JP2001340090A - 乳酸菌シャトルベクター - Google Patents
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Abstract
供し、生物中の異種遺伝子を発現する無害の宿主細胞を
DNAワクチン又は健康食品として用いることにより、安
全性及び免疫反応を高める。 【解決手段】 本発明は、(a)プラスミド複製数を調
節し大腸菌複製起源配列を含む領域と、(b)少なくと
も一つの真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列、異種
遺伝子が挿入されるマルチクローニングサイト、及び転
写終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセットと、
(c)複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミドの複製に
関連するタンパク質をコードする核酸配列とを含む乳酸
菌プラスミド配列と、(d)非抗生物質耐性選択遺伝子
及びそのプロモーター配列とを含有する、乳酸菌シャト
ルベクターを提供する。この乳酸菌シャトルベクターは
選択マーカーとしての非抗生物質耐性遺伝子を特徴と
し、薬剤や食品に利用できる。
Description
クター及びその用途、特に、選択マーカーとしての非抗
生物質耐性遺伝子を特徴とする乳酸菌シャトルベクター
に関するものである。
himurium)やリステリア菌(Listeriamonocytegene)等
といった細菌の摂取によって、多くのDNAワクチンが哺
乳動物に投与されている(Dietrich G.ら、1998, Natur
e Biotech., 16:181〜185; Lowrie, D.B., 1998, Natu
re Med., 4:147〜148)。その長所は、DNAワクチンを免
疫細胞に直接投与することが可能であり、あるいはDNA
ワクチンで免疫システムを刺激することにより免疫反応
を高めることが可能なことである。通常、このような細
菌の投与により生じる効果は、ワクチンとしてDNAのみ
を用いることにより生じる効果よりも優れている。しか
しながら、この種の弱毒化細菌は治療される哺乳動物に
とって有害であり、あるいはこれらの細菌の突然変異誘
発により病原性細菌になりうる。
スミドを含む細胞(例:細菌)を選択する選択マーカー
を有していなければならない。一般に、大部分の商品化
したプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイ
シン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を選択マーカ
ーとして有している。これらのプラスミドは殆どが実験
室で用いられるため、安全性が重要視されていない。し
かしながら、生物中に存在する細菌株のうち、自然界の
形質導入作用によって抗生物質耐性遺伝子を含み得るも
のもある。これらのプラスミドを薬学的ワクチン組成物
または食品添加物として用いた場合、プラスミド又はそ
の派生物で治療する生物を害する可能性がある。また、
精製したDNA内に抗生物質が残留すると、治療される生
物にアレルギー反応が生じうるため、抗生物質の使用に
は問題がある。
は、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを構築し、
生物中の異種遺伝子を発現する無害の宿主細胞をDNAワ
クチン又は健康食品として用いることにより、安全性及
び免疫反応を高めることを目的とする。
菌は病原性を生じうるため、上述の目的を達成するため
に、本発明ではワクチン媒体として乳酸菌を選んだ。乳
酸菌は病原性のないグラム陽性菌であり、乳製品や食品
産業において大量に使用される。また、乳酸菌は消化管
に存在する正常な細菌叢である(Bomba A.ら、1994,Ve
t. Med. (praha), 39:701-710; Nemcova R.ら、1998, D
TW Dtsch tierarztl wochenscher, 105:199-200)。さら
に、乳酸菌の細胞壁中のある化学組成物はヒトの免疫反
応を刺激しうる(Vilma M.A.ら、1996, Chem. Pharm. B
ull., 44(12):2263-2267)。異種遺伝子を生じるよう、
あるいはDNAワクチンとして用いるために乳酸菌株を改
変した場合、このような改変された乳酸菌を摂取した生
物の免疫又は健康を改善することが可能である。また、
組換え型のプラスミド又はベクターが遺伝子工学によっ
て調製されることにより、食品産業において有用な、よ
り価値のある乳酸菌株を得ることができる。
し、大腸菌複製起点配列を含む領域と;(b)真核細胞
遺伝子の転写プロモーター配列、異種遺伝子が挿入され
るマルチクローニングサイト、及び転写終結配列を含む
真核細胞遺伝子発現カセットと;(c)複製のプラス起
点と、乳酸菌プラスミドの複製に関連するタンパク質を
コードする核酸配列とを含む乳酸菌プラスミド配列と;
(d)非抗生物質耐性選択遺伝子及びそのプロモーター
配列とを有する乳酸菌シャトルベクターを提供する。
るキットを提供する。そのうち、異種遺伝子が組込まれ
る上述の乳酸菌シャトルベクターは、適当なシステムに
導入されて異種タンパク質を発現する。
アを提供する。そのうち、病原体または癌から得られる
抗原遺伝子は、上述の乳酸菌シャトルベクターに組込ま
れる。
前述の乳酸菌シャトルベクターを導入する工程と(その
うち、前記宿主細胞の内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝
子は正常な酵素機能を生じることができない)、(ii)
ラクトースが唯一の炭素源である条件下で、工程(i)
で形質転換した前記宿主細胞を培養する工程とを含む、
ベクターを含有する宿主細胞の選択方法を提供する。
(a)プラスミド複製数を調節し、大腸菌複製起源配列
を含む領域と、(b)真核細胞遺伝子の転写プロモータ
ー配列、異種遺伝子が挿入されるマルチクローニングサ
イト、及び転写終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセ
ットと、(c)複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミド
の複製に関連するタンパク質をコード化する核酸配列と
を含む乳酸菌プラスミド配列と、(d)非抗生物質耐性
選択遺伝子及びそのプロモーター配列とを有する乳酸菌
シャトルベクターであることを特徴とする。
(2)前記真核細胞遺伝子の転写プロモーターは、サイ
トメガロウイルス(CMV)プロモーターである、上記(1)
に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とす
る。
(3)前記乳酸菌プラスミド配列は、ラクトバチルスプ
ランタルムから単離した2.1kbのプラスミドである、上
記(1)に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特
徴とする。
(4)前記乳酸菌プラスミドの複製に関連する前記タン
パク質は、317のアミノ酸を含むRepAタンパク質であ
る、上記(3)に記載の乳酸菌シャトルベクターであるこ
とを特徴とする。
(5)前記非抗生物質耐性選択遺伝子はβ-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子である、上記(1)に記載の乳酸菌シャトル
ベクターであることを特徴とする。
(6)前記β-ガラクトシダーゼ遺伝子の前記プロモー
ターは、エリスロマイシン耐性遺伝子プロモーターであ
る、上記(5)に記載の乳酸菌シャトルベクターであるこ
とを特徴とする。
(7)配列番号:1で示される前記ヌクレオチド配列も
しくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はその縮退変
異体を含む、上記(1)に記載の乳酸菌シャトルベクター
であることを特徴とする。
(8)配列番号:2で示される前記ヌクレオチド配列も
しくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はその縮退変
異体を含む、上記(1)に記載の乳酸菌シャトルベクター
であることを特徴とする。
(9)(a)pCLP7(図3における制限酵素部位の配位を
有する。ATCC受入番号PTA-2661)と、(b)pCLP8(図3
における制限酵素部位の配位を有する。ATCC受入番号PT
A-2663)とからなる群より選ばれる、上記(1)に記載の
乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
(10)形質転換する宿主細胞がグラム陽性菌であり、
前記宿主細胞の内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子が正
常な酵素機能を生じることができない、上記(1)に記載
の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
(11)前記宿主細胞が、Ana-1(Lac-突然変異体)(A
TCC受入番号PTA-2662)と称するラクトバチルスカゼイ
(亜種カゼイ)の突然変異体である、上記(10)に記載の
乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
(12)(a)上記(1)に記載の乳酸菌シャトルベクター
と、(b)内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子が正常な酵
素機能を生じることができない宿主細胞と、(c)真核
細胞遺伝子とを含む、異種遺伝子発現用キットであるこ
とを特徴とする。
(13)上記(1)に記載の乳酸菌シャトルベクターを含
むDNAワクチンキャリアであることを特徴とする。
4)(i)前記宿主細胞に、上記(1)に記載の乳酸菌シャ
トルベクターを導入する工程と(そのうち、前記宿主細
胞の内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子は正常な酵素機
能を生じることができない)、(ii)工程(i)で形質
転換した前記宿主細胞を、ラクトースが唯一の炭素源で
ある条件下で培養する工程とを含む、ベクターを含有す
る宿主細胞の選択方法であることを特徴とする。
図面を参照することにより、本発明がさらに理解され、
さらなる利点が明らかになると考えられる。
クター」という用語は、大腸菌及びラクトバチルスの両
方のプラスミド複製起点が存在するベクターを表してお
り、このベクターが大腸菌及び乳酸菌の両方において複
製し増殖可能であることにより、細菌種間の障壁を打ち
破る。
め、本発明の乳酸菌シャトルベクターは、大腸菌内にお
けるベクターの複製に必要な複製起点Col E1を含む。
あるいはDNAワクチンキャリアとして用いるため、本発
明の乳酸菌シャトルベクターは、少なくとも1つの真核
細胞遺伝子転写プロモータ配列、マルチクローニングサ
イト、及び転写終結配列を有する真核細胞遺伝子発現カ
セットを含む。そのうち、所望の異種遺伝子がベクター
内のマルチクローニングサイトに挿入される。上述のベ
クターに用いることのできる要素は限定されないことが
当業者には理解されると思われる。例えば、本発明に適
した真核細胞遺伝子転写プロモーター配列には、CMV
(サイトメガロウイルス)プロモーター、SV40(シミア
ンウイルス40)初期プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウ
イルス)プロモーター等が含まれる。
用語は、結合した他の核酸を移送することが可能な核酸
分子を意味する。好ましいベクターの一つはエピソー
ム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好ま
しいベクターは、自律複製及び結合している核酸の発現
が可能なベクターである。作動的に結合された遺伝子の
発現を指向できるベクターは、本明細書では「発現ベク
ター」と称する。一般的に、組換えDNA技術において有
用な発現ベクターは、環状二本鎖DNAループを表す「プ
ラスミド」の形となっている(但し、ベクターの形は染
色体に限定されない)。
する」などという用語は、反応又は作用の制御に関連す
る配列を意味することが理解されると思われる。これに
は、遺伝子の発現の調節、制御、作用、あるいはプラス
ミドの複製、選択、維持に関係した配列が含まれる。例
えば、アティニュエーター、オペレーター、プロモータ
ーなどが含まれる。
用語は、核酸配列を複製するためのDNA合成を開始する
ヌクレオチド配列を表す。これは、一般にori部位と呼
ばれる。通常、バクテリアは単一のori部位を有してい
るのに対し、真核細胞の染色体はそれぞれ多くのori部
位を有している。この用語には、DNA複製の間、自律単
位として作用する遺伝因子を表すレプリコンが含まれ
る。細菌のうち、染色体は単一レプリコンとして機能す
るのに対し、真核細胞の染色体は一連のレプリコンを数
百個含む。
いう用語は、事前に薬剤によって不利に作用する微生物
により、特定の抗生物質に対する耐性を得たことを意味
する。通常、このような耐性は、突然変異、あるいは微
生物を形質転換する耐性遺伝子を含むプラスミドによる
耐性の獲得により生じる。
遺伝子の転写プロモーター配列はCMVプロモーター(以
下pCMVと称する)であり、転写終結配列は、mRNA(メッ
センジャーRNA)の合成を終了し安定させるBGHポリA
(ウシ成長ホルモンポリアデニル酸)領域である。
ミドが含まれており、複製起点及び必須タンパク質をコ
ードする遺伝子は、本発明に係るベクターの構築に適し
ている。ラクトバチルスプランタルム(ATCC 8014、CCR
C 10357)に含まれる天然プラスミドには3種類あり、そ
れぞれ2.1kb、10.5kb、38.8kbである(Yan T-Rら、199
6, Chinese Agri. Chem. Soc., 34:723-731)。便利性
と安定性の要件により、3つのプラスミドのうち最小の
ものが本発明のベクターに選ばれる。2.1kbのプラスミ
ドは、複製のプラス起点、転写解読枠、及び13回反復し
た17ヌクレオチドの配列群を備えた複製調節領域を含
む。そのうち、転写解読枠は317のアミノ酸からなり、
プラスミドの複製に関連した機能を有するタンパク質
(Rep Aタンパク質)を翻訳する(Bouia A.ら、1989, P
lasmid, 22:185-192; Bringel F.ら、1989, Plasmid, 2
2:193-202)。本発明は、上述した2つの重要な因子が破
壊されない条件の下、プラスミドを線形化するBclIのよ
うな適当な制限酵素を選択することにより、線状プラス
ミドを本発明のベクターに組込むのを容易にする。
ー遺伝子として、ラクトバチルスデルブレッキイ(亜種
ブルガリクス)のゲノムにおけるβ-ガラクトシダーゼ
遺伝子が選ばれる。β-ガラクトシダーゼ遺伝子の生成
物は、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水
分解する代謝酵素である(Schmidt B.F.ら、1989, J.Ba
cteriol., 171:625-635)。このため、細菌が酵素を欠
き(例:大腸菌JM109菌株)、ラクトースが唯一の炭素
源である条件下で増殖させた場合、細菌はプラスミドに
存在する遺伝子にコードされるβ-ガラクトシダーゼを
用いてラクトースを代謝させ、増殖に必要なグルコース
を得る(Hashida H., 1992, Biosci. Biotech. Bioche
m., 56:190-194)。
シダーゼ遺伝子は、プロモーターによる制御の下で発現
される。プロモーターは、遺伝子生成物を過度に発現す
る強力な転写プロモーターであるのが好ましい(Hashid
a H., 1992, Biosci. Biotech. Biochem., 56:190-19
4)。本発明の好ましい態様の1つにおいて、プロモータ
ーはエリスロマイシン耐性遺伝子プロモーター(以下Em
rPと称する)である。
ーとして用いることは、抗生物質耐性遺伝子に代替でき
るだけでなく、薬剤及び食品の安全性の要件に応えるこ
とができる。
ち、内因性β-ガラクトシダーゼ)自体の遺伝子にコー
ドされたβ-ガラクトシダーゼの機能は破壊されなけれ
ばならない(すなわち、宿主細胞は正常な酵素活性を有
するβ-ガラクトシダーゼを発現することができない)
ため、宿主細胞は生存のために本発明の組換えベクター
に頼らなければならない。本発明は、N-メチル-N'-ニト
ロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)を用いて対数増殖期
にある宿主細菌を処理する。MNNGは、グアニン及びチミ
ンを活性化し易くしてDNAの突然変異を生じさせるアル
キル化剤である。したがって、欠陥性β-ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を有する細菌株が選ばれる。
はラクトバチルスカゼイ(亜種カゼイ)が含まれる(但
しこれに限定されない)。この菌株を用いる長所として
は、(1)この細菌株は食品の安全性要件を満たしたチ
ーズを製造するのに用いられる菌株の1つであること、
(2)この細菌株は腸内に付着してコロニーを形成でき
ること、(3)本発明のシャトルベクターが乳酸菌プラ
スミドの複製プラス起点を含んでいることにより、ベク
ターは乳酸菌宿主菌株において複製できるとともに着実
に隔離できることが挙げられる(Leer R.ら、1992, Mo
l. Gen. Genet., 234:265-274; Posno M.ら、1991, App
l. Environmental Microbiol. 57:1822-1828)。乳酸菌
株はグラム陽性菌の1つであり、本発明のシャトルベク
ターは大腸菌及びラクトバチルスの両方の複製起点を有
していることを理解されたい。したがって、乳酸菌に類
似した遺伝子的特徴を有するグラム陽性菌も、本発明に
おいて宿主細胞として使用できることが、当業者には理
解されると思われる。つまり、突然変異して欠陥性β-
ガラクトシダーゼ遺伝子を得るいかなる適当な細菌株
も、あるいは内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子が正常
な酵素活性を有していない適当な細菌株も、本発明で用
いることができる。好ましい態様において、ラクトバチ
ルスカゼイ(亜種カゼイ)はMNNGで処理された後、X-ga
l及び選択培地でスクリーニングされて、Lac-突然変異
体(Ana-1と命名する)を得る。Ana-1は、2000年11月10
日にATCC(American Type Culture Collection, 10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA)に
寄託され、ATCC受入番号PTA-2662が付与されている。
クローニングサイトに、病原体又は癌から派生する適当
な抗原遺伝子を挿入することにより、遺伝子ワクチンキ
ャリアを得る。そして、この遺伝子ワクチンキャリア
は、欠陥性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を有する細菌株
に形質転換した後、経口又は注射(例:静脈注射、動脈
注射、皮下注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、または筋肉
内注射等)により生物に投与される。このため、遺伝子
ワクチンキャリアはエンドサイトーシス又は食作用によ
り生物の細胞に組込まれる。また、真核細胞遺伝子の転
写プロモーター配列(例:pCMV)の構築により、マルチ
クローニングサイト中の抗原遺伝子が即座に発現しう
る。
シダーゼ遺伝子を有する宿主細胞と結合する乳酸菌シャ
トルベクターを使用することには、以下の長所がある:
(1)乳酸菌は毒性でも病原性でもない;(2)乳酸菌の
細胞壁内のある化学組成物は、哺乳類の免疫反応を刺激
し増強することができる;(3)遺伝子ワクチンとして
用いられる乳酸菌シャトルベクターの用量はDNAワクチ
ンの直接注射の用量よりはるかに少なく、前者が約1mg/
用量未満であるのに対して、後者は約100mg/用量であ
り、注射部位は、例えば体表付近の部位等に限られてい
る;および(4)乳酸菌シャトルベクターは、ウイルス
ベクター(viral vector)を使用するよりも安全性がは
るかに高い。
マルチクローニングサイトに異種遺伝子を挿入して、組
換え発現ベクターを得る。これにより、興味深い異種タ
ンパク質が体内又は体外で、ベクターの真核細胞遺伝子
の転写プロモーターによって、適当な真核細胞において
過度に発現する。真核細胞遺伝子の転写プロモーターを
適当な原核細胞遺伝子の転写プロモーターで置き換える
ことにより、この興味深い異種タンパク質を適当な原核
細胞中で過剰発現させられることが当業者には理解され
ると思われる。
ズムにより、ベクターの細胞への形質転換を達成するこ
とができる。例えば、形質転換(二価カチオン、DMSO、
還元剤、塩化ヘキサミンコバルトなどによる処理を含
む)、エレクトロポレーション、または粒子の衝撃など
である。
く説明するが、この実施例はいかなる様式においても本
発明を限定するものではない。
ラクトバチルスデルブレッキイ(亜種ブルガリクス)
(CCRC14008)、ラクトバチルスプランタルム(CCRC103
57)、及びラクトバチルスカゼイ(亜種カゼイ)(CCRC
10697)が含まれ、これらは台湾・新竹のCCRC(Culture
Collection and Research Center)で入手できる。こ
の3種類の細菌全てをラクトバチルスMRSブイヨン(Lact
obacilli MRS broth)(プロテオースペプトンNo.3 10g
/L、牛肉エキス10g/L、酵母エキス5g/L、20g/Lデキスト
ロース、Tween-80 1g/L、クエン酸アンモニウム2g/L、C
H3COONa 5g/L、MgSO4・7H2O 0.1g/L、MnSO4・H2O 0.05g
/L、K2HPO4 2g/Lを含み、pH6.2〜6.5である)中で、37
℃で増殖させた。
lをMRSブイヨン1mlに接種して、37℃で4時間インキュベ
ートした。スピンダウンによりペレットを得て、PBS緩
衝液(50mMリン酸カリウム、150mM NaCl、ph7.2)で2度
洗浄した。この細菌ペレットをPBS緩衝液0.9ml中で再懸
濁し、MNNG(N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジ
ン; 0.05M酢酸中に5mg/ml)0.1mlで処理した。37℃で1
時間ゆっくり回転させた後、細菌を遠心分離して沈殿さ
せ、PBS緩衝液で3度洗浄してから、MRSブイヨン0.1ml中
に再懸濁した。MRSブイヨンで10倍の連続希釈を行い、
各希釈度のMRS中の細菌0.1mlを、40μlのX-gal(20mg/m
l)を塗布した直径100mmの寒天平板に接種した。これら
の平板を37℃で1〜3日培養した。ラクトバチルスカゼイ
(亜種カゼイ)のLac-突然変異体(Ana-1)として白色
コロニーを選択した。
ンタルムを収集し、この細菌を4.755mlの溶液I(ショ糖
6.7%、pH7.6の50mM Tris-HCl、pH8.0の1mM EDTA、リソ
チーム100μl)を用いて37℃で20分間溶解した。溶液II
(pH7.6の50mMTris-HCl、0.25M EDTA)482μl及び溶液I
II(SDS20%、pH7.6の50mM Tris-HCl、20mM EDTA)276
μlを加えた後、この混合液を37℃で20分間インキュベ
ートして30秒間激しく振った。それから、3N NaOH 1.27
6mlを加えて10分間回転し、2M Tris496μlを加えてさら
に10分間回転した。細菌のタンパク質を抽出するため
に、5M NaCl 717μl及び3%のNaClで飽和したフェノー
ル700μlに細菌溶菌液を加えた。遠心分離した後、液相
を等容量のクロロホルムイソアミルアルコール(24:
1)で抽出した。混合、遠心分離した後、等容量のイソ
プロパノールを用いて液相を0℃で1時間沈殿させてか
ら、5分間遠心分離してDNAペレットを得た。このDNAペ
レットを自然乾燥させてH2O 20μl中に溶かした。プラ
スミドDNAの質及び量は、1%のアガロース電気泳動法及
び臭化エチジウム染色により評価した。
スミドのクローニング ラクトバチルスプランタルムから単離したプラスミド
を、1%のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって
分別し、GENECLEANIIIキット(Bio 101, La Jollia, C
A)で精製した。プラスミドpCLP1及びpCLP2を生成する
ため、プラスミド2.1kbを制限酵素BclIで消化し、CMVプ
ロモーター、BGHポリA配列、Col E1複製起点、及びAmpR
転写解読枠を含有するpCLP0(図1参照)のBglII部位に
連結した。
染色体DNAの単離 一晩培養したMRSブイヨン20mlからラクトバチルスデル
ブレッキイ(亜種ブルガリクス)を収集し、細菌ペレッ
トをTES緩衝液(100mM Tris、20mM EDTA、ショ糖20%、
リソチーム1mg/ml)1ml中に、37℃で30分間再懸濁し
た。それから細胞に、ドライアイス-エタノールのバス
中で凍結させ37℃の水浴で融解する、凍結融解サイクル
を5回施した。体積が1/2である1%のドデシル硫酸ナト
リウム(SDS)溶液を加えて細胞を溶解した。3度フェノ
ール抽出を行うことにより、染色体DNAを精製した。最
後にDNAをエタノールで沈殿し、風乾させてから、H2O中
に溶かした。
ング ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、ラクトバチルス
デルブレッキイ(亜種ブルガリクス)の染色体DNAから
β-ガラクトシダーゼ遺伝子を増幅した。PCR増幅は、0.
075ユニットのPfu Turbo(商標) DNAポリメラーゼ(STRA
TAGENE(登録商標), La Jolla, CA)と、それぞれ1μMの
フォワードプライマー(5'-aagctcatgaTTGGCAGCCAGTCTC
CGGGC-3'(配列番号:3))及びリバースプライマー
(5'-gacctcatgaACCGTCGCTAGCGACACGCC-3'(配列番号:
4))とからなる。PCRは、(i)95℃を5分間、(ii)9
4℃を30秒間、54℃を30秒間、72℃を3分間、を30回繰り
返す、(iii)72℃を10分間、(iv)4℃に維持する、の
4段階で行った。増幅したDNA生成物を0.8%アガロース
電気泳動法及び臭化エチジウム染色により評価した後、
GENECLEANIIIキット(Bio 101, La Jolla, CA)により
精製した。精製したβ-ガラクトシダーゼDNAの断片3kb
をpcDNA3ベクター(INVITROGENE)のEcoRV部位に連結し
た。そして、ライゲーション混合物を大腸菌DH5α菌株
に形質導入した。β-ガラクトシダーゼ遺伝子を有する
プラスミドを含む青色のクローンをX-gal/Amp LB寒天平
板から選択した。
クローニング及びEmrp-β-ガラクトシダーゼDNA断片 CCRC(台湾、新竹)より入手したプラスミドpVA838をPC
Rによる(EmrP)DNA断片のクローニング用の鋳型として
使用した。PCR増幅は、0.075ユニットのPfu Turbo(商
標) DNAポリメラーゼ(STRATAGENE(登録商標), La Joll
a, CA)と、それぞれ1μMのフォワードプライマー(5'-
TTAACGATCGTTAGAAGCAAACTTAAGAGTG-3'(配列番号:
5))及びリバースプライマー(5'-TTAACGATCGATGTAAT
CACTCCTTCT-3'(配列番号:6))とからなる。PCRは、
(i)95℃を5分間、(ii)94℃を30秒間、50℃を30秒
間、72℃を3分間、を30回繰り返す、(iii)72℃を10分
間、(iv)4℃に維持する、の4段階で行った。増幅した
DNA生成物を1%アガロース電気泳動法及び臭化エチジウ
ム染色により評価した後、フェノール/クロロホルム抽
出による精製及びエタノール沈殿を行った。精製した12
0bpのEmrP DNA断片をpCRIIベクター(INVITROGENE)に
連結した。pCRII/EmrPプラスミドを有するこれらのクロ
ーンを、X-gal/Amp LB寒天平板から白色コロニーとして
選択し、さらにPCR及び制限酵素解析により調べた。
スミドプレップキット(GFX micro plasmid Prep kit)
(Amersham Pharmacia Biotech)で精製し、BamHIで線
形化してT4 DNAポリメラーゼを用いて末端を平滑化し
た。プラスミドpCRII/EmrP-β-ガラクトシダーゼを構築
するために、β-ガラクトシダーゼDNA断片をPCRによっ
てpcDNA3/β-ガラクトシダーゼプラスミドから増幅し、
線形化したpcRII/EmrPの平滑末端に連結した。pcRII/Em
rP-β-ガラクトシダーゼプラスミドを有するこれらのク
ローンを、X-gal/Amp LB寒天平板から青色コロニーとし
て選択し、さらにPCR及び制限酵素解析により調べた
(図2参照)。
の5'末端をリン酸化した後、DNA断片をGENECLEANIIIキ
ット(Bio 101, La Jolla, CA)により精製し、プラス
ミドpCLP1及びpCLP2のNruI部位に連結してプラスミドpC
LP3-6(図3参照)を得た。このライゲーション混合物を
エレクトロポレーションにより大腸菌JM109菌株に形質
導入した。EmrP-β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラ
スミドを有するこれらのクローンを、X-gal/Amp LB寒天
平板から青色コロニーとして選択し、さらにPCR及び制
限酵素解析により調べた。
ピシリン耐性遺伝子を削除するために、この2つのプラ
スミドをBspHIで消化した。大きいDNA断片のゲル溶出に
よってアンピシリン耐性遺伝子を含むDNA断片1kbを除去
した。精製されたDNA断片をさらにライゲーションし、
大腸菌JM109菌株に形質導入した。プラスミドを有する
これらのクローンを、Amp/LB寒天平板ではなく、L-M9寒
天平板(Na2HPO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 5g/L、NH4C
l 1g/L、2mM MgSO4、ラクトース0.1%、0.1mMCaCl2、2m
M プロリン、及び50μM チアミンを含む)上で増殖させ
ることにより選択し、さらにPCR及び制限酵素解析によ
り調べた(図4参照)。
製するため、ラクトバチルスカゼイ(亜種カゼイ)(実
施例1)からの一夜培養したLac-突然変異体宿主菌株1ml
を、グリシン1.25%を含むMRSブイヨン50mlに接種し、3
7℃で3時間インキュベートした。この細胞を遠心分離し
て沈殿させ、氷冷したポレーション(poration)/貯蔵
緩衝液(スクロース0.5M及びグリセロール10%)で4回
洗浄し、氷冷したポレーション/貯蔵緩衝液0.5ml中に再
懸濁した。このプラスミドDNAをQIAプレップ・ミニプレ
ア・キット(QIAprep miniprer Kit)(QIAGEN)で精製
した。使い捨てキュベット(STRATAGENE(登録商標);電
極間距離0.2cm)中でプラスミドDNA1μgとコンピテント
細胞100μlとを混合した。2500V(600Ω、25μF)の単
一パルスをこのDNA細胞混合液に与えた。パルスに従っ
て、細胞懸濁液を直接MRSブイヨン0.4mlで希釈し、37℃
で1.5時間インキュベートすることにより、β-ガラクト
シダーゼ遺伝子を発現させた。L-MRS寒天平板上に細胞
懸濁液の希釈液100μlをプレーティングすることによ
り、形質転換体を選択した。形質転換体の化学式は、デ
キストロースがラクトース2%に代替すること以外は、M
RSと同一である。
より形成された5'-突出末端の配列は同一であるため、
線形化乳酸菌プラスミド(LP)はpCLP0に2方向に挿入さ
れる。その結果、PCR増幅及び制限酵素解析により異な
るプラスミドが得られる。そのうち、RepA遺伝子とCMV
プロモーターとの方向が同じプラスミドをpCLP1と称す
る。これに対して、RepA遺伝子とCMVプロモーターとの
方向が異なるプラスミドをpCLP2と称する。pCLP1とpCLP
2とは共に大腸菌中で何代も複製することができ、その
制限酵素地図は変わらないため、乳酸菌プラスミドが大
腸菌プラスミド(pCLP0)に挿入された後、大腸菌内の
組換えシャトルベクターの複製数及び安定性に影響しな
い。
プラスミドが、染色体中に欠陥性β-ガラクトシダーゼ
遺伝子を有する細菌へ形質転換される場合、選択培地
(唯一の炭素源としてグルコースではなくラクトースを
含む)上で生存し、複製するために、細菌はβ-ガラク
トシダーゼ等の選択マーカー遺伝子の生成物を過度に発
現し、必要な元素を代謝する必要がある。このため、強
力な転写プロモーターであるEmrPが本発明のシャトルベ
クター内で用いられる。図3を参照すると、EmrP-β-ガ
ラクトシダーゼの構築後、DNA断片をプラスミドpCLP1及
びpCLP2に挿入する。平滑末端のライゲーションによ
り、EmrP-β-ガラクトシダーゼのDNA断片が2方向に挿入
される。PCR増幅及び制限酵素解析により4種の異なるプ
ラスミドが得られ、それぞれpCLP3、pCLP4、pCLP5、pCL
P6と称する。それから、これらのプラスミドの継代培養
が何代も行われる。そのうち、pCLP4及びpCLP6の複製
数、及びこの2つのプラスミドにより形質転換された宿
主細胞の増殖は有意に減少する。このことにより、プラ
スミドpCLP4及びpCLP6が構造的に不安定であるのに対
し、pCLP3及びpCLP5は比較的安定していると推測され
る。
遺伝子を有するプラスミドを構築するため、pCLP3及びp
CLP5のアンピシリン耐性遺伝子を欠失させ、プラスミド
pCLP7及びpCLP8を得る(図4参照)。細菌は、大腸菌に
形質転換した後、ラクトースが唯一の炭素源である培地
で十分に増殖することができる。また、制限酵素地図解
析によると、継代培養の後、pCLP7及びpCLP8の構造が安
定していることが示されている。このため、シャトルベ
クターpCLP7及びpCLP8の安定性により、それらを遺伝子
操作の際に適用することができる。pCLP7のヌクレオチ
ド配列は図5〜11(配列番号:1)に示されており、pCLP
8のヌクレオチド配列は図12〜18(配列番号:2)に示さ
れている。さらに、原ベクターであるpCLP7及びpCLP8の
制限酵素地図は図19Aに示されており、そのうち、レー
ン1はDNAマーカー(Gene Ruler(商標) 1kb Ladder, MB
I)であり、レーン2、3は未処理のベクターであり、そ
れぞれレーン3、7はXbaIで、レーン4、8はEcoRIで、レ
ーン5、9はHindIIIで処理したベクターであり、レーン1
0は別のDNAマーカー(Gene Ruler(商標) 100bp Ladder,
MBI)である。レーン2〜5はベクターpCLP7であり、レ
ーン6〜9はベクターpCLP8である。
びpCLP8がLac-突然変異株Ana-1(欠陥性β-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を有する)へと形質転換されると、細菌株
は選択培地中で十分増殖する。さらに、制限酵素地図解
析もまた、pCLP7及びpCLP8の構造は、100代の継代培養
後、安定していることを示している。図19Bは、100代の
継代培養後のベクターの制限酵素地図を示しており、そ
のうちレーン1はDNAマーカー(Gene Ruler(商標) 100bp
Ladder, MBI)であり、レーン2は別のDNAマーカー(Ge
ne Ruler(商標) 1kb Ladder, MBI)であり、レーン3、7
は未処理のベクターであり、それぞれレーン4、8はXbaI
で、レーン5、9はEcoRIで、レーン6、10はHindIIIで処
理したベクターである。レーン3〜6はベクターpCLP7で
あり、レーン7〜10はベクターpCLP8である。
体的に示し説明してきたが、様々な変更がその形式およ
び詳細において可能であり、それらは本発明の精神およ
び範囲を逸脱しないことが当業者には理解されると思わ
れる。
を調節し、大腸菌複製起源配列を含む領域と、(b)少
なくとも一つの真核細胞遺伝子の転写プロモーター配
列、異種遺伝子が挿入されるマルチクローニングサイ
ト、及び転写終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセッ
トと、(c)複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミドの
複製に関連するタンパク質をコードする核酸配列とを含
む乳酸菌プラスミド配列と、(d)非抗生物質耐性選択
遺伝子及びそのプロモーター配列とを少なくとも含有す
る、乳酸菌シャトルベクターが提供される。この乳酸菌
シャトルベクターは選択マーカーとしての非抗生物質耐
性遺伝子を特徴とし、薬剤や食品に利用することができ
る。
す図である。
す図である。
7(配列番号:1)のヌクレオチド配列を示す図であり、
図5はそのうち1位〜1200位までを示す図である。
pCLP7(配列番号:1)のヌクレオチド配列の1201位〜24
00位までを示す図である。
ベクターpCLP7(配列番号:1)のヌクレオチド配列の24
01位〜3600位までを示す図である。
ターpCLP7(配列番号:1)のヌクレオチド配列の3601位
〜4800位までを示す図である。
ターpCLP7(配列番号:1)のヌクレオチド配列の4801位
〜6000位までを示す図である。
クターpCLP7(配列番号:1)のヌクレオチド配列の6001
位〜7200位までを示す図である。
ベクターpCLP7(配列番号:1)のヌクレオチド配列の72
01位〜8115位までを示す図である。
pCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配列を示す図であ
り、図12はそのうち1位〜1200位までを示す図であ
る。
ターpCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配列の1201位
〜2400位までを示す図である。
ャトルベクターpCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配
列の2401位〜3600位までを示す図である。
ルベクターpCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配列の
3601位〜4800位までを示す図である。
ルベクターpCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配列の
4801位〜6000位までを示す図である。
ルベクターpCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配列の
6001位〜7200位までを示す図である。
ルベクターpCLP8(配列番号:2)のヌクレオチド配列の
7201位〜8115位までを示す図である。
示す図である。
Claims (14)
- 【請求項1】 (a)プラスミド複製数を調節し、大腸
菌複製起源配列を含む領域と、 (b)真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列、異種遺
伝子が挿入されるマルチクローニングサイト、及び転写
終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセットと、 (c)複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミドの複製に
関連するタンパク質をコード化する核酸配列とを含む乳
酸菌プラスミド配列と、 (d)非抗生物質耐性選択遺伝子及びそのプロモーター
配列とを有する乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項2】 前記真核細胞遺伝子の転写プロモーター
は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであ
る、請求項1に記載の乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項3】 前記乳酸菌プラスミド配列は、ラクトバ
チルスプランタルムから単離した2.1kbのプラスミドで
ある、請求項1に記載の乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項4】 前記乳酸菌プラスミドの複製に関連する
前記タンパク質は、317のアミノ酸を含むRepAタンパク
質である、請求項3に記載の乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項5】 前記非抗生物質耐性選択遺伝子はβ-ガ
ラクトシダーゼ遺伝子である、請求項1に記載の乳酸菌
シャトルベクター。 - 【請求項6】 前記β-ガラクトシダーゼ遺伝子の前記
プロモーターは、エリスロマイシン耐性遺伝子プロモー
ターである、請求項5に記載の乳酸菌シャトルベクタ
ー。 - 【請求項7】 配列番号:1で示される前記ヌクレオチ
ド配列もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はそ
の縮退変異体を含む、請求項1に記載の乳酸菌シャトル
ベクター。 - 【請求項8】 配列番号:2で示される前記ヌクレオチ
ド配列もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はそ
の縮退変異体を含む、請求項1に記載の乳酸菌シャトル
ベクター。 - 【請求項9】 (a)pCLP7(図3における制限酵素部位
の配位を有する。ATCC受入番号PTA-2661)と、 (b)pCLP8(図3における制限酵素部位の配位を有す
る。ATCC受入番号PTA-2663)とからなる群より選ばれ
る、請求項1に記載の乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項10】 形質転換する宿主細胞がグラム陽性菌
であり、前記宿主細胞の内因性β-ガラクトシダーゼ遺
伝子が正常な酵素機能を生じることができない、請求項
1に記載の乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項11】 前記宿主細胞が、Ana-1(Lac-突然変
異体)(ATCC受入番号PTA-2662)と称するラクトバチル
スカゼイ(亜種カゼイ)の突然変異体である、請求項10
に記載の乳酸菌シャトルベクター。 - 【請求項12】 (a)請求項1に記載の乳酸菌シャトル
ベクターと、 (b)内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子が正常な酵素機
能を生じることができない宿主細胞と、 (c)真核細胞遺伝子とを含む、異種遺伝子発現用キッ
ト。 - 【請求項13】 請求項1に記載の乳酸菌シャトルベク
ターを含むDNAワクチンキャリア。 - 【請求項14】 (i)前記宿主細胞に、請求項1に記載
の乳酸菌シャトルベクターを導入する工程と(そのう
ち、前記宿主細胞の内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子
は正常な酵素機能を生じることができない)、 (ii)工程(i)で形質転換した前記宿主細胞を、ラク
トースが唯一の炭素源である条件下で培養する工程とを
含む、ベクターを含有する宿主細胞の選択方法。
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