(ABA)信号转导途径中的应用，所述应用中HaWRKY29转录因子基因用来提高盐胁迫下ABA信号途径基因AtNCED3基因的表达量。

本发明还提供了上述HaWRKY29转录因子基因在盐胁迫下参与渗透平衡调节中的应用，所述应用中HaWRKY29转录因子基因用来提高盐胁迫下脯氨酸合成基因AtP5CS1的表达量。

本发明还提供了上述HaWRKY29转录因子基因编码蛋白质在调控含有CCAATBOX1、GTGANTG10和W-BOX中任意一种启动子元件的基因中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明从高耐盐性向日葵品种LD5009中成功克隆了向日葵转录因子基因HaWRKY29，并通过荧光定量PCR分析发现，HaWRKY29基因在LD5009根中的表达水平高于在茎、叶及种子中的表达水平。140mM NaCl处理下在向日葵品种LD5009和NK175的根和叶中HaWRKY29基因均能被盐胁迫诱导上调表达，LD5009根中HaWRKY29基因的上调水平高于NK175。在LD5009和NK175的叶中，HaWRKY29基因在3h、6h、12h、24h等所有时间点的表达水平均高于对照0h的状态，在达到峰值时LD5009叶中HaWRKY29基因的上调表达倍数更高。在盐胁迫早期，LD5009根和叶中HaWRKY29的表达量均处于快速累积的过程。表明HaWRKY29基因在不同向日葵品种的根和叶中均响应盐胁迫，在高耐盐性向日葵品种LD5009中的响应能力更强，并可能在早期盐应答过程中发挥调节耐盐性的作用。

(2)本发明通过对HaWRKY29进行亚细胞定位分析及转录活性分析发现HaWRKY29定位在细胞核，且在酵母细胞中具有转录激活活性，符合大多数的WRKY转录因子特征。

(3)本发明将HaWRKY29通过农杆菌介导法转入拟南芥后进行了功能分析，发现盐胁迫下，HaWRKY29的过表达降低了盐胁迫造成的伤害，与WT相比，转基因幼苗生长状态更好，叶片更加舒展，HaWRKY29的过表达能增加拟南芥幼苗的鲜重和根长，提高叶绿素含量。盐胁迫下，抽薹期HaWRKY29的过表达植株的株高和结荚数均高于WT，HaWRKY29的过表达能够促进拟南芥植株在盐胁迫下的生殖生长。

(4)本发明通过荧光定量PCR分析发现，盐胁迫下AtNCED3基因在HaWRKY29过表株系中的表达量显著上调至WT的3.70倍，表明HaWRKY29可能参与ABA信号转导途径。盐胁迫下AtP5CS1基因在HaWRKY29过表株系中表达量显著上调至WT的1.34倍，表明，HaWRKY29可能参与盐胁迫下的渗透平衡调节。

(5)本发明通过反式酵母单杂交技术筛选出HaWRKY29可能结合的DNA序列有“CCCAATCTCCAATGGG”包含CCAATBOX1元件；“CCCAATCTCCAATGGG”包含GTGANTG10元件；“CCCTGACTGTTTTGGG”包含W-BOX元件。

附图说明

图1为HaWRKY29基因的PCR扩增结果图；

图2为pMD19-T(simple)-HaWRKY29大肠杆菌阳性转化子鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照，2为阳性对照，3，4，5均为大肠杆菌转化子；

图3为向日葵各部位中HaWRKY29表达水平检测结果图；其中，图3中的A为向日葵品种LD5009中HaWRKY29基因的器官特异性表达水平检测结果图，图3中的B为盐胁迫下向日葵根中HaWRKY29表达水平检测结果图，图3中的C为盐胁迫下向日葵叶中HaWRKY29表达水平检测结果图，*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；****代表p<0.0001；

图4为pBI121-eGFP-HaWRKY29大肠杆菌阳性转化子鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(ddH₂O为模板)，2为阳性对照(pMD19T-HaWRKY29为模板)，3，4，5为大肠杆菌转化子；

图5为pBI121-eGFP-HaWRKY29酶切结果图；其中M为DL2000，1为空载体，2为重组载体，3为重组载体酶切产物；

图6为农杆菌阳性转化子鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(ddH₂O为模板)，2为阳性对照(pMD19T-HaWRKY29为模板)；3和4为农杆菌转化子；

图7为HaWRKY29在烟草叶片细胞中的定位图；

图8为pGBKT7-HaWRKY29大肠杆菌阳性转化子鉴定图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(ddH₂O为模板)，2为阳性对照(pMD19T-HaWRKY29为模板)，3，4和5为大肠杆菌转化子；

图9为pGBKT7-HaWRKY29酶切鉴定结果图；其中M为DL2000，1为空载体，2为重组载体，3为重组载体酶切产物；

图10为HaWRKY29在酵母中的转录活性分析结果图；

图11为pBI121酶切结果图；其中，M为DL2000；1为XbaI和SacI双酶切pBI121；

图12为pBI121-HaWRKY29大肠杆菌阳性转化子鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(ddH₂O为模板)，2为阳性对照(pMD19T-HaWRKY29为模板)，3为大肠杆菌转化子；

图13为pBI121-HaWRKY29酶切结果图；其中M为DL2000，1，3为重组载体，2，4为重组载体酶切产物，5为空载体；

图14为农杆菌阳性转化子鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(ddH₂O为模板)，2为阳性对照(pMD19T-HaWRKY29为模板)，3和4为农杆菌转化子；

图15为T1代转基因拟南芥筛选结果图；

图16为T1代转基因拟南芥的PCR鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(WT)，2，3，4，5，6，7，8，9，10为转基因拟南芥株系；

图17为T3代转基因拟南芥各株系中HaWRKYs基因的表达水平分析结果图；

图18为NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗根系生长分析结果图；其中，图18中的A为NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗期的根系生长表型，图18中的B为NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗期的根长，*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001，****代表p<0.0001；

图19为NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗的生长表型及生理指标分析结果图；图19中的A为NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗的生长表型，图19中的B为表型分析平板中的株系分布图，图19中的C为NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗期的鲜重分析结果图，图19中的D为NaCl胁迫下转基因拟南芥叶绿素a含量分析结果图，图19中的E为NaCl胁迫下转基因拟南芥叶绿素b含量分析结果图，*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001，****代表p<0.0001；

图20为NaCl胁迫下转基因拟南芥抽薹期的植株的生长表型及生长指标检测；其中，图20中的A为NaCl胁迫下转基因拟南芥抽薹期的植株生长表型，图20中的B为NaCl胁迫下转基因拟南芥抽薹期的植株株高，图20中的C为NaCl胁迫下转基因拟南芥抽薹期的植株结荚数，*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001，****代表p<0.0001；

图21为盐胁迫下野生型拟南芥(WT)和转基因拟南芥中耐盐功能基因的表达水平分析结果图；其中，图21中的A为AtP5CS1基因的表达水平检测结果图，图21中的B为AtSOS1基因的表达水平检测结果图，图21中的C为AtNHX1基因的表达水平检测结果图，图21中的D为AtSOD1基因的表达水平检测结果图，图21中的E为AtPOD1基因的表达水平检测结果图，图21中的F为AtNCED3基因的表达水平检测结果图，*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；****代表p<0.0001；

图22为pGADT7-Rec2-HaWRKY29大肠杆菌阳性转化子鉴定结果图；其中，M为DL2000，1为阴性对照(ddH₂O为模板)，2为阳性对照(pMD19T-HaWRKY29为模板)，3，4为大肠杆菌转化子；

图23为pGADT7-Rec2-HaWRKY29酶切结果图；其中，M为DL2000，1为空载体，2为重组载体，3为重组载体酶切产物；

图24为反式酵母单杂交筛选HaWRKY29结合的DNA序列结果图；其中，P为阳性对照(pHIS-53+pGADT7-Rec2-53)，N为阴性对照(pHIS-53+pGADT7-Rec2-HaWRKY29)。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均可通过商业途径购买获得。

向日葵(Helianthus annuus)LD5009可以通过商业途径购买；

向日葵(Helianthus annuus)NK175公开自于海峰,牟英男,李美娜等.不同生态区域向日葵油酸含量对气候因子的响应规律[J].西北植物学报,2022,42(08):1430-1440.)。

实施例1：HaWRKY29基因的克隆及盐胁迫对其表达水平的影响

本实施例涉及的材料如下：

菌种：大肠杆菌DH5α。

载体：克隆载体pMD19-T(simple)Vector购自宝生物工程(大连)有限公司。

酶及试剂盒：rTaq(R500A)和DNALigation Kit<Mighty Mix>(6023)购自宝生物工程(大连)有限公司、KOD-Plus-Neo(KOD-401)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(R212-01)、RNAisolater TotalRNAExtraction Reagent(R401-01)和

Gel DNA Extraction Mini Kit(DC301-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司、/>

Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix forqPCR(gDNAdigesterplus)(11141ES60)及Hieff/>

Universal Blue qPCR SYBRGreen Master Mix(11184ES08)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

HaWRKY29基因CDS全长引物如下：

HaWRKY29 F-1(SEQ ID NO.3)：5'-ATGTCTTCTTTTTCCGACCAACC-3'；

HaWRKY29 R-1(SEQ ID NO.4)：5'-TTACCTTGGATTTGGGTTTCCCTTGAC-3'。

HaWRKY29基因荧光定量PCR引物如下：

HaWRKY29 F-2(SEQ ID NO.5)：5'-ATCACCCGAAACCGCAATCT-3'；

HaWRKY29 R-2(SEQ ID NO.6)：5'-ACCGGACCTACTCCGATCAA-3'；

HaActin F(SEQ ID NO.7)：5'-CACTGAGGCACCATTGAATCC-3'；

HaActin R(SEQ ID NO.8)：5'-TGTACGACCACTGGCATAGAG-3'。

本实施例涉及的试验方法如下：

向日葵的培养：将向日葵的种子去壳，放入铺有滤纸的培养皿中，加入适量灭菌水，22-25℃避光培养2-3d。将发芽后的向日葵在1/2霍格兰营养液中继续培养，光周期16h/8h，温度为22-25℃。

向日葵的处理及取材：取向日葵的种子及二对真叶期向日葵幼苗的根、茎、叶，液氮速冻后于-80℃保存，用于HaWRKY29基因的器官特异性表达分析。将处于二对真叶期的向日葵幼苗用140mM NaCl处理，于0h、3h、6h、12h、24h时分别取根和叶，液氮速冻后于-80℃保存，用于基因克隆及盐胁迫下基因表达特性分析。

向日葵总RNA的提取：参见诺唯赞RNA提取试剂R401-01说明书提取向日葵材料的RNA。

反转录获得向日葵的cDNA：参照诺唯赞反转录试剂盒R212-01说明书，反转录获得cDNA，用于HaWRKY29基因的扩增。参照翊圣

Ⅲ1st Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR(gDNA digesterplus)(11141ES60)反转录试剂盒，反转录获得cDNA，用于HaWRKY29基因表达水平检测。

HaWRKY29的PCR扩增体系为：KOD-Plus-Neo缓冲液5μL，dNTPs(2mM)5μL，MgSO₄(25mM)3μL，上游引物(10μM)1.5μL，下游引物(10μM)1.5μL，KOD Plus Neo 1μL，cDNA 1μL，ddH₂O 32μL；PCR程序：采用Touchdown PCR，反应条件为94℃预变性2min；98℃变性10s，退火温度为57-51℃，每3个循环降低2℃；到达最后的退火温度时循环27次，延伸时间为90s；反应结束后，加入0.5μLrTaq酶，72℃反应20min，进行加A处理。

HaWRKY29片段的胶回收参见诺唯赞胶回收试剂盒DC301-01说明书。

pMD19-T(simple)Vector与HaWRKY29连接：pMD19-T(simple)(50ng/μL)1μL，HaWRKY29胶回收片段(70ng/μL)1μL，Ligation Mix 5μL，ddH₂O 3μL，将反应混合物置于低温恒温槽中16℃过夜连接。

pMD19-T(simple)-HaWRKY29大肠杆菌阳性转化子PCR验证的体系及反应程序：10×PCR Buffer1μL，dNTP Mix(2.5mM)0.8μL，上下游引物(10μM)各0.2μL，rTaq 0.2μL，菌液0.5μL，ddH₂O7.1μL，反应程序同HaWRKY29的PCR扩增。

实时荧光定量PCR：参照翊圣Hieff

Universal Blue qPCR SYBR GreenMaster Mix(11184ES08)试剂盒说明书，反应体系为：Hieff/>

Universal BlueqPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 8.2μL；反应程序为预变性95℃2min；变性95℃10s，退火/延伸56.5℃30s，40个循环。

(一)HaWRKY29基因的克隆

利用高保真酶KOD-Plus-Neo对向日葵HaWRKY29基因CDS序列进行扩增，反应结束后，加入rTaq进行加A处理，使用琼脂糖电泳检测结果。如图1所述，片段大小与预期结果相符(HaWRKY29基因的CDS为1173bp)，因此对扩增片段进行切胶回收。

将HaWRKY29的胶回收片段与pMD19-T(simple)Vector连接，获得重组载体pMD19-T(simple)-HaWRKY29，转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃过夜培养。挑取圆润的单菌落放入加有氨苄青霉素的液体LB中进行过夜培养，使用rTaq进行菌液PCR鉴定。结果如图2，从大肠杆菌转化子中均扩增出了与阳性对照大小一致的条带，表明重组载体构建成功，对阳性菌液进行菌种保存。将转化pMD19-T(simple)-HaWRKY29的阳性菌送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。将测序结果与pMD19-T(simple)序列比对，得到HaWRKY29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其翻译获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：

ATGTCTTCTTTTTCCGACCAACCTCAGCCACCCCGAACCACCGGACTCGCCGCCCGGATCGCGGAACGAGTCGGCTCCGGTATTCCCAAGTTCAAGTCAATCCCTCCACCTTCACTTCCCATCTCCCCGCCCGCGGTCTCCCCTTCTTCTTATTTTGCTATCCCGGCCGGACTAAGCCCGGCCGAGCTCCTCGACTCCCCTGTTTTACTCTCCTCTTCCAACATTCTACCGTCTCCGACTACAGGTTCATTCCCGTTTCAAGCTTTTAACTGGAAGAATCTGAACGGCAACTTCCATAATGAAGAACATAGCATCAAAAAGGAGCAAAAAAGCTTGGCGGATTTCTCTTTTCGACCACAATTGCATCATCCTACGGAGCAACAGATATGGAATAATCAGAAACAACAGATAGATCAAGAGGAAAAATCTTTAACCCAATCCGGACACTCGCCTCCGATGCAGAGCTTCTCACCCGAAATCGCAACAATTCAAACCGATTCAAACTCACAAGCACAAAGCTTCCAATCTGGTTATGACACCAACAGCAGCAGCAACTTCAACAACCAAACGTTACAGAAGAAGTCAGAAGACGGTTATAATTGGCGAAAATACGGGCAAAAACAAGTGAAAGGGAGCGAAAACCCGAGGAGTTATTACAAGTGCACGTATCCGAATTGTTCAATGAAGAAGAAACTAGAGACTAATATAGAAGGACAGATTACTGAGATTGTTTATAAGGGTAGTCATAATCACCCGAAACCGCAATCTACGCGAAGATCCTCGTCTTCTTCGGCTTCGAATACTTTGCAGATGAGTCAGGCTTCAAGTAATCATGATGTTCATGATTACCCGGATCAGTCTTATGCTTCTCATGGATCCGGGCAGGTTGATTCGGTTACTACGCCGGAAAATTCTTCGATTTCGGTCGGAGATGATGAGTTTGATCGGAGTAGGTCCGGTGGGGATGGTGTTACTGTTGATGAAGATGAGCCTGAGGCCAAAAGATGGAAGGTGTCGGAAAATGAAGGGATATCAATGATTGGTGGAACAAAGACGGTACGAGAACCGAGGATCGTGGTTCAAACGACAAGCGATATTGATATACTCGATGATGGTTATAGATGGAGAAAATACGGTCAAAAGGTGGTCAAGGGAAACCCAAATCCAAGGTAA

SEQ ID NO.2：

MSSFSDQPQPPRTTGLAARIAERVGSGIPKFKSIPPPSLPISPPAVSPSSYFAIPAGLSPAELLDSPVLLSSSNILPSPTTGSFPFQAFNWKNLNGNFHNEEHSIKKEQKSLADFSFRPQLHHPTEQQIWNNQKQQIDQEEKSLTQSGHSPPMQSFSPEIATIQTDSNSQAQSFQSGYDTNSSSNFNNQTLQKKSEDGYNWRKYGQKQVKGSENPRSYYKCTYPNCSMKKKLETNIEGQITEIVYKGSHNHPKPQSTRRSSSSSASNTLQMSQASSNHDVHDYPDQSYASHGSGQVDSVTTPENSSISVGDDEFDRSRSGGDGVTVDEDEPEAKRWKVSENEGISMIGGTKTVREPRIVVQTTSDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPR

(二)盐胁迫下向日葵根和叶中HaWRKY29表达量检测

基因在器官中的表达水平是其发挥功能的重要基础，用qRT-PCR技术检测向日葵根、茎、叶和种子中HaWRKY29基因的表达水平。

检测结果如图3中的A所示，HaWRKY29基因在根中的表达水平高于在茎、叶及种子种的表达水平。

植物的根是最早感知外界盐胁迫信号的器官，对处于二对真叶期的向日葵苗用140mMNaCl处理后，用qRT-PCR技术检测向日葵根中HaWRKY29基因在0h、3h、6h、12h、24h的表达变化。

检测结果如图3中的B所示，LD5009根中的HaWRKY29基因表达水平在盐处理3h时显著上调并于胁迫6h达到峰值，是未处理时HaWRKY29表达量的4.03倍。NK175根中HaWRKY29基因的表达水平在胁迫6h时上调并达到峰值，是未处理时表达水平的1.26倍。盐胁迫下高耐盐品种LD5009根中HaWRKY29基因的峰值水平高于NK175根中的峰值水平，且HaWRKY29基因在LD5009根中达到峰值时的上调表达倍数是NK175根中的3.20倍。说明HaWRKY29基因在不同向日葵品种的根中均响应盐胁迫，在高耐盐性向日葵品种LD5009中的响应能力更强，可能在早期盐应答过程中发挥重要的调节作用。

盐胁迫会导致植物叶片脱水收缩，气孔开放程度降低，光合速率下降，降低植株生长速率。对处于二对真叶期的向日葵苗用140mM NaCl处理后，用qRT-PCR技术检测向日葵叶中HaWRKY29基因在0h、3h、6h、12h、24h的表达变化。

检测结果如图3中的C所示，在LD5009和NK175的叶中，HaWRKY29基因在3h、6h、12h、24h等所有时间点的表达水平均高于未处理的表达水平。在盐胁迫早期，LD5009叶中HaWRKY29基因的表达量处于快速且持续累积的状态，在盐胁迫12h到峰值，上调表达倍数为24.69倍，在NK175叶中HaWRKY29基因在盐胁迫24h达到最高峰，上调表达倍数为4.5倍。说明HaWRKY29基因在不同向日葵品种的叶中均响应盐胁迫，在高耐盐性向日葵品种LD5009的叶中，HaWRKY29基因对盐胁迫的应答水平更高，可能在盐胁迫早期发挥调节耐盐性的作用。

实施例2：HaWRKY29的亚细胞定位和转录活性分析

本实施例所用材料如下：

菌种：大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、酵母菌株AH109均可由商业途径购买。

质粒pMD19-T(simple)-HaWRKY29为实施例1构建，质粒pBI121-eGFP、pGBKT7均可由商业途径购买。

培养基与试剂：

酶及试剂盒：XbaI、SacI、SmaI、EcoRI和NdeI限制性核酸内切酶和rTaq(R500A)以及DNALigation Kit<Mighty Mix>(6023)购自宝生物工程(大连)有限公司、KOD-Plus-Neo(KOD-401)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(B518191)购自生工生物工程(上海)股份有限公司、

Gel DNA Extraction MiniKit(DC301-01)和/>

II One Step Cloning Kit(C112-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

HaWRKY29基因亚细胞定位引物：

HaWRKY29 F-3(SEQ ID NO.9)：5'-gagaacacgggggactctagaATGTCTTCTTTTTCCGACCAACC-3'；

HaWRKY29 R-3(SEQ ID NO.10)：5'-actagtcagtcgacacccgggCCTTGGATTTGGGTTTCCCTTGAC-3'。

HaWRKY29基因转录激活引物：

HaWRKY29 F-4(SEQ ID NO.11)：5'-GGAATTCCATATGTCTTCTTTTTCCGACCAACC-3'；

HaWRKY29 R-4(SEQ ID NO.12)：5'-CGGAATTCTTACCTTGGATTTGGGTTTCCCTTGAC-3'。

本实施例涉及的试验方法如下：

pBI121-eGFP的双酶切体系及条件为：10×T Buffer 5μL，0.1％BSA 5μL，XbaI2.5μL，SmaI 2.5μL，pBI121-eGFP 25μL(约2500ng)，ddH₂O 10μL；37℃水浴5-6h。

HaWRKY29基因的扩增及胶回收：以pMD19T(simple)-HaWRKY29质粒为模板，使用高保真酶进行PCR扩增及胶回收，PCR体系和程序参照实施例1。

亚细胞定位载体与HaWRKY29片段连接及转化：线性化pBI121-eGFP 0.85μL(130ng)，HaWRKY29基因0.25μL(20ng)，5×CE II Buffer 2μL，Exnase II 1μL，ddH₂O 5.9μL，PCR仪中37℃反应2h，转化大肠杆菌感受态DH5α。

阳性转化子鉴定：菌液PCR鉴定参见实施例1，酶切鉴定的酶切体系为10×TBuffer 1μL，0.1％BSA1μL，XbaI 0.5μL，SmaI 0.5μL，pBI121-eGFP-HaWRKY29质粒7μL(约400ng)，条件为37℃水浴5-6h，进行电泳检测，将酶切鉴定正确的阳性菌保存的菌种送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。将测序正确的pBI121-eGFP-HaWRKY29转化农杆菌感受态GV3101，菌液PCR鉴定参见实施例1。

烟草的培养：将营养土、草炭土和蛭石按1：1：1的比例混匀，装盆后加水，至土壤浸透；在1.5mL离心管中放入适量本氏烟草种子，加入1mL蒸馏水，4℃春化2d；将烟草种子播种到土里，光周期为16h/8h，温度22-25℃。

HaWRKY29基因瞬时转化烟草：采用农杆菌注射法瞬时转化烟草，将含有pBI121-eGFP-HaWRKY29的农杆菌转入本氏烟草叶片，进行亚细胞定位分析。

HaWRKY29 PCR产物胶回收片段的双酶切：10×H Buffer 2μL，NdeI 1μL，EcoRI 1μL，HaWRKY29回收产物10μL(约1000ng)，ddH₂O 6μL，37℃水浴5-6h。

质粒pGBKT7的双酶切：10×H Buffer 6μL，NdeI 3μL，EcoRI 3μL，pGBKT715μL(约3000ng)，ddH₂O 33μL，37℃水浴5-6h。

HaWRKY29与pGBKT7的连接及转化：pGBKT7片段0.5μL(100ng/μL)，HaWRKY29片段0.3μL(75ng/μL)，Ligation mix 5μL，ddH₂O 4.2μL，16℃水浴槽中进行过夜连接。反应结束后转化大肠杆菌感受态DH5α。

阳性转化子的鉴定：菌液PCR鉴定参见实施例1，酶切鉴定的酶切体系为10×HBuffer 1μL，NdeI0.5μL，EcoRI 0.5μL，pGBKT7-HaWRKY29质粒1.5μL(约500ng)，ddH₂O 6.5μL，条件为37℃水浴5-6h，进行电泳检测，将酶切鉴定正确的阳性菌保存的菌种送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

重组质粒转酵母感受态AH109：参照AH109产品说明书将重组质粒pGBKT7-HaWRKY29转化到酵母菌株AH109中，涂布于SD/-Trp单缺培养基上，30℃倒置培养2-3d。

HaWRKY29在酵母体内的转录活性分析：挑取SD/-Trp单缺培养基上的阳性酵母菌落于SD/-Trp液体培养基中，30℃摇至OD₆₀₀＝0.8-1.2；加入灭菌水重悬至OD₆₀₀＝1.0；按照原液、稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍点于SD/-Trp、SD/-Trp-His及SD/-Trp-His-Ade固体培养基上，封口；30℃倒置培养2-3d，观察并拍照。

(一)HaWRKY29亚细胞定位分析

利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取pBI121-eGFP和pMD19-T(simple)-HaWRKY29质粒；对pBI121-eGFP进行双酶切及纯化；以pMD19-T(simple)-HaWRKY29质粒为模板，使用高保真酶对HaWRKY29进行PCR扩增及胶回收；然后将线性化pBI121-eGFP与HaWRKY29片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，使用rTaq进行菌液PCR鉴定，结果如图4所示，从大肠杆菌转化子中扩增出了与阳性对照大小一致的条带，初步表明重组载体构建成功；提取阳性菌液的质粒进行酶切验证，电泳检测结果如图5所示，pBI121-eGFP-HaWRKY29经XbaI和SmaI双酶切后产生两条带，较小的一条与HaWRKY29的大小(1173bp)一致，大片段为线性化的pBI121-eGFP，电泳检测结果证明pBI121-eGFP-HaWRKY29重组载体构建成功。将pBI121-eGFP-HaWRKY29重组载体转化农杆菌感受态，并进行PCR鉴定，结果见图6，从农杆菌转化子中均扩增出了与阳性对照大小一致的条带，表明重组质粒成功转化到农杆菌中。

为了分析HaWRKY29的亚细胞定位，将构建好的pBI121-eGFP-HaWRKY29重组载体和pBI121-eGFP空载体分别转入农杆菌GV3101，再将获得的阳性农杆菌转化子注射烟草叶片进行瞬时表达，培养48h后于激光共聚焦显微镜下观察定位情况(图7)，在转入pBI121-eGFP空载体的烟草细胞中，荧光信号均匀分布在烟草细胞的所有部分，包括细胞膜、细胞质和细胞核，转入pBI121-eGFP-HaWRKY29重组载体的烟草叶片只在细胞核中出现绿色荧光信号，表明HaWRKY29为核定位蛋白。

(二)HaWRKY29转录活性分析

以pMD19T(simple)-HaWRKY29质粒为模板，使用高保真酶对HaWRKY29基因进行PCR扩增及胶回收；分别对HaWRKY29基因片段和pGBKT7质粒载体进行双酶切及回收纯化；连接HaWRKY29片段和pGBKT7片段，并转化大肠杆菌感受态DH5α，使用rTaq进行菌液PCR鉴定，结果如图8，从大肠杆菌转化子中均扩增出了与阳性对照大小一致的条带，初步表明重组载体构建成功，对阳性菌液保存菌种备用，提取剩余阳性菌液的质粒进行酶切验证，pGBKT7-HaWRKY29经双酶切后产生两条带，较小的一条与HaWRKY29的大小(1173bp)一致，大片段为线性化的pGBKT7(见图9)，电泳检测结果证明pGBKT7-HaWRKY29重组载体构建成功。

为了研究HaWRKY29的转录活性，将重组质粒pGBKT7-HaWRKY29和阴性对照pGBKT7分别转化到酵母菌株AH109中。结果如图10，转入pGBKT7空载体、pGBKT7-HaWRKY29的酵母菌在SD/-Trp平板上正常生长，说明重组质粒成功转入酵母菌株AH109中。转入pGBKT7-HaWRKY29的酵母菌在SD/-Trp-/His平板上正常生长，说明重组载体中的His3报告基因被激活。转入pGBKT7-HaWRKY29的酵母菌还能在SD/-Trp-/His/-Ade平板上正常生长，说明重组载体中的Ade2报告基因被激活。这些结果表明HaWRKY29在酵母细胞中具有转录激活活性。

上述实验结果证实了HaWRKY29定位于细胞核，符合转录因子的特征，与大多数的WRKY转录因子的亚细胞定位结果一致，为进一步分析HaWRKY29基因的功能提供了基础；本发明将HaWRKY29的全长CDS与pGBKT7载体中的GAL4 DNA结合域融合，转化到酵母菌株AH109中，分析转录活性。结果显示HaWRKY29在酵母细胞中具有转录激活活性，这与大多数的WRKY转录因子转录活性分析结果一致。

实施例3：向日葵HaWRKY29基因在提高拟南芥耐盐胁迫能力中的应用

本实施例涉及的材料如下：

植物材料：野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana.L)为哥伦比亚生态型。

酶及试剂盒：XbaI、SacI限制性核酸内切酶和rTaq(R500A)以及DNALigation Kit<Mighty Mix>(6023)购自宝生物工程(大连)有限公司、KOD-Plus-Neo(KOD-401)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(B518191)购自生工生物工程(上海)股份有限公司、

Gel DNA Extraction Mini Kit(DC301-01)和

II One Step Cloning Kit(C112-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

HaWRKY29基因引物：

HaWRKY29 F-5(SEQ ID NO.13)：5'-gagaacacgggggactctagaATGTCTTCTTTTTCCGACCAACC-3'；

HaWRKY29 R-5(SEQ ID NO.14)：5'-cgatcggggaaattcgagctcTTACCTTGGATTTGGGTTTCCCTTGAC-3'；

NPTIIF(SEQ ID NO.15)：5'-GCTATGACTGGGCACAACAG-3'；

NPTIIR(SEQ ID NO.16)：5'-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3'。

质粒pBI121的双酶切体系及条件为10×M Buffer 5μL，SacI 2.5μL，XbaI 2.5μL，pBI1218μL(约2400ng)，ddH₂O 32μL，37℃水浴5-6h。

HaWRKY29基因的扩增及回收见实施例1。

线性化pBI121与HaWRKY29连接及转化：线性化pBI1212μL(110ng)，HaWRKY29基因0.6μL(30ng)，5×CE II Buffer 2μL，Exnase II 1μL，ddH₂O 4.4μL，PCR仪中37℃反应2h，转化大肠杆菌感受态DH5α。

阳性转化子的鉴定：菌液PCR鉴定参见实施例1，酶切鉴定的酶切体系为10×LBuffer 1μL，SacI0.5μL，pBI121-HaWRKY29质粒6μL(约400ng)，ddH₂O 2.5μL，条件为37℃水浴5-6h，进行电泳检测，将酶切鉴定正确的阳性菌保存的菌种送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。将测序正确的pBI121-HaWRKY29质粒转化农杆菌GV3101，菌液PCR鉴定参见实施例1。

农杆菌转化拟南芥：采用浸花法，利用含有pBI121-HaWRKY29的农杆菌将HaWRKY29基因转入野生型拟南芥中，等待收种。

转基因拟南芥的筛选：参照Zhang的方法(Zhang X R,Henriques R,Lin S S,etal.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using thefloral dip method.Nat Protoc,2006,1(2):641～646.)，将转基因拟南芥种子播种在1/2MS+20μg/mL Kan+200μg/mL Tim平板上筛选转基因拟南芥。

转基因拟南芥的分子鉴定：参照葛瑶的TPS法(葛瑶.栓质合成关键基因VvCYP86A1在耐盐中的功能研究[D].齐鲁工业大学,2021.)，微量提取转基因拟南芥基因组DNA，以其为模板，使用HaWRKY29 F-5和HaWRKY29R-5，对HaWRKY29转基因拟南芥进行PCR鉴定，体系和程序同实施例1。

转基因拟南芥株系的选择：提取T3代过表达HaWRKY29的整株拟南芥的RNA，反转录后以cDNA为模板进行荧光定量PCR，分析转基因拟南芥中HaWRKY29基因的表达水平，方法同实施例1。

转基因拟南芥的耐盐性分析：

(1)NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗期的表型分析

将6d龄长势一致的拟南芥幼苗移到添加0mM和150mM NaCl的1/2MS培养基中，每个株系移苗3株，黑暗平放培养一天后，置于光照培养室中培养(温度22℃、光照16h/黑暗8h)垂直培养，6d后观察根系表型并测定根长。

将野生型(WT)和HaWRKY29 T₃代拟南芥种子消毒，4℃春化2d，播种于1/2MS培养基上。将7d龄长势一致的拟南芥幼苗移到添加0mM、150mM NaCl的1/2MS培养基中，每个株系移苗10株，10d后观察幼苗表型并测定拟南芥鲜重变化。

(2)NaCl胁迫下转基因拟南芥幼苗期生理指标的测定

将7d龄长势一致的拟南芥幼苗移到添加0mM和150mM NaCl的1/2MS培养基中，10d后用于测定叶绿素含量。称取1g拟南芥叶片放入50mL离心管中，加入10mL二甲基亚砜，黑暗处理24h，以二甲基亚砜为对照，使用紫外分光光度计测量样品分别在664和648nm波长下的吸光值，计算叶绿素含量：

Chlorophyll a(μg/mL)＝12.25A_664nm-2.79A_648nm

Chlorophyllb(μg/mL)＝21.50A_648nm-5.10A_664nm。

(3)NaCl胁迫下转基因拟南芥抽薹期表型分析及生长指标的测定

将野生型(WT)、HaWRKY29 T₃代拟南芥种子消毒，4℃春化2d，播种于1/2MS培养基上。将培养14d长势一致的各株系幼苗移置于蛭石中，黑暗保湿条件下缓苗2d后，置于光照培养室中培养(温度22℃、光照16h/黑暗8h)，期间定期浇灌1/2Hoagland营养液；待植株抽苔后，挑取长势一致的植株进行0mM和150mM NaCl处理8d。用于分析抽薹期植株的表型以及测定抽薹期植株的株高和结荚数。

(一)植物表达载体的构建

采用XbaI和SacI双酶切的方式对提取的pBI121质粒进行线性化处理，pBI121全长14758bp，理论上酶切后会得到两个片段：小片段约1800bp，大片段约13000bp，酶切结束进行电泳检测，结果如图11，结果与预期一致，证明酶切成功，对大片段进行胶回收纯化。以pMD19T(simple)-HaWRKY29质粒为模板，使用高保真酶对HaWRKY29基因进行PCR扩增及胶回收，将基因片段和线性化质粒载体进行连接，并转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃过夜培养，挑取圆润的单菌落放入加有卡那霉素的液体LB中进行过夜培养后，使用rTaq进行菌液PCR鉴定，结果如图12，从大肠杆菌转化子中扩增出了与阳性对照大小一致的条带，初步表明重组载体构建成功，对阳性菌液保存菌种备用。提取剩余阳性菌液的质粒进行酶切验证，电泳检测结果如图13，pBI121-HaWRKY29经SacI单酶切后产生两条带，较小的一条带大小为984bp，大片段为线性化的pBI121，判断pBI121-HaWRKY29载体构建成功。

(二)拟南芥的稳定转化及筛选

将构建完成的植物表达载体pBI121-HaWRKY29转化农杆菌感受态GV3101，对农杆菌转化子进行PCR鉴定，结果如图14，从农杆菌转化子中扩增出了与阳性对照大小一致的条带，表明重组质粒成功转化到农杆菌中。将拟南芥种子漫洒在加入Kan和Tim的1/2MS固体培养基中(1/2MS+20μg/mL Kan+200μg/mL Tim)，培养10-15d(图15)，将根系生长良好的绿色幼苗移到土壤中继续培养。待拟南芥长到成苗期，以T₁代转基因拟南芥叶片基因组DNA为模板，进行PCR鉴定，结果见图16，HaWRKY29转基因阳性苗均鉴定成功。继续传代，直到收到T₃纯合种子。对转基因拟南芥各株系中目的基因进行表达水平分析，结果如图17，表明HaWRKY29在转基因拟南芥中成功过表达，在株系L6和L11中表达水平较高。

(三)转基因拟南芥的耐盐性分析

将6d龄长势一致的的WT和HaWRKY29过表达株系L6和L11在添加0mM、150mM NaCl的1/2MS的培养基上胁迫6d后，进行根系表型和根长分析。如图18所示，在150mM NaCl胁迫后，HaWRKY29过表达株系的根长要显著高于野生型，表明HaWRKY29的过表达能够增加拟南芥在盐胁迫下的根长。将7d龄的WT和HaWRKY29过表达株系拟南芥幼苗在添加0mM、125mM和150mMNaCl的1/2MS的培养基上胁迫10d，观察幼苗表型差异。如图19中的A和图19中的B所示，与WT相比，HaWRKY29过表达株系明显降低了盐胁迫造成的伤害，生长状态更好，叶片更加舒展，结果表明，HaWRKY29的过表达能提高转基因拟南芥在幼苗期的耐盐性。将7d龄的WT和HaWRKY29过表达株系拟南芥幼苗在添加0mM和150mM NaCl的1/2MS的培养基上胁迫10d后，进行鲜重分析。如图19中的C所示，在盐胁迫后，HaWRKY29过表达株系在150mMNaCl处理下鲜重显著高于WT，结果表明HaWRKY29的过表达能够增加拟南芥在盐胁迫下的鲜重。将7d龄的WT和HaWRKY29过表达株系在添加0mM和150mM NaCl的1/2MS的培养基上胁迫10d后，进行叶绿素含量测定。从图19中的D和图19中E中可以看出，在150mM NaCl处理后，HaWRKY29过表达株系中Chla含量和Chlb含量显著高于WT，结果表明，HaWRKY29的过表达能够提高拟南芥在盐胁迫下的叶绿素含量。将培养14d长势一致的WT和HaWRKY29过表达株系拟南芥幼苗移置于蛭石中培养，待植株抽苔后，挑取长势一致的植株进行0mM和150mMNaCl胁迫8d后，观察抽薹期植株表型并分析抽薹期植株的株高和结荚数。从图20中的A可以看出，盐胁迫后HaWRKY29过表达株系的长势优于WT，如图20中的B和图20中的C所示，HaWRKY29过表达株系的株高和结荚数均高于WT，结果说明HaWRKY29的过表达能够促进拟南芥植株在盐胁迫下的生殖生长。

实施例4：向日葵HaWRKY29下游功能基因的表达分析

本实施例涉及的材料如下：

植物材料：HaWRKY29过表达T₃拟南芥和野生型拟南芥。

菌种：酵母菌株Y187由本实验室提供。

载体：pHIS2 DNA文库(由东北林业大学王玉成教授馈赠)、pGADT7-Rec2、pHIS2-53和pGADT7-Rec2-53由本实验室提供；质粒pMD19-T(simple)-HaWRKY29由实施例1构建保存。

酶及试剂盒：SmaI限制性核酸内切酶和rTaq(R500A)购自宝生物工程(大连)有限公司、KOD-Plus-Neo(KOD-401)购自东洋纺(上海)生物科技有限公司、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(B518191)、酵母质粒DNA抽提试剂盒(B511245-0050)购自生工生物工程(上海)股份有限公司、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(R401-01)、

II One Step Cloning Kit(C112-01)和/>

Gel DNAExtraction MiniKit(DC301-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司、/>

Ⅲ1st Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(11141ES60)及Hieff/>

UniversalBlue qPCR SYBR Green Master Mix(11184ES08)购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

下游基因AtP5CS1、AtSOS1、AtNHX1、AtCAT2、AtNCED3基因引物：

AtP5CS1 F(SEQ ID NO.17)：5'-GCTCGCTTAGTTATGACACCTG-3'

AtP5CS1 R(SEQ ID NO.18)：5'-GACCATCTGCCACCTCTGTT-3'

AtSOS1 F(SEQ ID NO.19)：5'-TCTGGAGGAAGCGACCGATT-3'

AtSOS1 R(SEQ ID NO.20)：5'-ACGAGAAGAGCGACAGTGTAAG-3'

AtNHX1 F(SEQ ID NO.21)：5'-GGTGCTGTATCTATGGCTCTTG-3'

AtNHX1 R(SEQ ID NO.22)：5'-GCGTTCTGGTGCGGTAATAG-3'

AtCAT2 F(SEQ ID NO.23)：5'-AGCAACCTCTTCCGTCATCTC-3'

AtCAT2 R(SEQ ID NO.24)：5'-CCATCCAGCGACAATCCTTCT-3'

AtNCED3 F(SEQ ID NO.25)：5'-ACAAGAACAAGGTCGCAAGATT-3'

AtNCED3 R(SEQ ID NO.26)：5'-CAGAGATGGAAGCAGAAGCAAT-3'

HaWRKY29基因酵母单杂交引物：

HaWRKY29 F(SEQ ID NO.27)：5'-gagtggccattatggcccgggATGTCTTCTTTTTCCGACCAACC-3'

HaWRKY29 R(SEQ ID NO.28)：5'-gccgacatgttttttcccgggTTACCTTGGATTTGGGTTTCCCTTGAC-3'

本实施例涉及的试验方法如下：

植物材料的处理：将野生型(WT)和HaWRKY29过表达T₃代拟南芥种子消毒，4℃春化2d，播种于1/2MS培养基上，于第10d取材，液氮速冻后于-80℃保存。

HaWRKY29下游功能基因表达分析：从拟南芥中提取RNA，反转录后以cDNA为模板进行荧光定量PCR，分析AtP5CS1、AtSOS1、AtNHX1、AtSOD1、AtPOD1、AtNCED3等下游功能基因表达水平，方法同实施例1。

质粒的提取：提取pHIS2 DNA文库质粒、pGADT7-Rec2质粒，方法参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(B518191)说明书。

pGADT7-Rec2质粒单酶切酶切体系如下：10×T Buffer 8μL，0.1％BSA 8μL，SmaI4μL，pGADT7-Rec2质粒14μL(约4000ng)，ddH₂O 46μL，37℃水浴5-6h。

HaWRKY29片段与线性化pGADT7-Rec2连接及转化：按C112-01说明书，计算并添加反应体系：线性化pGADT7-Rec20.8μL(100ng/μL)，HaWRKY29基因片段0.2μL(150ng/μL)，5×CE II Buffer 2μL，Exnase II 1μL，ddH₂O 6μL，PCR仪中37℃反应2h，转化大肠杆菌感受态DH5α。

阳性转化子鉴定：挑取大肠杆菌转化板上边缘清晰圆润的单菌落摇菌，以菌液为模板进行PCR鉴定，体系和程序同实施例1，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌进行菌种保存。提取阳性转化子的质粒，进行单酶切验证，体系如下：10×T Buffer 1μL，0.1％BSA 1μL，SmaI 0.5μL，pGADT7-Rec2-HaWRKY29质粒2.5μL(500ng)，ddH₂O 5μL，30℃水浴5-6h，进行电泳检测，将酶切鉴定正确的阳性菌保存的菌种送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

酵母感受态细胞的制备及重组质粒转化酵母感受态：参照王留强的Y187酵母感受态的制备及转化方法(王留强.TF-centeredY1H系统的建立及柽柳NAC基因的抗逆功能研究[D].东北林业大学,2015.)，制备酵母感受态Y187并将pGADT7-Rec2-HaWRKY29质粒与pHIS2DNA文库质粒共转化Y187酵母感受态，涂布在SD/-Trp-Leu及添加15mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His培养基上，30℃培养3-5d。

酵母阳性转化子的筛选：挑取阳性菌落，在SD/-Trp-Leu液体培养基中摇至OD₆₀₀＝1.0；吸取3μL点到30mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His培养基上；根据阳性菌落大小筛选出生长较快的阳性菌落，再次在SD/-Trp-Leu液体培养基中摇至OD₆₀₀＝1.0；分别稀释10倍、100倍和1000倍，将原液与稀释液各吸取4μL分别点到SD/-Trp-Leu、添加30mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His及添加50mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His固体培养基上培养3-4d，拍照记录。

分析阳性相互作用结果：使用酵母质粒DNA抽提试剂盒(B511245-0050)，提取阳性酵母转化子质粒，方法参照说明书，将提取的质粒转入Top10感受态细胞，均匀涂布在固体LB培养基上(50μg/mL Kan)，筛选得到阳性菌落，挑取阳性菌落于液体LB中摇菌(50μg/mLKan)，保存菌种送至睿博兴科生物技术有限公司测序。

HaWRKYs可以结合的下游启动子序列分析：测序结果和pHIS2序列进行比对，得到筛选的随机DNA文库序列。使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)及https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝newplace预测筛选出的随机DNA文库含有的启动子元件。

(一)NaCl胁迫下转基因拟南芥中盐应答标记基因的表达分析

为了解析HaWRKY29的耐盐机制，选取了6个已知的盐应答标记基因，分别为AtP5CS1、AtSOS1、AtNHX1、AtSOD1、AtPOD1和AtNCED3，使用qRT-PCR技术分析其在HaWRKY29过表达拟南芥中的表达水平。

P5CS1是脯氨酸生物合成途径中的关键限速酶，上游转录因子通过上调P5CS1基因的表达增加脯氨酸的积累，进而维持盐胁迫下细胞的渗透平衡。本研究分析了盐胁迫下过表达HaWRKY29拟南芥中AtP5CS1基因的表达量。从图21中的A可以看出，盐胁迫下，AtP5CS1基因在HaWRKY29过表达株系中的表达量上升为WT的1.34倍。SOS1基因编码质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，在功能上是将细胞内的Na⁺排到细胞外，对减少Na⁺在细胞内乃至体内的积累是非常重要的。从图21中的B可以看出，盐胁迫下，AtSOS1基因在HaWRKY29过表达株系中的表达量低于WT。NHX1基因编码液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，是细胞内离子稳态的重要调节剂，具有将Na⁺区隔到液泡中的功能。从图21中的C可以看出，盐胁迫下，AtNHX1基因在HaWRKY29过表达株系中的表达量低于WT。AtSOD1基因编码超氧化物歧化酶，AtPOD1基因编码过氧化物酶，能减少ROS的积累并减轻细胞的损伤和凋亡。从图21中的D和图21中的E可以看出，盐胁迫下AtSOD1基因和AtPOD1基因在HaWRKY29过表达株系中的表达量均低于WT。NCED3是ABA合成基因，通过调节ABA的合成在耐盐性中发挥积极作用。从图21中的F可以看出，盐胁迫下，AtNCED3基因在HaWRKY29过表达株系中的表达量高于WT，上调为WT的3.70倍。

总体来看，在盐胁迫条件下在HaWRKY29过表达株系中，AtP5CS1基因的表达量上调为WT的1.34倍，说明HaWRKY29参与了盐胁迫下的渗透平衡调节，AtNCED3基因的表达量显著上调为WT的3.7倍，说明HaWRKY29参与了ABA信号转导途径。

(二)HaWRKY29结合的启动子元件分析

HaWRKY29酵母单杂交载体的构建：

对pGADT7-Rec2质粒进行SmaI单酶切并过柱回收纯化。以pMD19T(simple)-HaWRKY29质粒为模板，使用高保真酶对HaWRKY29基因进行PCR扩增及胶回收，将目的基因和线性化的pGADT7-Rec2连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃培养12h，挑取圆润的单菌落放入加有氨苄霉素的液体LB中摇菌，37℃培养12h，使用rTaq进行菌液PCR鉴定，结果如图22，从大肠杆菌转化子中扩增出了与阳性对照大小一致的条带，初步表明重组载体构建成功，对阳性菌液进行菌种保存。提取剩余阳性菌液的质粒进行酶切验证，电泳检测结果如图23，pGADT7-Rec2-HaWRKY29经SmaI单酶切后产生两条带，较小的一条与HaWRKY29的大小(1173bp)一致，大片段为线性化的pGADT7-Rec2，电泳检测结果证明pGADT7-Rec2-HaWRKY29重组载体构建成功。

HaWRKY29结合的启动子元件：

为了进一步分析HaWRKY29识别的元件序列，构建了pGADT7-Rec2-HaWRKY29酵母表达载体，将其与pHIS2 DNA文库质粒共转化酵母感受态Y187。如图24所示，在SD/-Trp-Leu培养基上，阳性对照(P：pHIS-53+pGADT7-Rec2-53)、阴性对照(N：pHIS-53+pGADT7-Rec2-HaWRKY29)、pGADT7-Rec2-HaWRKY29+pHIS2的转化子都能正常生长。在加入30mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His培养基上阴性对照不能生长，阳性对照与转化子能生长。在加入50mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His培养基上，阳性对照与转化子依旧生长，但是生长速度比二缺培养基慢。将通过提高SD培养基上的3-AT浓度筛出的6个阳性菌落进行摇菌，使用酵母质粒提取试剂盒提取质粒，转化TOP10感受态，涂布在抗性培养基上，挑取阳性菌测序，经处理并去除冗余序列得到的可能结合的DNA序列有三个：CCCAATCTCCAATGGG(SEQ ID NO.29)，CCCATTGTGAAATGGG(SEQ ID NO.30)，CCCTGACTGTTTTGGG(SEQ ID NO.31)，对应的元件分别为CCAATBOX1，GTGANTG10和W-BOX。本发明为进一步研究HaWRKY29直接调控的下游靶基因奠定了基础。

Claims (10)

1.一种向日葵HaWRKY29转录因子基因在提高植物耐盐胁迫能力中的应用，其特征在于，所述HaWRKY29转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HaWRKY29转录因子基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.含有权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因的重组载体在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

3.含有权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因的工程菌在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述工程菌包括大肠杆菌，农杆菌和酵母菌。

5.含有权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因的细胞系在提高植物耐盐胁迫能力中的应用。

6.一种提高植物耐盐胁迫能力的方法，其特征在于，所述方法包括构建含有如权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因的植物表达载体，将所得植物表达载体转入植物细胞中，培育获得具有耐盐性的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥。

8.权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因在参与盐胁迫下脱落酸信号转导途径中的应用，其特征在于，所述应用中HaWRKY29转录因子基因用来提高盐胁迫下脱落酸信号途径基因AtNCED3的表达量。

9.权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因在参与盐胁迫下渗透平衡调节中的应用，其特征在于，所述应用中HaWRKY29转录因子基因用来提高盐胁迫下脯氨酸合成基因AtP5CS1的表达量。

10.权利要求1所述HaWRKY29转录因子基因编码蛋白在调控含有CCAATBOX1，GTGANTG10和W-BOX中任意一种启动子元件的基因中的应用。

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