CN102762736B - 诱导型启动子在甲硫氨酸生产中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诱导型启动子在通过发酵进行的甲硫氨酸生产中的用途。本发明涉及用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法，其包括如下步骤：在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物，和从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，其中在所述经修饰的微生物中，涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。本发明还涉及在该方法中使用的经修饰的微生物。

Description

诱导型启动子在甲硫氨酸生产中的用途
发明领域
本发明涉及诱导型启动子在通过发酵进行的甲硫氨酸生产中的用途。
发明背景
含硫化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢是关键的，并且通过工业生产以用作食物或饲料添加剂和药剂。特别地，不能由动物合成的必需氨基酸甲硫氨酸在许多机体功能中起重要作用。除了其在蛋白质生物合成中的作用外，甲硫氨酸涉及转甲基作用以及硒和锌的生物利用度。甲硫氨酸还直接用作对于病症如变态反应和风湿热的治疗。然而，生产的大多数甲硫氨酸加入动物饲料中。
随着由于BSE和鸡流感造成的动物衍生的蛋白质的减少使用，关于纯甲硫氨酸的需求已经增加。在化学上，D,L-甲硫氨酸通常由丙烯醛、甲硫醇和氰化氢产生。然而，外消旋混合物不如纯L-甲硫氨酸一样表现良好，如例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson，C.L.,(1985)British Journal of Nutrition 54，621-633)。纯L-甲硫氨酸可以例如通过对N-乙酰-D,L-甲硫氨酸的酰基酶处理自外消旋甲硫氨酸产生，这急剧增加生产成本。对纯L-甲硫氨酸的渐增需求连同对环境的关注使甲硫氨酸的微生物生产变得有吸引力。
诱导型启动子在生物技术工艺中的使用是在化学生物合成领域中。这些启动子通常响应分别由丙酸盐(WO2007005837)、锌(WO2004020640)和阿拉伯糖(WO1998011231)或温度(Microbial conversion of glycerol to1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli.Tang X，Tan Y，ZhuH，Zhao K，Shen W.Appl Environ Microbiol.2009Mar；75(6):1628-34.)和光例示的化学或物理刺激。
甲硫氨酸生产依赖几个前体提供途径。有效的甲硫氨酸生产需要这些途径的细调。对于最大限度甲硫氨酸生产，能够在工艺过程中调整特定关键酶的表达可以是有利的。例如(i)特定酶的表达仅在生产阶段过程中是需要的，而在生物质生成过程中则不是，或反之亦然。其他酶仅在静止相中是有利的。因此，诱导型启动子的使用在改善在工业水平生产甲硫氨酸的总体得率方面可以是令人感兴趣的。
然而，由于甲硫氨酸代谢途径的复杂性和这些途径针对改善的甲硫氨酸生产的细调，从未考虑且报道诱导型启动子控制涉及甲硫氨酸生产的基因表达的用途。
本发明人目前已发现当用于调节涉及复杂代谢途径例如甲硫氨酸生物合成的基因的基因表达时，诱导型启动子可以是有利的。
发明概述
本发明涉及用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法，其包括如下步骤：
-在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物，和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，
其中在所述经修饰的微生物中，涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。
本发明还涉及经修饰用于改善的甲硫氨酸生产的微生物，其中涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。
在一个特定实施方案中，基因thrA、cysE和metA在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。
发明详述
本发明涉及用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法，其包括如下步骤：
●在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物，和
●从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，
其中在所述经修饰的微生物中，涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。
根据本发明，术语“发酵过程/工艺”、‘发酵’或‘培养’可互换使用，以指示在含有碳源、硫源和氮源的合适生长培养基上的细菌生长。
“合适的培养基”是适合于微生物的培养和生长的培养基。此类培养基是微生物发酵领域中众所周知的，取决于待培养的微生物。
术语“微生物”指示细菌、酵母或真菌。优选地，微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，微生物是菌种大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
术语“经修饰的微生物”是经修饰用于改善的甲硫氨酸生产的微生物，并且指示已经遗传修饰的微生物，目的是改善甲硫氨酸的生产得率。根据本发明，“改善的”或“改善”意指与相应未经修饰的微生物相比较，通过微生物生产的甲硫氨酸量，并且特别是甲硫氨酸得率(生产的甲硫氨酸/碳源的比)在经修饰的微生物中更高。通常的修饰包括通过转化和重组将基因的缺失引入微生物内、和用于表达异源基因的载体的引入。
在本发明的方法中使用的经修饰的微生物具有两种特征：
-它经修饰用于改善的甲硫氨酸生产，和
-涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在诱导型启动子的直接或间接控制下。
短语“从培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物”指示回收甲硫氨酸和可能的S-酰基甲硫氨酸和N-酰基甲硫氨酸化合物，例如N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸，和所有其他获得的衍生物的动作。
术语“诱导型启动子”指示其活性在外部刺激后可以是增加或减少的启动子。刺激可以在实质上是物理或化学的，例如温度、光、化学物质等。
靶基因的诱导可以经由刺激的直接或间接传递而获得。
当一种靶基因的表达在诱导型启动子的控制下时，实现直接传递。
间接传递可以是通过使用异源RNA聚合酶实现的，所述异源RNA聚合酶在诱导型启动子的控制下，并且识别驱动涉及甲硫氨酸生物合成的靶基因表达的特异性启动子。在这种情况下，诱导型启动子不与靶基因的启动子直接连接，但驱动转录所述靶基因的启动子的RNA聚合酶的表达。
这些异源RNA聚合酶可以是例如T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶或本领域专家已知的其他聚合酶。
‘间接传递’还指一种特定基因的诱导性表达对其邻近基因的表达的‘极性效应’。“极性效应”指示基因中的遗传修饰对在所述经修饰的基因下游的一种或多种基因表达的影响。
在本发明的特定方面，涉及甲硫氨酸生产的特定基因的诱导可以导致所述特定基因下游基因的诱导。
短语“在异源诱导型启动子的控制下”指示诱导型启动子不是基因的天然启动子且以至少部分控制与之可操作地连接的基因表达水平的方式引入的事实。诱导型启动子的活性通过生物或非生物因子的存在或不存在诱导。基因的表达可以根据本领域技术人员的需要打开或关闭。这些启动子可以是化学调节的(在四环素、激素等的存在下)或物理调节的，特别是通过热或光调节的。
在本发明的特定实施方案中，涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在诱导型启动子的直接控制下。
在本发明的第一个方面，诱导型启动子是物理诱导型启动子，特别是温度诱导型启动子或光诱导型启动子。
启动子有利地是优选通过噬菌体λ经修饰的阻遏物调节的温度诱导型启动子、启动子PR或PR的衍生物、启动子PL或PL的衍生物(A genetic switch.Ptashne M.Blackwell Scientific，Cambridge，MA.1986；A genetic switch：Phagelambda revisited.Ptashne M.Cold Spring Harbor Lab Press.Cold SpringHarbor，NY.2004；The bacteriophages，Part II：Life of phages，8.Gene regulatorycircuitry of phageλ.Little J.第2版2004.Richard Calendar.编辑OxfordUniversity Press)、和通过温度敏感的Lac阻遏物调节的经修饰的lac启动子。
阻遏物通过结合启动子区中的特异性结合位点阻遏来自同源(cognate)启动子的表达，从而限制RNA聚合酶对启动子的接近且减少转录的起始或延伸。有利地，所述阻遏物是λ阻遏物等位基因cI857(On a thermosensitiverepression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage.Sussman R，Jacob F.C.R.Hebd.Seances Acad.Sci.1962，254，第1517页)或cIλ阻遏物的另一种温度敏感的等位基因。
在本发明的特定方面，在用于甲硫氨酸生产的经修饰的微生物中，编码recA的基因已被缺失。蛋白质RecA已知充当对于cI的蛋白酶。因此，编码RecA的基因的缺失排除λ阻遏物cI的蛋白水解。
温度诱导型启动子可以有利地选自启动子PR或衍生物、和启动子PL或衍生物。
在另一个实施方案中，温度诱导型启动子是由温度敏感的Lac阻遏物调节的经修饰的lac启动子。
在本发明的第二个方面，诱导型启动子是化学调节的。特别地，启动子活性的诱导与碳分解代谢产物的阻遏中的变化连接。由碳分解代谢产物阻遏激活的启动子是在低浓度的葡萄糖或在不存在葡萄糖的情况下经由激活物CRP正调节的。
有利地，诱导型启动子由碳源或糖醇的存在诱导。由碳源或糖醇诱导的启动子的例子分别包括阿拉伯糖或棉子糖启动子和甘露醇启动子或葡糖醇启动子。
根据本发明的特定方面，目的基因的表达是经由“间接传递”调节的，即涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因由其表达在诱导型启动子控制下的异源RNA聚合酶转录。
在本发明的特定实施方案中，异源RNA聚合酶选自T7、T3聚合酶。
根据本发明，涉及甲硫氨酸生产或其前体生产的至少一种基因在异源诱导型启动子的直接或间接控制下；如先前解释的，基因在诱导型启动子的直接控制下，或基因由诱导性RNA聚合酶转录或二者组合。
涉及微生物中的甲硫氨酸生产的基因是本领域已知的，并且包含涉及甲硫氨酸特异性生物合成途径的基因以及涉及前体提供途径的基因和涉及甲硫氨酸消耗途径的基因。
甲硫氨酸的有效生产要求甲硫氨酸特异性途径和几个前体提供途径的最佳化。甲硫氨酸生产菌株已在专利申请WO 2005/111202、WO 2007/077041、WO 2009/043803和WO 2009/043372中描述，并且作为参考文献引入本申请内。
对于其抑制剂SAM和甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的过表达高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因的甲硫氨酸生产菌株在专利申请WO 2005/111202中描述。这个申请还描述了这些等位基因与甲硫氨酸阻遏物MetJ(GenBank1790373)的缺失的组合，如专利申请JP 2000/157267中提出的，所述甲硫氨酸阻遏物MetJ负责甲硫氨酸调节子的下调。此外，两种修饰与天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的过表达的组合在专利申请WO 2005/111202中描述。
基因cysE、metH和metF的过表达已在WO 2007/077041中提出。
为了增加甲硫氨酸生产，涉及甲硫氨酸生产的至少一种下述基因可以在诱导型启动子的控制下。
a)涉及硫同化的基因的表达可以有利地在诱导型启动子或RNA聚合酶的控制下：
b)添补反应可以通过表达下述基因得到加强：
ppc    1790393    磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
pps    1787994    磷酸烯醇式丙酮酸合酶
pyc    CAB13359   丙酮酸羧化酶(例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis))
c)乙酸盐消耗反应可以过表达以下基因得到加强：
acs    1790505    乙酰-CoA合成酶
d)直接涉及甲硫氨酸生物合成的酶：
e)涉及天冬氨酸盐代谢的酶：
asd     1789841    天冬氨酸-半醛脱氢酶
aspC    1787159    天冬氨酸氨基转移酶
lysC    1790455    天冬氨酸激酶III
在本发明的优选实施方案中，至少一种基因thrA和/或cysE的表达在诱导型启动子的直接或间接控制下。
酶ThrA或任何其同源物(MetL、LysC)催化在天冬氨酸盐至高丝氨酸(甲硫氨酸的前体)的转化中的反应。酶CysE催化丝氨酸的O-乙酰化，以形成作为半胱氨酸的直接前体的O-乙酰-丝氨酸，其继而又充当用于甲硫氨酸生物合成的硫供体。
甲硫氨酸的生产可以进一步通过使用改变的metB等位基因增加，所述改变的metB等位基因优先地或专一地使用H2S且因此由O-琥珀酰-高丝氨酸生产高半胱氨酸，如引入本文作为参考的专利申请WO 2004/076659中描述的。
甲硫氨酸生产中的进一步增加可以通过减弱基因pykA、pykF和/或purU的表达而获得，如专利申请WO2009043803中描述的。这还可以是通过使用诱导型启动子直接或间接实现的。
本申请还描述了甲硫氨酸生产菌株，其中操纵子cysPUWAM、cysJIH和gcvTHP以及基因serA、serB、serC、lpd和glyA是过表达的。类似地，这可以是通过使用诱导型启动子直接或间接实现的。
降解甲硫氨酸的途径(参见下文列表)或脱离甲硫氨酸生产途径的基因的更多表达可以使用诱导型启动子直接或间接减弱。在这个背景下的减弱描述通过手段减少酶的细胞内活性，所述手段例如减少其表达、减少酶的稳定性、增加其降解和/或本领域专家已知的其他解决方案。这可以通过减少诱导型启动子的表达来完成，即消除诱导诱导型启动子的刺激或减少诱导性RNA聚合酶的表达。
在本发明的优选实施方案中，至少一种基因：thrA、cysE、metA的表达在诱导型启动子的直接或间接控制下。在另一个特定实施方案中，基因thrA、cysE和metA在诱导型启动子的直接或间接控制下。在本发明的优选实施方案中，thrA基因的表达在诱导型启动子的直接控制下，并且cysE基因的表达在thrA基因的诱导性表达的‘极性效应’下。在本发明的另一个优选实施方案中，thrA基因的表达在诱导型启动子的直接控制下，并且cysE和metA基因的表达在thrA基因的诱导性表达的‘极性效应’下。
在特定实施方案中，三种基因thrA、cysE和metA在相同诱导型启动子例如上文和实施例中公开的温度诱导型启动子的控制下。
在本发明中，“thrA基因”意指天然thrA基因或对于苏氨酸具有减少的反馈敏感性的thrA等位基因，例如WO2005/108561中描述的。根据本发明，“metA基因”意指天然metA基因或编码对于甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的酶的metA突变体等位基因，例如WO2005/108561中描述的。
由诱导型启动子控制的基因可以在染色体上的其天然位置处或整合到非天然位置处。由诱导型启动子控制的基因的一次或几次整合可能是最佳甲硫氨酸生产所需的。类似地，调节基因的一个或多个拷贝可能是最佳表达所需的。阻遏基因拷贝和启动子的不同比例可以用于细调表达。
在诱导型启动子控制下的基因优先整合到基因座内，其修饰对甲硫氨酸生产不具有负面影响。关于基因可以整合到其内的基因座的例子是：
在本发明的描述中，基因和蛋白质使用相应基因在大肠杆菌中的命名进行标识。然而，且除非另有说明，这些命名的使用根据本发明具有更一般的含义，且覆盖在其他生物中，更具体而言在微生物中的所有相应基因和蛋白质。
使用在GenBank中对于已知基因给出的参考，本领域技术人员能够测定在其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等价基因。这个常规工作使用共有序列有利地完成，所述共有序列可以通过下述进行测定：进行与衍生自其他微生物的基因的序列比对，并且设计简并探针以克隆另一种生物中的相应基因。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在Sambrook等人(1989 Molecular Cloning：a LaboratoryManual.第2版Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)中请求保护。
PFAM(比对和隐马尔可夫模型(hidden Markov models)的蛋白质家族数据库；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM使得能够显现多重比对，看见蛋白质结构域，评价在多种生物中的分布，获得对于其他数据库的访问，且显现已知蛋白质结构。
COGs(蛋白质的直向同源物组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自代表主要种系发生系的完全测序基因组的蛋白质序列获得。每个COG由至少3个系进行定义，其允许鉴定以前保守的结构域。
鉴定同源序列及其同源性百分比的方法是本领域技术人员众所周知的，并且特别包括BLAST程序，其可以由网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用，使用在那个网站上指示的缺省参数。获得的序列随后可以使用例如程序  CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)加以利用(例如比对)，使用在那个网站上指示的缺省参数。
用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法是本领域技术人员众所周知的。可以调整发酵工艺的不同因素用于工艺的最佳化，例如硫源、碳源和氮源的选择。
在本发明的优选方面，加入培养基中的用于L-甲硫氨酸的发酵生产的硫源是硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基二硫化物及其他甲基封端硫化物或不同来源的组合。
更优先地，在培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或其混合物。
根据本发明，术语‘碳源’指示可以由本领域技术人员使用以支持微生物的正常生长的任何碳的来源，其可以是己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、寡糖、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油及其组合。特别优选的碳源是葡萄糖。另一种优选的碳源是蔗糖。
在本发明的特定实施方案中，碳源衍生自可再生原料。可再生原料定义为特定工业工艺所需的原始材料，其可以在短暂延迟内再生并以足够量再生，以允许其转化成所需产物。
术语氮源对应于铵盐或氨气。
氮源以铵或氨的形式供应。
发酵一般在具有适合于待使用的微生物的合适培养基的发酵罐中进行，所述合适培养基含有至少一种简单碳源和需要时用于生产代谢产物的协同底物。
本领域技术人员能够限定用于根据本发明的微生物的培养条件。特别地，细菌在20℃-55℃之间的温度发酵，优先在25℃-40℃之间，并且更具体而言对于谷氨酸棒状杆菌约30℃和对于大肠杆菌约37℃。
作为用于大肠杆菌的已知培养基的例子，培养基可以具有与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或例如由Schaefer等人(1999，Anal.Biochem.270：88-96)定义的培养基相同或相似的组成。
作为用于谷氨酸棒状杆菌的已知培养基的例子，培养基可以具有与BMCG培养基(Liebl等人，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：205-210)或例如由Riedel等人(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：573-583)描述的培养基相同或相似的组成。
本发明还涉及用于生产甲硫氨酸的方法，其包括分离发酵肉汤和/或生物质的甲硫氨酸、其前体或衍生物的步骤，任选以最终产物的份或总量(0-100%)剩余。
在本发明的特定方面，培养在此类条件下执行，从而使得微生物对于无机底物特别是磷酸盐和/或钾是有限的或饥饿的。
对生物实施无机底物的限制限定这样的条件，在该条件下微生物的生长由供应的无机化学物质的量支配，其仍允许弱生长。
使微生物对于无机底物饥饿限定这样的条件，在该条件下由于不存在无机底物，微生物的生长完全停止。
本发明还涉及包含例如上文描述的至少一种修饰的微生物。
实施例
实施例I：菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykADpurU DyncA Ptrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)(pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)的构建
具有减少的N-乙酰甲硫氨酸累积的甲硫氨酸生产菌株已在引入本申请内作为参考的专利申请WO2007077041和WO2009043803中描述。
1.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB::Km的构建。
为了增加磷酸丝氨酸磷酸化酶的水平，将组成型人工trc启动子SerB加入菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA内的serB基因上游。
为了加入这个人工trc启动子，使用由Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重组策略。这个策略允许插入卡那霉素抗性盒以及另外的DNA区，特别是在染色体中。为了这个目的，使用了两种寡核苷酸，Ptrc07-serBF(SEQ IDN°01)和Ptrc07-serBR(SEQ ID N°02)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)。
Ptrc07-serBF(SEQ ID N°01)
CCACCCTTTGAAAATTTGAGACTTAATGTTGCCAGAAGCAATGGATACAAGGTAGCCTCATGCTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTC TGCCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与基因serB的区域从4622816到4622878的序列同源的区域(大写情况)，
-关于来自T7噬菌体(Harrington K.J.，Laughlin R.B.和Liang S.Proc NatlAcad Sci U S A.2001 Apr 24；98(9):5019-24.)的T7Te转录终止序列的区域(大写加下划线的情况)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(在Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写粗体情况)。
Ptrc07-serBR(SEQ ID N°02)
CGCACCAGGTAATGTTAGGCATTAAGGCTCCTGTAAAATCGTTCGAAGCAGGGAAAATAACTTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATCGCCAACAGCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与基因serB的区域从4622939到4622879的序列同源的区域(大写情况)，
-关于trc启动子序列的区域(大写斜体情况)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(在Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参考序列)的区域(大写粗体情况)。
寡核苷酸Ptrc07-serBF(SEQ ID N°01)和Ptrc07-serBR(SEQ ID N°02)用于扩增来自质粒pKD4的卡那霉素抗性盒。随后通过电穿孔将所得到的PCR产物引入菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pKD46)内，其中所表达的Red重组酶允许同源重组。随后选择卡那霉素抗性转化体，并且通过PCR分析用下文定义的寡核苷酸serBF(SEQ ID N°03)和serBR(SEQ ID N°04)验证抗性盒的插入。随后通过DNA测序验证所选择的转化体。
将保留的菌株指定为MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykADpurU DyncA Ptrc07-serB::Km。
serBF(SEQ ID N°03)
CAAGGCAAGACAGAACAGG(与基因serB的区域从4622747到4622765的序列同源)。
serBR(SEQ ID N°04)
GGCATCACTTCATCACCAC(与基因serB的区域从4623006到4622988的序列同源)。
2.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB的构建
随后消除卡那霉素抗性盒。通过电穿孔将携带在卡那霉素抗性盒的FRT位点上起作用的重组酶FLP的pCP20质粒引入重组菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB::Km内。在42℃的一系列培养后，通过PCR分析用与先前使用的那些相同的寡核苷酸serBF(SEQ ID N°03)/serBR(SEQ ID N°04)验证卡那霉素抗性盒的丧失。将保留的菌株指定为MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykADpurU DyncA Ptrc07-serB。
3.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)的构建
pCC1BAC-serA-serC载体的构建已在WO2009043803中描述。
通过电穿孔将pCC1BAC-serA-serC载体引入菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB内，得到菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)。
4.菌株MG1655metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)(pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)的构建
pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11质粒衍生自质粒pCL1920(Lerner&Inouye，1990，NAR 18，15第4631页)、pME101-thrA*1-cysE和pFC1(Mermet-Bouvier&Chauvat，1994，CurrentMicrobiology，第28卷，第145-148页)。
pME101-thrA*1-cysE的构建在WO2007077041中描述。
对于质粒pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的构建，通过重叠PCR个别获得TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE和PgapA-metA*11区域，随后一起克隆到pCL1920载体中。
首先，通过使用下述寡核苷酸，ApaI-TTadc-CI857-F-1(SEQ ID N°05)和PlambdaR-thrA-R-2(SEQ ID N°06)(在网站http://ecogene.org/和http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind?C.acetobutylicum上的参考序列)，从pFC1载体PCR扩增TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)区域。其次，使用寡核苷酸PlambdaR-thrA-F-3(SEQ ID N°07)和cysE-R-4(SEQ ID N°08)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)，从pME101-thrA*1-cysE质粒PCR扩增thrA*1-cysE区域。将PlambdaR-thrA-R-2(SEQ ID N°06)和PlambdaR-thrA-F-3(SEQ ID N°07)寡核苷酸二者设计为具有32bp长的重叠序列。由于这个重叠序列，在第三个步骤中，通过混合TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)和thrA*1-cysE PCR产物且通过使用ApaI-TTadc-CI857-F-1(SEQ ID N°05)和cysE-R-4(SEQ ID N°08)寡核苷酸，PCR扩增了TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE区域。随后将这种PCR产物克隆到pSCB(Stratagene)中，并且通过测序验证所得到的载体且命名为pSCB-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE。
ApaI-TTadc-CI857-F-1(SEQ ID N°05)
accttgccgaGGGCCCTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTA
TTTTTTTTATCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCC
具有
-含额外碱基的区域(小写情况)，
-具有ApaI位点的区域(大写加下划线的情况)，
-关于TTadc转录终止序列(来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的adc基因的转录终止子，与pSLO1大质粒(megaplasmid)从179847到179807同源)的区域(大写情况)，
-与来自λ细菌噬菌体的cI857基因的3'末端同源的区域(大写粗体情况)。
PlambdaR-thrA-R-2(SEQ ID N°06)
CAACACTCTCATATGACCTCCTTAGTACATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATTGTCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCCTTGC
具有
-与thrA基因(从337到348，除了1个碱基外(大写粗体斜体情况))的5'末端同源的区域(大写粗体情况)
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源的区域(大写情况)，除了1个碱基外(大写斜体情况)，以获得PR变体形式的*(-35)版本，其中-35盒是经修饰的，以获得-35共有区(从TTGACT到TTGACA)
-与PlambdaR-thrA-F-3寡核苷酸的重叠区(大写加下划线的情况)。
PlambdaR-thrA-F-3(SEQ ID N°07)
GCATGTACTAAGGAGGTCATATGAGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTACATCAGTGGCAAATGC
具有
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源的区域(大写情况)，
-与thrA基因(从337到377，除了1个碱基外(大写粗体斜体情况))的5'末端同源的区域(大写粗体情况)
-与PlambdaR-thrA-R-2寡核苷酸的重叠区(大写加下划线的情况)
cysE-R-4(SEQ ID N°08)
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCG(与pME101-thrA*1-cysE质粒的cysE下游区同源)
为了在低拷贝载体中转移thrA*1和cysE基因，通过BsrBI和BamHI限制性切割pSCB-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE载体，并且将TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE片段克隆到载体pCL1920的SmaI/BamHI位点内，得到载体pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE。
随后，通过重叠PCR从MG1655metA*11菌株扩增PgapA-metA*11区域。首先，使用寡核苷酸SmaI-PgapA-F(SEQ ID N°09)和PgapA-metA*11-R(SEQ ID N°10)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)，PCR扩增PgapA启动子。其次，通过使用寡核苷酸PgapA-metA*11-F(SEQ ID N°11)和BamHI-metA*11-R(SEQ ID N°12)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)，PCR扩增metA*11基因。将PgapA-metA*11-R(SEQ ID N°10)和PgapA-metA*11-F(SEQ ID N°11)二者设计为对于其完整序列重叠。由于这个特异性，在第三个步骤中，通过混合metA*11和PgapA PCR产物且通过使用SmaI-PgapA-F(SEQ ID N°09)和BamHI-metA*11-R(SEQ ID N°12)寡核苷酸，PCR扩增了PgapA-metA*11区域。通过SmaI和BamHI限制性切割PCR产物，随后将消化的片段平端化，以便将其克隆到载体pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE的平端化的BamHI位点内。通过测序验证所得到的载体且命名为pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11。
SmaI-PgapA-F(SEQ ID N°09)
acgtCCCGGGCAAGCCCAAAGGAAGAGTGAGGC
具有
-含额外碱基的区域(小写情况)，
-具有SmaI位点的区域(大写加下划线的情况)，
-大肠杆菌的PgapA启动子序列从1860639到1860661同源的区域(大写情况)。
PgapA-metA*11-R(SEQ ID N°10)
GGCGGGTAGCTCGTCCGGCACACGAATCGGCATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG
具有
-metA基因从4212335到4212303同源的区域(大写粗体情况)
-PgapA启动子序列从1860794到1860761同源的区域(大写情况)
PgapA-metA*11-F(SEQ ID N°11)
CCTTTTATTCACTAACAAATAGCTGGTGGAATATATGCCGATTCGTGTGCCGGACGAGCTACCCGCC
具有
-metA基因从4212335到4212303同源的区域(大写粗体情况)
-PgapA启动子序列从1860794到1860761同源的区域(大写情况)
BamHI-metA*11-R(SEQ ID N°12)
acgtGGATCCGAATTCCGACTATCACAGAAGATTAATCCAGCGTTGG
具有
-含额外碱基的区域(小写情况)，
-具有BamHI位点的区域(大写加下划线的情况)，
-具有EcoRI位点的区域(大写斜体情况)，
-metA基因序列从4213248到4213218同源的区域(大写粗体情况)。
最后，通过电穿孔将载体pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11引入菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJDpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)内，得到菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)(pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)。
5.温度依赖性甲硫氨酸生产的评价
菌株1：MG1655metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncAPtrc07-serB(pCC1BAC-serA-serC)(pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)
生产菌株在小锥形瓶中进行评价。将5.5mL预培养物在30℃在混合培养基(具有2.5g.L-1葡萄糖的10%LB培养基(Sigma 25%)和90%基本培养基PC1)中生长21小时。将它用于接种50mL培养物至在培养基PC1中0.2的OD600。将壮观霉素以50mg.L-1的浓度、氯霉素以30mg.L-1的浓度加入。培养物的温度是30℃或37℃。当培养物已达到5-7的OD600时，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸，并且使用HPLC伴随折射计检测(有机酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS，来分析其他相关代谢产物。对于每个条件，进行3次重复。
表1：基本培养基组成(PC1)
  化合物   浓度(g.L-1)
  ZnSO4.7H2O   0.0040
  CuCl2.2H2O   0.0020
  MnSO4.H2O   0.0200
  CoCl2.6H2O   0.0080
  H3BO3   0.0010
  Na2MoO4.2H2O   0.0004
  MgSO4.7H2O   1.00
  柠檬酸   6.00
  CaCl2.2H2O   0.04
  K2HPO4.3H2O   10.50
  Na2HPO4   2.00
  (NH4)2HPO4   8.00
  NH4Cl   0.13
  NaOH 4M   调整至pH 6.8
  FeSO47H2O   0.04
  硫胺   0.01
  葡萄糖   10.00
  硫代硫酸铵   5.60
  维生素B12   0.01
  MOPS   10.00
  IPTG   0.0024
表2：在不同培养条件下通过菌株1在分批培养物中生产的以% g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的定义，参见下文。SD指示关于基于几次重复计算的得率的标准差(N=重复次数)。
  条件   Ymet   SD   N
  菌株1-预培养30℃+培养30℃   10.6   0.4   3
  菌株1-预培养30℃+培养37℃   12.9   0.8   9
  菌株1-预培养37℃+培养37℃   7.4   0.9   6
在OPA/FMOC衍生化后通过HPLC定量细胞外甲硫氨酸浓度。使用HPLC伴随折射计检测，分析残留葡萄糖浓度。甲硫氨酸得率如下表示：
如表2中所示，在培养过程中基因thrA和cysE的表达的热诱导增加生产的甲硫氨酸量。培养过程自始至终的组成性表达导致低甲硫氨酸得率。
表3显示在诱导后，HDH和SAT活性增加。thrA和cysE的组成性表达导致在非诱导和诱导条件之间的HDH和SAT活性水平，部分解释了较低的甲硫氨酸得率。其他细胞因子最可能影响在组成性表达后的这些活性且减少所述活性。总之，这些结果证实thrA和cysE的诱导对于增加甲硫氨酸得率是真正有利的。
表3：高丝氨酸脱氢酶(HDH)和丝氨酸乙酰基转移酶(SAT)活性在上述培养物中进行测定，并且以mUI/mg DW给出。基于几个独立培养物计算标准差(N=重复次数)。
  条件   HDH   SAT   N
  菌株1–预培养30℃+培养30℃   33±0   40±12   3
  菌株1–预培养30℃+培养37℃   94±15   246±12   3
  菌株1–预培养37℃+培养37℃   51±1   148±28   3
对于在体外的酶活性测定，将大肠杆菌菌株在如上所述的基本培养基中培养。
SAT活性的测定已在WO 2007077041中描述。
对于在体外的HDH活性测定，将大肠杆菌细胞重悬浮于冷20mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)中，并且在冰上超声处理(Branson超声波破碎仪(sonifier)，70W)。在离心后，定量在上清液中含有的蛋白质(Bradford，1976)。
在100mM Tris-HCl pH9、150mM KCl、1mM NADP+和25mM L-高丝氨酸中在30℃测定10μL提取物(1,5μg/mL蛋白质)10分钟。在340nm下分光光度计测量跟踪在L-高丝氨酸的存在下的NADP+减少共30分钟。
实施例II：菌株MG1655metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykADpurU DyncA DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ)的构建
具有减少的N-乙酰甲硫氨酸累积的甲硫氨酸生产菌株已在引入本申请内作为参考的专利申请WO2007077041和WO2009043803中描述。
1.菌株MG1655metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ)的构建
质粒pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ衍生自质粒pBeloBAC11(New England BioLabs；Kim等人，1996，Genomics，34，231-218)和pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11(上文描述的)。
首先，通过使用下述寡核苷酸，SnaBI-thrA-SMC-cysE-F(SEQ ID N°13)和cysE-R(SEQ ID N°14)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)，由pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11质粒PCR扩增thrA*1-SMC-cysE区域(SMC用于多克隆位点)。
SnaBI-thrA-SMC-cysE-F(SEQ ID N°13)
tgctacgtaccctctcatggaagttaggagtctgaGCTAGCTAGTCCGCTCGAGATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGG
具有
-与thrA基因的3'末端(从2765到2799)同源且具有SnaBI限制位点(斜体小写情况)的区域(小写情况)
-用于具有NheI和XhoI限制位点(斜体粗体情况)的SMC区域的区域(粗体情况)
-与cysE基因的5'上游区(从3780796到3780819)同源的区域(大写情况)
cysE-R(SEQ ID N°14)
CAACCAGTGACCGATGCG
与cysE基因从3780226到3780243同源
通过SnaBI和StuI限制性切割PCR扩增的片段thrA*1-SMC-cysE，并且将消化的片段克隆到质粒pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的SnaBI/StuI位点内。通过测序验证所得到的质粒且命名为pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11。
随后，通过使用下述寡核苷酸，SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F(SEQ IDN°15)和metA-T7TФ-SfoI-R(SEQ ID N°16)(在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=21516上的参考序列)，从pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-SMC-PgapA-metA*11质粒PCR扩增了PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ区域。将这种PCR产物克隆到pSCB载体(Stratagene)内。通过测序验证所得到的载体且命名为pSCB-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ。为了将PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ区域转移到单拷贝载体pBeloBAC11内，通过SfoI限制性切割pSCB-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-E-PgapA-metA*11-T7TФ，并且将PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ片段克隆到载体pBeloBAC11的平端化的NotI位点内，得到质粒pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ。
SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F(SEQ ID N°15)
GGCGCCtcgattcgaacttctgatagacttcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatATGAGAGTGTTGAAGTTCGGCGG
具有
-具有SfoI限制位点的区域(斜体大写情况)
-与T7细菌噬菌体的T7P45(10A)基因的启动子区(从22858到22967)同源的区域(小写情况)
-与thrA基因(从337到359，除了1个碱基外(大写粗体加下划线的情况))同源的区域(大写粗体情况)
metA-T7TФ-SfoI-R(SEQ ID N°16)
GGCGCCctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagTTAATCCAGCGTTGGATTCATGTGC
具有
-具有SfoI限制位点的区域(斜体大写情况)
-与T7细菌噬菌体的T7P45(10A)基因的转录终止区(从24111到24218)同源的区域(小写情况)
-与metA基因(从4213208到4213232)同源的区域(大写粗体情况)
最后，通过电穿孔将质粒pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ引入菌株MG1655metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJDpykF DpykA DpurU DyncA内，得到菌株MG1655metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJDpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ)。
2.菌株MG1655metA*11 DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km(pKD46)的构建
为了缺失malS区域并且将其替换为TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07区域，使用由Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重组策略。这个策略允许卡那霉素抗性盒以及另外的DNA的插入，同时缺失关注的大部分区域。为了这个目的，构建了下述质粒，pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km。
pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km质粒衍生自质粒pUC18(Norrander等人，1983，Gene 26,101-106)和pUC18-DmalS::SMC::Km(上文描述的)、pAR1219(Sigma)、和pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07(由Geneart合成且在下文描述的)。
2.1.质粒pUC18-DmalS::SMC::m的构建
对于质粒pUC18-DmalS::SMC::Km的构建，通过重叠PCR获得了malS的上游区(upmalS)、多克隆位点(SMC)和卡那霉素盒(Km)，并且随后扩增且克隆malS的下游区(downmalS)。
首先，使用下述寡核苷酸，HindIII-upmalS-F-1(SEQ ID N°17)和upmalS-Km-R-2(SEQ ID N°18)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)，从MG1655大肠杆菌基因组DNA PCR扩增了upmalS区域。其次，使用寡核苷酸upmalS-Km-F-3(SEQ ID N°19)和Km-SMC-R-4(SEQ ID N°20)，从pKD4质粒(Datsenko&Wanner,2000)PCR扩增了Km-SMC区域。将upmalS-Km-R-2(SEQ ID N°18)和upmalS-Km-F-3(SEQ ID N°19)寡核苷酸二者设计为具有45bp长的重叠序列。由于这个重叠序列，在第三个步骤中，通过混合upmalS和Km-SMC PCR产物且通过使用HindIII-upmalS-F-1(SEQID N°17)和Km-SMC-R-4(SEQ ID N°20)寡核苷酸，PCR扩增了upmalS-Km-SMC区域。随后将这种PCR产物克隆到pSCB(Stratagene)中，并且通过测序验证所得到的质粒且命名为pSCB-upmalS-Km-SMC。
HindIII-upmalS-F-1(SEQ ID N°17)
atcgtaAAGCTTTTCACTTTACCTGGCGCATTGG
具有
-含额外碱基的区域(小写情况)
-具有HindIII限制位点的区域(大写斜体情况)
-与malS基因的上游区(从3734620到3734641)同源的区域(大写情况)
upmalS-Km-R-2(SEQ ID N°18)
ctaaggaggatattcatatgACCGGTTCGGCGGCGTTCTGGATGG
具有
-用于扩增卡那霉素抗性盒(在Datsenko&Wanner，2000，PNAS，97，6640-6645中的参考序列)的区域(小写情况)
-与malS基因的上游区(从3735836到3735860)同源的区域(大写情况)
upmalS-Km-F-3(SEQ ID N°19)
CCATCCAGAACGCCGCCGAACCGGTcatatgaatatcctccttag
具有
-与malS基因的上游区(从3735836到3735860)同源的区域(大写情况)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(在Datsenko&Wanner，2000，PNAS，97，6640-6645中的参考序列)的区域(小写情况)
Km-SMC-R-4(SEQ ID N°20)
GATCGATGGATCCATCTCGAGATCCGCGGATGTATACATGGGCCCtgtaggctggagctgcttcg
具有
-含额外碱基的区域(大写情况)
-用于具有BamHI、XhoI、SacII、BstZ17I、ApaI限制位点的SMC的区域(斜体大写情况)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(在Datsenko&Wanner，2000，PNAS，97，6640-6645中的参考序列)的区域(小写情况)。
随后，通过BamHI和HindIII限制性切割pSCB-upmalS-Km-SMC质粒，并且将upmalS-Km-SMC片段克隆到载体pUC18的BamHI/HindIII位点内，得到载体pUC18-upmalS-Km-SMC。
随后，使用下述寡核苷酸，downmalS-F-1(SEQ ID N°21)和downmalS-R-2(SEQ ID NO 22)(在网站http://ecogene.org/上的参考序列)，从MG1655大肠杆菌基因组DNA PCR扩增了downmalS区域。随后将这种PCR产物克隆到pSCB(Stratagene)中，并且通过测序验证了所得到的质粒且命名为pSCB-downmalS。
downmalS-F-1(SEQ ID N°21)
ATGCTGAATTCaccggtgaagcctggggccacggcg
具有
-含额外碱基的区域(大写情况)
-具有EcoRI限制位点的区域(斜体大写情况)
-与malS基因的下游区(从3737020到3737044)同源的区域(小写情况)downmalS-R-2(SEQ ID NO 22)
TACGATGAATTCgggacgccataagcgttatcaatcacc
具有
-含额外碱基的区域(大写情况)
-具有EcoRI限制位点的区域(斜体大写情况)
-与malS基因的下游区(从3738372到3738398)同源的区域(小写情况)。
随后，通过EcoRI限制性切割pSCB-downmalS质粒，并且将downmalS片段克隆到载体pUC18的EcoRI位点内，得到载体pUC18-DmalS::SMC::Km。
2.2.质粒pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km的构建
对于质粒pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km的构建，通过ApaI和BamHI限制性切割存在于pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07(由Geneart合成的)内的TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07区域(下文描述的)，并且将片段亚克隆到质粒pUC18-DmalS::SMC::Km的ApaI和BamHI限制位点内，得到质粒pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07::Km。随后使用下述寡核苷酸，AvrII-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-F(SEQ ID N°24)和T7RNApol-BstZ17I-TT07-BamHI-XhoI-R(SEQ ID N°25)(在网站http://ecogene.org/和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=21516上的参考序列)，从载体pAR1219(Sigma)扩增PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07区域。随后通过AvrII和BamHI限制性切割PCR产物，并且将片段亚克隆到部分AvrII和BamHI限制性切割的pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07::Km质粒内，得到通过DNA测序验证的pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km质粒。
TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07区域存在于pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07(SEQ IDN°23)内：
gggcccTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTTAttaattaacctaggTCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCACAACGGAACAACTCTCATTGCATGGGATCATTGGGTACTGTGGGTTTAGTGGTTGTAAAAACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCAAGTCTGGCTATGCAGAAATCACCTGGCTCAACAGCCTGCTCAGGGTCAACGAGAATTAACATTCCGTCAGGAAAGCTTGGCTTGGAGCCTGTTGGTGCGGTCATGGAATTACCTTCAACCTCAAGCCAGAATGCAGAATCACTGGCTTTTTTGGTTGTGCTTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTTAGGTGAGAACATCCCTGCCTGAACATGAGAAAAAACAGGGTACTCATACTCACTTCTAAGTGACGGCTGCATGCTAACCGCTTCATACATCTCGTAGATTTCTCTGGCGATTGAAGGGCTAAATTCTTCAACGCTAACTTTGAGAATTTTTGTAAGCAATGCGGCGTTGTAAGCATTTAATGCATTGATGCCATTAAATAAAGCACCAACGCCTGACTGCCCCATCCCCATCTTGTCTGCGACAGATTCCTGGGATAAGCCAAGTTCATTTTTCTTTTTTTCATAAATTGCCTTAAGGCGACGTGCGTCCTCAAGCTGCTCTTGTGTTAATGGTTTCTTTTTTGTGCTCATcctaggAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACAATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTATAAGTATA Ctcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcggatcc
具有
-具有限制位点ApaI、PacI、AvrII和BamHI的区域(斜体小写情况)
-与TTadc转录终止序列(来自丙酮丁醇梭菌的adc基因的转录终止子，与pSLO1大质粒从179847到179807同源)(TTadc)同源的区域(加下划线的大写情况)
-与具有旨在制备或缺失某些限制位点(斜体大写情况)(CI857*)中的密码子使用变化的cI857基因同源的区域(大写情况)
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源的区域(粗体大写情况)，除了1个碱基外(斜体粗体大写情况)，以获得PR的*(-35)版本，即变体形式，其中-35盒是经修饰的，以获得-35共有区(从TTGACT到TTGACA)(PlambdaR*(-35))
-用于核糖体结合位点(RBS01)的区域(加下划线的粗体大写情况)
-具有BstZ17I限制位点(SMC)的区域(加下划线的斜体大写情况)
-关于T7Te转录终止序列(Harrington等人，2001，PNAS，98(9)，5019-24)(TT07)的区域(加下划线的小写情况)
AvrII-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-F(SEQ ID N°24)
ctcatCCTAGGAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGATCATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTATAAatgaacacgattaacatcgctaagaacg
具有
-含额外碱基的区域(小写情况)
-具有AvrII限制位点的区域(斜体大写情况)
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源的区域(粗体大写情况)，除了2个碱基外(斜体粗体大写情况)，以获得PR启动子的PlambdaR03突变体版本
-核糖体结合位点(加下划线的大写情况)
-与细菌噬菌体T7RNA聚合酶基因(T7P07基因)的5'末端(从3171到3198)同源的区域(粗体小写情况)
T7RNApol-BstZ17I-TT07-BamHI-XhoI-R(SEQ ID N°25)
cggccagCTCGAGCGCGGATCCGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGAGTATACttacgcgaacgcgaagtccgac
具有
-含额外碱基的区域(小写情况)
-具有XhoI和BamHI限制位点的区域(斜体大写情况)
-关于T7Te转录终止序列(Harrington等人，2001，PNAS，98(9)，5019-24)的区域(粗体大写情况)
-具有BstZ17I限制位点的区域(加下划线的斜体大写情况)
-与细菌噬菌体T7RNA聚合酶基因(T7P07基因)的3'末端(从5801到5822)同源的区域(粗体小写情况)
2.3.malS区域由TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07区域的替换
最后，为了缺失malS区域并且将其替换为TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07区域，通过ScaI和EcoRV限制性切割pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km质粒，并且通过电穿孔将DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km片段引入菌株MG1655metA*11(pKD46)内，其中所表达的Red重组酶允许同源重组。随后选择卡那霉素抗性转化体，并且通过PCR分析用寡核苷酸malS-F(SEQ ID N°26)、Km-R(SEQ ID N°27)、T7RNApol-F(SEQ ID N°28)和malS-R(SEQ ID N°29)(在网站http://www.ecogene.org/和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db= genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin =1#protmap；和Datsenko&Wanner，2000，PNAS，97，6640-6645上的参考序列)，验证DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km片段的插入。将菌株指定为MG1655metA*11DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km。
malS-F(SEQ ID N°26)：GCACCAACAACGCTTCAGGC(与从3734280到3734299的malS区域同源)
Km-R(SEQ ID N°27)：TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(与pKD4载体的卡那霉素抗性盒同源)
T7RNApol-F(SEQ ID N°28)：GCTGCTAAGCTGCTGGCTGC(与细菌噬菌体T7RNA聚合酶基因(T7P07基因)从5274到5293同源)
malS-R(SEQ ID NO 29)：GGAAAGACTCATGCACAGC(与从3738453到3738471的malS区域同源。
3.菌株MG1655metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncADmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ)的构建
为了缺失malS区域，并且将其替换为菌株MG1655metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJDpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ)中的TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07区域，通过P1噬菌体转导(参见下文)将DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km构建体从MG1655metA*11DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km菌株转移到MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ)菌株内。选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体，并且通过PCR分析用先前描述的寡核苷酸malS-F(SEQ ID N°26)、Km-R(SEQ ID N°27)、T7RNApol-F(SEQ ID N°28)和malS-R(SEQ ID N°29)，验证DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km区域的插入。将保留的菌株指定为MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ)。
噬菌体裂解产物P1的制备：
-用菌株MG1655metA*11DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km的100μL过夜培养物接种补充有卡那霉素(50μg/mL)、葡萄糖(0.2%)和CaCl2(5mM)的10mL LB
-在30℃伴随振荡温育1小时
-加入在菌株MG1655上制备的100μL噬菌体裂解产物P1(约1.109噬菌体/mL)
-在30℃振荡3小时直至所有细胞裂解
-加入200μL氯仿且涡旋
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片
-将上清液转移至无菌管且加入200μL氯仿
-将裂解产物贮存于4℃
转导：
-对于菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ)在LB培养基中的5mL过夜培养物，以1500g离心10分钟
-将细胞团块悬浮于2.5mL 10mM MgSO4、5mM CaCl2中
-对照管：100μL细胞
菌株MG1655metA*11DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km的100μL噬菌体P1
-测试管：100μL细胞+菌株MG1655metA*11DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km的100μL噬菌体P1
-不伴随振荡在30℃温育30分钟
-将100μL1M柠檬酸钠加入每个管中且涡旋
-加入1mL LB
-伴随振荡在30℃温育1小时
-在将管以7000rpm离心3分钟后，在补充有卡那霉素(50μg/mL)的LB皿上涂布
-在30℃温育过夜
4.温度依赖性甲硫氨酸生产的评价
菌株2：MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncADmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km(pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TФ)
预培养和培养条件如上文实施例1中所述。使用卡那霉素代替壮观霉素。培养温度是30℃或34℃。
表4：在30和34℃通过菌株2在分批培养物中生产的以% g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的准确定义，参见上文。SD指示关于基于三次重复计算的得率的标准差。
  条件   Ymet   SD   N
  菌株2–预培养30℃+培养30℃   6.7   0.1   3
  菌株2-预培养30℃+培养34℃   9.9   0.4   3
thrA和cysE的诱导增加生产的甲硫氨酸量。这通过两种活性HDH和SAT的分析加以证实。两种活性在转变为34℃后都增加。
表5：高丝氨酸脱氢酶(HDH，thrA*1)和丝氨酸乙酰基转移酶(SAT，cysE)活性在上述培养物中进行测定，并且以mUI/mg蛋白质给出。基于几个独立培养物计算标准差(N=重复次数)。
实施例III：在下文实施例IV和V中测试的热诱导菌株的构建
1.方案
几种方案已用于构建甲硫氨酸生产菌株且在下述实施例中描述。
方案1：通过同源重组的染色体修饰和重组体的选择(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000)
通过如由Datsenko.&Wanner(2000)所述的同源重组进行在特定染色体基因座中的等位基因替换或基因破坏。通过分别使用pKD3或pKD4、p34S-Gm(Dennis et Zyltra，AEM july 1998，第2710-2715页)或pLOI2065(Underwood等人，Appl Environ Microbiol.2002December；68(12)：6263-6272)质粒作为模板，扩增了氯霉素(Cm)抗性cat、卡那霉素(Km)抗性kan、庆大霉素(Gt)抗性gm基因或四环素(Tc)抗性tet，侧面为Flp识别位点。所得到的PCR产物用于转化具有质粒pKD46的受体大肠杆菌菌株，所述质粒pKD46表达λRed(γ,β,exo)重组酶。随后选择抗生素抗性转化体，并且通过PCR分析用表2中列出的合适引物验证突变的基因座的染色体结构。
通过使用如由Datsenko.&Wanner(2000)所述的质粒pCP20，去除cat、kan、gm和tc-抗性基因，除了具有pCP20质粒的克隆在37℃在LB上培养且随后在30℃测试抗生素抗性的丧失外。随后通过PCR使用表2中列出的引物验证了抗生素敏感的克隆。
方案2：噬菌体P1的转导
通过P1转导将染色体修饰转移至给定大肠杆菌受体菌株。该方案由2个步骤组成：(i)在含有抗性相关染色体修饰的供体菌株上制备噬菌体裂解产物和(ii)通过这种噬菌体裂解产物感染受体菌株。
噬菌体裂解产物的制备
-将具有目的染色体修饰的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种在10ml LB+Cm30μg/ml或Km50μg/ml或Gt10μg/mL或Tet10μg/mL+葡萄糖0.2%+CaCl25mM中。
-伴随振荡在37℃温育30分钟
-加入在供体菌株MG1655上制备的100μl P1噬菌体裂解产物(约1.109噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直至细胞的完全裂解。
-加入200μL氯仿且涡旋。
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。
-将上清液转移至无菌管。
-将裂解产物贮存于4℃。
转导
-将在LB培养基中培养的5ml大肠杆菌受体菌株过夜培养物以1500g离心10分钟
-将细胞团块悬浮于2.5mL MgSO4 10mM、CaCl2 5mM中
-用具有在染色体上的修饰的菌株MG1655的100μl P1噬菌体(测试管)和不含P1噬菌体的100μl细胞和不含细胞的100μl P1噬菌体作为对照管感染100μl细胞。
-不伴随振荡在30℃温育30分钟。
-将100μl柠檬酸钠1M加入每个管中且涡旋。
-加入1ml LB。
-伴随振荡在37℃温育1小时。
-以7000rpm离心3分钟。
-LB+Cm30μg/ml或Km 50μg/ml或Gt10μg/mL或Tet10μg/mL上铺平板。
-在37℃温育过夜。
随后选择抗生素抗性转导株，并且通过PCR分析用表2中列出的合适引物验证突变的基因座的染色体结构。
表6：在下述实施例中出现的中间菌株和生产菌株的基因型和相应编号列表
1.菌株3：MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurUΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的构建
甲硫氨酸生产菌株3(表6)已在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述。这些申请引入本申请内作为参考。
2.菌株4：MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykAΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA＊1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA＊1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA＊1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的构建
根据方案2，用来自专利申请EP10306164.4和US61/406249中所述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的P1噬菌体裂解产物，将专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述的ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰转导到菌株3(表6)内。
选择氯霉素抗性转导株，并且通过PCR用Ome1707-DwcaM_verif_F(SEQ ID N°30)和Ome1708-DwcaM_verif_R(SEQID N°31)(表7)验证了ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm染色体修饰的存在。将所得到的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm称为菌株4(表1)。
3.菌株5：MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykAΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc的构建
3.1.质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc的构建质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc衍生自上文描述的质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc和pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔyjbI::TT02-SMC、下文描述的质粒pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2和pLOI2065(Underwood等人，Appl EnvironMicrobiol.2002December；68(12)：6263–6272)。
3.1.1pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc的构建
质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc质粒衍生自上文描述的pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2、pLOI2065(Underwood等人，Appl Environ Microbiol.2002December；68(12)：6263–6272)、以及EP10306164.4和US61/406249专利申请中描述的pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。
质粒pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2的构建
pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2衍生自质粒pMA-RQ-TTadc-CI*1-PlambdaR*(-35)-RBS01*2和pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)RBS01*2，其已由GeneArt(http://www.geneart.com/)合成。将TTadc-CI*1-PlambdaR*(-35)-RBS01*2和TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2片段克隆到来自GeneArt的质粒pMA-RQ的SfiI位点内，且分别含有下述序列：
pMA-RQ-TTadc-CI*1-PlambdaR*(-35)-RBS01*2(SEQ ID N°32)
ggccgtcaaggccgcatggcgcgccttataacctccttaGTACATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATTGTCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCCTTGCGGTGATAGATTTAACGTATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTTAAGGCAATTCATGAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGGGCAGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTACAACGCCGCATTGCTTGCGAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAAATCTACGAGATGTATGAAGCGGTTAGCATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCATGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTGAACTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGGGTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCATTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGACCGCACCAACAGGCTCCAAGCCAAGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCAGGCTGTTGAGCCAGGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCTTCAAGAAACTGATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCAATGATCCCATGCAATGAGAGTTGTTCCGTTGTGGGGAAAGTTATCGCTAGTCAGTGGCCTGAAGAGACGTTTGGCTGATAAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAGGGCCCTTAATTAACTGGGCCTCATGGGCC
-加下划线的小写情况对应于SfiI和AscI限制位点
-粗体小写情况对应于以反向方向的RBS01*2序列(TAAGGAGGTTATAA)和PsiI限制位点，
-斜体大写情况与λ细菌噬菌体PR启动子(PlambdaR*(-35),(Mermet-Bouvier&Chauvat，1994，Current Microbiology，第28卷，第145-148页))同源。
-大写情况对应于λ细菌噬菌体的阻遏蛋白cI的序列，其中将核苷酸T67改变为C67，生成一个氨基酸变化Tyr23His(Mermet-Bouvier&Chauvat，1994，Current Microbiology，第28卷，第145-148页)。将这种序列称为cI*1。
-粗体大写情况以相反方向与TTadc转录终止序列(来自丙酮丁醇梭菌的adc基因的转录终止子，与pSLO1大质粒从179847到179807同源)同源。
-加下划线的大写情况对应于ApaI、PacI和SfiI
pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2(SEQ ID N°33)
ggccgtcaaggccgcatggcgcgccttataacctccttaGTACATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATTGTCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCCTTGCGGTGATAGATTTAACGTATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTTAAGGCAATTTATGAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGGGCAGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTACAACGCCGCATTGGCGACAAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAAATCTACGAGATGTATGAAGCGGTTAGCATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCATGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTAAGCTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGGGTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCATTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGACCGCACCAACAGGCTCCAAGCCAAGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCAGGCTGTTGAGCCAGGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCTTCAAGAAACTGATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCAATGATCCCATGCAATGAGAGTTGTTCCGTTGTGGGGAAAGTTATCGCTAGTCAGTGGCCTGAAGAGACGTTTGGCTGATAAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAG GGCCCTTAATTAACTGGGCCTCATGGGCC
-加下划线的小写情况对应于SfiI和AscI限制位点
-粗体小写情况对应于以反向方向的RBS01*2序列(TAAGGAGGTTATAA)和PsiI限制位点，
-斜体大写情况与λ细菌噬菌体PR启动子(PlambdaR*(-35),(Mermet-Bouvier&Chauvat，1994，Current Microbiology，第28卷，第145-148页))同源。
-大写情况对应于λ细菌噬菌体的阻遏蛋白cI的序列，其中将核苷酸196-CTTGCG-201改变为196-GCGACA-201，生成两个氨基酸变化Leu66Ala和Ala67Thr(Mermet-Bouvier&Chauvat，1994，Current Microbiology，第28卷，第145-148页)。将这种序列称为cI*3。
-粗体大写情况以相反方向与TTadc转录终止序列(来自丙酮丁醇梭菌的adc基因的转录终止子，与pSLO1大质粒从179847到179807同源)同源。
-加下划线的大写情况对应于ApaI、PacI和SfiI
为了构建pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2，将由上文描述的pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2纯化的XmnI/NsiI片段NsiI-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2-XmnI克隆到上文描述的质粒pMA-RQ-TTadc-CI*1-PlambdaR*(-35)-RBS01*2的XmnI和NsiI位点之间，制备cI蛋白质阻遏物的野生型等位基因。通过DNA测序验证所得到的质粒，并且称为pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2。
质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的构建
pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm质粒衍生自EP10306164.4和US61/406249专利申请中所述的pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm和上文描述的pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2。
为了构建pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm，将通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理且由pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2纯化的ApaII/PsiI片段TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)，克隆到质粒pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的SfoI位点之间。通过限制性切割验证所得到的质粒，并且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。
最后，为了构建pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc，通过PCR用引物Ome1836-HindIII-K7-FRT-Tc-F(SEQ ID N°34)和Ome1837-SmaI-BstZ17I-K7-FRT-Tc-R(SEQ ID N°35)，使用pLOI2065作为模板，扩增了FRT-Tc-FRT抗性盒。
Ome1836-HindIII-K7-FRT-Tc-F(SEQ ID N°34)
GCCCAAGCTTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACCGGATCAATTCATCGCGCGTC
具有
-加下划线的大写情况对应于HindIII限制位点和额外碱基，
-粗体大写情况序列对应于质粒pKD4(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的FRT序列，
-大写情况序列与定位于pLOI2065(Underwood等人，Appl EnvironMicrobiol.2002December；68(12)：6263–6272)上的四环素抗性基因的序列同源。
Ome1837-SmaI-BstZ17I-K7-FRT-Tc-R(SEQ ID N°35)
TCCCCCGGGGTATACCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAATTGTCGACAAGCTAGCTTGC
具有
-加下划线的大写情况对应于SmaI和BstZ17I限制位点和额外碱基，
-粗体大写情况序列对应于质粒pKD4(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)的FRT序列，
-大写情况序列与定位于pLOI2065(Underwood等人，Appl EnvironMicrobiol.2002December；68(12)：6263–6272)上的四环素抗性基因的序列同源。
将FRT-Tc-FRT PCR产物通过BstZ17I和HindIII消化，并且通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理。随后将所得到的片段克隆到BstZ17I和PacI之间，其已通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理。所选择的质粒具有以与pUC18质粒的amp抗性盒相同方向的tc抗性盒，并且通过DNA测序验证且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01*2-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc。
3.1.2质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔyjbI::TT02-SMC的构建
为了构建ΔyjbI::TT02-MCS片段，完成在yjbI的上游区(upyjbI)、TT02转录终止子、多克隆位点(MCS)和yjbI的下游区(downyjbI)之间的重叠PCR。
首先，通过PCR使用引物Ome 1852-SfoI-KpnI-DyjbI amont-F(SEQ IDN°36)和Ome1853-SMC-TT02-DyjbI amont-R(SEQ ID N°37)，由大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增了片段upybI-TT02-MCS。随后，通过PCR使用引物Ome1854-TT02-SMC-DyjbI aval-F(SEQ ID N°38)和Ome1855-SfoI-KpnI-DyjbI aval-R(SEQ ID N°39)，由大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增TT02-MCS-downyjbI片段。将引物Ome1853-SMC-TT02-DyjbIamont-R(SEQ ID N°37)和Ome1854-TT02-SMC-DyjbI aval-F(SEQ ID N°38)设计为通过36个核苷酸长的区域重叠。最后，通过混合upybI-TT02-MCS和TT02-MCS-downybI扩增子且使用引物Ome 1852-SfoI-KpnI-DybIamont-F(SEQ ID N°36)和Ome 1855-SfoI-KpnI-DyjbI aval-R(SEQ ID N°39)，扩增了upybI-TT02-MCS-downybI片段。将所得到的融合PCR产物通过SfoI消化，并且克隆到上文描述的质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的EcoRI位点之间，所述质粒已通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理。通过DNA测序验证了所得到的质粒且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔyjbI::TT02-MCS。
Ome1852-SfoI-KpnI-DyjbI amont-F(SEQ ID N°36)
CGTAGGCGCCGGTACCGAGTGCAGATCGGCTGGAAGGCG
具有
-加下划线的大写情况对应于SfoI和KpnI限制位点和额外碱基，
-大写情况序列与yjbI基因上游的序列(4247987-4248009，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源。
Ome1853-SMC-TT02-DyjbI amont-R(SEQ ID N°37)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCATTTCTGTAGAATTTTACACTTATAGTATCATTACTGATTGAGACTTCA
具有
-加下划线的大写情况序列用于BstZ17I限制位点和多克隆位点的开始，
-大写情况序列对应于大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(OroszA，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov 1；201(3):653-9)
-粗体大写情况序列与yjbI基因下游的序列(4248931-4248980，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源。
Ome1854-TT02-SMC-DyjbI aval-F(SEQ ID N°38)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTTACCTAGGGCCCTTAATTAAATAATGAATAAGGGTGTTTAAGTAAAGGAAAACAT CACCGTTCCTGGCAT
具有
-大写情况序列对应于大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(OroszA，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov 1；201(3):653-9)
-粗体大写情况序列含有多克隆位点：BstZ17I、HindIII、AvrII、ApaI、PacI，
-加下划线的大写情况序列与yjbI基因下游的序列(4250286-4250335，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源。
Ome1855-SfoI-KpnI-DyjbI aval-R(SEQ ID N°39)
CGTAGGCGCCGGTACCCAGCATAATCATTCACCACACATCCG
具有
-加下划线的大写情况对应于SfoI和KpnI限制位点和额外碱基，
-大写情况序列与yjbI基因上游的序列(4251224-4251249，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源
3.1.3.质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc的构建
为了构建pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc，将由pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc纯化的BstZ17I/SmaI片段PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc克隆到质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔyjbI::TT02-SMC的PacI/BstZ17I位点之间，所述质粒已通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理。所选择的质粒具有以与pUC18质粒的amp抗性盒相同方向的tc抗性盒，并且通过DNA测序验证且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc。
3.2.菌株MG1655metA*11DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc pKD46的构建
为了将yjbI基因替换为TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc区域，根据方案1，将pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc通过AhdI和KpnI限制性酶消化，并且将剩余经消化的片段ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc引入菌株MG1655metA*11pKD46内。
选择四环素抗性重组体，并且通过PCR用引物Ome1856-DybI-verif1-F(SEQ ID N°40)、Ome1857-DyjbI-verif2-R (SEQ ID N°41)、Ome1838-K7-FRT-Tc-seq-F(SEQ ID N°42)、和Ome 1815-metA*11-seq-F(SEQ IDN°43)(表7)且通过DNA测序，验证了ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc染色体修饰的存在。将经验证且选择的菌株称为MG1655metA*11ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc(pKD46)。
3.3.将ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc转导到菌株4内
根据方案2，用来自上文描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc的P1噬菌体裂解产物，将ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc染色体修饰转导到上文描述的菌株4(表6)内。
选择四环素抗性转导株，并且通过PCR用Ome1856-DyjbI-verif1-F(SEQID N°40)、Ome1857-DyjbI  -verif2-R(SEQ ID N°41)、Ome1838-K7-FRT-Tc-seq-F(SEQ ID N°42)、和Ome 1815-metA*11-seq-F(SEQ IDN°43)(表2)验证了ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc染色体修饰的存在。将所得到的菌株MG1655metA*11Ptpc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:：Tc称为菌株5(表6)。
4.菌株6：MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykAΔpurU ΔyncA  ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm    ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc    ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt的构建
4.1.质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt的构建
质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt衍生自下文描述的pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt和pUC18-TTadc-CDC*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-MCS::Gt。
4.1.1.质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt的构建
质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt衍生自上文描述的pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-SMC::Gt和pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm。
pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Gt的构建
为了构建质粒，通过PCR用引物BstZ17I-FRT-Gt-F(SEQ ID N°44)和HindIII-FRT-Gt-R(SEQ ID N°45)，使用p34S-Gm作为模板，扩增了FRT-Gt-FRT抗性盒。
BstZ17I-FRT-Gt-F(SEQ ID N°45)
TCCCCCGGGGTATACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAGATGGGTACCGAGCTCGAATTG
具有
-加下划线的大写情况序列用于SmaI和BstZ17I限制位点和额外碱基，
-粗体大写情况序列对应于FRT序列(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)
-大写情况序列与定位于p34S-Gm(Dennis et Zyltra，AEM July 1998，第2710-2715页)上的庆大霉素基因的序列同源。
HindIII-FRT-Gt-R(SEQ ID N°45)
CCCAAGCTTCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGCGCGGATGGGTACCGAGCTCGAATTG
具有
-加下划线的大写情况序列用于HindIII限制位点和额外碱基，
-粗体大写情况序列对应于FRT序列(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645)
-大写情况序列与定位于p34S-Gm(Dennis et Zyltra，AEM July 1998，第2710-2715页)上的庆大霉素基因的序列同源。
将FRT-Gt-FRT PCR产物通过BstZ17I和HindIII消化，并且克隆到EP10306164.4和US61/406249专利申请中所述的pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS的BstZ17I和HindIII位点之间。通过DNA测序验证了所得到的质粒且称为pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS-Gt。
pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-SMC::Gt的构建
为了构建pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-SMC::Gt，将由上文描述的pMA-ΔCP4-6::TT02-MCS::Gt纯化的StuI/BsrBI片段ΔCP4-6::TT02-SMC::Gt克隆到质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的EcoRI位点之间，所述质粒已通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理。通过测序验证了所得到的质粒且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-SMC::Gt。
为了构建最终质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt，将由上文描述的pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm纯化的ApaI/BamHI片段TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11克隆到质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-SMC::Gt的ApaI/BamHI位点之间。通过测序验证了所得到的质粒且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt。
4.1.2.质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-SMC的构建
为了构建ΔmelB::TT02-MCS片段，完成了在melB的上游区(upmelB)、TT02转录终止子、多克隆位点(MCS)和melB的下游区(downmelB)之间的重叠PCR。
首先，通过PCR使用引物Ome 1841-SfoI-KpnI-DmelB amont-F(SEQ IDN°46)和Ome1842-SMC-TT02-DmelB amont-R(SEQ ID N°47)，由大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增了片段upmelB-TT02-MCS。随后，通过PCR使用引物Ome1843-TT02-SMC-DmelB  aval-F(SEQ ID N°48)和Ome1844-SfoI-KpnI-DmelB aval-R(SEQ ID N°49)，由大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增了TT02-MCS-downmelB片段。将引物Ome1842-SMC-TT02-DmelB amont-R(SEQ ID N°47)和Ome1843-TT02-SMC-DmelB aval-F(SEQ ID N°48)设计为在36核苷酸长的区域上重叠。最后，通过混合upmelB-TT02-MCS和TT02-MCS-downmelB扩增子且使用引物Ome1841-SfoI-KpnI-DmelB amont-F(SEQ ID N°46)和Ome1844-SfoI-KpnI-DmelB    aval-R(SEQ ID N°49)，扩增了upmelB-TT02-MCS-downmelB片段。将所得到的融合PCR产物通过SfoI消化，并且克隆到上文描述的质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm的EcoRI位点之间，所述质粒已通过大肠杆菌DNA聚合酶I的大(Klenow)片段处理。通过DNA测序验证了所得到的质粒且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-MCS。
Ome 1841-SfoI-KpnI-DmelB amont-F(SEQ ID N°46)
CGTAGGCGCCGGTACCGACCTCAATATCGACCCAGCTACGC
具有
-加下划线的大写情况对应于SfoI和KpnI限制位点和额外碱基，
-大写情况序列与melB基因上游的序列(4340489-4340513，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源
Ome1842(SMC-TT02-DmelB amont-R)(SEQ ID N°47)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCATTGAAATGCTCATAGGGTATCGGGTCGC
具有
-加下划线的大写情况序列用于BstZ17I限制位点和多克隆位点的开始，
-大写情况序列对应于大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(OroszA，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov 1；201(3):653-9)
-粗体大写情况序列与melB基因下游的序列(4341377-4341406，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源。
Ome1843(TT02-SMC-DmelB aval-F)(SEQ ID N°48)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTAATTAACCTAGGGCCCGGGCGGATCCGTGAGTGATGTGAAAGCCTGACGTGG
具有
-大写情况序列对应于大肠杆菌rrnB的转录终止子T1(OroszA，Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991Nov 1；201(3):653-9)
-粗体大写情况序列含有多克隆位点：BstZ17I、HindIII、AvrII、ApaI、BamHI，
-加下划线的大写情况序列与melB基因下游的序列(4342793-4342818，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源
Ome1844(SfoI-KpnI-DmelB aval-R)(SEQ ID N°49)
CGTAGGCGCCGGTACCCGAACTGCACTAAGTAACCTCTTCGG
-加下划线的大写情况对应于SfoI和KpnI限制位点和额外碱基，
-大写情况序列与melB基因上游的序列(4343694-4343719，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源
4.1.3.质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt的构建
为了构建pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*-(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt，将由上文描述的pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt纯化的BstZ17I/BamHI片段PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt克隆到上文描述的质粒pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-SMC的BstZ17I/BamHI位点之间。通过测序验证了所得到的质粒且称为pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt。
4.2.菌株MG1655metA*11DmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt pKD46的构建
为了将melB基因替换为TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt区域，根据方案1，将pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:Gt通过AhdI和SphI限制性酶消化，并且将剩余经消化的片段ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt引入菌株MG1655metA*11pKD46内。
选择庆大霉素抗性重组体，并且通过PCR用引物Ome1845-DmelB-verif1-F(SEQ ID N°50)和Ome1846-DmelB-verif2-R(SEQ IDN°51)(表7)且通过DNA测序，验证了ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt染色体修饰的存在。将经验证且选择的菌株称为MG1655metA*11 ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt(pKD46)。
4.3.将ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt转导到菌株5内
根据方案2，用来自上文描述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt的P1噬菌体裂解产物，将ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt染色体修饰转导到上文描述的菌株5(表6)内。
选择庆大霉素抗性转导株，并且通过PCR用Ome1845-DmelB-verif1-F(SEQ ID N°50)和Ome 1846-DmelB-verif2-R(SEQ IDN°51)(表7)验证了ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt染色体修饰的存在。将所得到的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm ΔyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc ΔmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt称为菌株6。
5.菌株8：MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE pBeloBAC11-PL1*1/RBS01＊2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ的构建
5.1.菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE的构建
根据方案2，将启动子染色体修饰Ptrc-metH、PtrcF-cysPUWAM、PtrcF-cysJIH、Ptrc09-gcvTHP和Ptrc36-ARNmst17-metF(其已在WO2007/077041和WO2009/043803专利申请中描述)，以及ΔmetJ、ΔpykF、ΔpurU和ΔyncA基因缺失(其已在WO2007/077041、WO2009/043803和WO2005/111202专利申请中描述)转导到含有metA*11等位基因的菌株内，所述metA*11等位基因编码对于S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的高丝氨酸琥珀酰转移酶，如WO2005/111202中所述。
在菌株构建过程中与每种染色体修饰或缺失相关的抗性盒已根据方案1去除。
根据方案2，用来自EP10306164.4和US61/406249专利申请中所述的菌株MG1655metA*11pKD46ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km的P1噬菌体裂解产物，将ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km染色体修饰转导到菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFΔmetJΔpykFΔpurUΔyncA内。
选择卡那霉素抗性转导株，并且通过PCR用引物Ome 0826-malS-F(SEQID N°52)和Ome 0827-malS-R(SEQ ID N°53)(表7)验证ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km染色体修饰的存在。所得到的菌株具有基因型MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km。
最后，根据方案1去除了上述菌株的卡那霉素抗性。通过PCR通过使用引物Ome 0826-malS-F(SEQ ID N°52)和Ome 0827-malS-R(SEQ ID N°53)验证了卡那霉素抗性盒的丧失。将所得到的菌株MG1655metA*11Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE称为菌株7。
5.1.1.菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP  Ptrc36-ARNmst 17-metF  ΔmetJ  ΔpykF  ΔpurU  ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE    pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ的构建
pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ质 粒的构建
质粒pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ质粒衍生自本专利申请的实施例2中所述的质粒pBeloBAC11-PT7/RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ。
为了构建质粒pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ，用引物Ome 2012-SfoI-HpaI-AvrII-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-F(SEQ ID N°54)和Ome 0625-Ptrc-cysE*rec(SEQ ID N°55)扩增了质粒pBeloBAC11-PT7/RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ。将HpaI/NheI消化的PL1*1/RBS01*2-thrA*1片段克隆到本专利申请的实施例2中所述的质粒pBeloBAC11-PT7/RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ的HpaI和NheI位点之间。通过DNA测序验证了所得到的质粒且称为pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ。
Ome 2012SfoI-HpaI-AvrII-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-F(SEQ ID N°54)
TGCCGGCACGGCGCCAAGTTAACCCTAGGTTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTTATACTGAGCACAtcaacTAAGGAGGTTATAAATGAGAGTGTTGAAGTTCG
具有
-加下划线的大写情况对应于SfoI、HpaI和AvrII限制位点和额外碱基，
-粗体大写碱基序列对应于短形式的λ细菌噬菌体PL启动子(PL1 Giladi等人，FEMS Microbiol Rev.1995Aug；17(1-2):135-40)且具有在-10盒中的突变(Kincade&deHaseth，Gene.1991 Jan 2；97(1):7-12中描述的G-12T)。将这种启动子称为PL1*1)。
-小写情况：5个碱基间隔PL1*1的转录起始位点和核糖体结合位点RBS01*2
-斜体大写情况对应于RBS01*2序列
-加下划线的大写情况序列与thrA*1基因(337-354，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源。
Ome 0625Ptrc-cysE*rec(SEQ ID N°55)
CCGGGTCAGCGGCGTAGGC
与cysE基因(3780360-3780378，在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源
通过电穿孔将上文描述的pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ引入菌株7(表6)内。验证了质粒pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TΦ的存在，并且将所得到的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-TT01称为菌株8。
表7：用于上文描述的染色体修饰的PCR验证的引物
实施例IV：菌株3、4、5和6的温度依赖性甲硫氨酸生产的评价
生产菌株在小锥形瓶中进行评价。将5.5mL预培养物在混合培养基(具有2.5g.L-1葡萄糖的10%LB培养基(Sigma 25%)和90%基本培养基PC1)中生长21小时。将它用于接种50mL培养物至在培养基PC1中0.2的OD600。当需要时，将庆大霉素以10mg.L-1的浓度、氯霉素以30mg.L-1的浓度和四环素以5mg.L-1的浓度加入。当培养物已达到5–7的OD600时，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸，并且使用HPLC伴随折射计检测(有机酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS，来分析其他相关代谢产物。
培养和预培养条件显示于下表中。使预培养物在30℃或37℃生长。使培养物在30℃或37℃或在37℃生长2小时，随后在42℃生长2小时且最后对于培养的其余部分在37℃生长。
表8：基本培养基组成(PC1)
  化合物   浓度(g.L-1)
  ZnSO4.7H2O   0.0040
  CuCl2.2H2O   0.0020
  MnSO4.H2O   0.0200
  CoCl2.6H2O   0.0080
  H3BO3   0.0010
  Na2MoO4.2H2O   0.0004
  MgSO4.7H2O   1.00
  柠檬酸   6.00
  CaCl2.2H2O   0.04
  K2HPO4   8.00
  Na2HPO4   2.00
  (NH4)2HPO4   8.00
  NH4Cl   0.13
  NaOH 4M   调整至pH 6.8
  FeSO47H2O   0.04
  硫胺   0.01
  葡萄糖   15.00
  硫代硫酸铵   5.60
  维生素B12   0.01
  MOPS   15.00
表9：通过菌株3在分批培养物中生产的以% g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的准确定义，参见下文。SD指示关于基于几次重复计算的得率的标准差(n=重复次数)。测试不同培养条件。它们在表中指出；PC意指预培养物，并且C意指培养物。
如表9中所示，在培养过程中基因thrA*1和cysE的表达的热诱导增加生产的甲硫氨酸量。培养过程自始至终的组成性表达导致低甲硫氨酸得率。
对于最佳甲硫氨酸生产，最佳培养条件对于预培养是30℃，随后为在37℃(2小时)、42℃(2小时)、37℃的培养。在此类条件下，菌株3以9.2%的得率生产甲硫氨酸。
表10：通过菌株4、5和6在分批培养物中生产的以% g甲硫氨酸/g de葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的准确定义，参见下文。SD指示关于基于几次重复计算的得率的标准差(n=重复次数)。预培养物在30℃培养，并且培养物在37℃培养2小时、42℃2小时和37℃直至培养结束。
  菌株和生长条件   Ymet   SD
菌株4、5和6都在用于最佳甲硫氨酸生产的条件下进行培养。
如表10中所示，在培养工艺过程中基因thrA*1和cysE的表达的热诱导与受诱导型启动子控制的基因拷贝数成比例地增加生产。事实上，具有在Pλ启动子(参见表6)控制下的thrA*1的7个拷贝的菌株6以比菌株5(thrA*1的6个拷贝)和4(5个拷贝)更高的得率生产甲硫氨酸。
菌株5和6不能在37℃的恒定温度下生长是值得注意的。总之，这些结果证实热诱导不仅对于生产更佳，还是此类情况下必需的。
在OPA/FMOC衍生化后通过HPLC定量了细胞外甲硫氨酸浓度。使用HPLC伴随折射计检测，分析了残留葡萄糖浓度。甲硫氨酸得率如下表示：
为了验证thrA*1和cysE基因的表达的热诱导，在粗提取物中测定了相应酶的活性。
对于在体外的酶活性测定，将大肠杆菌菌株在如上所述的基本培养基中培养，并且通过离心在指数生长期结束时收获。将团块重悬浮于含有蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)片剂与EDTA的冷20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)中。随后，通过用Precellys系统(Bertin Technologies)的珠磨(bead beating)将细胞以6500rpm裂解1x30秒，随后以12000g(4℃)离心30分钟。将上清液脱盐且用于分析。使用Bradford测定试剂(Bradford，1976)测定蛋白质浓度。
对于在体外的HDH活性(高丝氨酸脱氢酶，由thrA*1编码)测定，将15μg细胞粗提取物在100mM Tris-HCl pH9、150mM KCl、1mM NADP+和25mML-高丝氨酸中测定。在340nm下以分光光度法监控在L-高丝氨酸的存在下的NADP+减少共30分钟。
由于CoA与DTNB的反应，通过测量在408nm下TNB的吸光度10分钟在25℃以分光光度法测定SAT活性(丝氨酸乙酰基转移酶，由cysE编码)。用在80mM磷酸钾pH7.5、2mM乙酰-coA、30mM丝氨酸和0,1mM DTNB中的2μg粗提取物完成了反应。
表11：对在不同条件下生长的菌株3的培养物的粗提取物测定了高丝氨酸脱氢酶(HDH，thrA*1)和丝氨酸乙酰基转移酶(SAT，cysE)活性。活性以mUI/mg蛋白质给出。基于几个独立培养物计算了标准差(N=重复次数)。
 菌株3的预培养物和培养物的生长条件   HDH   SAT   N
 预培养30℃+培养30℃   78±28   99±10   6
 预培养30℃+培养37℃   104±21   153±28   18
 预培养30℃+培养37/42/37℃   195±33   324±32   16
 预培养37℃+培养37℃   94±25   181±20   6
表11显示在诱导后，HDH和SAT活性增加。thrA*1和cysE的组成性表达导致在非诱导和诱导条件之间的HDH和SAT活性水平，部分解释了较低的甲硫氨酸得率。总之，这些结果证实thrA*1和cysE的诱导对于增加甲硫氨酸得率是真正有利的。
以对于菌株4、5和6相同的方式，HDH和SAT活性在诱导后增加。活性与染色体上整合的基因thrA*1和cysE的拷贝数成比例增加(数据未显示)。
实施例V：菌株8的温度依赖性甲硫氨酸生产的评价
菌株8如实施例IV中所述在小锥形瓶中进行评价。将它与菌株3相比较。
表12：通过菌株8和3在分批培养物中生产的以% g甲硫氨酸/g de葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的准确定义，参见下文。SD指示关于基于几次重复计算的得率的标准差(n=重复次数)。预培养物在30℃培养，并且培养物在37℃培养2小时、42℃2小时和随后37℃直至培养结束。
如表12中所示，对于携带构建体PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE的菌株8在诱导后的甲硫氨酸生产与对于携带构建体PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE的4个拷贝的菌株3一样好。
在OPA/FMOC衍生化后通过HPLC定量了细胞外甲硫氨酸浓度。使用HPLC伴随折射计检测，分析了残留葡萄糖浓度。甲硫氨酸得率如下表示：
为了验证受PL1*1诱导型启动子控制的thrA*1和cysE基因的表达的热诱导，如实施例IV中所述在粗提取物中测定相应酶的活性。
表13：在上述培养物中测定了高丝氨酸脱氢酶(HDH，thrA*1)和丝氨酸乙酰基转移酶(SAT，cysE)活性，并且以mUI/mg蛋白质给出。基于几个独立培养物计算了标准差(N=重复次数)。
  菌株3和8的生长条件   HDH   SAT   N
  菌株8-预培养30℃+培养37/42/37℃   91±8   140±2   3
  菌株3-预培养30℃+培养37/42/37℃   100±3   140±10   2
如表13中可见，菌株8的HDH和SAT活性类似于菌株3的那种。因此，来自PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE的诱导至少等效于来自PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE的4个拷贝的诱导。
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Claims (19)

1.一种用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法，其包括如下步骤：
-在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物，所述微生物是大肠杆菌，和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，
其中在所述经修饰的微生物中，涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在通过物理刺激诱导的异源诱导型启动子的直接或间接控制下，其中所述至少一种基因是thrA和cysE，所述诱导型启动子选自由温度诱导型启动子或光诱导型启动子组成的组，且其中所述经修饰的微生物还提供如下遗传修饰：
-反馈抗性的metA等位基因、反馈抗性的thrA等位基因、cysE、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF的过表达，和
-基因metJ、pykF、pykA、purU、yncA的缺失。
2.权利要求1的方法，其中所述涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在异源诱导型启动子的直接控制下，其中所述至少一种基因是thrA和cysE。
3.权利要求1的方法，其中所述温度诱导型启动子选自由通过噬菌体λ经修饰的阻遏物调节的启动子、启动子PR或PR的衍生物、启动子PL或PL的衍生物、和通过温度敏感的Lac阻遏物调节的经修饰的lac启动子组成的组。
4.权利要求2的方法，其中所述温度诱导型启动子选自由通过噬菌体λ经修饰的阻遏物调节的启动子、启动子PR或PR的衍生物、启动子PL或PL的衍生物、和通过温度敏感的Lac阻遏物调节的经修饰的lac启动子组成的组。
5.权利要求3的方法，其中所述噬菌体λ经修饰的阻遏物是λ阻遏物等位基因cI857或λ阻遏物cI的任何其他温度不稳定的等位基因。
6.权利要求4的方法，其中所述噬菌体λ经修饰的阻遏物是λ阻遏物等位基因cI857或λ阻遏物cI的任何其他温度不稳定的等位基因。
7.权利要求3-6中任一项的方法，其中在所述经修饰的微生物中，基因 recA是缺失的。
8.权利要求1的方法，其中涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因在异源诱导型启动子的间接控制下，所述基因由其表达在诱导型启动子控制下的异源RNA聚合酶转录。
9.权利要求8的方法，其中所述异源RNA聚合酶选自由T7和T3聚合酶组成的组。
10.权利要求1-6和8-9中任一项的方法，其中基因metA的表达也在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。
11.权利要求7的方法，其中基因metA的表达也在异源诱导型启动子的直接或间接控制下。
12.一种经修饰用于甲硫氨酸的改善生产的微生物，所述微生物是大肠杆菌，其中在所述经修饰的微生物中，涉及甲硫氨酸生产的至少一种基因的表达在通过物理刺激诱导的异源诱导型启动子的直接或间接控制下，其中所述至少一种基因是thrA和cysE，所述诱导型启动子选自由温度诱导型启动子或光诱导型启动子组成的组，且其中所述经修饰的微生物还提供如下遗传修饰：
-反馈抗性的metA等位基因、反馈抗性的thrA等位基因、cysE、metH、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF的过表达，和
-基因metJ、pykF、pykA、purU、yncA的缺失。
13.权利要求12的微生物，其包含权利要求2-10中描述的至少一种修饰。
14.权利要求1的方法，其中所述经修饰的微生物还提供serB的过表达。
15.权利要求1的方法，其中在经修饰的微生物中，反馈抗性的thrA等位基因和基因cysE在诱导型启动子的控制下。
16.权利要求14的方法，其中在经修饰的微生物中，所述反馈抗性的thrA等位基因和基因cysE在诱导型启动子的控制下。
17.权利要求12的微生物，其中所述经修饰的微生物还提供serB的过表达。
18.权利要求12的经修饰的微生物，其中在所述微生物中，反馈抗性的thrA等位基因和基因cysE在诱导型启动子的控制下。
19.权利要求17的经修饰的微生物，其中在所述微生物中，所述反馈抗性的thrA等位基因和基因cysE在诱导型启动子的控制下。
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