ES2459617T3

ES2459617T3 - Procedimiento para la preparación de metionina y sus precursores homoserina o succinilhomoserina que utiliza un microorganismo

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Publication number: ES2459617T3
Application number: ES06707666.1T
Authority: ES
Inventors: Rainer Figge; Fabien Lux; Céline RAYNAUD; Michel Chateau; Philippe Soucaille
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2006-01-04
Publication date: 2014-05-12
Anticipated expiration: 2026-01-04
Also published as: EP1969130A1; JP2009521939A; DK2314710T3; PL1969130T3; CN101351558B; EP2314710A3; US9187775B2; CN101351558A; EP2314710B1; MY148979A; EP2314710A2; WO2007077041A1; BRPI0620880A2; US20080311632A1; US8389250B2; AR058914A1; US20130183726A1; EP1969130B1; JP5172697B2; BRPI0620880B1

Abstract

Procedimiento para la producción de metionina, sus derivados o precursores mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre, y la recuperación de la metionina a partir del medio de cultivo, en el que: - la expresión del gen cysE, involucrado en la producción de cisteína, está aumentada en el microorganismo, y - la expresión del gen metH, involucrado en la producción de unidades C1 y la transferencia a la homocisteína, está aumentada y/o impulsada por un promotor heterólogo, y - el(los) alelo(s) de homoserina succiniltransferasa (MetA), que codifica(n) enzima(s) con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la S-adenosil-metionina y/o la metionina, está(n) integrado(s) en el microorganismo.

Description

Procedimiento para la preparación de metionina y sus precursores homoserina o succinilhomoserina que utiliza un microorganismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo adecuado, que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre. El microorganismo reivindicado se modifica de tal modo que se mejora la producción de cisteína y/o unidades C1, y/o se aumenta u optimiza el potencial de transferencia de las unidades C1 a la homocisteína. También se reivindica el aislamiento de la metionina o sus derivados a partir del medio de fermentación.

Técnica anterior

Los compuestos que contienen azufre, tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosil-metionina, son esenciales para el metabolismo celular y se producen a escala industrial para su utilización como aditivos en alimentos destinados al consumo humano o animal, y como productos farmacéuticos. Particularmente, la metionina, un aminoácido esencial que no puede ser sintetizado por los animales, tiene un papel importante en muchas funciones del organismo. Además de su papel en la biosíntesis de proteínas, participa en la transmetilación y la biodisponibilidad del selenio y el cinc. La metionina también se utiliza directamente como tratamiento para trastornos como la alergia y la fiebre reumática. Sin embargo, la mayor parte de la metionina que se produce se incorpora a alimentos para animales.

Tras la disminución de la utilización de proteínas derivadas de animales a consecuencia de la EEB y de la gripe aviar, ha aumentado la demanda de metionina. Desde el punto de vista químico, la D,L-metionina se produce habitualmente a partir de acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, la mezcla racémica no funciona tan bien como la L-metionina pura, por ejemplo en aditivos para piensos de pollo (Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition, 54, 621-633). La L-metionina pura se puede producir a partir de la metionina racémica, por ejemplo, a través del tratamiento de la N-acetil-D,L-metionina con acilasa, lo que incrementa enormemente los costes de producción. La creciente demanda de L-metionina pura, unida a los aspectos medioambientales, han hecho crecer el interés por la producción microbiana de la metionina.

Los microorganismos han desarrollado mecanismos de regulación muy complejos que ajustan con precisión la biosíntesis de los componentes celulares, lo que les proporciona mayores tasas de proliferación. De este modo, únicamente se sintetizan las cantidades necesarias de metabolitos, tales como aminoácidos, y por regla general no se pueden detectar en el sobrenadante del cultivo de las cepas naturales. Las bacterias controlan la biosíntesis de los aminoácidos básicamente por retroinhibición de enzimas y por represión o activación de la transcripción de genes. En muchos casos, los efectores de estas vías de regulación son los productos finales de las vías principales. Por ello, las estrategias para la sobreproducción de aminoácidos en los microorganismos requieren la desregulación de estos mecanismos de control.

La vía para la síntesis de la L-metionina se conoce bien en muchos microorganismos. La metionina deriva del aminoácido aspartato, pero su síntesis requiere la convergencia de dos vías adicionales: la biosíntesis de cisteína y el metabolismo C1 (N-metiltetrahidrofolato). El aspartato se convierte en homoserina a través de una secuencia de tres reacciones. A continuación, la homoserina puede entrar en la vía biosintética de treonina/isoleucina o de metionina. En la E. coli, la entrada en la vía de la metionina requiere la acilación de la homoserina a succinilhomoserina. Esta etapa de activación permite la posterior condensación con la cisteína, obteniéndose la cistationina, que contiene tioéter, la cual se hidroliza para obtener la homocisteína. La transferencia de metilo final, con la que se obtiene la metionina, se lleva a cabo a través de una metiltransferasa dependiente o independiente de la vitamina B12. La biosíntesis de metionina en la E. coli está regulada por la represión y la activación de los genes de la biosíntesis de metionina a través de las proteínas MetJ y MetR, respectivamente (descrito en Neidhardt, F. C. (editor jefe), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechtez y

H. E. Umbarger (eds.), 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology; Weissbach y otros, 1991, Mol. Microbiol., 5, 1593-1597). se sabe que la proteína MetJ, junto con su correpresor S-adenosil-metionina, regula los genes metA, metB, metC, metE y metF. Otros genes que codifican enzimas implicadas en la producción de metionina, como glyA, metE, metH y metF, son activados por la proteína MetR, mientras que el metA es reprimido por la MetR. Todas las enzimas correspondientes participan en la producción y la transferencia de unidades C1 de la serina a la metionina. El gen glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa, cataliza la conversión de serina en glicina y la transferencia concomitante de una unidad C1 a la coenzima tetrahidrofolato (THF). La unidad C1 en forma de metileno-THF debe reducirse a metil-THF antes de que pueda transferirse a la homocisteína para producir metionina. Esta reacción está catalizada por la proteína MetF. La transferencia del grupo metilo está catalizada por la proteína MetH, a través de la vitamina B12, o directamente por la proteína MetE. Se sabe que la enzima MetH tiene una velocidad catalítica cien veces mayor que la enzima MetE. En ausencia de vitamina B12, y por consiguiente de MetH activa, la MetE puede representar hasta el 5% de las proteínas celulares totales. La presencia de MetH activa reduce la actividad de la MetE, probablemente

por la reducción de la cantidad de homocisteína que normalmente activa la transcripción del gen metE a través de la MetR. Por consiguiente, la producción de metionina a través de MetH ahorra recursos importantes para la célula, al no expresar grandes cantidades de MetE. La acumulación de homocisteína es tóxica para la E. coli (Tuite y otros, 2005, J. Bacteriol., 187, 13, 4362-4371), y al mismo tiempo tiene un efecto negativo y regulador sobre la expresión del metA a través de la MetR. Por consiguiente, es claramente necesaria una expresión fuerte de las enzimas MetH y/o MetE para una producción eficiente de metionina.

En la E. coli, el azufre reducido se integra en la cisteína y posteriormente se transfiere al precursor de la metionina O-succinil-homoserina, un proceso llamado transsulfuración (descrito en Neidhardt, F. C. (editor jefe), R. Curtiss III,

J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger (eds.), 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology). La cisteína se produce a partir de O-acetil-serina y H2S por sulfhidrilación. El proceso está negativamente retrorregulado por el producto, la cisteína, que actúa sobre la serina transacetilasa, codificada por cysE. La N-acetil-serina, que se produce espontáneamente a partir de O-acetil-serina, junto con el factor de transcripción CysB, activa los genes que codifican las enzimas implicadas en el transporte de los compuestos de azufre, su reducción a H2S y su integración en el compuesto orgánico de azufre cisteína, que, como la metionina, es un aminoácido esencial.

En ausencia de cisteína, la MetB cataliza la conversión del precursor de metionina O-succinil-homoserina en amoníaco, a-cetobutirato y succinato, una reacción llamada eliminación y (Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys, 433, 166-75). A continuación, el a-cetobutirato se puede convertir en isoleucina. Esta reacción secundaria no es deseable para la producción industrial de metionina, ya que estos dos aminoácidos son difíciles de separar. Por consiguiente, una actividad de eliminación y baja es un aspecto importante para la producción industrial de metionina. La solicitud de patente provisional US 60/650.124, presentada el 7 de febrero de 2005, describe cómo se puede reducir la eliminación y mediante la optimización de la enzima MetB. La optimización del flujo de biosíntesis de la cisteína también puede reducir la eliminación y y, por consiguiente, la producción del subproducto isoleucina, y constituye una forma de realización de la presente invención.

Descripción general de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina, sus precursores o sus productos derivados en un proceso fermentativo, utilizando microorganismos con una producción aumentada de cisteína y que proliferan en una fuente de carbono y azufre definida, tal como se define en las reivindicaciones.

Los precursores de la metionina se definen como metabolitos que forman parte de la vía metabólica específica de la metionina, o que pueden derivarse de estos metabolitos. La vía específica de la metionina se inicia con la transformación de la homoserina en succinil-homoserina por parte de la enzima homoserina succiniltransferasa (MetA).

Los productos derivados de la metionina se originan a través de vías de transformación y/o degradación de la metionina.

Para aumentar la producción de cisteína, se ha potenciado la expresión de los genes implicados en la producción de cisteína.

En este contexto, el término “potenciar” describe el aumento de la actividad intracelular de una actividad enzimática codificada por el ADN correspondiente, por ejemplo, aumentando el número de copias del gen, utilizando un promotor fuerte o utilizando un alelo con una mayor actividad, y posiblemente combinando estas posibilidades.

Los términos “aumento de la expresión” o “potenciación de la expresión” se utilizan en la presente memoria y tienen un significado similar.

Para aumentar la expresión de un gen, éste puede estar codificado cromosómica o extracromosómicamente. Cromosómicamente, se pueden introducir una o varias copias en el genoma por métodos de recombinación conocidos por el experto en la materia. Extracromosómicamente, los genes pueden estar soportados por diferentes tipos de plásmidos, que difieren en cuanto a su origen de replicación y, por consiguiente, su número de copias en la célula. Pueden estar presentes a razón de 1 a 5 copias, aproximadamente 20 copias o hasta 500 copias, correspondientes a plásmidos de bajo número de copias con replicación restringida (pSC101, RK2), plásmidos de bajo número de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de alto número de copias (pSK Bluescript II).

En una forma de realización preferida de la presente invención, el gen se puede expresar utilizando promotores con diferente fuerza, que necesitan ser inducidos o no por moléculas inductoras. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Los ejemplos de los mismos son los promotores Ptrc, Ptac, Plac, el promotor lambda cI u otros promotores conocidos por el experto en la materia.

La expresión de los genes diana puede impulsarse o reducirse mediante elementos que estabilizan o desestabilizan el correspondiente ARN mensajero (Carrier y Keasling (1998), Biotechnol. Prog., 15, 58-64) o la proteína (por ejemplo, las etiquetas GST, Amersham Biosciences).

La presente invención también se refiere a microorganismos que contienen uno o varios alelos del gen que se pretende potenciar, según la presente invención.

5 En una forma de realización particular de la presente invención, se potencia la expresión de los genes implicados en la producción de cisteína.

Los genes implicados en la producción de cisteína comprenden genes que codifican proteínas necesarias para la 10 importación de una fuente de azufre, la transformación de esta fuente de azufre en sulfuro de hidrógeno y la asimilación del sulfuro de hidrógeno o la fuente de azufre en cisteína o sus derivados.

En la E. coli, estas proteínas están codificadas por los siguientes genes (acompañados de sus números de entrada y de la función del polipéptido correspondiente): 15

Gen Número de entrada Función cysA 1788761 Sulfato permeasa cysU, cysT 1788764 Componente de transportador ABC de sulfato cysW 1788762 Proteína de transporte de sulfato unida a la membrana cysZ 1788753 ORF secuencia arriba de cysK cysN 1789108 ATP sulfurilasa cysD 1789109 Sulfato adenililtransferasa cysC 1789107 Adenililsulfato cinasa cysH 1789121 Adenililsulfato reductasa cysI 1789122 Sulfito reductasa, subunidad alfa cysJ 1789123 Sulfito reductasa, subunidad beta cysE 1790035 Serina acetiltransferasa cysK 1788754 Cisteína sintasa cysM 2367138 O-acetil-serina sulfhidrilasa cysZ 1788753 Transporte de sulfato sbp 1790351 Proteína periplásmica de unión a sulfato

En la descripción de la presente invención, los genes y las proteínas se identifican mediante las denominaciones de los genes de E. coli correspondientes. Sin embargo, y a menos que se indique lo contrario, el uso de estas denominaciones tiene, según la presente invención, un significado más general, abarcando todos los genes y

20 proteínas correspondientes de otros organismos, más particularmente microorganismos.

La PFAM (base de datos de familias de proteínas con alineamientos y modelos ocultos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) presenta una gran colección de alineamientos de secuencias proteicas. Cada PFAM permite visualizar múltiples alineamientos, ver los dominios de las proteínas, evaluar su distribución

25 entre los organismos, tener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras de proteínas conocidas.

Los COG (clústeres de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen comparando secuencias proteicas de 66 genomas completamente secuenciados que representan 30 líneas filogenéticas principales. Cada COG se define por lo menos a partir de tres líneas, lo que permite la identificación de los dominios

30 anteriores conservados.

Las maneras de identificar secuencias homólogas y sus homologías porcentuales son bien conocidas por los expertos en la materia, e incluyen, particularmente, los programas BLAST, que se pueden utilizar a través de la página web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros por defecto que se indican en la misma. A

35 continuación, las secuencias obtenidas se pueden explotar (por ejemplo, alinearse), por ejemplo, mediante los programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgibin/multalin.pl), con los parámetros por defecto indicados en estas páginas web.

A partir de las referencias indicadas en GenBank para los genes conocidos, los expertos en la materia podrán

40 determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo de rutina se lleva a cabo ventajosamente utilizando secuencias de consenso, que se pueden determinar realizando alineamientos de secuencias con genes derivados de otros microorganismos y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos métodos rutinarios en biología molecular son bien conocidos por los expertos en la materia, y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros

45 (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nueva York.).

En una forma de realización preferida, el microorganismo que se utiliza en el procedimiento según la presente invención se modifica a fin de aumentar la expresión de cysE, que codifica la serina transacetilasa.

50 La presente invención también se refiere a microorganismos que contienen uno o varios alelos que codifican la serina transacetilasa según la presente invención.

Dichas cepas se caracterizan por el hecho de que poseen un metabolismo de cisteína que permite un mayor flujo hacia la metionina, proporcionando un aumento de la concentración de sustrato para la síntesis de y-cistationina,

5 una reacción catalizada por la MetB. A bajas concentraciones de cisteína, la enzima MetB produce amoníaco, succinato y a-cetobutirato a partir de succinil-homoserina, una reacción llamada eliminación y. La mayor concentración de cisteína reduce la cantidad de a-cetobutirato producido y, en consecuencia, aumenta el flujo hacia la metionina.

10 El aumento de la expresión de las actividades de la serina transacetilasa se puede comprobar en ensayos enzimáticos con serina y acetil-CoA. La reacción se inicia mediante la adición del extracto proteico que contiene actividad de serina transacetilasa, y la formación de O-acetil-serina se controla por CG-EM tras la precipitación de la proteína y la derivatización con un reactivo de sililación.

15 La presente invención se refiere también al aumento de la expresión del gen cysM, que codifica la O-acetil-serina sulfhidrilasa, que permite una mayor integración del tiosulfato en la sulfocisteína que impulsa la producción de cisteína.

Así, la presente invención reivindica un procedimiento en el que la eliminación y y, por consiguiente, la producción 20 de isoleucina, se reducen optimizando la producción de cisteína.

Un promotor heterólogo, según la presente invención, se entiende como el promotor natural modificado, o cualquier promotor de otro organismo, o un promotor completamente sintético. Preferentemente, el promotor heterólogo es un promotor fuerte, tal como Ptrc, Ptac, lambda cI u otros promotores conocidos por el experto en la materia.

25 En otra forma de realización preferida de la presente invención, se reivindica un procedimiento en el que se utiliza un microorganismo para la producción de metionina o sus derivados, en el que la expresión de los genes implicados en la producción de unidades C1 y/o su potencial de transferencia a la homocisteína está o están aumentados u optimizados.

30 Según la presente invención, la optimización se lleva a cabo adaptando el nivel de expresión del gen en cuestión a fin de obtener la máxima producción de metionina. En la mayoría de los casos, esto se consigue mediante la creación de bibliotecas de expresión del gen en cuestión utilizando, por ejemplo, promotores heterólogos, y haciendo un cribado para identificar los mejores productores.

35 Según la presente invención, el término “unidad C1” describe átomos de carbono individuales enlazados a la molécula portadora tetrahidrofolato en forma de grupos metilo, metileno, metenilo o formilo.

El término “potencial de transferencia” designa la capacidad de los microorganismos para transferir unidades C1 a la 40 homocisteína. Este potencial está determinado por las actividades de MetF y/o MetH, que han sido mejoradas y/u optimizadas por los presentes inventores.

Los genes implicados en la producción de unidades C1 se indican a continuación:

serA 1789279 Fosfoglicerato deshidrogenasa serB 1790849 Fosfoserina fosfatasa serC 1787136 Fosfoserina aminotransferasa glyA 1788902 Serina hidroximetiltransferasa gcvT 1789272 Aminometil transferasa dependiente de tetrahidrofolato gcvH 1789271 Escisión de glicina, portador de grupo aminometilo gcvP 1789269 Glicina deshidrogenasa (descarboxilante) lpd 1786307 Lipoamida deshidrogenasa

45 Los genes implicados en la transferencia de las unidades C1 a la homocisteína se indican a continuación:

metF 1790377 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa metH 1790450 Homocisteína-N5-metiltetrahidrofolato transmetilasa dependiente de la vitamina B12 metE 2367304 Tetrahidropteroiltriglutamato metiltransferasa

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el microorganismo que se utiliza 50 para la producción de metionina se modifica a fin de aumentar la expresión de metF o metH, o ambos, o para expresar metF a partir de un promotor heterólogo.

El aumento de la actividad de la metionina sintasa (MetH) dependiente de la vitamina B12 se puede comprobar en ensayos enzimáticos con metil-THF y homocisteína en presencia de vitamina B12 y SAM. La reacción se inicia 55 mediante la adición del extracto proteico que contiene actividad de metilentetrahidrofolato reductasa, y la formación

de la metionina se comprueba por CG-EM tras la precipitación de la proteína y la derivatización con un reactivo de sililación.

La producción de metionina se puede aumentar adicionalmente incrementando la expresión de genes adicionales 5 implicados en la biosíntesis de la metionina, que también es objeto de la presente invención.

Estos genes se indican a continuación:

metA 1790443 Homoserina succiniltransferasa metB 1790375 Cistationina y-sintasa metC 1789383 Cistationina �-liasa metF 1790377 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa metR 1790262 Gen regulador positivo para metE, metH y metF

10 Además, la expresión de los genes en las vías de degradación de la metionina o que se desvían de la vía de producción de metionina se pueden reducir, o los genes se pueden eliminar.

speD 1786311 S-adenosil-metionina descarboxilasa speC 1789337 Ornitina descarboxilasa astA 1788043 Arginina succiniltransferasa dapA 1788823 Dihidrodipicolinato sintasa

Se pueden potenciar las reacciones anapleróticas mediante la expresión de los siguientes genes:

15 ppc 1790393 Fosfoenolpiruvato pps 1787994 Fosfoenolpiruvato sintasa

Las reacciones que consumen acetato se pueden potenciar mediante la sobreexpresión de los siguientes genes:

acs 1790505 Acetil-CoA sintetasa

20 Se puede alcanzar un aumento adicional de la producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos mediante la sobreexpresión de uno o varios de los siguientes genes: piruvato carboxilasas, por ejemplo de Rhizobium etli (pyc, U51439), o uno de sus homólogos, las enzimas que sintetizan homoserina codificadas por los genes thrA (homoserina deshidrogenasa/aspartocinasa, 1786183), preferentemente con una sensibilidad de retroalimentación reducida, metL (homoserina deshidrogenasa/aspartocinasa, g1790376) o lysC

25 (aspartocinasa, 1790455) y asd (aspartato semialdehído deshidrogenasa).

Se alcanza un aumento adicional de la producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos, mediante la deleción del gen que codifica la proteína represora MetJ, responsable de la regulación a la baja del regulón de metionina, tal como se propone en el documento JP 2000157267-A/3 (véase también GenBank

30 1790373).

La producción de metionina se aumenta adicionalmente mediante la utilización de alelos de homoserina succiniltransferasa con una sensibilidad de retroalimentación reducida con respecto a sus inhibidores SAM y metionina, tal como se describe en la solicitud de patente WO 2005/111202, que se incorpora al presente

35 documento.

Se puede alcanzar un aumento de la producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos mediante la atenuación de la actividad o la deleción de uno de los siguientes genes.

40 En este contexto, el término “atenuación” se refiere a la reducción de la actividad intracelular de una enzima a través de medidas como la reducción de su expresión, la reducción de su estabilidad, el aumento de su degradación y/u otras soluciones conocidas por el experto en la materia.

Gen Entrada en GenBank Actividad ackA 1788633 Acetato cinasa pta 1788635 Fosfotransacetilasa aceE 1786304 Piruvato deshidrogenasa E1 aceF 1786305 Piruvato deshidrogenasa E2 lpd 1786307 Piruvato deshidrogenasa E3 sucC 1786948 Succinil-CoA sintetasa, subunidad beta sucD 1786949 Succinil-CoA sintetasa, subunidad alfa pck 1789807 Fosfoenolpiruvato carboxicinasa pykA 1788160 Piruvato cinasa II pykF 1787965 Piruvato cinasa I

Gen: Entrada en GenBank Actividad

poxB: 1787096 Piruvato oxidasa

ilvB: 1790104 Acetohidroxiácido sintasa I, subunidad grande

ilvN: 1790103 Acetohidroxiácido sintasa I, subunidad pequeña

ilvG: 1790202 Acetohidroxiácido sintasa II, subunidad grande

1790203

ilvM: 1790204 Acetohidroxiácido sintasa II, subunidad pequeña

ilvI: 1786265 Acetohidroxiácido sintasa III, subunidad grande

ilvH: 1786266 Acetohidroxiácido sintasa III, subunidad pequeña

aroF: 1788953 DAHP sintetasa

aroG: 1786969 DAHP sintetasa

aroH: 1787996 DAHP sintetasa

thrB: 1786184 Homoserina cinasa

thrC: 1786185 Treonina sintasa

sdaA: 1788116 Serina desaminasa

sdaB: 1789161 Serina desaminasa

La producción de metionina se puede aumentar adicionalmente mediante la utilización de un alelo modificado de metB que utiliza preferente o exclusivamente H2S y, de este modo, produce homocisteína a partir de O-succinilhomoserina, tal como se ha descrito en la solicitud de patente WO 2004/076659, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia.

La fuente de azufre que se utiliza para la producción fermentativa de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos, puede ser cualesquiera de las siguientes, o una combinación de las mismas: sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionito, sulfito.

En una forma de realización preferida de la presente invención, la fuente de azufre es sulfato y/o tiosulfato.

La presente invención también se refiere al procedimiento de producción de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos, que comprende la fermentación del microorganismo productor de la metionina descrito anteriormente, la concentración de la metionina, sus precursores o derivados de los mismos, y el aislamiento del producto deseado a partir del caldo de fermentación.

Según la presente invención, los términos “cultivo” y “fermentación” se utilizan indistintamente para designar la proliferación de un microorganismo en un medio de cultivo adecuado, que contiene una fuente de carbono simple.

Según la presente invención, una fuente de carbono simple es una fuente de carbono que puede ser utilizada por los expertos en la materia para obtener la proliferación normal de un microorganismo, particularmente una bacteria. Particularmente, puede ser un sacárido asimilable, tal como glucosa, galactosa, sacarosa, lactosa o melazas, o subproductos de estos sacáridos. Una fuente de carbono simple particularmente preferente es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferente es la sacarosa.

Los expertos en la materia son capaces de definir las condiciones de cultivo para los microorganismos según la presente invención. Particularmente, las bacterias se fermentan a una temperatura comprendida entre 20ºC y 55ºC, preferentemente entre 25ºC y 40ºC, y más específicamente de aproximadamente 30ºC en el caso de C. glutamicum y de aproximadamente 37ºC en el caso de E. coli.

Habitualmente, la fermentación se lleva a cabo en fermentadores con un medio de cultivo inorgánico de composición conocida y definida, adaptada a las bacterias utilizadas y que contiene, como mínimo, una fuente de carbono simple y, dado el caso, un cosustrato necesario para la producción del metabolito.

Particularmente, el medio de cultivo inorgánico para la E. coli puede tener una composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) o un medio como el definido por Schaefer y otros (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).

Análogamente, el medio de cultivo inorgánico para C. glutamicum puede tener una composición idéntica o similar a un medio BMCG (Liebl y otros, 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o a un medio como el descrito por Riedel y otros (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583). Estos medios se pueden complementar a fin de compensar las auxotrofias introducidas por las mutaciones.

Tras la fermentación, la L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de los mismos, se recupera o recuperan y, si es necesario, se purifican. Los métodos para la recuperación y purificación en los medios de cultivo del compuesto producido, por ejemplo la metionina, son bien conocidos por los expertos en la materia.

Opcionalmente, entre el 0% y el 100% de la biomasa se puede retener durante la purificación del producto de fermentación.

La presente invención también se refiere a un microorganismo optimizado para la producción fermentativa de la 5 metionina.

El término “microorganismo optimizado” se refiere a un microorganismo en el que las modificaciones descritas anteriormente están integradas y proporcionan el mejor rendimiento industrial para la producción del metabolito o metabolitos deseados y, eventualmente, la menor producción de productos secundarios.

10 En una aplicación preferida, el organismo es E. coli o C. glutamicum o Saccharomyces cerevisiae.

En la aplicación más preferida, el organismo es E. coli.

15 Descripción detallada de la invención

En el documento de patente PCT N° PCT/IB04/001901, pre sentada el 12 de mayo de 2004, se describe una cepa de

E. coli en la que el represor de metionina codificado por el gen metJ ha sido sustituido por un casete de cloranfenicol

(LmetJ::Cm) y que aloja un alelo metA con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la metionina y la SAM 20 (metA*11). En esta cepa se introdujeron las siguientes modificaciones genéticas.

Construcción de MG1655 metA*11LmetJ::Cm Ptrc-metF::Km

Para clonar el gen metF bajo el control del promotor Ptrc heterólogo, se utilizó la estrategia de recombinación

25 homóloga descrita por Datsenko y Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o a kanamicina cerca de los genes de interés. Con este fin, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

Ptrc-metF R (SEC ID nº 1)

con:

-: una región (mayúsculas) homóloga a la secuencia (4130259-4160195) del gen metF (secuencia de referencia

en la página web http://genolist.pasteur.ft/Colibri/) 35

-: una región (cursiva) homóloga a la secuencia del promotor Ptrc con el RBS (negrita) y las cajas -35 y -10 (negrita)

-: una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de 40 referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)

Ptrc-metF F (SEC ID nº 2)

45 con:

-: una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4130114-4130195) de la región del gen metF (secuencia de referencia en la página web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)

50 - una región (cursiva, minúsculas) homóloga a la secuencia de la región terminal del bacteriófago T7 (GenBank V01146)

-: una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

55 Los oligonucleótidos Ptrc-metF F y Ptrc-metF R se utilizaron para amplificar el casete de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. A continuación, el producto de la PCR se introdujo por electroporación en la cepa MG1655 metA*11 LmetJ (pKD46), donde la expresión de la enzima recombinasa Red permite la recombinación homóloga. Se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina y la inserción del casete de resistencia se verificó

60 mediante análisis por PCR con los oligonucleótidos Ptrc-metFv F y Ptrc-metFv R, que se definen a continuación.

Ptrc-metFv F (SEC ID nº 3) GCCCGGTACTCATGITITCGGGTITATGG (homóloga a la secuencia de 4129866 a 4129894).

Ptrc-metFv R (SEC ID nº 4): CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG (homóloga a la secuencia de 4130524 a 4130497).

La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF:Km.

Construcción del plásmido pME101-thrA*1-cysE

pME101-thrA*1

Para potenciar la producción de homoserina, se expresó thrA*, que codifica aspartocinasa/homoserina con una resistencia de retroalimentación reducida a treonina a partir del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15, p. 4631) utilizando el promotor Ptrc. Para la construcción del plásmido pME101-thrA*1, el thrA se amplificó por PCR a partir de ADN genómico utilizando los siguientes oligonucleótidos:

BspH1thrA (SEC ID nº 5): ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc

Sma1thrA (SEC ID nº 6): ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc

El fragmento amplificado por PCR se cortó con las enzimas de restricción BspHI y SmaI, y se clonó en los sitios NcoI/SmaI del vector pTRC99A (Stratagene). Para la expresión a partir de un vector de bajo número de copias, se construyó el plásmido pME101 del modo siguiente. El plásmido pCL1920 se amplificó por PCR utilizando los oligonucleótidos PME101F y PME101R, y el fragmento BstZ17I-XmnI del vector pTRC99A que aloja el gen lacI y el promotor Ptrc se insertaron en el vector amplificado. El vector resultante y el vector que aloja el gen thrA se sometieron a restricción por ApaI y SmaI, y el fragmento que contenía el thrA se clonó en el vector pME101. Para liberar la ThrA de la retroinhibición, se introdujo la mutación F318S por mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene) utilizando los oligonucleótidos ThrAF F318S y ThrAR F318S, obteniéndose el vector pME101-thrA*1.

PME101F (SEC ID nº 7): Ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R (SEC ID nº 8): Agcttagtaaagccctcgctag

ThrAF F318S (SmaI) (SEC ID nº 9): Ccaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccggg

ThrAR F318S (SmaI)(SEC ID nº 10): Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg

pNM101-thrA*1-cysE

Para la construcción de pME101-thrA*1-cysE, el gen cysE se amplificó por PCR utilizando los oligonucleótidos Ome B001 y Ome B002, el producto de la PCR se cortó con la enzima de restricción PvuII y se clonó en el sitio SmaI del vector pME101-thrA*1, obteniéndose el vector pME101-thrA*1-cysE.

Ome B001_cysER-PvuII (SEC ID nº 11)

GGAGGGACAGCTGATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGGCGC

Ome H002_cysEF-PvuII (SEC ID nº 12)

Atacgcagctgggacattagatcccatccccatactcaaatgtatgg

Se subrayan los sitios PvuII. La secuencia en negrita corresponde a cysE (Colibri) (3780423-3780397).

Construcción de MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH::Km

Para potenciar la producción de metionina, el gen metH se sobreexpresó utilizando el promotor Ptrc. Para la construcción, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

DiclR-metHF (SEC ID nº 13)

con:

-: una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (4221461-4221408) del gen metH (secuencia de referencia en la página web http://genolist.pasteur.ft/Colibri/)

- una región (cursiva, mayúsculas) homóloga a la secuencia del promotor Ptrc con el RBS (negrita) y las cajas 35 y -10 (negrita)

iclR-metHF (SEC ID nº 14)

con: 10

-: una región (cursiva, mayúsculas) homóloga a la secuencia (4221327-4221406) de la región del gen metH (secuencia de referencia en la página web http://genolist.pasteur.ft/Colibri/),

-: una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de 15 referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

Los oligonucleótidos DicIR-metHF e iclR-metBF se utilizaron para amplificar el casete de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. A continuación, el producto de la PCR se introdujo por electroporación en la cepa MG1655 metA*11 LmetJ (pKD46), donde la expresión de la enzima recombinasa Red permite la recombinación homóloga. Se

20 seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina y la inserción del casete de resistencia se verificó mediante análisis por PCR con los oligonucleótidos iclF e iclR, que se definen a continuación.

iclF (SEC ID nº 15): CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC (homóloga a la secuencia de 4221558 a 4221533).

25 iclR (SEC ID nº 16): GCTTTTTAATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC (homóloga a la secuencia de 4219917 a 4219949).

La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH:Km

30 Construcción de MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metF:Km Ptrc-metH

Para la construcción de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metF:Km Ptrc-metH, los casetes de resistencia a cloranfenicol y a kanamicina se eliminaron de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH:Km.

35 El plásmido pCP20, que comprende la FLP recombinasa, que actúa en los sitios FRT del casete de resistencia a cloranfenicol, se introdujo en la cepa recombinante por electroporación. Tras una serie de cultivos a 42ºC, la pérdida de los dos casetes se verificó por análisis de PCR. La cepa retenida se designó MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH.

Para transferir el constructo promotor Ptrc::metF:Km en la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH, se utilizó el

40 método de transducción por fago P1. El protocolo se llevó a cabo en 2 etapas, con la preparación del lisado del fago de la cepa MG1655 MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF:Km y la posterior transducción en la cepa MG1655 LmetA*11 LmetJ Ptrc-metH.

Preparación del lisado del fago P1: 45

-: Inoculación con 100 1l de un cultivo de una noche de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF:Km de 10 ml deLB + Km 50 1g/ml + glucosa 0,2% + CaCl2 5 mM.

-: Incubación durante 30 min a 37ºC con agitación. 50

-: Adición de 100 1l de lisado de fago P1 preparado en la cepa MG1655 (aproximadamente 1 x 109 fagos/ml).

-: Agitación a 37ºC durante 3 horas hasta que se lisaron todas las células. 55 -Adición de 200 1l de cloroformo y agitación en vórtex.

-: Centrifugación durante 10 min a 4.500 g a fin de eliminar los desechos celulares.

-: Transferencia del sobrenadante a un tubo estéril y adición de 200 1l de cloroformo. 60

-: Almacenamiento del lisado a 4ºC.

Transducción

-: Centrifugación durante 10 min a 1.500 g de 5 ml de un cultivo de una noche de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH en medio LB.

-: Suspensión del sedimento celular en 2,5 ml de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM

- Tubos de control: 100 1l de células 100 1l de fagos P1 de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF:Km

-: Tubo de ensayo: 100 1l de células + 100 1l de fagos P1 de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF:Km

-: Incubación durante 30 min a 30ºC sin agitación.

-: Adición de 100 1l de citrato de sodio 1 M en cada tubo y agitación en vórtex.

-: Adición de 1 ml de LB.

-: Incubación durante 1 hora a 37ºC con agitación.

-: Dispersión en cápsulas de LB + Km 50 1g/ml tras la centrifugación de los tubos durante 3 min a 7000 rpm.

-: Incubación a 37ºC hasta el día siguiente.

Verificación de la cepa

Se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina y la presencia del constructo promotor Ptrc-metF:Km se verificó por análisis de PCR con los oligonucleótidos Ptrc-metFv F y Ptrc-metFv R, descritos anteriormente. La cepa retenida se designó MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH Ptrc-metF:Km.

Construcción de MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-cysM::Km

Para clonar el gen cysM bajo el control del promotor Ptrc heterólogo, se utilizó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o kanamicina cerca de los genes de interés. Con este fin, se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:

con:

-: una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (2537627-2537681) del gen cysM (secuencia de referencia en la página web http://genolist.pasteur.ft/Colibri/)

- una región (cursiva, minúsculas) homóloga a la secuencia del promotor Ptrc con el RBS (negrita) y las cajas 35 y -10 (negrita)

-: una región (mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K. A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

con:

-: una región (minúsculas) homóloga a la secuencia (2537734-2537684) de la región del gen cysM (secuencia de referencia en la página web http://genolist.pasteur.ft/Colibri/)

-: una región (cursiva, mayúsculas) homóloga a la secuencia de la región terminal del bacteriófago T7 (GenBank V01146)

5 Los oligonucleótidos Ptrc-cysM F y Ptrc-cysM R se utilizaron para amplificar el casete de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. A continuación, el producto de la PCR se introdujo por electroporación en la cepa MG1655 metA*11 LmetJ (pKD46), donde la expresión de la enzima recombinasa Red permite la recombinación homóloga. Se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina y la inserción del casete de resistencia se verificó mediante análisis por PCR con los oligonucleótidos Ptrc-cysMv F y Ptrc-cysMv R, que se definen a continuación.

10 Ptrc-cysMv F : ggtgacaagaatcagttccgc (homóloga a la secuencia de 2537262 a 2537282). (SEC ID nº 19) Ptrc-cysMv R : GCGTTTATTCGTTGGTCTGC (homóloga a la secuencia de 2537833 a 2537814). (SEC ID nº 20)

La cepa resultante se denominó MG1655 metA*11 LmetJ J Ptrc-cysM::Km.

15 Construcción de MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM:Km

Para la construcción de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM:Km, los casetes de resistencia a cloranfenicol y a kanamicina se eliminaron de la cepa MG1655 metA*11 LmetJ:Cm Ptrc-metF:Km Ptrc

20 metH utilizando el plásmido pCP20, tal como se ha descrito anteriormente. La cepa retenida se designó MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH

Para transferir el constructo promotor Ptrc-cysM:Km en la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH, se utilizó el método de transducción por fago P1. El protocolo se llevó a cabo en 2 etapas, con la preparación del lisado

25 del fago de la cepa MG 1655 MG 1655 metA*11 LmetJ Ptrc-cysM:Km y la posterior transducción en la cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH, tal como se ha descrito anteriormente. La cepa retenida se designó MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM:Km.

Combinación de la expresión potenciada de cysE y metH y la expresión optimizada de metF y cysM con los alelos 30 metA*11 y LmetJ

Para la construcción de las cepas MG1655 metA*11 LmetJ::Cm (pME101-thrA*1), MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH:Km (pME101-thrA*1-cysE), MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH Ptrc-metF:Km (pME101-thrA*11cysE) y MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM:Km (pME101-thrA*11-cysE), los plásmidos

35 (pME101-thrA*1) o (pME101-thrA*1-cysE) se introdujeron en las cepas MG1655 metA*11 LmetJ::Cm, MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH:Km, MG1655 metA*11 LmetJ::Cm Ptrc-metH Ptrc-metF:Km y MG 1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM:Km por transformación.

Evaluación de las cepas productoras de metionina con una expresión potenciada de cysE, metH y/o cysM y/o metF 40 bajo el control de un promotor heterólogo

Inicialmente, las cepas de producción se evaluaron en matraces Erlenmeyer pequeños. Se cultivó un precultivo en medio LB con 2,5 g/l de glucosa y se utilizó para inocular un cultivo de una noche en medio PC1 mínimo. Este cultivo sirvió para inocular un cultivo de 50 ml a una OD600 de 0,2 en el medio PC1 complementado con 0,01 g·l-1 de

45 vitamina B12. Si estaba indicado, el sulfato de amonio se sustituyó por 5,6 g/l de tiosulfato de amonio. Si resultó necesario, se añadió espectinomicina en una concentración de 100 mg/l. A una DO600 de entre 4,5 y 5, se cuantificaron los aminoácidos extracelulares por HPLC tras derivatización con OPA/Fmoc, y otros metabolitos significativos se analizaron mediante CG-EM después de sililación.

50 Tabla 1. Composición del medio PC1 mínimo Como se puede apreciar en la tabla 2, la cantidad de metionina aumenta con la sobreexpresión de cysE, cysE y metH o cysE, metH y la expresión alterada de metF, en conjunto. La expresión aumentada de cysM puede aumentar adicionalmente la producción de metionina. Determinadas cepas produjeron mayores cantidades de metionina en

Compuesto: Concentración

ZnSO4·7H2O: 0,0040 g·l-1

CuCl2·2H2O: 0,0020 g·l-1

MnSO4·H2O: 0,0200 g·l-1

CoCl2·6H2O: 0,0080 g·l-1

H3BO3: 0,0010 g·l-1

Na2MoO4·2H2O: 0,0004 g·l-1

MgSO4·7H2O: 1,00 g·l-1

Ácido cítrico: 6,00g·l-1

CaCl2·2H2O: 0,04 g·l-1

(NH4)2SO4: 5,00 g·l-1

K2HPO4: 8,00 g·l-1

Na2HPO4: 2,00 g·l-1

(NH4)2HPO4: 8,00 g·l-1

Compuesto: Concentración

NH4Cl: 0,13 g·l-1

NaOH 4M: Ajustado a pH 6,8

FeSO4·7H2O: 0,04 g·l-1

Tiamina: 0,01 g·l-1

Glucosa: 5,00 g·l-1

Vitamina B12 (cianocobalamina): 0,01 g·l-1

Espectinomicina: 0,2 g·l-1

MOPS: 5,00 g·l-1

5 presencia de tiosulfato. La producción más alta de metionina se obtiene cuando cysE, cysM y metH están sobreexpresados y la expresión de metF está controlada por el promotor Ptrc en presencia de tiosulfato. La producción de isoleucina se reduce drásticamente con la expresión de cysE y metH, lo que indica una actividad reducida de eliminación y. La sobreexpresión de cysM reduce la eliminación y en una cepa que sobreexpresa cysE y metH, y que expresa metF a partir de un promotor heterólogo.

10 Tabla 2. Metionina e isoleucina en mmol/g ps producidas por las cepas descritas anteriormente en cultivos por lotes con sulfato (S) o tiosulfato (T) como fuente de azufre. n.d., no determinado

Genotipo: meth (mmol/g ps) (S) meth (mmol/g ps) (T) iso (mmol/g ps) (S) iso (mmol/g ps) (T)

MG1655 metA*11 LmetJ (pME101-thrA*1): 0,55 0,68 0,28 0,32

MG1655 metA*11 LmetJ (pME101-metA*1cysE): 1,02 0,86 0,15 0,23

MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH:Km (pME101-thrA*1-cysE): 1,23 1,19 0,07 0,1

MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF:Km (pME101-thrA*1-cysE): 1,36 1,77 0,17 0,23

MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH PtrcmetF Ptrc-cysM (pME101-thrA*1-cysE): n.d. 2,04 n.d. 0,02

15 3. Determinación de los cambios en la actividad enzimática de CysE y MetH

Para validar los cambios en la expresión de los genes cysE y metH, se determinó la actividad de las correspondientes enzimas en extractos crudos.

20 Para determinar la actividad enzimática in vitro, se cultivaron cepas de E. coli en medio mínimo, tal como se ha descrito anteriormente, y se recogieron en la fase semilogarítmica. Las células se resuspendieron en tampón de fosfato de potasio frío y se sonicaron en hielo (sonificador Branson, 70W). Tras la centrifugación, se cuantificaron las proteínas presentes en los sobrenadantes (Bradford, 1976).

25 Para la determinación de la actividad de la serina acetiltransferasa (CysE), se sometieron a ensayo 10 1l de extracto en fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5, acetil-CoA 4 mM y L-serina 30 mM durante 10 minutos a 25ºC. La proteína se precipitó con acetona y se detectó la O-acetil-serina por CG-EM tras la derivatización con un reactivo de sililación.

Para la determinación de la actividad de la metionina sintasa (MetH) dependiente de la vitamina B12, se sometieron a

30 ensayo 100 1l de extracto en fosfato de potasio 100 mM, pH 7,2, homocisteína 1 mM, metiltetrahidrofolato 0,25 mM, vitamina B12 50 1M, S-adenosil-metionina 20 1M y DTT 25 mM durante 10 min a 37 °C. La proteína s e precipitó con acetona y se detectó la metionina por CG-EM tras la derivatización con un reactivo de sililación.

Tal como se puede apreciar en la tabla 3, la sobreexpresión de los genes cysE y metH hace aumentar la actividad

35 enzimática correspondiente. De este modo, el aumento de la actividad de estos genes produce un aumento de la producción de metionina.

Tabla 3. Actividad expresada en mUI/g ps de serina acetiltransferasa (CysE) y metionina sintasa (MetH) en cepas productoras de metionina cultivadas en presencia de tiosulfato. 40

Genotipo: CysE MetH

MG1655 metA*11 LmetJ (pME101-thrA*1): 65 3,2

MG1655 metA*11 LmetJ (pML101-thrA*1-cysE): 453 1,2

metA*11 LmetJ Ptrc-metH (pME101-thrA*1-cysE): 475 12

MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF:Km (pME101-thrA*1-cysE): 292 6,8

Validación de la producción de metionina en condiciones de fermentación

Las cepas que produjeron cantidades sustanciales de los metabolitos de interés se sometieron posteriormente a 5 ensayo en condiciones de producción en fermentadores de 300 ml (DASGIP) utilizando un protocolo de fermentación alimentada.

Con este fin, un cultivo de 8 horas cultivado en medio LB con 2,5 g/l de glucosa se utilizó para inocular un precultivo de una noche en medio PC1 mínimo (véase anteriormente). Los fermentadores se llenaron con 150 ml de medio 10 mínimo (B1) y se inocularon hasta una concentración de biomasa de prácticamente 0,09 g/l con 1,5 ml de precultivo concentrado (entre 9 g/l y 12 g/l).

Tabla 4. Composición de medio mínimo B1

Compuesto: Concentración

ZnSO4·7H2O: 0,0040 g·l-1

CuCl2·2H2O: 0,0020 g·l-1

MnSO4·H2O: 0,0200 g·l-1

CoCl2·6H2O: 0,0080 g·l-1

H3BO3: 0,0010 g·l-1

Na2MoO4·2H2O: 0,0004 g·l-1

MgSO4·7H2O: 1,00 g·l-1

CaCl2·2H2O: 0,08 g·l-1

(NH4)2SO4: 5,00 g·l-1

K2HPO4: 8,00 g·l-1

Na2HPO4: 2,00 g·l-1

(NH4)2HPO4: 8,00 g·l-1

NH4Cl: 0,13 g·l-1

Ácido cítrico: 6,00g·l-1

FeSO4·7H2O: 0,04 g·l-1

Tiamina: 0,01 g·l-1

Glucosa: 5,00 g·l-1

PPG: 0,4 ml·l-1

Espectinomicina: 0,2g·l-1

Vitamina B12 (cianocobalamina): 0,01 g·l-1

NaOH 4M: Ajustado a pH 6,8

Tabla 5. Medio mínimo FB tipo T1

Compuesto: Concentración

ZnSO4·7H2O: 0,0040 g·l-1

CuCl2·2H2O: 0,0020 g·l-1

MnSO4·H2O: 0,0200 g·l-1

CoCl2·6H2O: 0,0080 g·l-1

H3BO3: 0,0010 g·l-1

Na2MoO4·2H2O: 0,0004 g·l-1

MgSO4: 5,00 g·l-1

Ácido cítrico: 6,00 g·l-1

(NH4)2SO4: 8,32 g·l-1

Na2SO4: 8,95 g·l-1

(NH4)2S2O3: 22,32 g·l-1

FeSO4·7H2O: 0,04 g·l-1

Tiamina: 0,01 g·l-1

Glucosa: 500 g·l-1

Espectinomicina: 0,2 g·l-1

Vitamina B12 (cianocobalamina): 0,01 g·l-1

NH4OH 28%: Ajustado a pH 6,0 antes de la adición de tiosulfato

Tabla 6. Medio mínimo FB tipo S

Compuesto: Concentración

ZnSO4·7H2O: 0,0040 g·l-1

CuCl2·2H2O: 0,0020 g·l-1

MnSO4·H2O: 0,0200 g·l-1

Compuesto: Concentración

CoCl2·6H2O: 0,0080 g·l-1

H3BO3: 0,0010 g·l-1

Na2MoO4·2H2O: 0,0004 g·l-1

MgSO4: 5,00 g·l-1

Ácido cítrico: 6,00 g·l-1

(NH4)2SO4: 20,0 g·l-1

Na2SO4: 10,0 g·l-1

FeSO4·7H2O: 0,04 g·l-1

Tiamina: 0,01 g·l-1

Glucosa: 500 g·l-1

Espectinomicina: 0,2g·l-1

Vitamina B12 (cianocobalamina): 0,01 g·l-1

NH4OH 28%: Ajustado a pH 6,8

La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37ºC y el pH se ajustó permanentemente a valores comprendidos entre 6,5 y 8, preferentemente 6,7, utilizando una solución de NH4OH. La velocidad de agitación se mantuvo a 600 rpm durante la fase de lotes y se aumentó a un máximo de 1.000 rpm en el final de la fase de fermentación 5 alimentada discontinua. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores comprendidos entre el 20% y el 40%, preferentemente del 30% de saturación, utilizando un controlador de gas. Cuando la masa celular alcanzó una concentración de entre 0,9 g/l y 1,2 g/l, se inició la fermentación alimentada con un caudal inicial comprendido entre 0,1 ml/h y 1,5 ml/h, preferentemente de 0,43 ml/h, y un aumento sigmoidal (24 h) hasta un caudal comprendido entre 0,5 ml/h y 5,8 ml/h, preferentemente de 1,7 ml/h. Las condiciones precisas de alimentación se calcularon

10 mediante la siguiente fórmula:

donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml/h para un volumen de lote de 150 ml

15 P1 está comprendido entre 0,025 y 0,35, siendo preferentemente de 0,100. P2 está comprendido entre 0,400 y 5,600, siendo preferentemente de 1,600. P3 está comprendido entre 0,068 y 0,95, siendo preferentemente de 0,270. P4 está comprendido entre 1,250 y 17,5, siendo preferentemente de 5,000.

20 En este caso se utilizó medio FB que contenía glucosa en una concentración comprendida entre 300 g/l y 800 g/l (preferentemente 500 g/l).

Cuando la concentración de biomasa alcanzó valores comprendidos entre 20 g/l y 50 g/l (preferentemente 35 g/l, 25 entre 40 h y 80 h), la fermentación se detuvo y se determinó la concentración extracelular de metionina e isoleucina mediante HPLC.

Tabla 7. Títulos de metionina obtenidos en fermentación alimentada discontinua de cepas con sobreexpresión de cysE, y metH o metF con un promotor heterólogo, o una combinación de los tres. Ref corresponde a MG1655 30 metA*11 LmetJ. Las cepas se cultivaron en presencia de tiosulfato (T) o sulfato (S).

Genotipo: Tiosulfato/sulfato met (mM) Iso (mM)

Ref + (pME101-thrA*1): S 70 mM 25 mM

Ref + (pME101-thrA*1): T 94 mM 35 mM

Ref + (pME101-thrA*1-cysE): S 74 mM 2 mM

Ref + (pME101-thrA*1-cysE): T 101 mM 0 mM

Ref + Ptrc-metH Ptrc-metF:Km (pME101-thrA*1-cysE): T 121 mM 1 mM

Tal como se puede observar en la tabla 7, el aumento de la expresión de cysE, cysE y metH, cysE, metH y metF bajo el control de un promotor heterólogo o cultivando las cepas en presencia de tiosulfato puede hacer aumentar 35 significativamente la producción de metionina. La producción de isoleucina se reduce significativamente mediante la sobreexpresión de cysE y/o metH.

La cepa que produjo la mayor cantidad de metionina en el fermentador de 300 ml se sometió posteriormente a ensayo en condiciones de producción en un fermentador de 2,5 l (PIERRE GUERIN) mediante un protocolo de 40 fermentación alimentada.

Con este fin, un cultivo de 8 horas cultivado en medio LB con 2,5 g/l de glucosa se utilizó para inocular un precultivo de una noche en medio PC1 mínimo. Los fermentadores se llenaron con 600 ml de medio mínimo (B2) y se

inocularon hasta una biomasa de 0,9 g/l con 6 ml de precultivo concentrado (entre 9 g/l y 12 g/l).

La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37ºC y el pH se ajustó permanentemente a valores comprendidos entre 6,3 y 8, preferentemente 6,8, utilizando una solución de NH4OH al 28%. La velocidad de agitación inicial se 5 ajustó a 200 rpm durante la fase de lotes y se aumentó hasta 1.200 rpm durante la fase de fermentación alimentada discontinua. El caudal de aire inicial se ajustó a 40 Nl/h durante la fase de lotes y se aumentó hasta 250 Nl/h durante la fase de fermentación alimentada discontinua. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo a valores comprendidos entre el 20% y el 40% de saturación, preferentemente del 30%, aumentando la velocidad de agitación y el caudal de aire. Cuando la concentración de biomasa alcanzó un valor comprendido entre 1,2 g/l y 1,5 g/l, se

10 inició la fermentación alimentada con un caudal inicial comprendido entre 0,5 ml/h y 4 ml/h, preferentemente de 1,0 ml/h, y un aumento exponencial (15 h) hasta valores de caudal comprendidos entre 3 ml/h y 35 ml/h, preferentemente de 20,1 ml/h. En este punto, el caudal se mantuvo constante entre 10 horas y 45 horas, preferentemente 30 h. Para la alimentación, se utilizó medio FB de tipo T2 (véase la tabla 8) que contenía glucosa en una concentración comprendida entre 300 g/l y 800 g/l, preferentemente de 750 g/l.

15 Cuando la concentración de biomasa alcanzó valores comprendidos entre 40 g/l y 110 g/l, preferentemente de 90 g/l, la fermentación se detuvo y se determinó la concentración extracelular de metionina mediante HPLC. La cepa MG1655 metA*11 LmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF (pME101-thrA*1-cysE) produjo metionina 169 mM en estas condiciones.

20 Tabla 8. Medio mínimo FB tipo T2

Compuesto: Concentración

ZnSO4·7H2O: 0,0040 g·l-1

CuCl2·2H2O: 0,0020 g·l-1

MnSO4·H2O: 0,0200 g·l-1

CoCl2·6H2O: 0,0080 g·l-1

H3BO3: 0,0010 g·l-1

Na2MoO4·2H2O: 0,0004 g·l-1

MgSO4: 5,00,g·l-1

Ácido cítrico: 6,00 g·l-1

K2HPO4·3H2O: 3,93 g·l-1

(NH4)2SO4: 5,54 g·l-1

Na2SO4: 5,96 g·l-1

(NH4)2S2O3: 33,48 g·l-1

FeSO4·7H2O: 0,04 g·l-1

Tiamina: 0,01 g·l-1

Glucosa: 750 g·l-1

Espectinomicina: 0,2g·l-1

Vitamina B12 (cianocobalamina): 0,01 g·l-1

NH4OH 28%: Ajustado a pH 6,0 antes de la adición de tiosulfato

Tabla 9. Composición de medio mínimo B2

Compuesto: Concentración

ZnSO4·7H2O: 0,0040 g·l-1

CuCl2·2H2O: 0,0020 g·l-1

MnSO4·H2O: 0,0200 g·l-1

CoCl2·6H2O: 0,0080 g·l-1

H3BO3: 0,0010 g·l-1

Na2MoO4·2H2O: 0,0004 g·l-1

MgSO4·7H2O: 1,00 g·l-1

CaCl2·2H2O: 0,16 g·l-1

(NH4)2SO4: 5,00 g·l-1

K2HPO4: 15,00 g·l-1

Na2HPO4: 2,00 g·l-1

(NH4)2HPO4: 8,00 g·l-1

NH4Cl: 0,13 g·l-1

Ácido cítrico: 6,00 g·l-1

FeSO4·7H2O: 0,04 g·l-1

Tiamina: 0,01 g·l-1

Glucosa: 5,00 g·l-1

PPG: 0,4 ml·l-1

Espectinomicina: 0,2 g·l-1

Compuesto: Concentración

Vitamina B12 (cianocobalamina): 0,01 g·l-1

NaOH 4M: Ajustado a pH 6,8

Listado de secuencias

<110> metabolic Explorer 5

<120> Procedimiento para la producción de metionina cultivando un microorganismo modificado para mejorar la producción de cisteína

<130> 349179 D24084 10

<160> 20

<170> PatentIn versión 3.3 15 <210> 1

<211> 127

<212> ADN

<213> Artificial 20 <220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 1

<210> 2

<211> 136

<212> ADN 30 <213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

35 <400> 2 <223> Oligonucleótido sintético

40: <210> 3 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 3

50 55: gcccggtact catgttttcg ggtttatgg <210> 4 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> 29

<400> 4 5 ccgttattcc agtagtcgcg tgcaatgg 28

<210> 5

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético 15 <400> 5 ttatcatgag agtgttgaag ttcggcggta catcagtggc 40

<210> 6

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 25 <223> Oligonucleótido sintético

<400> 6 ttacccgggc cgccgccccg agcacatcaa acccgacgc 39

<210> 7

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial 35

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 7 ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24

<210> 8

<211> 22 45 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 8 agcttagtaa agccctcgct ag 22 55 <210> 9

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 9 65 ccaatctgaa taacatggca atgtccagcg tttctggccc ggg 43

5: <210> 10 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 10

cccgggccag aaacgctgga cattgccatg ttattcagat tgg: 43

15: <210> 11 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 11

ggagggacag ctgatacgaa agaagtccgc gaactggcgc: 40

25: <210> 12 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 12

35: atacgcagct gggacattag atcccatccc catactcaaa tgtatgg 47

<210> 13 <211> 140 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucleótido sintético

45: <400> 13

<210> 14

<211> 100

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 55 <223> Oligonucleótido sintético

<400> 14

<210>: 15

<210>: 18

<211> 26 <212> ADN <213> Artificial

5: <220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 15

cctttgaggt cgcatggcca gtcggc: 26

15: <210> 16 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 16

gctttttaat agaggcgtcg ccagctcctt gcc: 33

25: <210> 17 <211> 130 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 17

<211> 107

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético 55

<400> 19

ggtgacaaga atcagttccg c 21

<210> 20

<211> 20

<212> ADN <213> Artificial

5: <220> <223> Oligonucleótido sintético

<400> 20

10: gcgtttattc gttggtctgc 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la producción de metionina, sus derivados o precursores mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre, y la recuperación de la metionina a partir del medio de cultivo, en el que:

-

la expresión del gen cysE, involucrado en la producción de cisteína, está aumentada en el microorganismo, y

-

la expresión del gen metH, involucrado en la producción de unidades C1 y la transferencia a la homocisteína, está aumentada y/o impulsada por un promotor heterólogo, y

-

el(los) alelo(s) de homoserina succiniltransferasa (MetA), que codifica(n) enzima(s) con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la S-adenosil-metionina y/o la metionina, está(n) integrado(s) en el microorganismo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que por lo menos un gen, involucrado en la producción de unidades C1 y/o el potencial de transferencia a la homocisteína, está sobreexpresado, seleccionándose dicho gen de entre el grupo que consiste en:

•

metE, que codifica la metionina sintasa

•

metF, que codifica la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa

•

glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa

•

gcvTHP, lpd, que codifican el complejo de escisión de la glicina.
3.

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la expresión de metF está aumentada y/o el gen se expresa a partir de un promotor heterólogo.
4.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la actividad de eliminación y se mantiene baja mediante la optimización del flujo de biosíntesis de la cisteína y se reduce así la producción del subproducto isoleucina.
5.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la expresión de unos genes adicionales involucrados en la producción de metionina está aumentada.
6.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la expresión de los genes que disminuyen la producción de metionina está atenuada.
7.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el represor de la metionina codificado por el gen metJ está eliminado o mutado.
8.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionito, sulfito, o una combinación de las diferentes fuentes.
9.

Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato, o una mezcla de los dos.
10.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la etapa de aislamiento de los aminoácidos/constituyentes deseados del caldo de fermentación y/o la biomasa que permanece opcionalmente en porciones o en la cantidad total (0-100%) en el producto final.
11.

Microorganismo utilizado para la producción fermentativa de metionina o sus derivados, en el que la expresión del gen cysE involucrado en la producción de cisteína está aumentada, la expresión del gen metH, involucrado en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia a la homocisteína, está aumentada y/o impulsada por un promotor heterólogo, y el(los) alelo(s) de homoserina succiniltransferasa (MetA) que codifica(n) una(s) enzima(s) con una sensibilidad de retroalimentación reducida a la S-adenosil-metionina y/o la metionina está(n) integrado(s) en dicho microorganismo.
12.

Microorganismo según la reivindicación 11, en el que por lo menos un gen, involucrado en la producción de unidades C1 y el potencial de transferencia a la homocisteína, está sobreexpresado, seleccionándose dicho gen de entre el grupo que consiste en:

•

metE, que codifica la metionina sintasa

•

metF, que codifica la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa

•

glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa

•

gcvTHP, lpd, que codifican el complejo de escisión de la glicina.
13.

Microorganismo según la reivindicación 12, en el que la expresión de metF está aumentada y/o el gen se expresa a partir de un promotor heterólogo.
14.

Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la actividad de eliminación y se mantiene

5 baja mediante la optimización del flujo de la biosíntesis de cisteína y se reduce así la producción del subproducto isoleucina.
15. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la expresión de genes adicionales

involucrados en la producción de metionina está aumentada. 10
16. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la expresión de genes que reducen la producción de metionina está atenuada.
17. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el represor de la metionina codificado por el 15 gen metJ está eliminado o mutado.