CN101985631B - 一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明的棒状杆菌启动子探测载体pDXW-11，可用于筛选能在棒状杆菌中高效表达的启动子，通过质粒的探测，筛选到一种棒状杆菌强启动子tac-M，在棒状杆菌中能高效表达，尤其适用于棒状杆菌代谢产物的研究和生产。

Description

一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种启动子探测载体及其构建方法和应用，特别是一种棒状杆菌启动子探测载体以及应用该载体筛选到的强启动子，属于微生物基因工程领域。

背景技术

棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来(Kinoshita等，1957年)，棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别(Liebl等，1991)。

由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识(Eggeling andBott，2005；Burkovski，2008)，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。应用表达载体对氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因的过表达，是代谢工程最常用的策略之一。目前几乎所有的现存棒状杆菌表达载体都使用大肠杆菌启动子如lacUV5、trp、tac、λP_RP_L和araBAD启动子来表达外源基因(Srivastava and Deb，2005)；然而，在棒状杆菌中，这些启动子的活性较弱，外源基因在他们的控制下的表达水平通常不高，这会限制氨基酸的产量。因此，应用探测载体寻找用于棒状杆菌代谢工程改造的强启动子，具有重要的意义。

在本发明中，我们首先构建了一个新的棒状杆菌启动子探测载体pDXW-11，应用该载体探测了四种已知的启动子PilvA，Pkan，PF104，tac以及两种我们设计tac衍生物，即tac-M1，tac-M启动子在黄色短杆菌中的活性。我们发现tac-M启动子在黄色短杆菌中能高水平表达报告基因cat编码的氯霉素酰基转移酶CAT。tac-M启动子是一个适用于棒状杆菌代谢工程研究的强启动子，它的发现具有如下的重要意义：目前棒状杆菌中存在的使用tac启动子控制外源基因表达的弱表达载体，可以通过定点突变技术，转变成使用tac-M启动子的强表达载体。

发明内容

本发明提供了一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方案，通过此探测载体筛选到一个强启动子。

一种本发明所要解决的技术问题是提供一种棒状杆菌启动子探测载体pDXW-11。

本发明所述的探测载体包括筛选标记、复制子片段及多克隆位点，其特征在于含有用于检测外源DNA片段启动子活性的氯霉素酰基转移酶基因(cat)；用于控制报告基因上游启动子转录通读的rrnBT1T2终止子序列。

探测载体pDXW-11含有使质粒能在棒状杆菌宿主中复制并稳定存在的rep片段，从4786位到2010位。

探测载体pDXW-11含有用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因kan，从5789位到6604位。

探测载体pDXW-11含有用于检测外源DNA片段启动子活性报告基因cat，从823位到164位。

探测载体pDXW-11含有用于控制报告基因上游启动子转录通读的rrnBT1T2终止子序列，其中rrnBT1从1121位到1080位，rrnBT2从947位到940位。

本发明提供的表达载体pDXW-11，{Escherichia coli DH5α(pDXW-11)}已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号CCTCC NO：M 2010006保藏日期：2010-1-13。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供表达载体pDXW-11的构建方法。

为解决上述问题，所采用的技术方案是：

第一步：用限制酶XbaI和BglI双酶切载体pET28a，去除含lacI基因及T7启动子的DNA片段，将大片段自身环化，构建成的重组质粒命名为pDXW-1；

第二步：以质粒大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的棒状杆菌复制子片段rep，PCR产物用SmaI酶切，并连接到用BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-1上，构建的穿梭载体命名为为pDXW-2；

第三步：以含有cat基因的载体为模板，cat-F和cat-R为引物，通过PCR扩增686bp报告基因cat的开放阅读框，在扩增产物的5′和3′末端分别引入限制酶内切酶酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到用同样限制性内切酶双切后的pDXW-2上，构建的重组质粒命名为pDXW-2-cat；

第四步：以含有终止子rrnBT1T2的载体为模板，rrnBT1T2-F和rrnBT1T2-R为引物，通过PCR扩增294bp的终止子rrnBT1T2，在扩增产物的5′和3′末端分别引入限制酶内切酶酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到同样用同样限制性内切酶双切后的pDXW-2-cat上，构建的重组质粒命名为pDXW-11。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一个应用棒状杆菌启动子探测载体筛选得到的强启动子tac-M，该启动子根据杂合性启动子tac进行人工改造后得到，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

所述启动子通过寡核苷酸链退火法获得。

本发明的有益效果：

本发明的探测载体pDXW-11在大肠杆菌及棒状杆菌中皆能稳定存在，可用于检测DNA片段在棒状杆菌中有无启动子活性及活性的相对大小；应用本发明构建的探测载体，筛选到一种在棒状杆菌中能高效表达外源基因的强启动子tac-M，解决了目前棒状杆菌启动子普遍较弱的问题，尤其适用于棒状杆菌生产次生代谢产物的研究和生产。

附图说明

图1表达载体pDXW-11的构建。

图2表达载体pDXW-11的构建。

图3不同黄色短杆菌菌株全蛋白SDS-PAGE图。

图4不同黄色短杆菌菌株CAT活性图。

图5启动子探测载体pDXW-11的物理图谱。

具体实施方式

实施例1表达载体pDXW-11的构建

表达载体pDXW-10的构建过程如图1，2所示。

第一步，以表达载体pET28a(Novagen，USA)为基础，去除lacI基因及T7启动子，构建质粒pDXW-1(图1)。用限制酶XbaI和BglI双酶切载体pET28a，将获得的大片段纯化，用T4连接酶将大片段自身环化，构建成的重组质粒大小为3524bp，命名为pDXW-1(图1)；

第二步，构建穿梭载体pDXW-2(图1).以质粒大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pC2(Goyal etal.，1996Plasmid.36：62-66)为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的棒状杆菌复制子片段rep，在扩增产物的5’和3’末端引入限制酶SmaI酶切位点。PCR扩增反应体系为50μl，包括10μl5×PrimerSTAR buffer(Mg²⁺plus)，4μl dNTP混合物(各2.5mM)，1μl质粒模板pC2(100ng/μl)，1μl正向引物rep-F(20μM)，1μl反向引物rep-R(20μM)，0.5μl PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase；反应程序：94℃预变性分钟；94℃变性30秒，60℃退火15秒，72℃延伸2分45秒，35个循环；72℃再延伸10分钟；10℃保存。PCR产物用SmaI酶切，并连接到用BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-1，由此产生的穿梭载体大小为6216bp，命名为为pDXW-2。

第三步，向质粒pDXW-2引入将报告基因cat，cat编码氯霉素酰基转移酶(CAT)(图2)。以质粒pDXW-10-cat(Xu et al.，2010FEMS Microbiology letters.In review)为模板，带有三个串联终止密码子和SD序列的引物cat-F和cat-R为引物，通过PCR扩增686bp报告基因cat的开放阅读框，在扩增产物的5′和3′末端分别引入限制酶NotI和XhoI酶切位点。PCR扩增反应体系为50μl，包括10μl 5×PrimerSTAR buffer(Mg²⁺plus)，4μl dNTP混合物(各2.5mM)，1μl质粒模板pDXW-10-cat(100ng/μl)，1μl正向引物cat-F(20μM)，1μl反向引物cat-R(20μM)，0.5μl PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase；反应程序：94℃预变性分钟；94℃变性30秒，54℃退火15秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃再延伸10分钟；10℃保存。PCR产物用NotI和XhoI双切，并连接到同样用NotI和XhoI双切后的pDXW-2，构建的重组质粒大小为6901bp，命名为pDXW-2-cat(图2)。

第四步，为了消除报告基因上游pDXW-2自身序列对报告基因转录的干扰，在cat上游的多克隆位点前面引入转录终止子rrnBT1T2(图2)。以质粒pKK223-3(Pharmacia，Sweden)为模板，rrnBT1T2-F和rrnBT1T2-R为引物，通过PCR扩增294bp的终止子rrnBT1T2，在扩增产物的5′和3′末端分别引入限制酶NheI和BamHI酶切位点。PCR扩增反应体系为50μl，包括10μl 5×PrimerSTAR buffer(Mg²⁺plus)，4μl dNTP混合物(各2.5mM)，1μl质粒模板pKK223-3(100ng/μl)，1μl正向引物rrnBT1T2-F(20μM)，1μl反向引物rrnBT1T2-R(20μM)，0.5μl PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase；反应程序：94℃预变性分钟；94℃变性30秒，44℃退火15秒，72℃延伸20秒，35个循环；72℃再延伸10分钟；10℃保存。PCR产物用NheI和BamHI双切，并连接到同样用NheI和BamHI双切后的pDXW-2-cat，构建的重组质粒即为最终的启动子探测载体，其大小为7163bp，命名为pDXW-11，物理图谱见图5，构建过程中使用的引物序列如下：

rep-F：     agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatca

rep-R：     agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg

cat-F：     aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggaga

cat-R：     actactcgagttacgccccgccctgccact

rrnBT1T2-F：atctagctagccgatggtagtgtggggtctc

rrnBT1T2-R：agttggatccagaaaaataaacaaaagagt

实施例2应用探测载体pDXW-11探测启动子

为了证明pDXW-11的可用性并且寻找能在棒状杆菌中高效表达的启动子，在黄色短杆菌中，我们对六个不同类型的异源启动子P_ilvA，P_kan，PF104，tac，，tac-M1和tac-M进行了活性检测。P_ilvA是谷氨酸棒杆菌染色体上苏氨酸脱氢酶基因ilvA的启动子序列；P_kan是来自转座子Tn5的启动子序列；PF104是来自谷氨酸棒杆菌噬菌体φGA1的启动子序列；tac是杂合性启动子；tac-M1和tac-M是我们自己设计的tac启动子的衍生物。

首先，设计合成启动子寡核苷酸单链序列，并且在序列中引入限制性酶切位点，应用寡核苷酸链退火法获得启动子双链DNA序列。寡核苷酸单链序列包括P_ilvA-F、P_ilvA-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得P_ilvA启动子双链DNA序列；PF104-F、PF104-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得PF104启动子双链DNA序列；P_kan-F、P_kan-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得P_kan启动子双链DNA序列；tac-F、tac-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得tac启动子双链DNA序列。为了能够克隆到启动子探测载体的多克隆位点，所有启动子序列的5′和3′末端都分别引入了限制性切点BamHI和HindIII。将P_ilvA，P_kan，PF104，tac启动子双链DNA序列用BamHI和HindIII双切，并连接到同样用BamHI和HindIII双切后的启动子探测载体pDXW-11，获得的重组质粒分别命名为pDXW-11-P_ilvA，pDXW-11-P_kan，pDXW-11-PF104和pDXW-11-tac。将pDXW-11-P_ilvA，pDXW-11-P_kan，pDXW-11-PF104和pDXW-11-tac转化黄色短杆菌B.flavumATCC14067，分别形成菌株14067/pDXW-11-P_ilvA，14067/pDXW-11-P_kan，14067/pDXW-11-PF104和14067/pDXW-11-tac。将1mL过夜培养的上述黄色短杆菌菌株分别接种到30mL含卡那霉素的LBG培养基中，培养物生长到在600nm光密度为1.5时，离心收获细胞并悬浮在5mL Tris-HCl缓冲液(100mM，pH7.8)中。用Constant Cell Disruption Systems(Constant Systems，Daventry，UK)，在20KPSI条件下，破碎细胞，离心除去细胞碎片，粗提物用于SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE结果显示：所有样品都没有出现与预测的分子量约为25kD特异性CAT蛋白条带(报告基因cat的编码产物)(图3)，这意味着检测的启动子在黄色短杆菌中活性不是很强。为了进一步证明上述检测的启动子是否具有活性以及活性相对大小，我们应用Shaw(1975)等的方法，分别对上述4个菌株粗提物进行了CAT的生物活性检测。结果显示：14067/pDXW-11-P_ilvA，14067/pDXW-11-P_kan，14067/pDXW-11-PF104和14067/pDXW-11-tac样品的CAT的相对活性分别为0.086、0.785、0.128、0.467U(mg protein^-1)(Fig.4)。结合SDS-PAGE图谱及CAT活性测定数值进行分析可得出结论：P_ilvA，P_kan，PF104，tac启动子在黄色短杆菌中都具有活性，但活性水平不高。

然后，为了发现适用于棒状杆菌代谢工程研究的强启动子，我们设计了两个tac启动子的衍生物tac-M1和tac-M。tac、tac-M1和tac-M启动子的差别仅在于其延伸的-10区序列，他们的延伸的-10区序列分别为gctcgtataa tgt、tgtgctataa tgg和tgtggtacca tgt。我们应用寡核苷酸链退火法获得tac-M1和tac-M启动子双链DNA序列，序列的5′和3′末端都分别引入了限制性切点BamHI和HindIII。寡核苷酸单链序列包括：tac-M1-F、tac-M1-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得tac-M1启动子双链DNA序列；tac-M-F、tac-M-R，用于通过寡核苷酸链退火法获得tac-M启动子双链DNA序列。将tac-M1和tac-M启动子双链DNA序列用BamHI和HindIII双切，并连接到同样用BamHI和HindIII双切后的启动子探测载体pDXW-11，获得的重组质粒分别命名为pDXW-11-tac-M1和pDXW-11-tac-M2。将pDXW-11-tac-M1和pDXW-11-tac-M2转化黄色短杆菌B.flavumATCC14067，分别形成菌株14067/pDXW-11-tac-M1和14067/pDXW-11-tac-M。将1mL过夜培养的黄色短杆菌菌株14067/pDXW-11-tac-M1和14067/pDXW-11-tac-M分别接种到30mL含卡那霉素的LBG培养基中，培养物生长到在600nm光密度为1.5时，离心收获细胞并悬浮在5mL Tris-HCl缓冲液(100mM，pH7.8)中。用Constant Cell Disruption systems(Constant Systems，Daventry，UK)，在20KPSI条件下，破碎细胞，离心除去细胞碎片，粗提物用于SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE结果显示：14067/pDXW-11-tac-M样品显示了分子量约为25kD的CAT蛋白条带(图3)，说明tac-M启动子在黄色短杆菌中能高效表达活性很强。为了进一步证明tac-M1和tac-M启动子活性相对大小，我们应用Shaw(1975)等的方法，分别对上述2个菌株粗提物进行了CAT的生物活性检测。结果显示：14067/pDXW-11-tac-M1和14067/pDXW-11-tac-M样品的CAT的相对活性分别为0.602、5.526U(mg protein^-1)(图4)。结合SDS-PAGE图谱及CAT活性测定数值进行分析可得出结论：tac-M启动子在黄色短杆菌中是一个强启动子。

用于获得启动子双链DNA的寡核苷酸单链序列如下：

P_ilvA-F：agcggatcccaaagtaggtgcaattctaggagaagattacactagtcaaccatgagtgaaaagcttagc

P_ilvA-R：gctaagcttttcactcatggttgactagtgtaatcttctcctagaattgcacctactttgggatccgct

PF104-F：aataggatcccagcgtatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcggaagctttaat

PF104-R：attaaagcttccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctgggatcctatt

P_kan-F： acttggatccccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaaagcttaatg

P_kan-R： cattaagcttttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggggatccaagt

tac-F：  atatggatcctgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaattaagctttaaa

tac-R：  tttaaagcttaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattgtcaacagctcaggatccatat

tac-M1-F：agctggatcctgagctgttgacaattaatcatcgtgtgctataatgggtggaattgtgagcggataacaattaagcttagct

tac-M1-R：agctaagcttaattgttatccgctcacaattccacccattatagcacacgatgattaattgtcaacagctcaggatccagct

tac-M-F： agctggatcctgagctgttgacaattaatcatcgtgtggtaccatgtgtggaattgtgagcggataacaattaagcttagct

tac-M-R： agctaagcttaattgttatccgctcacaattccacacatggtaccacacgatgattaattgtcaacagctcaggatccagct

核苷酸序列表

<110>江南大学

<120>一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7163

<212>DNA

<213>pDXW-11

<400>1

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa    60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt    120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttacgcc ccgccctgcc    180

actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaga    240

cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt    300

tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac    360

tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag    420

ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact    480

gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga    540

aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca    600

tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa    660

acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct    720

ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt    780

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aaaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca tccgtcagga tggccttctg cttaatttga    960

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ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta ctcaggagag cgttcaccga caaacaacag    1080

ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt    1140

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gcaccaggcc gctgctgtga tgatgatgat gatggctgct gcccatggta tatctccttc    1260

ttaaagttaa acaaaattat ttctaggcat ggcggcccca cgggtgcgca tgatcgtgct    1320

cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc    1380

accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac    1440

aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc    1500

ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc    1560

tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct ggtcccgccg    1620

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agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag    1740

aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc    1800

ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga    1860

tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg    1920

cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt    1980

cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg    2040

tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtaggg    2100

cattgtcaac aacaagaccc atcatagttt gcccccgcga cattgaccat aaattcatcg    2160

cacaaaatat cgaacggggt ttatgccgct tttagtgggt gcgaagaata gtctgctcat    2220

tacccgcgaa caccgccgca ttcagatcac gcttagtagc gtccccatga gtaggcagaa    2280

ccgcgtccaa gtccacatca tccataacga tcatgcacgg ggtggaatcc acacccagac    2340

ttgccagcac ctcattagcg acacgttgcg cagcggccac gtccttagcc ttatccacgc    2400

aatctagaac gtactgccta accgcgaaat cagactgaat cagtttccaa tcatcgggct    2460

tcaccaaagc aacagcaacg cgggttgatt cgacccgttc cggtgcttcc agaccggcga    2520

gcttgtacag ttcttcttcc atttcacgac gtacatcagc gtctatgtaa tcaatgccca    2580

aagcacgctt agccccacgt gaccaggacg aacgcaggtt tttagaacca acctcatact    2640

cacgccaccg agccaccaaa acagcgtcca tatcctcgcc ggcgtcgctt tgatcggcca    2700

acatatccaa catctgaaac ggcgtgtacg accccttaga cgcggtttta gtagcggagc    2760

cagtcagttc ctgagacatg cccttagcga ggtaggttgc cattttcgca gcgtctccac    2820

cccaggtaga cacctgatca agtttgaccc cgtgctcacg cagtggcgcg tccataccgg    2880

ccttaaccac accagcagac cagcgggaaa acatggaatc ctcaaacgcc ttgagttcat    2940

cgtcagacag tggacgatcc aagaacaaca gcatgttgcg gtgcaagtgc caaccgttcg    3000

cccaagagtc tgtgacctca tagtcactat aggtgtgctc caccccgtac cgtgcacgtt    3060

ctttcttcca ctgagatgtt ttcaccatcg aagagtacgc agtcttaata cccgcttcaa    3120

cctgcgcaaa tgactgtgag cggttgtgtc gaacagtgcc cacaaacatc atgagcgcgc    3180

cacccgccgc caagtgattc ttagtagcaa tagccagctc aatgcggcgt tcgcccatga    3240

cttccaattc agccagaggt gacccccagc gagagtgaga gttttgcaga ccctcaaact    3300

gcgaagcacc gttagacgac caggacaccg caacagcttc gtccctgcgc cacctatggc    3360

accccgccag agccttacta ttggtgatct tgtacatgac gttttgccta cgccacgccc    3420

tagcgcgagt gaccttagaa ccctcattga cctgcggttc cttagaggtg ttcacttcta    3480

tttcagtgtt acctagaccc gatgttgtgc ggggttgcgc agtgcgagtt tgtgcgggtg    3540

ttgtgcccgt tgtcttagct agtgctatgg ttgtcaattg aaaccccttc gggttatgtg    3600

gcccccgtgc atatgagttg gtagctcgca cgggggtttg tcttgtctag ggactattaa    3660

tttttagtgg tgtttggtgg ccgcctagct tggctatgcg tgccagctta cccgtactca    3720

atgttaaaga tttgcatcga catgggaggg ttacgtgtcc gatacctagg gggggtatcc    3780

gcgactaggt gccccggtgc tcactgtctg taccggcggg gcaagcccca caccccgcat    3840

ggacagggtg gctccgcccc ctgcaccccc agcaatctgc atgtacatgt tttacacatt    3900

agcacgacat gactgcatgt gcatgcactg catgcagact aggtaaatat gagtatgtac    3960

gactagtaac aggagcactg cacataatga atgagttgca ggacaatgtt tgctacgcat    4020

gcgcatgaca tatcgcagga aagctactag agtcttaaag catggcaacc aaggcacagc    4080

tagaacagca actacaagaa gctcaacagg cactacaggc gcagcaagcg caggcacaag    4140

ccaccatcga agcactagaa gcgcaggcaa aggctaagcc cgtcgtggtc accgcacgcg    4200

ttcctttggc actacgtgag gacatgaagc gcgcaggcat gcagaacggt gaaaacctcc    4260

aagagttcat gatcgccgcg tttaccgagc ggctagaaaa gctcaccacc accgacaacg    4320

aggaaaacaa tgtctaaccc actagttctc tttgcccacc gtgacccggt aaatgacgtg    4380

acgttcgagt gcattgagca cgccacctac gacacacttt cacacgctaa agaccagatc    4440

accgcccaaa tgcaagccct agacgaagaa gccgccctac tgccctaatg ggtgtttcat    4500

gggtgtttcc ctagtgtttc atggtgtttt cacctaagct agggaattgc gcgagaagtc    4560

tcgcaaaaat cagcaacccc cggaaccaca cagttcacgg gggttcttct atgccagaaa    4620

tcagaaaggg gaaccagtga acgaccccga atattggatc acagcgcagc aggtcgccgc    4680

ccgcgtagct ctcaccccgg ccaccattaa aaagtgggca aacgagggaa aaatcaccgc    4740

atacaagatc ggcaagtccg tccgattcaa agcatcagac gtagacccct actggcttaa    4800

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atatgcggtg tgaaataccg    4860

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac    4920

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata    4980

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa    5040

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct    5100

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa    5160

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg    5220

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca    5280

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa    5340

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg    5400

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg    5460

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg    5520

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc    5580

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag    5640

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac    5700

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgaacaataa aactgtctgc    5760

ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc    5820

taggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga    5880

taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga    5940

gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag    6000

actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc    6060

tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga    6120

agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt    6180

gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca    6240

ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa    6300

tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga    6360

ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt    6420

aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat    6480

cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata    6540

tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt    6600

ctaagaatta attcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag    6660

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgaaat tgtaaacgtt aatattttgt    6720

taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg  6780

gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt  6840

ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct  6900

atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt  6960

gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa  7020

agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc  7080

tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc  7140

tacagggcgc gtcccattcg cca                                          7163

<210>2

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgagctgttg acaattaatc atcgtgtggt accatgtgtg gaattgtgag cggataacaa    60

tt                                                                   62

Claims (2)

1.一种棒状杆菌启动子探测载体，包括筛选标记、复制子片段及多克隆位点，其特征在于含有用于检测启动子活性的氯霉素酰基转移酶报告基因（cat）；多克隆位点后为用于控制报告基因上游启动子转录通读的rrnBT1T2终止子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.权利要求1所述的探测载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步：用限制酶XbaI和BglI双酶切载体pET28a，去除含lacI基因及T7启动子的DNA片段，将大片段自身环化，构建成的重组质粒命名为pDXW-1；

第二步：以质粒大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的棒状杆菌复制子片段rep，PCR产物用SmaI酶切，并连接到用BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-1上，构建的穿梭载体命名为为pDXW-2；

所述rep-F序列为：agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatca；

所述rep-R序列为：agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg；

第三步：以含有氯霉素酰基转移酶基因（cat）的载体为模板，cat-F和cat-R为引物，通过PCR扩增686 bp 报告基因cat的开放阅读框，在扩增产物的5 '和3 '末端分别引入限制酶内切酶酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到用同样限制性内切酶双切后的pDXW-2上，构建的重组质粒命名为pDXW-2-cat；

所述cat-F序列为：aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggaga;

所述cat-R序列为：actactcgagttacgccccgccctgccact

第四步：以含有终止子rrnBT1T2的载体为模板，rrnBT1T2-F和rrnBT1T2-R为引物，通过PCR扩增294 bp 的终止子rrnBT1T2，在扩增产物的5 '和3 '末端分别引入限制酶内切酶酶切位点，PCR产物用引入的限制性内切酶双切，并连接到同样用同样限制性内切酶双切后的pDXW-2-cat上，构建的重组质粒命名为pDXW-11;

所述rrnBT1T2-F序列为：atctagctagccgatggtagtgtggggtctc;

所述rrnBT1T2-R序列为：agttggatccagaaaaataaacaaaagagt。

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