JP2013516162A - メチオニンの生産のための株および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、トレオニンの変換が減弱された改変株を用いたメチオニンの生産方法に関する。これはトレオニンのグリシンへの分解を低減し、かつ/またはそのα−ケト酪酸への変換を低減することによって達成することができる。本発明はまた、トレオニンの変換が減弱された改変株に関する。
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用すべく工業的に生産される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような障害に対する治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
(A)トレオニンは、トレオニンデヒドロゲナーゼ(Tdh;E.C.1.1.1.103)と2−アミノ3−ケト酪酸−coA−リアーゼ(Kbl;E.C.2.3.1.29)により触媒される2つの逐次反応によってグリシンに変換され得る(Boylan S.A. et al, 1981, Journal of Biological Chemistry, 256, 4, pp 1809-1815; Mukherjee J.J. et al, 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14441-14447)。これらの反応はそれぞれ1分子のアセチル−coAおよびNADHを生じる(Komatsubara S. et al, 1978, Journal of Bacteriology, 1981, 135, pp 318-323)。
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程:
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該微生物がメチオニンよりも他の化合物におけるトレオニンの変換を低減するように改変される方法に関する。
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程:
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該微生物がメチオニンよりも他の化合物へのトレオニンの変換を低減するように改変される方法に関する。
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているような周辺質硫酸結合タンパク質をコードするcysP、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているような硫酸ABC輸送体の成分をコードするcysU、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているような膜結合硫酸輸送タンパク質をコードするcysW、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているような硫酸パーミアーゼをコードするcysA、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなO−アセチルセリンスルフヒドララーゼをコードするcysM、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているような亜硫酸レダクターゼの、それぞれαおよびβサブユニットをコードするcysIおよびcysJ(cysIとcysJはともに過剰発現することが好ましい)、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようにアデニリル硫酸レダクターゼをコードするcysH、
・WO2007/077041に記載されているようなセリンアシルトランスフェラーゼをコードするcysE、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなテトラヒドロ葉酸依存性アミノメチルトランスフェラーゼをコードするgcvT、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなアミノエチル基の担体をコードすることによるグリシン切断に関与するgcvH、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなグリシンデヒドロゲナーゼをコードするgcvP、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなリポアミドデヒドロゲナーゼをコードするIpd、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなホスホグリセル酸デヒドロゲナーゼをコードするserA、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなホスホセリンホスファターゼをコードするserB、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするserC、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするglyA、
・WO2007/077041に記載されているような5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードするmetF、
・WO2005/111202に記載されているようなS−アデノシルメチオニンおよび/またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするmetA対立遺伝子、
・WO2009/043803およびWO2005/111202に記載されているようなトレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ/ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするthrAまたはthrA対立遺伝子、
・WO2007/077041に記載されているようなB12依存性ホモシステイン−N5−メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼをコードするmetH
からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現の増強、および/または
以下の遺伝子:
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなピルビン酸キナーゼをコードするpykA、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなピルビン酸キナーゼをコードするpykF、
・WO2007/077041およびWO2009/043803に記載されているようなホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードするpurU
のうち少なくとも1つの発現の阻害。
(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各PFAMにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
・Metj遺伝子の欠失、
・メチオニンに対するフィードバック感受性が低減された対立遺伝子MetAの発現、および
・上記のような改変の少なくとも1つ
を含んでなる改変微生物に関する。
メチオニン生産株は特許出願WO2007/077041およびWO2009/043372(引用することにより本願の一部とされる)に記載されている。
特許出願WO2007/077041およびPCT/FR2009/052520に記載されているプラスミドpME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11を、エレクトロポレーションによって組換え株MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTUP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykAに導入し、MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysRU Ptrc09−gcvTUP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA(pME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)を得た。
メチオニン生産株は特許出願WO2007077041およびWO2009/043372(引用することにより本願の一部とされる)に記載されている。
ltaE遺伝子を不活化するために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、カナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、DltaEFとDltaERの2つのオリゴヌクレオチドを用いた(ウェブサイトhttp://ecogen.org/に参照配列)。
この配列は以下の領域を有する。
・ltaE領域の908446〜908526の配列と相同な領域(小文字)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
tdh遺伝子を不活化するために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコール耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、DtdhFとDtdhRの2つのオリゴヌクレオチドを用いた(ウェブサイトhttp://ecogen.org/に参照配列)。
この配列は以下の領域を有する。
・tdh領域の3789287〜3789366の配列と相同な領域(小文字)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域(大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
次に、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位に作用するリコンビナーゼFLPを担持するpCP20プラスミドを、エレクトロポレーションによって組換え株MG1655 met A*11 Ptrc−metF PtrcF−cysFUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δlta::Km Δtdh::Cmに導入した。42℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドltaEF/ltaERおよびtdhF/tdhRを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdhと呼称した。
特許出願WO2007/077041およびPCT/FR2009/052520に記載されているプラスミドpME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11を、エレクトロポレーションによって組換え株MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdhに導入し、MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTUP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh(pME101−tArA*1−cysE−PgapA−metA*11)株を得た。
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。5.5mLの前培養物を混合培地(2.5g/Lグルコースおよび90%最小培地PC1を含む10%LB培地(Sigma25%))中、37℃で16時間増殖させた。これを用いて、培地PC1においてOD600が0.2となるよう50mL培養物に植菌を行った。スペクチノマイシンは終濃度50mg/Lで加えた。培養温度は37℃とした。培養物のOD600が5〜7に達した際に、細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたHPLC(有機酸およびグルコース)およびシリル化後のGC−MSを用いて分析した。各株につき3反復を行った。
株2 MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh(pME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)
1.プロトコール
いくつかのプロトコールを用いてメチオニン生産株を構築したが、それらを下記実施例に記載する。
特定の染色体座における対立遺伝子置換または遺伝子破壊を、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されているような相同組換えによって行った。Flp認識部位が隣接するクロラムフェニコール(Cm)耐性cat遺伝子、カナマイシン(Km)耐性kan遺伝子、またはゲンタマイシン(Gt)耐性gm遺伝子を、それぞれ鋳型としてpKD3またはpKD4またはp34S−Gm(Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)プラスミドを用いたPCRにより増幅した。得られたPCR産物を用いて、λ Red(γ、β、exo)リコンビナーゼを発現するプラスミドpKD46を担持するレシピエント大腸菌株を形質転換した。抗生物質耐性変換体を選択し、突然変異を有する遺伝子座の染色体構造を表4に挙げられている適当なプライマーを用いたPCR分析によって確認した。
染色体改変をP1形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に移入した。このプロトコールは、(i)耐性遺伝子関連の染色体改変を含むドナー株に対するファージ溶解液の調製と、(ii)得られたファージ溶解液によるレシピエント株の感染、の2工程から構成される。
・10mlのLB+Km50μg/mlまたは+グルコース0.2%+CaCl2 5mM中、目的の染色体改変を有するMG1655株の一晩培養物100μlを植菌する。
・振盪しながら37℃で30分間インキュベートする。
・ドナーMG1655株で調製されたP1ファージ溶解液100μl(約1×109ファージ/mL)を添加する。
・37℃で3時間、細胞が完全に溶解するまで振盪する。
・200μlのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・4500gで10分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を4℃で保存する。
・LB培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物5mlを1500gで10分間遠心分離する。
・2.5mlのMgSO4 10mM、CaCl2 5mMに細胞ペレットを懸濁させる。
・100μlの細胞に、染色体改変株MG1655のP1ファージ100μl(試験管)および対照試験管としてP1ファージを含まない100μl細胞および細胞を含まない100μlのP1ファージを感染させる。
・振盪せずに30℃で30分間インキュベートする。
・各試験管に100μlの1Mクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・1mlのLBを加える。
・振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。
・7000rpmで3分間遠心分離する。
・LB+Km 50μg/mlに播種する。
・37℃で一晩インキュベートする。
メチオニン生産株3の遺伝子改変(表3)は特許出願EP10306164.4およびUS61/406249(引用することにより本願の一部とされる)に記載されている。株3のDNA配列決定を行った後、予期しないことにsdaA遺伝子にミスセンス突然変異が特定された。この突然変異は構造遺伝子の158番に存在し(T158G)、対応するタンパク質にロイシン53からアルギニンへのアミノ酸変化を生じる。この対立遺伝子をsdaA*1と呼称した。
3.1.sdaA*(T158G)を含む株5の構築
株3においてyobD遺伝子を欠失させるために、プライマーOme1983−DyobD−amplif−F(配列番号09)およびOme1986−DyobD−amplif−R(配列番号10)(表4)を用いて、BW25113 ΔyobD::Km株(Keio collection Baba. et al., Mol Syst Biol, 2, 2006-0)からΔyobD::Km欠失を増幅したこと以外はプロトコール1を用いた。
遺伝子sdaAおよびyobDは、大腸菌染色体上で近接しており(それぞれ40.84minと41.01min)、ファージP1は2minの大腸菌染色体をパッケージングできるので、これらの遺伝子sdaAとyobDは同時に形質導入可能である。これにより、sdaA野生型対立遺伝子とAyobD::Km欠失は、プロトコール2に従い、BW25113 sdaA AyobD::Km株(Keio collection Baba. et al., Mol Syst Biol, 2, 2006-0)から、P1ファージ溶解液を用いて株3(表3)へ同時に形質導入した。
4.1.glyA遺伝子の欠失による株8の構築
株3においてglyA遺伝子を欠失させるために、プライマーOme0641−DglyA R(配列番号13)とOme0642−DglyA F(配列番号14)(下記参照)を用いてプラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅したこと以外はプロトコール1を用いた。カナマイシン耐性組換え体を選択した。この耐性カセットの挿入は、プライマーOme0643−glyA R(配列番号15)とOme0644−glyA F(配列番号16)(表4)を用いたPCR、またDNA配列決定により確認した。得られた株をMG1655 metA*11 ΔglyA::Km pKD46と呼称した。
この配列は以下の領域を有する。
・glyA遺伝子の上流配列(2683451〜2683529、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な大文字の配列
・プラスミドpKD4(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)のプライマー部位2に相当する下線大文字の配列
この配列は以下の領域を有する。
・glyA遺伝子の上流配列(2682298〜2682376、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な大文字の配列
・プラスミドpKD4(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)のプライマー部位1に相当する下線大文字の配列
大腸菌のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させるために、プラスミドpCC1B AC(EpiCentre)およびpSCB(Stratagene)に由来するプラスミドpCC1BAC−PglyA−glyA−TTglyAを構築した。
この配列は以下の領域を有する。
・HindIII制限部位およびEcoRI制限部位ならびに余分な塩基に関する下線大文字の配列
・glyAプロモーター配列(2682063〜2682085、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な太字大文字の配列
この配列は以下の領域を有する。
・BamHI制限部位およびHindIII制限部位ならびに余分な塩基に関する下線大文字の配列
・glyA遺伝子の転写ターミネーター(2683744〜2683762、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な太字大文字の配列
pSCB−PglyA−glyA * (R235K)−TTglyAの構築
プラスミドpCC1BAC−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAを構築するために、プライマーOme1483−glyA* R R235K(配列番号19)とOme1482−glyA* F R235K(配列番号20)を用いてプラスミドpSCB−PglyA−glyA−TTglyAを構築した。親DNA鋳型を除去するためにこのPCR産物をDpnIで消化した。得られた接着性のオーバーハングをリン酸化し、大腸菌株に導入し、プラスミドpSCB−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAを形成した。このPglyA−glyA*(R235K)−TTglyA挿入配列、特に、glyA遺伝子におけるR235K(703−AAA−705)突然変異の存在をDNA配列決定により確認した。
この配列は以下の領域を有する。
・glyA遺伝子(2682802〜2682850、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な大文字の配列
・挿入されたコドン突然変異CGC−708−TTT(R235K)に相当する太字大文字
・StuI制限部位を出現させるサイレント点突然変異(G704T)に相当する下線大文字
この配列は以下の領域を有する。
・glyA遺伝子(2682802〜2682850、ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)と相同な大文字の配列
・挿入されたコドン突然変異CGC−708−TTT(R235K)に相当する太字大文字
・StuI制限部位を出現させるサイレント点突然変異(G704T)に相当する下線大文字
pCC1BAC−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAを構築するために、下記のpSCB−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAからHindIII断片PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAを精製し、プラスミドpCC1BACのHindIII部位間にクローニングした。選択されたプラスミドは、プラスミドpCC1BACのlacZプロモーター配向とは逆配向にPglyA−glyA*(R235K)−TTglyA挿入配列を持っており、これをDNA配列決定により確認し、pCC1BAC−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAと呼称した。
pCL1920−PglyA−glyA−TTglyAの構築
プラスミドpCL1920−PglyA−glyA−TTglyAは、プラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)および上記のpCC1BAC−P glyA−glyA−TTglyAに由来するものである。
pCL1920−PglyA−glyA * (R235K)−TTglyAの構築
プラスミドpCL1920−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAは、プラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)および上記のpCC1BAC−PglyA−glyA*(R235K)−TTglyAに由来するものである。
1.glyAまたはglyA*対立遺伝子のいずれかを有する生産株の評価
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。5.5mLの前培養物を混合培地(2.5g/Lグルコースおよび90%最小培地PC1を含む10%LB培地(Sigma25%))中、30℃で21時間増殖させた。これを用いて、培地PC1(表5の組成)においてOD600が0.2となるよう50mL培養物に植菌を行った。必要であれば、カナマイシンおよびスペクチノマイシンを50mg/L濃度で加え、クロラムフェニコールを30mg/L濃度で加えた。培養温度は37℃とした。培養物のOD600が5〜7に達した際に、細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたHPLC(有機酸およびグルコース)およびシリル化後のGC−MSを用いて分析した。
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(SHMT)、トレオニンアルドラーゼ(TAL)およびアロトレオニンアルドラーゼ(aTAL)活性のin vitro測定については、大腸菌株を上記のような最小培地で培養し、対数増殖期の終了時に遠心分離によりバイオマスを回収した。ペレットをEDTAとともにプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する冷20mMリン酸カリウムバッファーpH7.2に再懸濁させた。その後、細胞をPreCellys(Bertin Technologies;2×10秒6500rpm)でビーズビーティングを行うことで溶解させた後、4℃にて30分12000gで遠心分離を行った。上清を脱塩し、酵素分析に用いた。タンパク質濃度はBradfordアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。
(1)L−セリン+THF+2H+←→グリシン+5,10−メチレン−THF(SHMT反応)
(2)5,10−メチレン−THF+NADP+←→5,10−メテニル−THF+NADPH(MTHFD反応)
1.sdaArc(株7)またはsdaA*(株5)のいずれかを有する生産株の評価
流加法を用いた2.5L発酵槽(Pierre Guerin)での生産条件下で株を試験した。カナマイシンおよびスペクチノマイシン(spectinopycin)を各培地に50mg/Lの濃度で加えた。簡単に述べれば、2.5g/Lグルコースを含む10mLのLB培地で増殖させた24時間培養物を用いて、最小培地(B1a)中24時間前培養物に植菌した。これらのインキュベーションは、ロータリーシェーカー(200RPM)にて、50mLの最小培地(B1a)の入った500mLバッフル付きフラスコ中で行った。初回の前培養物を30℃で増殖させ、2回目の前培養物を34℃で増殖させた。
により算出した。
消費グルコースt=[グルコース]0 *V0+注入グルコース−[グルコース]残留 *Vt
[グルコース]0、[グルコース]、[グルコース]残留はそれぞれ最初のグルコース濃度、供給グルコース濃度および残留グルコース濃度である。
SDA活性のin vitro測定については、大腸菌株を上記のような最小培地で培養し、遠心分離により回収した。ペレットを、3mM FeSO4、30mM DTTおよびEDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む冷50mMグリシルグリシンバッファー(pH8)に懸濁させた。その後、細胞をPreCellys(Bertin Technologies;2×10秒6500rpm)でビーズビーティングを行うことで溶解させた後、12000g(4℃)にて30分遠心分離を行った。上清を脱塩し、酵素分析に用いた。タンパク質濃度はBradfordアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。上清を脱塩せずに、酵素分析に用いた。タンパク質濃度はBradfordアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。
Claims (16)
- 発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程:
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該微生物が、メチオニンよりも他の化合物におけるトレオニンの変換を低減するように改変される、方法。 - トレオニンからのグリシンの生産が低減される、請求項1に記載の方法。
- トレオニンをグリシンに変換する酵素の活性が低減される、請求項2に記載の方法。
- 下記遺伝子:ltaE、kbl、glyA、tdhのうち少なくとも1つの発現が減弱される、請求項3に記載の方法。
- 酵素GlyAのセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を維持しつつトレオニンアルドラーゼ活性が減弱されている変異GlyA酵素が発現される、請求項4に記載の方法。
- 前記GlyA酵素が、そのポリペプチド配列において下記のアミノ酸変化:T128S、T224S、T225S、T226S、T227S、T230S、R235Kのうち少なくとも1つを有する、請求項5に記載の方法。
- 内因性遺伝子glyAが、微生物から欠失されている、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物が、トレオニンからのイソロイシンの生産が低減されるように改変される、請求項1に記載の方法。
- トレオニンからα−ケト酪酸への脱アミノ化および/または脱水が低減される、請求項8に記載の方法。
- 下記の酵素活性:トレオニンデアミナーゼ、トレオニンデヒドラターゼのうち少なくとも1つが減弱される、請求項9に記載の方法。
- 下記遺伝子:ilvA、tdcB、sdaA、sdaB、tdcGのうち少なくとも1つの発現が減弱される、請求項10に記載の方法。
- 微生物のセリン利用能が増大される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- セリン生産が、遺伝子serA、serB、serCの少なくとも1つの発現を増強することにより微生物において増大される、請求項12に記載の方法。
- セリン分解が、セリンデアミナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子sdaAまたはsdaBのうち少なくとも1つの活性を減弱することにより低減される、請求項12または13に記載の方法。
- sdaA遺伝子が、その核酸配列にT158Gヌクレオチド変化を有する、請求項11または14に記載の方法。
- ・metJ遺伝子の欠失、
・メチオニンに対するフィードバック感受性が低減された対立遺伝子metAの発現、および
・請求項1〜15のいずれか一項に記載されているものなどの少なくとも1つの改変
を含んでなる微生物。
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