KR101618235B1 - Ｌｕｃ 2의 ＯＲＦ에 제한 효소 절단위치가 삽입된, Ｌｕｃ 2 레포터 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Luc 2의 ORF (open reading frame)에 제한 효소 절단위치가 삽입된, Luc 2 레포터 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 이용한 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region) 활성의 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명의 Luc 2 레포터 벡터는 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)와 접합되어 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)에서 유전자 조절에서 중요한 핵산 영역들을 식별 및 분석하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｌｕｃ 2의 ＯＲＦ에 제한 효소 절단위치가 삽입된, Ｌｕｃ 2 레포터 벡터 {Luc 2 reporter vector inserted restriction site into open reading frame of Luc 2}

본 발명은 Luc 2의 ORF (open reading frame)에 제한 효소 절단위치가 삽입된, Luc 2 레포터 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 이용한 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇-flanking region) 활성의 확인 방법에 관한 것이다.

레포터 유전자 분석은 예컨대 DNA 서열, 전사 인자, RNA 서열, RNA-결합 단백질, 신호 전달 통로(signal transduction pathways) 및 특정 자극과 같은 중요 유전자 발현을 무엇이 조절하는 지에 대해 해석하여 유전자 발현 연구에 있어 중요한 도구를 나타낸다. 특히, 레포터 분석은 유전자 조절에서 중요한 핵산 영역들을 식별하는데 사용될 수 있다. 그러한 영역들 및/또는 상기 영역들을 결합하거나 변경하는 인자들은 인간 질병의 치료나 예방에 있어 치료적 개입(therapeutic intervention)을 위한 잠재적 목적으로서 역할을 할 수 있다. 레포터 분석은 약품을 선별하여 상기 약품의 효력이 유전자 발현을 변형하도록 하는 데 사용될 수 있다.

이상적인 레포터 유전자는 다음의 특징을 가져야 한다.

(1) 레포터 유전자는 면역반응을 피하기 위해 포유동물의 세포에 존재하되 발현은 하지 않아야 한다.

(2) 특정 레포터 탐색자는 특정 레포터 유전자가 발현된 세포에만 선택적으로 축적되어야 한다.

(3) 레포터 유전자가 발현되지 않을 때는 레포터 탐색자가 축적되지 않아야 한다.

(4) 레포터 유전자 생산물에 의해 면역 부작용이 일어나지 않아야 한다.

(5) 레포터 탐색자는 생명체 내에서 안정해야 한다. (레포터 탐색자가 생명체 내에서 말단 대사물로 대사될 경우 이 탐색자 축적의 정량분석이 어렵기 때문이다.)

(6) 레포터 탐색자는 혈액 내에서나 비 특이적으로 섭취된 세포에서 빨리 배출되어야 한다.

(7) 레포터 탐색자는 영상 목적의 용량에서 세포 독성을 가지지 않아야 한다.

(8) 레포터 유전자의 크기는 매개체에 삽입할 수 있을 정도의 크기를 유지해야 한다.

(9) 레포터 탐색자는 표적 세포의 세포막을 용의하게 통과하여야 한다.

(10) 레포터 탐색자의 영상 신호는 레포터 유전자의 mRNA/ 단백질의 발현 정도와 높은 상관관계를 가져야 한다.

그 동안 사용되어 왔던 레포터 유전자로는 CAT (chloramphenicol acetyl transferase), ALP (alkaline phosphatase), lac Z등을 들 수 있다. 하지만 이들 레포터 유전자의 발현여부를 알기 위해서는 발현된 조직을 적출하거나 혈액을 채취해야 하는 번거로움이 있고, 반복 검사가 힘들거나, 발현된 세포나 조직의 위치, 발현 기간, 발현 강도 등을 생명체 내에서 종합적으로 모니터 하는데 한계가 있다.

생명체 내 실험에 사용되던 레포터 유전자로는 GFP (green fluorescent protein)과 루시퍼라아제 (luciferase)로, 이 유전자의 발현에 의한 형광(fluorescence) 또는 생물 발광(bioluminescence)으로 유전자 발현의 정보를 제공한다. 빛의 투과가 용이한 동물 모델에서는 적절한 장비에 의한 영상화가 가능하게 되었다.

루시퍼라아제는 생체 외 분석 시스템에서 가장 일반적으로 사용되는 레포터 단백질이다. 루시퍼라아제는 생물 발광을 할 수 있는 효소이며, 유기체의 범위에서 발견된다. 시판중인 분석 시스템에서, 루시퍼라아제는 기질로서 D-루시페린을 사용하는 것과 기질로서 코엘렌테라진(coelenterazine)을 사용하는 것으로 나누어질수 있다. 전자의 가장 널리 채용되는 예는 반딧불이 루시퍼라아제 즉 세포내 효소이다. D-루시페린을 사용하는 루시퍼라아제의 다른 예는 방아벌레나 철도 벌레(railroad worms)와 같은 딱정벌레의 다른 종류를 포함한다. 루시퍼라아제는 상기 루시퍼라아제가 유도된(derived) 유기체가 육생 또는 수생(통상적으로 해양성)인지의 여부를 기초로 하여 구별될 수 있다. 통상적으로, 기질로서 코엘렌테라진을 사용하는 루시퍼라아제는 연산호류 레닐라 (soft coral Renilla) 또는 요각류 가우시아(copepod Gaussia)와 같은 해양성 동물로부터 유도되는 반면, D-루시페린을 사용하는 루시퍼라아제는 육색 동물로부터 유도되는 것이 일반적이다. 루시퍼라아제들을 구별하는 다른 수단은, 상기 루시퍼라아제들이 자연 상태 즉 상기 루시퍼라아제들이 유도된 유기체에서 분비성인지 비분비성인지의 여부를 기반으로 한다. 육생 유기체로부터 유도된 루시퍼라아제는 통상적으로 비 분비성(세포내)이며, 반면 해양성 유기체로부터 유도된 루시퍼라아제는 분비성 또는 비 분비성(세포내)일 수 있다. 예컨대, 레닐라 루시퍼라아제는 세포내에 있으며, 반면 가우시아 루시퍼라아제는 자연 상태에서 분비성 효소이다. 해양성 유기체에 의해 루시퍼라아제가 분비되는 것은 접근 중인 포식자를 교란시키도록 설계된 보호 감응으로 생각될 수 있다. 다른 분비성 루시퍼라아제들은 메트리디아 롱가(Metridia longa), 바르굴라 힐겐도르피아이(Vargula hilgendorfii), 오플로포루스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris), 플류롬마 시피아스 (Pleuromamma xiphias), 키프리디나 녹틸루카(Cypridina noctiluca), 및 메트리딘 과(Metridinidae)의 다른 종류로부터의 루시퍼라아제들을 포함한다. 바르굴라 루시퍼라아제는 코엘렌테라진 또는 D-루시페린과 다른 기질을 사용한다. 루시퍼라아제의 다른 클래스(class)는 와편모조류(dinoflagellates)로부터 유도된 루시퍼라아제이다.

본 발명자는 루시퍼라아제를 포함하는 레포터 벡터에 제한 효소 절단 위치를 삽입하는 경우, 유전자의 5＇ 플랭킹 부위의 활성을 효과적으로 확인할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 일 양상은 Luc 2의 ORF (open reading frame)에 제한 효소 절단위치 (restriction site)가 삽입된, Luc 2 레포터 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 양상은 상기 숙주세포를 이용한 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇-flanking region) 활성의 확인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 Luc 2 벡터에서 Luc 2의 ORF (open reading frame)에 제한 효소 절단위치 (restriction site)가 삽입된, Luc 2 레포터 벡터를 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 레포터 유전자는 유전자의 발현물질 또는 기능 등을 검출할 수 있도록 하는 유전자를 의미하며, 예를 들면, 유전자 발현에 관여하는 촉진자/증강인자(promoter/enhancer), 유발촉진자(inducible promoter)에 의한 유전자 발현 여부, 내재 촉진자(endogenous promoter)의 하위에 레포터 유전자를 두고 내재 유전자(endogenous gene)의 발현을 연구하는 등에 활용될 수 있다.

본 발명에 있어서 벡터는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다.

본 발명에 있어서 Luc 2 는 반디불이로부터 유래한, 프로모터가 제외된 루시퍼라아제를 코딩하는 유전자로써 전사 인자 결합 부위 transcription factor bingding site)의 대부분이 제거되고, 코돈 최적화를 통하여 포유동물에서의 발현이 개선된 유전자이다.

본 발명에 있어서, Luc 2 레포터 벡터는 Luc 2 유전자를 포함하는 벡터로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 ORF (open reading frame)는 코딩서열(coding sequence, CDS)을 나타내는 것으로 단백질 합성에서 주형(template)이 되는 부분을 말한다.

본 발명에 있어서 제한 효소 절단위치 (restriction site)란 제한효소에 의해 자를 수 있는 DNA 부위를 의미하며, 상기 제한효소는 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중 사슬을 절단하는 효소로서, 그 종류를 제한하지 않는다. 예를 들면, EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnI, NotI, PstI, SmaI, XhoI 등이 있으며, 바람직하게는 SmaI이다. 제한 효소 절단 위치는 Luc 2 유전자의 ORF 내에 임의적으로 위치할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 123 내지 128번째 염기서열 위치에 치환될 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 Luc 2 레포터 벡터는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것 일 수 있다. 상기 Luc 2 레포터 벡터의 바람직한 개열지도는 도 1과 같다.

본 발명의 Luc 2 레포터 벡터는 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)이 접합될 수 있다. 상기 실험 대상 유전자는 그 종류를 제한하지 않으며, 예를 들면 KLF 10 유전자일 수 있다.

상기의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)는 유전자의 5＇ 말단에 인접해 있는 DNA 부위를 의미하며, 이 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)는 유전자의 발현 여부 및 정도를 조절할 수 있는 프로모터, 인핸서 또는 다른 단백질 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)는 예를 들면 서열번호 8의 염기서열 또는 이에 제한 효소가 처리한 형태, 예를 들면 서열번호 9의 염기서열로 접합될 수 있다.

본 발명의 벡터는 가장 바람직하게는 도 2의 개열지도와 같은 구성일 수 있으며, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 상기 Luc 2 레포터 벡터는 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)와 접합되어 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)에서 유전자 조절에서 중요한 핵산 영역들을 식별 및 분석하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 Luc 2 레포터 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다.

상기 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 벡터의 숙주 세포 내로의 도입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 Luc 2 레포터 벡터가 도입된 숙주세포에서 Luc 2의 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는, 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region) 활성의 확인 방법을 제공한다. 상기에 있어서, Luc 2의 발현 정도를 확인하는 것은 당업계에 알려진 방법에 의할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 변이된 Luc 2 레포터 벡터에 의하여 제조된 재조합 펩타이드를 제공할 수 있다.

본 발명의 Luc 2 레포터 벡터는 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)와 접합되어 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)에서 유전자 조절에서 중요한 핵산 영역들을 식별 및 분석하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Luc 2 ORF에 제한효소 절단 위치가 삽입된 Luc 2 레포터 벡터의 예시적인 개열지도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 변이된 Luc 2 레포터 벡터에 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위가 접합된 형태의 예시적인 개열지도를 나타낸 도이다.
도 3은 KLF10/5＇아암/Luc2_SmaI 벡터에서 KLF10 유전자의 활성을 확인한 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Luc2 _ SmaI 레포터 벡터의 제작

pGL4.10 [luc2] 벡터(Promega, Cat. number: E5661)로부터 돌연변이(mutagenesis)를 통해 Sma?절단부위를 pGL4.10[luc2] 벡터에 삽입함으로써 Luc2-SmaI 레포터 벡터를 제작하였다.

구체적으로, pGL4.10[Luc2] 벡터에 SmaI 절단부위를 첨가하기 위해 프라이머(서열번호 3 및 4)를 제작하였다. 또한, 돌연변이 (mutagenesis)는 QuikChange^® Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, Cat. Number: 200518)를 사용하였으며 사용 설명서에 따라 실시하였다. 조건은 표 1과 같다. PCR 산물을 DH5α 형질전환성 세포 (competent cell)에 형질전환하여 SmaI 절단부위가 성공적으로 만들어 유전자 클론을 확보하였고, 염기서열분석을 통해 최종적으로 확인하고, “Luc2-SmaI레포터벡터”라고 명명하였다. 변이되기 전 벡터(pGL4.10[Luc2])의 염기서열은 서열번호 1로 나타내었으며, 변이된 후의 벡터 Luc2_SmaI 레포터벡터의 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.

구체적인 개열지도는 도 1과 같다.

도 1과 같이, pGL4.10[Luc2]의 ORF에 SmaI 절단부위가 첨가된 새로운 레포터넉인벡터를 제조함으로써, luc2를 이용하여 KLF10의 5＇ 플랭킹 부위 (5'-flanking region)에 대한 활성을 보다 효과적으로 측정할 수 있는 레포터 벡터의 제작이 가능하도록 하였다. 이하 하기 실시예 2를 통해 그 방법을 설명한다.

pGL4.10[Luc2]의 ORF 내에 SmaI 절단부위 첨가
프라이머	서열번호 3(Luc2-SmaI -5＇): 5＇-GCCAAAAACATTAAcccGGGCCCAGCGCCATTCTACCC-3＇
	서열번호 4(Luc2-SmaI -3＇): 5＇-GGGTAGAATGGCGCTgggCCCGGGTTAATGTTTTTGGC-3＇
	밑줄 부분이 SmaI 제한효소가 인식하는 염기서열이며 이중 소문자가 변형시킨 염기서열임
PCR 을 위한 돌연변이 가닥 합성 반응액	5㎕ 10×반응 완충액	PCR 조건	사이클 1: 95℃, 30초 사이클 18: 95℃, 30초/ 53℃, 1분/ 68℃, 5분 사이클 1: 4℃, 2분 (이때, 1㎕ Dpn I 제한효소를 첨가함) 사이클 1: 37℃, 1시간
	2㎕ pGL4.10[luc2]벡터(50ng)
	1㎕ Luc2-SmaI -5＇프라이머 (10pmole)
	1㎕ Luc2-SmaI -3＇프라이머 (10pmole)
	1㎕ dNTP mix
	40㎕ dH2O
	1㎕ PfuTurbo DNA 폴리머라아제 (2.5 U/㎕)

실시예 2: 상기 레포터 벡터를 이용한 KLF10 유전자 5＇ 플랭킹 부위 활성도 측정

마우스의 KLF10 (Kruppel-like factor 10) 유전자의 5＇ 플랭킹 부위에 대한 활성도를 측정하기 위하여, 레포터로 luc2 를 활용하는 벡터를 고안하였다.

구체적으로, KLF10 유전자의 개시코돈으로부터 5＇-업스트림으로 약 1.2kb 되는 부분(1239bp 단편, 서열번호 5)을 고안된 5＇-프라이머 (서열번호 6: KLF10/5＇-1: 5＇-CACAAGCTGGCTTCCCTAAG-3＇)와 Luc2_SmaI 레포터벡터의 5＇말단 쪽의 결실된 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 고안된 3＇-프라이머 (서열번호 7: KLF10/3＇-1: 5＇-TTCTTAATGTTTTTGGCATCTTCCATGGTTGGCTGCCTGGCCGCAGGTCG-3＇)를 이용하여 주형 2㎕ (플라스미드 DNA 10ng), 프라이머 쌍(10 pmole) 1㎕/1㎕, Pfu-PreMix 5㎕ 및 dH₂O 41㎕로 총 50㎕의 반응액을 제조하여, 94℃, 5분; 94℃, 60초/66.6℃, 60초/ 72℃, 2분 30초로 25 사이클; 72℃, 10분의 조건으로 PCR 증폭시켰다.

PCR 산물(서열번호 8)을 KpnI 제한효소로 처리 (서열번호 9)하고, 실시예 1에서 제조한 Luc2-SmaI레포터벡터를 KpnI/SmaI로 절단 (서열번호 10)한 후 클로닝 하였다. 이렇게 클로닝된 KLF10/5＇아암/Luc2_SmaI 벡터의 개열지도는 도 2와 같다. 서열번호 11은 KLF10/5＇아암/Luc2_SmaI 벡터의 염기서열이다. 이 벡터를 NIH3T3 세포주에 일시적으로 도입하여 KLF10 유전자의 활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 벡터가 도입된 숙주세포에서는 KLF10 (Kruppel-like factor 10) 유전자의 5＇ 플랭킹 부위의 활성을 확인할 수 있었다.

<110> KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Luc 2 reporter vector inserted restriction site into open reading frame of Luc 2 <130> 1-5 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc 2 vector <400> 1 ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tggcctcggc 60 ggccaagctt ggcaatccgg tactgttggt aaagccacca tggaagatgc caaaaacatt 120 aagaagggcc cagcgccatt ctacccactc gaagacggga ccgccggcga gcagctgcac 180 aaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc 240 gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg 300 aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt gcagcgagaa tagcttgcag 360 ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg ctgtggcccc agctaacgac 420 atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc 480 gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa agaagctacc gatcatacaa 540 aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct tccaaagcat gtacaccttc 600 gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact 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gctctccgca 480 aagcctagtc gccgccaccg cgcctcccag ctatgccccg ccgccggcgc cgcccccggg 540 catgggcgga ggactgaagg ctagggttgg gcgaggggcg tcacggagtc aggtggtccc 600 cggagttccc cggggctgga ccgagggaac acggtgcctc gggttgtgta cacgctccac 660 tgacagagcc tcttgcagcc gggcagccgc tgatcacgcg tggctctgcc agctcattgg 720 ctgaggcctc acacaccttt gccgctgatt ggtcgacact aggccccgcc ctctaccccg 780 cccgcggcgc ggggcaggca gagcggctac ctgcacgggg aggggggcag acagcgcgga 840 gcgcggtggc gtcgacgtct agtgtctcag tgctcccgtc tgtggctaac taagcagcca 900 gcagccaggc agctcgcgac ctgcggccag gcagccaacc atggaagatg ccaaaaacat 960 taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg accgccggcg agcagctgca 1020 caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc gcctttaccg acgcacatat 1080 cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc gttcggctgg cagaagctat 1140 gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg tgcagcgaga atagcttgca 1200 gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg gctgtggccc cagctaacga 1260 catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc agccagccca ccgtcgtatt 1320 cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa aagaagctac cgatcataca 1380 aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc ttccaaagca tgtacacctt 1440 cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac ttcgtgcccg agagcttcga 1500 ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc agtaccggat tgcccaaggg 1560 cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt catgcccgcg accccatctt 1620 cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg gtgccatttc accacggctt 1680 cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt cgggtcgtgc tcatgtaccg 1740 cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat aagattcaat ctgccctgct 1800 ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc atcgacaagt acgacctaag 1860 caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc aaggaggtag gtgaggccgt 1920 ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac ggcctgacag aaacaaccag 1980 cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc gcagtaggca aggtggtgcc 2040 cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag acactgggtg tgaaccagcg 2100 cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc tacgttaaca accccgaggc 2160 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Claims (10)

1. 서열번호 1의 123 내지 128번째 염기서열이 제한 효소 절단위치(restriction site)로 치환된 염기서열로 이루어지는, Luc 2 레포터 벡터.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 제한 효소는 smaI인 것인, Luc 2 레포터 벡터.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 Luc 2 레포터 벡터는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, Luc 2 레포터 벡터.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 Luc 2 레포터 벡터는 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)가 접합된 것을 특징으로 하는, Luc 2 레포터 벡터.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 실험 대상 유전자는 KLF 10 유전자인 것을 특징으로 하는, Luc 2 레포터 벡터.
7. 청구항 5에 있어서, 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, Luc 2 레포터 벡터.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 Luc 2 레포터 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, Luc 2 레포터 벡터.
9. 청구항 1, 2, 4 내지 8 중 어느 한 항의 Luc 2 레포터 벡터가 도입된 숙주 세포.
10. 청구항 5 내지 8 중 어느 한 항의 Luc 2 레포터 벡터가 도입된 숙주세포에서 Luc 2의 발현 정도를 확인하는 단계;를 포함하는, 실험 대상 유전자의 5＇ 플랭킹 부위 (5＇ flanking region)의 작동 활성의 확인 방법.
    
    

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