CN114262682B - 一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及工业微生物技术领域，尤其是涉及一株高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以P43启动子、含有来源于枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp以及来源于质粒pQE‑30的rrnB T1终止子序列、来源于质粒pGJ103的含有复制起始位点的氯霉素抗性基因和来源于质粒pUZ8002的parDE基因构建重组质粒pSFP1作为表达载体，以含有sfp基因序列的枯草芽孢杆菌168为宿主菌构建得到的基因工程菌株。本发明以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现了枯草芽孢杆菌OKB105来源的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的高效表达，简化了生产工艺流程且明显降低了生产费用。

Description

一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及 其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及工业微生物技术领域，尤其是涉及一株高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

以猪流行性腹泻病毒为代表的囊膜病毒类传染病对畜牧业带来严峻挑战。目前我国养殖户在预防囊膜病毒疾病方面几乎束手无策，只能通过饲料中添加适量的“痢菌净”进行全群预防以及一些效果牵强的隔离免疫。一旦动物发病，往往需要在饲料中添加营养性抗应激的多维和广谱抗生素防止继发感染，造成大量的抗生素药物残留，制约了我国养殖业健康发展。随着国家饲料禁抗政策的全面落实，从预防角度开发新产品遏制囊膜病毒类疾病已成为行业的迫切需要。

生物表面活性素属于脂肽类化合物，由一个成环的七肽和一条脂肪链共价结合而成。七肽构成表面活性素较大的亲水端，而脂肪链作为表面活性素较小的疏水端，使其分子具备“倒锥形脂”的结构特点。倒锥形脂能够插入病毒囊膜，抑制囊膜病毒入侵宿主细胞时的膜融合过程，可以在囊膜病毒感染细胞早期发挥有效的抗病毒作用。

目前主要利用大肠杆菌实现生物表面活性素的工业化生产，但大肠杆菌无法应用于饲料添加，且生物表面活性素的表达量不高，亟需改进。目前主要通过蔗糖诱导的次级代谢产物、野生菌筛选或基因工程改造等方式来提高生物表面活性素的产量，但生物表面活性素的产量仍不理想。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株能够大幅提高磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的相对表达量。

本发明的第二目的在于提供一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株的构建方法。

本发明的第三目的在于提供一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株在发酵生产磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶中的应用。

本发明提供的一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株，以P43启动子、含有来源于枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp以及来源于质粒pQE-30的rrnB T1终止子序列、来源于质粒pGJ103的含有复制起始位点的氯霉素抗性基因和来源于质粒pUZ8002的parDE基因构建重组质粒pSFP1作为表达载体，以含有sfp基因序列的枯草芽孢杆菌168为宿主菌构建得到的基因工程菌株。

枯草芽孢杆菌为传统的工业生产菌，其生产的生物表面活性素可以被直接分泌到菌体外，无需破坏细胞就可以获得大量生物表面活性素，显著降低了目标肽的生产成本。枯草芽孢杆菌还是国家饲料添加剂目录许可的益生菌，其不含有内毒素，采用枯草芽孢杆菌表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶并生产生物表面活性素具有很大优势。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（sfp）是合成生物表面活性素的关键酶，其通过催化非核糖体肽和载铁蛋白前体的形成，进而激活生物表面活性素合成酶，实现生物表面活性素的合成。本发明通过控制磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的表达量进而影响生物表面活性素的产量。

优选地，所述宿主菌由枯草芽孢杆菌168改造得到，其改造方法为：

步骤1.PCR扩增pJOE8999质粒；

步骤2.化学合成含pJOE8999质粒同源臂的gRNA序列；

步骤3.将步骤1扩增的pJOE8999质粒序列与步骤2合成的gRNA序列连接，获得完整质粒进行大肠杆菌转化，繁殖后提取获得pJOE8999-gRNA质粒；

步骤4.化学合成含有P43启动子序列-sfp基因序列-终止子序列的供体DNA重组大片段；

步骤5.将步骤3得到的重组质粒pJOE8999-gRNA与步骤4得到的供体DNA重组大片段共同转化入枯草芽孢杆菌168中，培养筛选得到完全丢pJOE8999-gRNA质粒的转化子，获得宿主菌-枯草芽孢杆菌168-SFP。

本发明还提供了一种基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）构建重组表达载体pSFP1，包括以下步骤：

a.以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，PCR扩增其P43启动子；

b.以枯草芽孢杆菌OKB105基因组DNA为模板，PCR扩增获得磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因sfp；

c.连接P43启动子序列与sfp基因获得序列A1；

d.由质粒pQE-30中PCR扩增获得rrnB T1终止子序列并与序列A1连接获得序列A2；

e.由质粒pGJ103中PCR扩增获得含氯霉素抗性基因且含有复制起始位点的基因序列并与序列A2连接获得序列A3；

f.由质粒pUZ8002中PCR扩增获得parDE基因，并与序列A3连接获得重组表达载体pSFP1；

（2）将重组表达载体pSFP1转化到所述宿主菌，从而获得基因工程菌株。

优选地，所述P43启动子的序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，步骤a中PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；之后72℃延伸10min。

优选地，步骤b中PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；之后72℃延伸10min。

优选地，步骤d中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。

优选地，步骤e中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；之后72℃延伸10min。

优选地，步骤f中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。

本发明还提供了本发明所述的高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株在发酵生产磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶中的应用。

有益效果：

本发明以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现了枯草芽孢杆菌OKB105来源的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的高效表达，重组磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的相对表达量与现有改造得到的菌株相比提高56倍，简化了生产工艺流程且明显降低了生产费用。本发明的表达水平已达到工业化生产要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例中重组质粒pSFP1的构建流程。

图2为宿主菌枯草芽孢杆菌168-SFP的构建流程。

图3为宿主菌枯草芽孢杆菌168-SFP与实施例中枯草芽孢杆菌168-SFP-SFP1-1的溶血实验结果对比图。

图4为实施例1中基因工程菌株枯草芽孢杆菌168-SFP-SFP1-1表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶表达载体pSFP1的获得，构建流程如图1所示，包括如下步骤：

由枯草芽孢杆菌中PCR扩增得到P43启动子基因序列，P43启动子基因序列如SEQID NO：1所示，该序列含有同源臂序列。PCR引物序列如下：

上游引物为“GGTCTCGTACGAAGAGCTTTTATAGGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA”（图1中Primer3），

下游引物为“CCCAATTTGACCAAGGGGGACGCGTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAA”（图1中Primer4）。

PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；之后72℃延伸10min。

以枯草芽孢杆菌OKB105基因组DNA为模板，PCR扩增获得磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因sfp，序列如SEQ ID NO：2所示。PCR引物序列如下：

上游引物为“ATGAAGATTTACGGAATTTATATGG”（图1中Primer1），

下游引物为“CTATAAAAGCTCTTCGTACGAGACC”（图1中Primer2）。

PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s，共30个循环；之后72℃延伸10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在675bp处出现目的条带，与预期大小相符。将此序列命名为p1-sfp。

采用全式金pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，通过GibsonAssembly方法将化学合成枯草芽孢杆菌P43启动子序列与枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp连接获得序列A1；

连接条件为反应重组体系50℃反应15min，冰浴10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在999bp处出现目的条带，与预期大小相符。

从质粒pQE-30中PCR扩增获得rrnB T1终止子序列，序列如SEQ ID NO：3所示。PCR引物序列如下：

上游引物“GTCTGACGCTCAGTGGGCCCGGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGA”，（图1中Primer5）

下游引物为“CCCAATTTGACCAAGGGGGACGCGTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAA”。（图1中Primer6）

PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在927bp处出现目的条带，与预期大小相符。

将所得序列与序列A1连接获得序列A2；连接条件为反应重组体系50℃反应15min，冰浴10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在1901bp处出现目的条带，与预期大小相符。

从质粒pPGJ103中PCR扩增获得含氯霉素抗性基因且含有复制起始位点的序列，序列如SEQ ID NO：4所示。PCR引物序列如下：

上游引物为“GAGCTCTAGCACTTTGCCACTCAT”（图1中Primer7），

下游引物为“GGGCCCACTGAGCGTCAGAC”（图1中Primer8）。

PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；之后72℃延伸10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在3193bp处出现目的条带，与预期大小相符。

将所得序列与序列A2连接获得序列A3；连接条件为反应重组体系50℃反应15min，冰浴10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在5074bp处出现目的条带，与预期大小相符。

含氯霉素抗性基因且含有复制起始位点和的基因序列是构建质粒的筛选标记。

从质粒pUZ8002中PCR扩增获得parDE基因，序列如SEQ ID NO：5所示。PCR引物序列如下：

上游引物为“CGCGTCCCCCTTGGTCAAATTGGG”（图1中Primer9），

下游引物为“ATGAGTGGCAAAGTGCTAGAGCTCAGTACGCCATCAGGACGTTGTGAGTG”（图1中Primer10）。

PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在815bp处出现目的条带，与预期大小相符。

将所得序列与序列A3连接获得重组表达载体pSFP1；条件为反应重组体系50℃反应15min，冰浴10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在5841处出现目的条带，与预期大小相符。

（2）将重组表达载体pSFP1转化进入宿主菌（含有sfp基因序列的枯草芽孢杆菌168）

将质粒pSFP1与宿主菌感受态细胞相混合，电转，于37℃、200rpm恢复培养3h，离心收菌涂布于含氯霉素的LB平板上，于37℃培养至单菌落出现，挑取阳性转化子提取质粒进行PCR扩增和Sanger测序鉴定，最终获得成功转化质粒pSFP1的基因工程菌BS168-SFP-SFP1-1、BS168-SFP-SFP1-2、BS168-SFP-SFP1-3的阳性转化子。

（3）磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在宿主菌中的高表达

将筛选得到的BS168-SFP1-1、BS168-SFP1-2、BS168-SFP1-3的阳性转化子接种到25ml的LB培养基中，于37℃、250rpm振荡培养16小时，提取RNA，利用qRT-PCR检测sfp表达量，PCR引物序列如下：

上游引物为“TCACAGGAAGAAAATGAACGG”，

下游引物为“CGTGCTAAAGCGGATATCGGA”。

qRT-PCR反应条件为95℃预变形3min；95℃变性15s、60℃延伸30s，45个循环。采用常规方法分析宿主菌枯草芽孢杆菌168-SFP和基因工程菌中磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶表达量差异，鉴定得到表达量最高的基因工程菌BS168-SFP-SFP1-1。

宿主菌的改造过程：

上述构建过程中采用的宿主菌的改造方法为一种现有表达sfp基因基因工程菌株的构建方法，具体构建过程如图2所示，包括以下步骤，：

步骤1.以购买得到的pJOE8999质粒为模板进行PCR扩增，pJOE8999质粒购自上海海吉浩格生物科技有限公司，型号为HH-YGE-016。PCR引物序列如下：

上游引物为“TGAGACCGATTCATTAATGCAG”（图2中Primer11）

下游引物为“TGAGACCGATTCATTAATGCAG”（图2中Primer12）

PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸7min，共30个循环；之后72℃延伸10min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测在7722bp处出现目的条带，与预期大小相符。

步骤2.化学合成含pJOE8999质粒同源臂的gRNA序列：

CTGCATTAATGAATCGGTCTCACCTTTGCCTTCCTTGTTTGATAATTTTTACTCCATCTGGATTTGTTC。

步骤3.将步骤1扩增后的pJOE8999质粒序列与步骤2化学合成含gRNA的序列利用重叠延伸PCR进行连接，获得完整质粒，进行大肠杆菌转化，繁殖后提取获得pJOE8999-gRNA质粒。

步骤4.化学合成含有P43启动子序列-sfp基因序列-终止子序列的供体DNA重组大片段：BS168上游同源臂序列-P43启动子序列-sfp基因序列-终止子序列-BS168下游同源臂序列。

BS168上游同源臂序列如SEQ ID NO：6所示；

P43启动子序列如SEQ ID NO：7所示；

sfp基因序列如SEQ ID NO：2所示；

终止子序列为“ATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTG”；

BS168下游同源臂序列如SEQ ID NO：8所示。

步骤5.将步骤3得到的重组质粒pJOE8999-gRNA与步骤4得到的供体DNA重组大片段共同转化入枯草芽孢杆菌168中，于含有筛选压力(卡那霉素和0.2％甘露醇)的固体平板上进行固体平板培养，30℃倒扣培养11-17h；长出单菌落后，进行菌落PCR实验，筛选单菌落，得到初步确定整合的转化子。

将初步确定整合的转化子转移至50℃继续培养，采用基因组验证引物和pJOE8999质粒通用引物进行菌落PCR得到整合成功并且pJOE8999-gRNA质粒丢失的转化子。继续50℃培养得到的转化子，对其进行纯化和完全丢pJOE8999-gRNA质粒，再次PCR后挑取完全丢pJOE8999-gRNA质粒的转化子，最终获得枯草芽孢杆菌168-SFP菌株。作为后续构建过程的宿主菌。

测试例1

对实施例1制备得到的重组工程菌枯草芽孢杆菌168-SFP-SFP1-1进行溶血实验。

称取1.5g琼脂至100ml生理盐水中，加热溶解后，冷却至40-50℃加入5ml绵羊血，摇匀后倒平板，待凝固后，得到血琼脂平板。

按无菌操作法挑取少量实施例1中制备得到的BS168-SFP-SFP1-1在血琼脂平板上划线，过夜37℃培养，观察溶血圈的大小。实验结果如图3中右侧培养皿所示。

对宿主菌进行溶血实验。

称取1.5g琼脂至100ml生理盐水中，加热溶解后，冷却至40-50℃加入5ml绵羊血，摇匀后倒平板，待凝固后，得到血琼脂平板。

按无菌操作法挑取少量宿主菌在血琼脂平板上划线，过夜37℃培养，观察溶血圈的大小。实验结果如图3中左侧培养皿所示。

实验结论：

枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性素具有良好的溶血性能，由图3可知，本发明制备得到的基因工程菌枯草芽孢杆菌168-SFP-SFP1-1与宿主菌对比产生的溶血圈明显，生物表面活性素的产量更高。

测试例2

基因工程菌枯草芽孢杆菌168-SFP-SFP1-1分泌表达生物表面活性素

将实施例1中制备得到的BS168-SFP-SFP1-1接种到25ml的LB培养基中，于37℃、250rpm振荡培养16小时，以1%体积比接种于100ml Landy培养液，35℃~37℃、200rpm培养36小时，即得到生物表面活性素发酵液。

Landy培养液的由下列组分组成：L-glutamic acid 5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KCl0.5g/L，Yeast Extract 1g/L，MnSO₄.H2O 5mg/L，FeSO₄.6H₂O 0.15mg/L，CuSO₄.5H₂O0.16mg/L，L-苯丙氨酸 2 mg/L，蔗糖 20g/L、KH₂PO₄ 1g/L。

将得到的生物表面活性素发酵液离心去沉淀调上清液pH=2.0，4℃过夜，再次离心去上清，溶解沉淀调pH=7.0，得到生物表面活性素粗提液。适当稀释生物表面活性素粗提液，100kDa滤膜超滤，弃滤液。补加去离子水并超离3次，收集上室液，加入3倍体积无水乙醇，混匀。100kDa滤膜超滤，收集滤过液。用16%的Tricine-SDS-PAGE进行蛋白电泳分析及银染染色，测试结果见图4，实验得出基因工程菌BS168-SFP-SFP1-1能分泌表达生物表面活性素，并且可分泌1.2KDa左右蛋白。

上述测试证明本发明实现了枯草芽孢杆菌OKB105来源的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的高效表达，重组磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的相对表达量比宿主菌提高56倍。本发明可在现有菌株的基础上进行改进，通过控制磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的表达量影响了生物表面活性素的产量。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110>奥林贝尔生物科技集团有限公司 甘肃奥林贝尔生物工程研究院有限公司甘肃奥谱金肽生物工程技术有限公司

<120>一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用

<160>8

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>349

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

ggtctcgtac gaagagcttt tataggtgta cattcctctc ttacctataa tggtaccgct 60

atcactttat attttacata atcgcgcgct ttttttcacg cccatttcta aaaatgtaaa 120

ataaatgtaa gaattttcag ccattacagc tttggcaaaa aaataagtaa accaataata 180

cacgaaatca cggcaaaaac gcaaacagcc ccggcggcag cgtccttggc cgctttagca 240

agagggtgat gtttgtcagt tattaaatca accgtatgtt caatggctgt atttaaaagt 300

tcaagcgaaa acataccacc tatcacgcgt cccccttggt caaattggg 349

<210>2

<211>675

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60

atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120

gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180

ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240

cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300

tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360

cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420

gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480

ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540

gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600

aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660

gaagagcttt tatag 675

<210>3

<211>882

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

gggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc 60

ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctc aagctagaga gtcattaccc 120

caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc tgccactcat 180

cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca caaacggcat 240

gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 300

tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 360

aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 420

aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 480

aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 540

tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgaa 600

attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 660

gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 720

aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 780

tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa 840

atctcgccaa gctagcttgg attctcacca ataaaaaacg cc 882

<210>4

<211>3193

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

gagctctagc actttgccac tcattttttg cgttagcaaa aacataaagg gtatgggata 60

taatcccatc aagccggtat attcagaaca ggaacagcaa caagaacaac aaaagaatca 120

aaaacgagat agaggtatgc acttatagaa catgcattta tgccgagaaa acttattggt 180

tggaatgggc tatgtgttag ctaacttgtt agcgagttgg ttggacttga attgggatta 240

atcccaagaa agtaccaact caacaacaca taaagccctg taggttccga ccaataagga 300

aattggaata aagcaataaa aggagttgaa gaaatgaaat tcagagaagc ctttgagaat 360

tttataacaa gtaagtatgt acttggtgtt ttagtagttt taactgttta ccagataata 420

caaatgctta aataaaaaaa gacttgatct gattagacca agtcttttga tagtgttata 480

ttaataacaa aataaaaagg agtcgctcac gccttgacca aagtttgtga acgacatcat 540

tcaaagaaaa aaacactgag ttgtttttat aatcttgtat atttagatat taaacgatat 600

ttaaatatac atcaagatat atatttgggt gagcgattcc ttaaacgaaa ttgagattaa 660

ggagtcgatt ttttatgtat aaaaacaatc atgcaaatca ttcaaatcat ttggaaaatc 720

acgatttaga caatttttct aaaaccggct actctaatag ccggttaagt ggtaattttt 780

ttaccacccc tcaaccagaa ttaagttttg atgctatgac aatcgttggg aatttgaaca 840

aaactaacgc taaaaagcta tctgatttta tgagtacaga gccacaaata aggctttggg 900

atatattaca aacaaagttt aaagctaaag cacttcaaga aaaggtttat atcgaatatg 960

acaaagtaaa agcagatagt tgggatagac gtaatatgcg tgttgaattt aatccaaata1020

aactcacaca tgaagaaatg ctttggttaa aacaaaatat tatcgactac atggaagatg1080

acggttttac gaggttagat ttagcttttg attttgaaga tgatttgagt gattactacg1140

caatgactga taaagcagtt aagaaaacta ttttttatgg tcgtaatggt aagccagaaa1200

caaaatattt tggtgttcgt gacagtgata gatttattag aatttataat aaaaaacaag1260

aacgtaaaga taacgccgat gttgaagtta tgtctgaaca tttatggcgt gtagaaattg1320

aattgaaaag agatatggtt gattactgga atgattgctt tgatgattta cacattttga1380

aacccgattg gacaacacca gaaaaagtaa aagaacaagc aatggtttat ttgttactga1440

atgaagaagg cacgtgggga aaacttgaaa gacatgctaa atataaatac aagcaattga1500

ttaaagaaat atctccaatt gatttaacgg aattaatgaa atcgacttta aaagagaatg1560

aaaagcaatt gcaaaaacag attgattttt ggcaacgtga atttagattt tggaagtaaa1620

ataagtttta ttttataaaa attgctgatt cagtataatt aatatttacg gggtgacata1680

acgtatgaaa aaatcagagg attattcctc ctaaatataa agatttaaaa tttaggagga1740

aattatatat gacttttaat attatcaaat tagaaaattg ggatagaaaa gaatattttg1800

aacactattt taaccagcaa actacgtata gcattactaa agaaattgat attactttgt1860

ttaaagatat gataaaaaag aaaggatatg aaatttatcc ttctttgatt tatgcaatta1920

tggaagttgt aaataaaaat aaagtgttta gaacaggaat taatagtgag aataaattag1980

gttattggga taagttaaat cctttgtata cagtttttaa taagcaaact gaaaaattta2040

ctaacatttg gactgaatct gataacaact tcacttcttt ttataataat tataaaaatg2100

acttgcttga atataaagat aaagaagaaa tgtttcctaa aaaaccgata cctgaaaaca2160

ccataccgat ttcaatgatt ccttggattg attttagttc atttaattta aacattggta2220

acaatagcaa ctttttattg cctattatta cgataggtaa attttatagt gagaataata2280

aaatttatat accagttgct ttgcagcttc atcatgctgt atgtgatggt taccatgctt2340

cattatttat gaatgaattt caagatataa ttcataaggt agatgattgg atttagtttt2400

tagattttgg aagtgaattt aattttatac acgcaagtga tcataaaatt tatgaacgta2460

tagcaaccac atttttggtt gcataggttt tgattttgaa ttaggtcttg aactatgagt2520

ggctagagct tgcatgcgga tctcgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct2580

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa2640

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg2700

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca2760

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa2820

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg2880

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg2940

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga3000

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc3060

tcttgatccg gcaaaaaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag3120

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac3180

gctcagtggg ccc 3193

<210>5

<211>791

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

cgcgtccccc ttggtcaaat tgggtatacc catttgggcc tagtctagcc ggcatggcgc 60

attacagcaa tacgcaattt aaatgcgcct agcgcatttt cccgacctta atgcgcctcg 120

cgctgtagcc tcacgcccac atatgtgcta atgtggttac gtgtatttta tggaggttat 180

ccaatgagcc gcctgacaat cgacatgacg gaccagcagc accagagcct gaaagccctg 240

gccgccttgc agggcaagac cattaagcaa tacgccctcg aacgtctgtt ccccggtgac 300

gctgatgccg atcaggcatg gcaggaactg aaaaccatgc tggggaaccg catcaacgat 360

gggcttgccg gcaaggtgtc caccaagagc gtcggcgaaa ttcttgatga agaactcagc 420

ggggatcgcg cttgacggcc tacatcctca cggctgaggc cgaagccgat ctacgcggca 480

tcatccgcta cacgcgccgg gagtggggcg cggcgcaggt gcgccgctat atcgctaagc 540

tggaacaggg catagccagg cttgccgccg gcgaaggccc gtttaaggac atgagcgaac 600

tctttcccgc gctgcggatg gcccgctgcg aacaccacta cgttttttgc ctgccgcgtg 660

cgggcgaacc cgcgttggtc gtggcgatcc tgcatgagcg catggacctc atgacgcgac 720

ttgccgacag gctcaagggc tgatttcagc cgctaaaaat cgcgccactc acaacgtcct 780

gatggcgtac t 791

<210>6

<211>300

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

gtcattattt atcagattat ccgaaagaaa atctattaaa aatcaatatt tccaatgtga 60

aaacggaaga tattgagcgc ggtgtcaagc tgttgatgag ccatttataa aagctcttcg 120

tacgagacca ttgtgatatc ctcggggaaa tcagggtgta cggcgcatac agccattttg 180

tagccgggat cgacctcata cgttttgata tagcatgggg aatggctgtc cggaagctca 240

atggatactt gtccgtcctg gtgcaggcgc actgaaaagg aatcaagcgg aagcgataag 300

<210>7

<211>300

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

gtgtacattc ctctcttacc tataatggta ccgctatcac tttatatttt acataatcgc 60

gcgctttttt tcacgcccat ttctaaaaat gtaaaataaa tgtaagaatt ttcagccatt 120

acagctttgg caaaaaaata agtaaaccaa taatacacga aatcacggca aaaacgcaaa 180

cagccccggc ggcagcgtcc ttggccgctt tagcaagagg gtgatgtttg tcagttatta 240

aatcaaccgt atgttcaatg gctgtattta aaagttcaag cgaaaacata ccacctatca 300

<210>8

<211>300

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

gcaaatgacc cagcgtccgg agtgagaaat gttgaaatga gcgtcgggaa gatcagggat 60

gcacggcttc ccgtattcct gcgtgctaaa gcggatatcg gatttgtcca actgatactg 120

cctgcttatg actgagcgaa cgagcacatc tcccagcagg gtgcggtgag catcttcttt 180

atgataaaat ctccggcatt tctcccgttt ttcaggtgat atgaaagaca tgaaccgttc 240

attttcttcc tgtgaaagcg ggcggtccat ataaattccg taaatcttca ttctagatcc 300

Claims (7)

1.一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株，其特征在于，以P43启动子、含有来源于枯草芽孢杆菌OKB105的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp以及来源于质粒pQE-30的rrnB T1终止子序列、来源于质粒pGJ103的含有复制起始位点的氯霉素抗性基因和来源于质粒pUZ8002的parDE基因构建重组质粒pSFP1作为表达载体，以含有sfp基因序列的枯草芽孢杆菌168为宿主菌构建得到的基因工程菌株；

所述基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）构建重组表达载体pSFP1，包括以下步骤：

a.以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，PCR扩增其P43启动子，所述P43启动子的序列如SEQ ID NO：1所示；

b.以枯草芽孢杆菌OKB105基因组DNA为模板，PCR扩增获得磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因sfp；

c.连接上述P43启动子序列与sfp基因获得序列A1；

d.由质粒pQE-30中PCR扩增获得rrnB T1终止子序列并与序列A1连接获得序列A2；

e.由质粒pGJ103中PCR扩增获得含氯霉素抗性基因且含有复制起始位点的基因序列并与序列A2连接获得序列A3；

f.由质粒pUZ8002中PCR扩增获得parDE基因，并与序列A3连接获得重组表达载体pSFP1；

（2）将重组表达载体pSFP1转化到所述宿主菌，从而获得基因工程菌株；

所述宿主菌由枯草芽孢杆菌168改造得到，其改造方法为：

步骤1.PCR扩增pJOE8999质粒；

步骤2.化学合成含pJOE8999质粒同源臂的gRNA序列，gRNA序列为：

CTGCATTAATGAATCGGTCTCACCTTTGCCTTCCTTGTTTGATAATTTTTACTCCATCTGGATTTGTTC；

步骤3.将步骤1扩增的pJOE8999质粒序列与步骤2合成的gRNA序列连接，获得完整质粒进行大肠杆菌转化，繁殖后提取获得pJOE8999-gRNA质粒；

步骤4.化学合成含有P43启动子序列-sfp基因序列-终止子序列的供体DNA重组大片段：BS168上游同源臂序列-P43启动子序列-sfp基因序列-终止子序列-BS168下游同源臂序列，

BS168上游同源臂序列如SEQ ID NO：6所示；

P43启动子序列如SEQ ID NO：7所示；

终止子序列为：

ATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTG；

BS168下游同源臂序列如SEQ ID NO：8所示；

步骤5.将步骤3得到的重组质粒pJOE8999-gRNA与步骤4得到的供体DNA重组大片段共同转化入枯草芽孢杆菌168中，培养筛选得到完全丢pJOE8999-gRNA质粒的转化子，获得宿主菌-枯草芽孢杆菌168-SFP。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，步骤a中PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5 min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；之后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，步骤b中PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5 min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；之后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，步骤d中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5 min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。

5.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，步骤e中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5 min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；之后72℃延伸10min。

6.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，步骤f中的PCR扩增的反应体系如下：95℃预变性5 min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min。

7.权利要求1所述的高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株在发酵生产生物表面活性素中的应用。

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