CN108486143B - 一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用 - Google Patents
一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于真菌RNA干涉载体构建技术领域，具体涉及一种真菌RNA干涉载体pBHt2‑CHSA Intron、构建方法及应用。所述载体pBHt2‑CHSA Intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该载体是在已有真菌表达载体pBHt2‑eGFP的基础上，引入了植物RNA干涉载体pFGC5941质粒的茶尔酮合成酶基因内含子序列CHSA Intron构建而成。新载体pBHt2‑CHSA Intron转化进真菌细胞内可产生靶基因的双链RNA结构，从而对靶基因转录形成的mRNA进行切割，导致靶基因沉默现象，能用于小麦全蚀病菌等真菌的基因沉默研究。
Description
技术领域
本发明属于真菌RNA干涉载体构建技术领域，具体涉及一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用。
背景技术
RNA干涉(RNAi)是由特异双链RNA(dsRNA)引发的能序列特异性降解目的基因信使RNA(mRNA)的基因沉默机制，是基因的一种转录后沉默机制。对研究目的基因的功能和利用特定基因沉默来防治植物病虫害具有重要意义。真菌病害，如小麦白粉病，全蚀病，赤霉病等是许多植物最重要的病害，以RNA沉默为核心的寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)为防治真菌病害提供了崭新的途径。
RNA干涉载体是研究RNA干涉的重要工具，为方便真菌基因功能验证和寄主诱导基因沉默技术的应用。pBHt2-eGFP(闭合环状，总长9851bp,图1所示)含有真菌色氨酸合成操纵子中编码吲哚甘油磷酸合酶的基因(trpC)的启动子，是真菌最常用的转化载体之一，但不能转录形成双链RNA，不能用于真菌类RNA干涉研究。质粒pFGC5941(图2所示)启动子为花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S)，且含有茶尔酮合成酶基因内含子序列(CHSAIntron)，是常用的植物RNA干涉载体。但由于CaMV 35S启动子不能在真菌中表达，质粒pFGC5941不能用做真菌RNA干涉载体。基于上述原因，目前缺乏一种能够用于诱导小麦全蚀病菌等真菌基因沉默研究的载体。
发明内容
本发明提供的一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用，新载体pBHt2-CHSA Intron转化进真菌细胞内可产生靶基因的双链RNA结构，从而对靶基因转录形成的mRNA进行切割，导致靶基因沉默现象，能用于小麦全蚀病菌及其它真菌的基因沉默研究。
本发明的第一个目的是提供一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，所述载体pBHt2-CHSA Intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron的构建方法，包括以下步骤：
S1，去除pBHt2质粒的eGFP序列，构建pBHt2线性载体
S11，pBHt2-eGFP载体用BsrG1和SacI双酶切，切除9782-710bp位置的DNA片段，切除的DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,凝胶回收余下9072bp的酶切片段；
S12，人工合成一段如SEQ ID NO.3所示的序列；
S13，人工合成的SEQ ID NO.3所示片段用SacI酶切，凝胶回收75bp的SacI酶切片段；将9072bp的酶切片段与75bp的SacI酶切片段用T4DNA连接酶连接；连接后的质粒跑凝胶电泳回收，得到大小为9147bp的pBHt2线性载体；
S2，制备CHSA-Intron及两翼多克隆位点序列
pFGC5941质粒用NcoI和SmaI进行双酶切，其中NcoI酶切产生5’粘性末端，SmaI酶切产生平末端；凝胶回收1421bp的CHSA-Intron线性片段；
S3，连接pBHt2线性载体与CHSA-Intron线性片段
将S13回收的pBHt2线性载体用NcoI酶切，然后与S2回收的CHSA-Intron线性片段用T4DNA ligase连接；连接产物跑凝胶电泳，回收产物用连接酶进行平末端连接；连接产物跑胶纯化，回收重组质粒，即新载体候选质粒；新载体候选质粒经克隆鉴定，片段大小正确的为真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron在小麦全蚀菌龙胆酸加双氧酶基因RNAi效应分析中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用，具有以下有益效果：
我们在已有真菌表达载体pBHt2-eGFP的基础上，引入了植物RNA干涉载体pFGC5941质粒的茶尔酮合成酶基因内含子序列CHSA Intron，构建了真菌专用的RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron。该载体用CHSA Intron取代了pBHt2-eGFP载体的eGFP(绿色荧光蛋白基因)序列。真菌靶基因反向插入CHSA Intron两翼，构建“正向靶基因CHSA Intron-反向靶基因”的真菌RNA干涉载体“pBHt2-CHSA Intron-靶基因”，新载体pBHt2-CHSA Intron转化进真菌细胞内可产生靶基因的双链RNA结构，从而对靶基因转录形成的mRNA进行切割，导致靶基因沉默现象。一旦发现靶基因沉默可导致真菌侵染植物能力丧失或下降，可以把“正向靶基因CHSA Intron-反向靶基因”序列从干涉载体“pBHt2-CHSA Intron-靶基因”中用双酶切切除，转移到植物RNA干涉载体pFGC5941上，进行寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)研究及应用。
目前，该载体已经用于小麦全蚀病菌的基因沉默研究。我们将小麦全蚀病菌的龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)片段连接进真菌专用的RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，构建了pBHt2-CHSA Intron-Gdo重组质粒，导入小麦全蚀病菌后产生的转化子菌丝生长速度只有野生菌丝的1/3左右，从而证明了龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)的干涉可以严重影响全蚀病菌的生长发育，该基因可以作为利用寄主诱导的基因沉默技术防治全蚀病危害的靶基因。
附图说明
图1为pBHt2-eGFP质粒示意图；
图2为pFGC941质粒示意图；
图3为pFGC5941质粒酶切后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；
其中1-4号泳道均为NcoI、SmaI酶切结果，M泳道为marker，C泳道为未酶切质粒，W泳道为空白对照；
图4为pBHt2-CHSA-Intron质粒酶切后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；
其中1号泳道均为EcoRI、XbaI酶切结果，M泳道为marker，C泳道为未酶切质粒，W泳道为空白对照；
图5为pBHt2-CHSA–Intron的质粒图；
图6为全蚀病菌cDNA的扩增结果
其中1号泳道为Gdo片段，M泳道为marker；
图7为不同小麦全蚀病菌的平板培养图；
其中的图7A和图7C均为用作对照的野生型全蚀病菌，图7B为M5转化子菌，图7D为M6转化子菌。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，所述载体pBHt2-CHSAIntron的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，载体pBHt2-CHSA Intron的长度为10567bp，只保留了原来pBHt2-eGFP载体中的eGFP的10个碱基GTACAAGTAA(pBHt2-eGFP载体的第1到第10位)；且插入了来自植物RNA沉默载体PFGC5941的大小为1426bp的内含子CHSA-Intron及其多克隆位点(PFGC5941的第9142到第10567位)。
所述真菌RNA干涉载体载体pBHt2-CHSA Intron的主要位点作用解释如下：
(1)1-10bp：绿色荧光蛋白(eGFP)残留序列；
(2)11-273bp：粗糙链孢菌β微管蛋白终止子；
(3)4990-5270bp：pBR322质粒的复制起始点；
(4)5561-6355bp：抗卡那霉素基因(NptII)；
(5)7087-8112bp：潮霉素磷酸转移酶hptII；
(6)8119-8466bp：真菌色氨酸合成操纵子中编码吲哚甘油磷酸合酶的基因(TrpC)的启动子；
(7)8774-9141bp：玉米叶枯病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子；
(8)9142-10567bp：茶尔酮合成酶基因(CHSA)内含子；
(9)多克隆位点：9142-9173bp：限制性内切酶NocI，AscI，SwaI的识别位点区域；10429-10567bp：限制性内切酶BamH1，XbaI，PacI，SmaI的识别位点区域；
(10)T-DNA边界左边界：6625-6650bp；右边界：520-546bp。
基于同一种发明构思，所述的真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron的构建方法，将植物RNAi载体pFGC5941质粒的内含子序列(CHSA Intron)及其临近多克隆位点切除，插入真菌转化载体pBHt2-eGFP中取代eGFP区段，构建成一个新的真菌RNAi载体(pBHt2-CHSAIntron)，具体包括以下步骤：
S1，去除pBHt2质粒(闭合环状，总长9851bp)的eGFP序列，构建pBHt2线性载体
S11，pBHt2-eGFP载体用BsrG1和SacI双酶切，切除9782-710bp位置(9782-9851bp和1-710bp位置)的DNA片段(总计779bp)，切除的779bp的DNA片段核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，如下；
AGCTCAGCCCGATTTCCATTCCTCAATTCAAGTCTATTAACTCTCTCAAAGAGGAACCCAATCTTCAA AATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGgTCGAGCTGGACGGCGACGTaAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCT
其中下划线部分为玉米叶枯病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gpd)被切除序列(69bp)，其余为绿色荧光蛋白(eGFP)基因部分序列(710bp)。黑色斜粗体加下划线部分是SacI酶切末端，黑色黑体是BsrG1酶切末端。结果eGFP被切除710bp，在质粒上余留10bp，而gpd基因启动子被切除69bp，原来9851bp的pBHt2-eGFP质粒余下9072bp，凝胶回收该余下的9072bp酶切片段。
S12，人工合成一段如SEQ ID NO.3所示的76bp序列，如下：
GAGCTCAGCCCGATTTCCATTCCTCAATTCAAGTCTATTAACTCTCTCAAAGAGGAACCCAATCTTCAA ACCATGG
其中下划线部分为被SacI酶切除的玉米叶枯病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)序列；并引进了NocI酶切位点(CCATGG)和SacI酶切位点(GAGCTC)。该段人工序列的目的是补回pBHt2-eGFP质粒上被切除的69bp的gpd基因启动子部分序列。
S13，人工合成的SEQ ID NO.3所示片段用SacI酶切，凝胶回收75bp的SacI酶切片段；将质粒9072bp的酶切片段与75bp的SacI酶切片段用T4DNA连接酶连接；连接后的质粒跑凝胶电泳回收，得到包含完整玉米叶枯病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)序列，大小为9147bp的pBHt2线性载体。
S2，制备CHSA-Intron及两翼多克隆位点序列
pFGC5941质粒用NcoI和SmaI进行双酶切，其中NcoI酶切产生5’粘性末端，SmaI酶切产生平末端；凝胶回收1421bp的CHSA-Intron线性片段；pFGC5941质粒经酶切后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图3所示，其中1-4号泳道均为NcoI、SmaI酶切结果，W泳道为marker，C泳道为未酶切质粒，白色箭头为CHSA Intron片段，大小在1421bp位置，符合序列长度。
S3，连接pBHt2线性载体与CHSA-Intron线性片段
将S13回收的pBHt2线性载体(9147bp)用NcoI酶切，然后与S2回收的CHSA-Intron线性片段(1421bp)用T4DNA ligase连接；连接产物跑凝胶电泳，回收产物用Takara DNABlunting Kit(T4DNA ligase)自带的连接酶进行平末端连接；连接产物跑胶纯化，回收10567bp重组质粒，即pBHt2-CHSA Intron新载体候选质粒。
pBHt2-CHSA Intron新载体候选质粒经克隆鉴定，片段大小正确的为真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，具体步骤如下：直接转化E.coli，涂平板，挑取阳性克隆；阳性克隆液体培养，摇菌，提取质粒；质粒PCR检测，阳性质粒提交测序验证，得到正确的载体pBHt2-CHSA–Intron，pBHt2-CHSA-Intron质粒酶切后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图4所示，质粒经EcoRI和XbaI酶切后产生1849bp大小的片段，片段大小正确。pBHt2-CHSA–Intron的质粒图谱如图5所示。
需要说明的是，在所述的真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron的构建方法中，酶切体系相同，均采用如下体系：质粒4μL、内切酶1μL、10×buffer 2μL；ddH2O补足20μL，如果是两个内切酶，则每个内切酶均取1μL；连接反应的条件为：将需要连接的两个片段序列与连接缓冲液混合，然后16℃水浴过夜。
基于同一种发明构思，本发明还提供了一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron在小麦全蚀菌龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)RNAi效应分析中的应用，以全蚀病菌cDNA为模板，带有特定接头的引物扩增目的基因片段，所述引物序列如下：
5'引物序列：
5'-CAAACCATGGGGCGCGCCATGCTGGTGAACCCATCTCG-3'，如SEQ ID NO.4所示，
3'引物序列：
5'-AAATTCTTACACATTTAAATAGGTAGGGCAGAGTGGCATA-3'，如SEQ ID NO.5所示；
PCR扩增出500bp的Gdo片段，全蚀病菌cDNA的扩增结果如图6所示，其中1号泳道为Gdo片段，M泳道为marker。将上述pBHt2-CHSA-Intron质粒经过酶AscI和SwaI双酶切线性化后通过无缝连接方法将Gdo片段连接到CHSA Intron的上游；然后用BamHI/XbaI双酶切载体，将Gdo片段反向连接，最终把小麦全蚀病龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)序列相同的两段片段接入新建干扰载体pBHt2-CHSA-Intron，构建了pBHt2-CHSA-Intron-Gdo载体，用农杆菌介导的方法将pBHt2-CHSA-Intron-Gdo载体转化病原菌，从转化后代筛选到M5和M6转化子。
在全蚀病菌PDA培养基上培养5天时，M5和M6转化子菌丝生长明显放慢，直径只有1.25和1.45cm，而对照(野生型全蚀病菌)丝生长直径达到4.26cm，转化子菌丝生长直径只有对照的1/3左右，比对照有极显著差异(t＝0.037<0.5)，如图7所示，图7为不同小麦全蚀病菌的平板培养图，其中的图7A和图7C均为用作对照的野生型全蚀病菌，图7B为M5转化子菌，图7D为M6转化子菌。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 河南农业大学生命科学学院
<120> 一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10567
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtacaagtaa atcattccac tcaacattca ggctcctctg cgcacgtaaa gtgccaaagg 60
caataccctg ctcggtggaa tgccgccggg cttgtcgatt ttacgcacat atgcgcattc 120
ttgacttgaa gcggaggagt tcttcgttgc gggttacagt gttttaataa aagaatggtc 180
aaatcaaact gctagatata cctgtcagac actctagttg ttgaccccta tactcttaat 240
acatcagaca gtacatgcat gttgcatgat gataagcttg gcactggccg tcgttttaca 300
acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 360
tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 420
cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg tttcccgcct 480
tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag 540
cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt 600
gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc 660
cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg 720
tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt 780
gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc 840
atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag 900
gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag 960
aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc 1020
cctggcgacg ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta 1080
ctggacattg ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg 1140
tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc 1200
gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc 1260
cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc 1320
gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat 1380
cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg 1440
cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag 1500
aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt 1560
tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg 1620
cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg 1680
cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat 1740
gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa 1800
ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg 1860
gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga 1920
tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga 1980
agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc 2040
catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt 2100
gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat 2160
atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag 2220
gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt 2280
tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt 2340
gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga 2400
cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa 2460
tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca 2520
cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc 2580
aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc 2640
aagaccatta ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa 2700
tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca 2760
accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt 2820
aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc 2880
ggcgtgacgg tcgcaaacca tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc 2940
tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac 3000
gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc 3060
cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt 3120
tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg 3180
ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag 3240
acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc 3300
tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg 3360
gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc 3420
gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca 3480
cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg 3540
agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt 3600
acatcgagat cgagctagct gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg 3660
acgtgctgac ggttcacccc gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct 3720
accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct 3780
acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga 3840
tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga 3900
tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta 3960
cggagcagat gctagggcaa attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctctttc 4020
ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca 4080
ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag 4140
agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc 4200
gcctggcctg tgcataactg tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta 4260
cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg 4320
gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc 4380
cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat 4440
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 4500
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 4560
gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 4620
cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 4680
ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 4740
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 4800
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 4860
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 4920
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 4980
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 5040
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 5100
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 5160
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 5220
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 5280
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 5340
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 5400
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 5460
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 5520
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta 5580
aaatataata ttttattttc tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct 5640
cgacatactg ttcttccccg atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat 5700
accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt 5760
tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct 5820
tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc 5880
agttttcgca atccacatcg gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc 5940
ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga 6000
tgcactccgc atacagctcg ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg 6060
agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa 6120
agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc 6180
gttccacatc ataggtggtc cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt 6240
cattttctcc caccagctta tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc 6300
agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt 6360
atttccttcc tcttttctac agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac 6420
gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc 6480
aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg 6540
gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat 6600
catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg 6660
agcaaagtct gccgccttac aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg 6720
cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt 6780
ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg 6840
acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa ttaattcggg ggatctggat tttagtactg 6900
gattttggtt ttaggaatta gaaattttat tgatagaagt attttacaaa tacaaataca 6960
tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc 7020
ttatctggga actactcaca cattattatg gagaaactcg aaactggttc ccggtcggca 7080
tctactctat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag 7140
tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc 7200
gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc 7260
atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata 7320
cgcccggagg cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg 7380
ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaggatg ttggcgacct cgtattggga 7440
atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag 7500
gacattgttg gagccgaaat ccgcatgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc 7560
ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac 7620
agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt 7680
gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc 7740
cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctggaga acagcgggca gttcggtttc 7800
aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc 7860
gctgaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg 7920
ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc 7980
acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag 8040
gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc 8100
aggctttttc atttggatgc ttgggtagaa taggtaagtc agattgaatc tgaaataaag 8160
ggaggaaggg cgaacttaag aaggtatgac cgggtcgtcc acttaccttg cttgacaaac 8220
gcaccaagtt atcgtgcacc aagcagcaga tgataataat gtcctcgttc ctgtctgcta 8280
ataagagtca cacttcgagc gccgccgcta ctgctacaag tggggctgat ctgaccagtt 8340
gcctaaatga accatcttgt caaacgacac aaattttgtg ctcaccgcct ggacgactaa 8400
accaaaatag gcattcattg ttgacctcca ctagctccag ccaagcccaa aaaatgctcc 8460
ttcaatatca gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 8520
gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 8580
caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 8640
tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 8700
tgacatgatt acgaattcga attgggtact caaattggtt cccgcttgac gacattccga 8760
aacccccaat ttcgcggctt cgaatcgtgg ctacccttgg ccgaggttgc gatttctctg 8820
ccgtatctga caatgatcca accggccgga tgtgtgggag ggcgcaaagg gtgtaattgg 8880
gtctaggcgt gagctgcatg tccgatggca gaaaaagaac tactaaaact ctgtgacgtc 8940
ctcagggctg gtagctattt agcttgcccc tccctcaccc cacctagctc aaacccaaca 9000
aaacacagca ccgaccacaa aaatctgcct cttaccacct gctcatcacc ttttctcaca 9060
tataaagcag tgagctcagc ccgatttcca ttcctcaatt caagtctatt aactctctca 9120
aagaggaacc caatcttcaa acatggggcg cgcccaatcg atgatttaaa tgtgtaagaa 9180
tttcttatgt tacattatta cattcaacgt tttatcttaa ttggctcttc atttgattga 9240
aatttgacaa ttatttcttg tttttttttt tgtcacactc tttttgggtt ggggtggccg 9300
acgaattgtg ggaaggtaga aagaggggag gacttttgtt atactccatt agtaattact 9360
gtttccgttt caatttatgt gacaatattt cctttttagt cggttccaaa agaaaatgtc 9420
agcattataa acaatttaat tttgaaatta caattttgcc attaataaaa tgatttacaa 9480
ccacaaaagt atctatgagc ctgtttgggt gggcttataa gcagcttatt ttaagtggct 9540
tataagtcaa aaagtgacan tttttgagaa gttagaaaat cctaacttct caaaaagtag 9600
cttttaagcc acttatgact tataagtcca aaaattttta agttaccaaa catatattaa 9660
tgggtttata agcttataag ccacttttaa gctcacccaa acgggttcta tgtctcactt 9720
tagactacaa attttaaaag tcttcattta tttcttaatc tccgtggcga gtnaaactat 9780
aacacataaa gtgaaacgga gggaataaga tggagtcata aactaatcca aatctatact 9840
ctctccgtta atttgttttt tagtttgatt tggtacatta ataaaacaga tttttcgaag 9900
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aattcgtgtg tttctagcta gtacttgatg ttatctttaa ccttttagta attttttgtc 10020
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agttgtccaa atgctttgaa attagaaatc tttaatccct tatttttttt taaaatgttt 10260
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atcttttttg gtcaatttgc aggtatttgg atcctaggtg agtctagaga gttaattaag 10560
acccggg 10567
<210> 2
<211> 779
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agctcagccc gatttccatt cctcaattca agtctattaa ctctctcaaa gaggaaccca 60
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gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 180
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tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 300
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cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 600
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cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagct 779
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagctcagcc cgatttccat tcctcaattc aagtctatta actctctcaa agaggaaccc 60
aatcttcaaa ccatgg 76
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<212> DNA
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<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaattcttac acatttaaat aggtagggca gagtggcata 40
Claims (1)
1.真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA-Intron-Gdo在小麦全蚀菌龙胆酸加双氧酶基因（Gdo）RNAi效应分析中的应用，其特征在于，所述载体能够抑制全蚀病菌的生长发育；
所述的真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA-Intron-Gdo的构建方法包括以下步骤：
S1，去除pBHt2质粒的eGFP序列，构建pBHt2线性载体
S11，pBHt2-eGFP载体用BsrG1和SacI双酶切，切除9782-710bp位置的DNA片段，切除的DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示, 凝胶回收余下9072bp的酶切片段；
S12，人工合成一段如SEQ ID NO. 3所示的序列；
S13，人工合成的SEQ ID NO. 3所示片段用SacI酶切，凝胶回收75bp的SacI酶切片段；将9072bp的酶切片段与75bp的SacI酶切片段用T4 DNA连接酶连接；连接后的质粒跑凝胶电泳回收，得到大小为9147bp的pBHt2线性载体；
S2，制备CHSA-Intron及两翼多克隆位点序列
pFGC5941质粒用NcoI和SmaI进行双酶切，其中NcoI酶切产生5’粘性末端，SmaI酶切产生平末端；凝胶回收1421 bp的CHSA-Intron线性片段；
S3，连接pBHt2线性载体与CHSA-Intron线性片段
将S13回收的pBHt2线性载体用NcoI酶切，然后与S2回收的CHSA-Intron线性片段用T4DNA ligase连接；连接产物跑凝胶电泳，回收产物用连接酶进行平末端连接；连接产物跑胶纯化，回收重组质粒，即新载体候选质粒；新载体候选质粒经克隆鉴定，片段大小正确的为真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，如SEQ ID NO. 1所示；
S4，构建pBHt2-CHSA-Intron-Gdo载体
以全蚀病菌cDNA为模板，用引物PCR扩增出龙胆酸加双氧酶基因（Gdo）片段，所述引物序列如下：
5'引物序列：
5'-CAAACCATGGGGCGCGCCATGCTGGTGAACCCATCTCG-3'，如SEQ ID NO. 4所示，
3'引物序列：
5'-AAATTCTTACACATTTAAATAGGTAGGGCAGAGTGGCATA-3'，如SEQ ID NO. 5所示；
将所述干扰载体pBHt2-CHSA-Intron经过酶AscI和SwaI双酶切线性化后，通过无缝连接方法将Gdo片段连接到CHSA Intron的上游；然后用BamHI／XbaI双酶切载体，将Gdo片段反向连接，最终把Gdo序列相同的两段片段接入干扰载体pBHt2-CHSA-Intron上，构建出pBHt2-CHSA-Intron-Gdo载体。
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