BRPI0620880A2 - método para a produção de metionina, seus derivados, ou precursores pelo cultivo de um microorganismo, e, microorganismo - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA A PRODUçãO DE METIONINA, SEUS DERIVADOS, OU PRECURSORES PELO CULTIVO DE UM MICROORGANISMO, E, MICROORGANISMO. A presente invenção refere-se a um processo para a produção de metionina ou de seus derivados pelo cultivo de um microorganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre. O microorganismo reivindicado é modificado em uma maneira que a produção de cisteína e/ou unidades C1 é aumentada e/ou potencial de transferência de unidades C1 sobre homocisteína é aumentada ou otimizado. O isolamento de metionina ou de seus derivados do meio de fermentação também é reivindicado.
Description
"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE METIONINA, SEUS DERIVADOS, OU PRECURSORES PELO CULTIVO DE UM MICROORGANISMO, E, MICROORGANISMO"
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a um processo para a produção de metionina ou seus derivados pelo cultivo de um microorganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre. O microorganismo reivindicado é modificado em uma modificado em uma maneira que a produção de cisteína e/ou unidades Cl é aumentada e/ou o potencial de transferência de unidades Cl sobre homocisteína é aumentado ou otimizado. O isolamento de metionina ou seus derivados do meio de fermentação também é reivindicado.
Arte anterior
Compostos contendo enxofre tais como cisteína, homocisteína, metionina ou S-adenosil-metionina são críticos para o metabolismo celular e são produzidos industrialmente para serem usados como aditivos de alimento ou de ração e fármacos. Em particular metionina, um aminoácido essencial, que não pode ser sintetizado por animais, desempenha um papel importante em muitas funções do corpo. Além de seu papel em biossíntese de proteína, metionina está envolvida em transmetilação e na biodisponibilidade de selênio e zinco. Metionina também é diretamente usada como um tratamento para distúrbios como alergia e febre reumática. Contido a maior parte de metionina que é produzida é adicionada em ração animal.
Com o uso diminuído de proteínas derivadas de animal como um resultado de BSE e gripe de galinha, a demanda por metionina pura tem aumentado. Quimicamente D,L-metionina é comumente produzida a partir de acroleína, metil-mercaptano e cianeto de hidrogênio. Contudo a mistura racêmica não desempenha tão bem quanto a L-metionina pura, como por exemplo em aditivos de ração de galinha (Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633). L-Metionina pura pode ser produzida a partir de metionina racêmica e.g. através de tratamento com acilase de N- acetil-D,L-metionina que aumenta dramaticamente os custos de produção. A demanda crescente por L-metionina pura acompanhada por preocupações ambientais torna atrativa a produção microbiana de metionina.
Microorganismos tem desenvolvido mecanismos regulatórios elevadamente complexos que finamente sintonizam a biossíntese de componentes celulares permitindo assim velocidades de crescimento máximas. Conseqüentemente apenas as quantidades requeridas de metabólitos, tais como aminoácidos, são sintetizadas e podem não ser normalmente detectadas no sobrenadante de cultura de cepas de tipo selvagem. Bactérias controlam a biossíntese de aminoácido principalmente por inibição de retro-alimentação de enzimas, e repressão ou ativação de transcrição de gene. Efetores para estas rotas regulatórias não na maioria dos casos os produtos finais das rotas relevantes. Conseqüentemente, estratégias para sobreprodução de aminoácidos em microorganismos requer a desregulação destes mecanismos de controle.
A rota para a síntese de L-metionina é bem conhecida em muitos microorganismos. Metionina é derivada do aminoácido aspartato, mas sua síntese requer a convergência de duas rotas adicionais, biossíntese de cisteína e metabolismo Cl (N-metil-tetra-hidro-folato). Aspartato é convertido em homo-serina por uma seqüência de três reações. Homo-serina pode subseqüentemente entrar na rota biossintética de treonina/isoleucina ou metionina. Em E. coli entrada na rota de metionina requer a acilação de homo-serina a succinil-homo-serina. Esta etapa de ativação permite a condensação subseqüente com cisteína, levando à cistationina contendo tioéter, que é hidrolisada para dar homocisteína. A transferência final de metila levando à metionina é realizada por uma metil-transferase quer Bi2- dependente quer B12-independente. A biossíntese de metionina em E. coli e regulada pela repressão e ativação dos genes biossintéticos de metionina via as proteínas MetJ e MetR, respectivamente (revisto em Neidhardt, F. C. (Edito-Chefe), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, Κ. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, e Η. E. Umbarger (eds), 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology; Weissbach et al., 1991 Mol. Microbiol., 5, 1593- 1597). É sabido que MetJ junta com seu co-repressor S-adenosil-metionina regula os genes metA, metB, metC, metE e met¥. Outros genes codificadores de enzimas implicadas em produção de metionina, tais como glyA, metE, metH e mefF são ativados por MetR enquanto que metA é reprimido por MetR. As enzimas correspondentes estão todas envolvidas na produção e na transferência de unidades Cl de serina para metionina. GlyA codificador de serina-hidróxi-metil-transferase catalisa a conversão de serina em glicina e a concomitante transferência de uma unidade Cl na coenzima tetra-hidro-folato (THF). A unidade Cl na forma de metileno-THF necessita ser reduzida a metil-THF antes de ela poder ser transferida sobre homocisteína para dar metionina. Esta reação é catalisada pela proteína metF. Transferência de grupo metila é quer catalisada por metH via vitamina B12 quer diretamente por MetE. É sabido que a enzima metH possui uma velocidade catalítica que é cem vezes mais alta do que a da enzima MetE. Na ausência de vitamina B12 e portanto de metH ativa, MetE pode compor até 5% da proteína celular total. A presença de metH ativa reduz a atividade de MetE provavelmente pela redução da quantidade de homocisteína que normalmente ativa a transcrição de metE via MetR. Portanto a produção de metionina via metH economiza recursos importantes para a célula pela não expressão de quantidades grandes de MetE. Um acúmulo de homocisteína é tóxico para E. coli (Tuite et al., 2005 J. Bacteriol, 187, 13, 4362-4371.) e ao mesmo tempo possui um efeito regulatório, negativo sobre a expressão de metA via MetR. Assim uma expressão forte das enzimas metH e/ou MetE é claramente requerida para produção eficiente de metionina.
Em E. coli enxofre reduzido é integrado em cisteína e então transferido para precursor de metionina O-succinil-homo-serina, um processo chamado de transulfuração (revisto em Neidhardt, F. C. (Editor-Chefe), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, Κ. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, e Η. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology). Cisteína é produzida a partir de O-acetil-serina e H2S por sulfidrilação. O processo é negativamente regulado por retro- alimentação pelo produto, cisteína, atuando sobre serina-transacetilase, codificada por cysE. N-acetil-serina, que é espontaneamente produzida a partir de O-acetil-serina, juntamente com o fator de transcrição CysB ativa genes codificadores de enzimas envolvidas no transporte de compostos de enxofre, sua redução a H2S e sua integração no composto orgânico de enxofre cisteína, que como metionina é um aminoácido essencial.
Na ausência de cisteína, MetB catalisa a conversão de precursor de metionina O-succinil homo-serina em amônia, α-ceto-butirato e succinato, uma reação chamada de γ-eliminação (Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys 433, 166-75). α-Ceto-butirato pode ser subseqüentemente convertido em isoleucina. Esta reação secundária não é desejável para a produção industrial de metionina, porque os dois aminoácidos são difíceis de separar. Assim atividade de γ-eliminação baixa é um aspecto importante para a produção industrial de metionina. O pedido de patente provisório US 60/650.124 depositado aos 7 de fevereiro de 2005 descreve como γ-eliminação pode ser reduzida pela otimização da enzima MetB. Otimização do fluxo de biossíntese de cisteína também pode reduzir a γ-eliminação e assim a produção do subproduto isoleucina e constitui uma modalidade desta invenção. Descrição geral da invençAo
A invenção refere-se a um processo para a produção de metionina, seus precursores ou produtos derivados da mesma em um processo fermentativo usando microorganismos que possuem produção aumentada de cisteína e que crescem em uma fonte de carbono e de enxofre definida.
Precursores de metionina são definidos como metabólitos que são parte da rota metabólica específica de metionina ou podem ser derivados destes metabólitos. A rota específica de metionina começa com a transformação de homo-serina em succinil-homo-serina pela enzima homo- serina succinil transferase (MetA).
Produtos derivados de metionina originam-se das rotas de degradação e/ou transformação de metionina.
Para aumentar a produção de cisteína os inventores têm aumentado a expressão de genes envolvidos na produção de cisteína.
O termo aumentado neste contexto descreve o aumento na atividade intracelular de uma atividade enzimática que é codificada pelo correspondente DNA5 por exemplo pelo aumento do número de cópias do gene, usando um promotor forte ou usando um alelo com atividade aumentada e possivelmente combinando estas medidas.
Os termos "expressão aumentada" ou "expressão intensificada" são ambos usados no teste e possuem significado similar.
Para aumentar a expressão de um gene ele pode ser cromossômica ou extracromossomicamente codificado. Cromossomicamente pode haver uma ou várias cópias no genoma que pode ser introduzido pelos métodos de recombinação conhecidos pelo perito no campo. Extracromossomicamente genes podem ser transportados por tipos diferentes de plasmídeos que diferem com respeito à sua origem de replicação e assim ap seu número de cópias na célula. Podem estar presentes como 1-5 cópias, cerca de 20 ou até 500 cópias, correspondendo aos plasmídeos de baixo número de cópias com a replicação apertada (pSClOl, RK2), plasmídeos de baixo número de cópias (pACYC, pRSF 1010) ou plasmídeos de alto número de cópias (pSK bluescript II).
Em uma modalidade preferida da invenção o gene pode ser expressado usando promotores com força diferente que necessitam ou não de serem induzidos por moléculas indutoras. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Exemplos são os promotores Ptrc, Ptac, Plac, o promotor lambda cl ou outros promotores conhecidos pelo perito no campo.
Expressão dos genes alvo pode ser reforçada ou reduzida por elementos estabilizadores ou desestabilizadores do correspondente RNA mensageiro (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou da proteína (e.g. etiquetas GST, Amersham Biosciences).
A presente invenção também se refere aos microorganismos que contêm um ou mais alelos do gene a ser intensificado de acordo com a invenção.
Em uma modalidade particular da invenção a expressão de genes envolvidos na produção de cisteína é aumentada.
Genes envolvidos na produção de cisteína compreendem genes codificadores de proteínas requeridas para a importação de uma fonte de enxofre, a transformação daquela fonte de enxofre em sulfeto de hidrogênio e a assimilação do sulfeto de hidrogênio ou da fonte de enxofre em cisteína ou seus derivados.
Em E. coli estas proteínas são codificadas pelos seguintes genes (seguidos pelos números de acesso e pela função dos polipeptídeo correspondente):
<table>table see original document page 7</column></row><table> CJAS1W 1788762 proteína transportadora de sulfato ligada à membrana
cysL 1788753 ORF a montante de cysK
cjasN 1789108 ATP sulfurilase
cysO 1789109 sulfato adenil-transferase
cysC 1789107 adenilil-sulfato cinase
cysW 1789121 adenilil-sulfato redutase
cysI 1789122 sulfito-redutase, subunidade alfa
cysJ 1789123 sulfito-redutase, subunidade beta
cysE 1790035 serina-acetil-transferase
cysK 1788754 cisteína-sintase
cysM 2367138 O-acetil-serina-sulfidrilase
cysZ 1788753 transporte de sulfato
sbp 1790351 Proteína ligante de sulfato periplásmica
Na descrição da presente invenção, genes e proteínas são identificados usando as denominações dos genes correspondentes em E. coli. Contudo, e a não ser se especificado de outra maneira, uso destas denominações possui um significado mais geral de acordo com a invenção e cobre todos os correspondentes genes e proteínas em outros organismos, mais particularmente microorganismos.
PFAM (banco de dados de alinhamentos de famílias de proteínas e modelos escondidos de Markov; http ://www. saner. ac .uk/Software/Pfam/) representa uma coleção grande de alinhamentos de seqüências de proteínas. Cada PFAM torna possível visualizar alinhamentos múltiplos, ver domínios de proteína, avaliar distribuição dentre os organismos, ganhar acesso a outros bancos de dados, e visualizar as estrutura de proteína conhecida.
COGS (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas; http://www.nebi.nlmLmih.gov/COG/) são obtidos por comparação de seqüências de proteína de 66 genomas totalmente seqüenciados representando 30 linhagens filogênicas maiores. Cada COG é definido de pelo menos três linhagens, que permite a identificação dos primeiros domínios conservados.
Os meios de identificação de seqüências homólogas e de suas homologias percentuais são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte, e incluem em particular os programas BLAST, que podem ser usados do sítio da Internet http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros pré-estabelecidos indicados naquele sítio da Internet. As seqüências obtidas podem ser então exploradas (e.g., alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN fhttpV/prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), com os parâmetros pré-estabelecidos indicados naqueles sítios da Internet.
Usando as referências dadas no GenBank para genes conhecidos, aquelas pessoas experientes na arte são capazes de determinar genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando seqüências de consenso que podem ser determinadas pela realização de alinhamentos de seqüências com genes derivados de outros microorganismos, e planejamento de sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte, e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
Como uma modalidade preferida, o microorganismo usado no método da presente invenção é modificado para aumentar a expressão de cysE codificador de serina-transacetilase.
A presente invenção também se refere aos microorganismos que contêm um ou vários alelos codificadores de serina-transacetilase de acordo com a invenção.
Tais cepas são caracterizadas pelo fato de que possuem um metabolismo de cisteína que permite um fluxo aumentado na direção de metionina pela provisão de uma concentração de substrato aumentada para a síntese de γ-cistationina, uma reação catalisada por MetB. Em concentrações baixas de cisteína a enzima MetB produz amônia, succinato e a-ceto-butirato a partir de succinil-homo-serina, uma reação chamada de γ-eliminação. Uma concentração de cisteína aumentada reduz a quantidade de a-ceto-butirato produzido e assim aumenta o fluxo na direção de metionina.
Expressão intensificada de atividades de serina-transacetilase pode ser validada em testes enzimáticos com serina e acetil-CoA. A reação é iniciada pela adição do extrato de proteína contendo atividade de serina- transacetilase, e a formação de O-acetil-serina é monitorada por GC-MS após precipitação de proteína e derivação com um agente de sililação.
A presente invenção também se refere à expressão intensificada do gene cysts codificador de O-acetil-serina sulfidrilase que permite a integração aumentada de tiossulfato em sulfo-cisteína reforçando a produção de cisteína.
A presente invenção portanto reivindicas um processo no qual γ-eliminação e portanto a produção de isoleucina é reduzida pela otimização da produção de cisteína.
Um promotor heterólogo de acordo com a invenção é entendido como o promotor de tipo selvagem modificado ou qualquer promotor de outro organismo ou um promotor inteiramente sintético. Preferivelmente o promotor heterólogo é um promotor forte, tal como Ptrc, Ptac, lambda cl ou outros promotores conhecidos pelo perito no campo.
Em outra modalidade preferida da invenção é reivindicado um processo no qual um microorganismo é usado para a produção de metionina ou seus derivados no qual a expressão de genes envolvidos na produção de unidades Cl e/ou sua transferência potencial para homocisteína é/são aumentado(s) ou otimizado(s).
De acordo com a invenção, otimização é realizada pela adaptação do nível de expressão do gene de interesse em um modo para obter a produção mais alta de metionina. Na maioria dos casos isto é feito pela criação de bibliotecas de expressão do gene de interesse usando por exemplo promotores heterólogos e triagem dos melhores produtores.
De acordo com a invenção o termo unidade Cl descreve átomos de carbono individuais que são ligados na molécula transportadora tetra-hidro-folato como grupos metila, metileno, metenila òu formila.
O termo "potencial de transferência" descreve a capacidade dos microorganismos para transferir unidades Cl para homocisteína. Este potencial é determinado pelas atividades de metF e/ou metR que têm sido intensificadas e/ou otimizadas pelos inventores.
Genes envolvidos na produção de unidades Cl são listados abaixo:
serA 1789279 Fosfoglicerato-desidrogenase
serB 1790849 Fosfoserina-fosfatase
serC 1787136 Sosfosserina-amino-transferase
glyA 1788902 Serina-hidróxi-metil-transferase
gcvT 1789272 Amino-metil-transferase dependente de tetra- hidro-folato dependente
gcvH 1789271 Clivagem de glicina, transportador de grupo amino-metila
gcvP 1789269 Glicina-desidrogenase (descarboxilação)
Ipd 1786307 Lipoamida-desidrogenase
Genes envolvidos na transferência de unidades Cl em homocisteína são listados abaixo:
metV 1790377 5,10-Metileno-tetra-hidro-folato redutase <table>table see original document page 12</column></row><table>
Em uma modalidade especialmente preferida da invenção o microorganismo usado para a produção de metionina é modificado para aumentar a expressão de metF ou metH, ou ambos ou para expressar metF de um promotor heterólogo.
Atividade intensificada de metionina sintase (metH) dependente de vitamina B12 pode ser validade em testes enzimáticos com metil-THF e homocisteína na presença de vitamina B12 e SAM. A reação é iniciada pela adição do extrato de proteína contendo a atividade de metileno tetra-hidro-folato redutase, e a formação de metionina é monitorada por GC- MS após a precipitação e derivação de proteína com um agente de sililação.
Produção de metionina pode ser adicionalmente aumentada pela expressão de genes adicionais envolvidos na biossíntese de metionina, que também é o objetivo da invenção.
Estes genes são listados abaixo:
metA 1790443 Homo-serina succinil-transferase
metB 1790375 Cistationina-y-sintase
metC 1789383 Cistationina-P-lyase
metF 1790377 5,10-Metileno-tetra-hidro-folato redutase
metR 1790262 Gene regulatório positivo para metE, metH e metF
Ademais expressão de genes em rotas de degradação de metionina ou de desvio da rota de produção de metionina pode ser reduzida ou os genes podem ser deletados.
spéD 1786311 S-Adenosil-metionina descarboxilase
speC 1789337 Ornitinadescarboxilase
astA 1788043 Arginina succinil-transferase <table>table see original document page 13</column></row><table>
Um aumento adicional na produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma pode ser realizado pela sobreexpressão de um ou vários dos seguintes genes: piruvato carboxilases, e.g. de Rhizobium etli (pyc, U51439), ou um de seus homólogos, as enzimas de síntese de homo-serina codificadas pelos genes thrA (homo-serina desidrogenase/ aspartocinase, 1786183), preferivelmente com sensibilidade de retro-alimentação reduzida, metL (homo-serina desidrogenase/aspartocinase, gl790376) ou lysC (aspartocinase, 1790455) e asd (aspartato semialdeído desidrogenase).
Um aumento adicional na produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, é realizado por meio da deleção do gene para a proteína repressora MetJ, responsável pela infra- regulação do regulon de metionina como foi sugerido em JP 2000157267-A/3 (veja também GenBank 1790373).
Produção de metionina é adicionalmente aumentada pelo uso de alelos de homo-serina succinil-transferase com sensibilidade de retro- alimentação reduzida aos inibidores SAM e metionina como descrito no pedido de patente WO 2005/111202 que é incorporado neste documento.
Um aumento na produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, pode ser realizado pela atenuação da atividade ou deleção de um dos seguintes genes.
Atenuação neste contexto descreve a redução da atividade intracelular de uma enzima pelas medidas tais como redução de sua expressão, redução da estabilidade da enzima, aumento de sua degradação e/ou outras soluções conhecidas pelo perito no campo.
<table>table see original document page 14</column></row><table> aroG 1786969 DAHP sintetase
acoH 1787996 DAHP sintetase
thrQ 1786184 homo-serina cinase
thrC 1786185 treonina sintase
sdaA 1788116 serina desaminase
sdaB 1789161 serina desaminase
Produção de metionina pode ser adicionalmente aumentada pelo uso de um alelo metB alterado que usa preferencialmente ou exclusivamente H2S e assim produz homocisteína a partir de O-succinil- homo-serina como tem sido descrito no pedido de patente WO 2004/076659, cujo conteúdo é aqui incorporado como referência.
A fonte de enxofre usada para a produção fermentativa de L- metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, pode ser qualquer uma das seguintes ou uma combinação das mesmas: sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio, ditionito, sulfito.
Em uma modalidade preferida da invenção a fonte de enxofre é sulfato e/ou tiossulfato.
A invenção também se refere-se ao processo para a produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, compreendendo a fermentação do microorganismo produtor de metionina descrito acima, a concentração de metionina, seus precursores ou derivativos e o isolamento do produto desejado do caldo de fermentação.
De acordo com a invenção, os termos 'cultura" e 'fermentação', são usados indiferentemente para denotarem o crescimento de um microorganismo em um meio de cultura apropriado contendo uma única fonte de carbono.
De acordo com a invenção uma única fonte de carbono é uma fonte de carbono que podem ser usadas por aquelas pessoas experientes na arte para obter crescimento normal de um microorganismo, em particular de uma bactéria. Em particular pode ser um açúcar assimilável tal como glicose, galactose, sacarose, lactose ou melaço, ou subprodutos destes açúcares. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é glicose. Outra fonte de carbono simples é sacarose.
Aquelas pessoas experientes na arte são capazes de definirem as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular as bactérias são fermentadas em uma temperatura entre 20°C e 55°C, preferencialmente entre 25°C e 40°C, e mais especificamente cerca de 30°C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.
A fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura inorgânica de composição definida conhecida adaptada às bactérias usadas, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e se necessário um co-substrato necessário para a produção do metabólito.
Em particular, o meio de cultura inorgânica para E. coli pode ser de composição idêntica ou similar de um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual e Handbook for Eseheriehia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio tal como definido por Schaefer et ai. (1999, Anal. Biochem. 270: 8896).
Analogamente, o meio de cultura inorgânico para C. glutamicum pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol 32: 205210) ou a um meio tal como aquele descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol Biotechnol. 3: 573-583). Os meios podem ser suplementados para compensarem as auxotrofias introduzidas por mutações.
Após a fermentação L-metionina, seus precursores ou compostos derivados da mesma, é/são recuperado(s) e purificado(s) se necessário. Os métodos para a recuperação e a purificação dos compostos produzidos tal como metionina no meio de cultura são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte.
Opcionalmente de 0 a 100% da biomassa pode ser retido durante a purificação do produto de fermentação.
A invenção também se refere a um microorganismo que é otimizado para a produção fermentativa de metionina.
O termo "microorganismo otimizado" descreve o microorganismo no qual as modificações descritas acima são integradas acarretando o melhor desempenho industrial para a produção do(s) metabólito(s) desejado(s) e possivelmente a produção mais baixa de subprodutos.
Em uma aplicação preferida o microorganismo é E. coli ou C. glutamicum ou Saccharomyces cerevisiae.
Na aplicação mais preferida o organismo é E. coli.
Descrição detalhada da invenção
Uma cepa de E. coli na qual o repressor de metionina codificado pelo gene meti tem sido substituído por um cassete de cloranfenicol (AmetJ::Cm) e que hospeda um alelo metA com sensibilidade de retro-alimentação reduzida à metionina e SAM (metA* W) tem sido descrita em PCT N0 PCT/IB04/001901 depositado aos 12 de maio de 2004. Nesta cepa as seguintes modificações genéticas foram introduzidas.
Construção de MG1655 metA*11 AmetJiiCm Ytrc- metF::Km
Para clonar gene metF sob o controle do promotor heterólogo P trc, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol ou canamicina próximo dos genes de interesse. Para este propósito os seguintes oligonucleotídeos foram usados: PircmetF R (SEQ ID NO 1 )
GCCAGGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAA AAGCTCATaatatacc tccttattccacacattaíacgagccggatgattaatígtcaacagctcTG TAGGCTGGAGCTGCTTCG
com:
- uma região (letras maiúsculas) homóloga à seqüência (4130259-4160195) do gene metF (seqüência de referência no sítio da Internet http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
- uma região (letras em itálico) homóloga à seqüência de promotor Ptre com o RBS (negrito) os boxes -35 e -10 (negrito)
- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS5 97: 6640-6645)
Ptre-metF F (SEQ ID NO 2 )
ccttcatctttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatgagg taaggttcacactggctcaccftcgggígggcctffcígcCATATGAATATCCTCCTTAG com :
- uma região (letras' minúsculas) homóloga à seqüência (4130114-4130195) da região de gene metF (seqüência de referência no sítio da Internet http://genolist.pasteur.fr/Colibti/)
- uma região (itálicos, letras minúsculas) homóloga à seqüência do bacteriófago T7 terminus (Genbank VOl 146)
- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotídeos Ptre-metF F e Ptre-metF R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pKD4. O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na cepa MGl655 metA*11 AmetJ (pKD46), na qual a enzima Red recombinase expressada permite a recombinação homóloga. Os transformantes de resistência à canamicina foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos PfrometFv F e PirometFv R definidos abaixo.
PfrometFv F (SEQ ID NO 3) :
GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG (homóloga à seqüência de 4129866 a 4129894).
PfrometFv R (SEQ ID NO 4):
CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG (homóloga à seqüência de 4130524 a 4130497).
A cepa resultante foi chamada de MGl 655 metA* 11 AmetJ PfroraeíF:Km.
Construção de plasmídeo pME101-thrrA*l-çysE pME101-thrA*l
Para reforçar a produção de homo-serina thrA* codificador de aspartocinase/homo-serina com resistência de retro-alimentação reduzida à treonina foi expressado do plasmídeo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 ρ 4631) usando o promotor Pire. Para a construção do plasmídeo pME101-thrA*l thrA foi amplificado por PCR de DNA genômico usando os seguintes oligonucleotídeos:
BspHlthrA (SEQ ID NO 5):
ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc
.SmalthrA (SEQ ID NO 6):
ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc
O fragmento amplificado por PCR foi cortado com as enzimas de restrição BspHi e Smal e clonado em sítios Ncol/Smal do vetor pTRC99A (Stratagene). Para a expressão de um vetor de cópia baixa o plasmídeo pMElOl foi construído como segue. O plasmídeo pCL1920 foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos PMElOIF e PME10IR e o fragmento BstZlll Xmnl do vetor pTRC99A hospedando o gene Iacl e o promotor Pirc foram inseridos no vetor amplificado. O vetor resultante e o vetor hospedando o gene thrA gene foram restritos por Apal e Smal e o fragmento contendo thrA foi clonado no vetor pMElOl. Para mitigar o thrA de inibição de retro- alimentação a mutação F318S foi introduzida por mutagênese sítio- direcionada (Stratagene) usando os oligonucleotídeos ThrAF F318S e ThrAR F318S, resultando no vetor pME101-rárA* 1.
PMElOlF (SEQID NO 7): Ccgacagtaagacgggtaagcctg
PMElOlR (SEQ ID NO 8): Agcttagtaaagccctcgctag
ThrAF F318S (SmaI) (SEQ ID NO 9):
Ccaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggcccggg
ThrAR F318S (SmaI) (SEQ ID NO 10):
Cccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattgg
pME 101thr-Ά* 1 -cysE
Para a construção de pME 101-thrA* 1 -cysE o gene cysE foi amplificado por PCR usando oligonucleotídeos Ome BOOl e Ome B002, o produto de PCR foi cortado com a enzima de restrição PvmII e clonado no sítio Smal do vetor pME101-thrA*l resultando no vetor pME101thrA*l- cysE.
Ome B001_cysER-PvuII (SEQ ID NO 11)
GGAGGGACAGCTGATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGGCGC Ome B002_cysEF-PvuII (SEQ ID NO 12)
Atacgcagctggacattagatcccatccccatactcaaatgtatgg
sítios PvuII estão sublinhados. A seqüência em negrito corresponde a cysE (Colibri) (3780423-3780397)
Construção de MG1655 metA*ll AmetJ ::Cm Vtrc- metH::Km
Para reforçar a produção de metionina o gene metH foi sobreexpressado usando o promotor Ptrc. Para a construção os seguintes oligonucleotídeos foram usados:
DiclR-metHF (SEQ ID NO 13)
gcaccagaatacgttcatttaactgcgcacgcagttgttccactttgctgctcatGrCrGrCCrCC4Gr A CA TGCAA CCCCAA CA TTA TA CGA GCCGGA TGA TTAA TTGTCAA CA GC TCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com:
- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (4221461-4221408) do gene metH (seqüência de referência no sítio da Internet http:// enolist.pasteur.fr/Colibri/)
- uma região (itálicos, letras maiúsculas) homóloga à seqüência de promotor Ptrc com o RBS (negrito) os boxes -35 e -10 (negrito)
- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner5 B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
iclR-metHF (SEQ ID NO 14)
GCTTTTA CCA CA GA TGCGTTTA TGCCA GTA TGGTTTGTTGAA TTTTTA TT AAA TCTGGGTTGA GCGTGTCGGGA GCAA GTCA TA TGAA TA TCCTCCTT AG
com :
- uma região (itálicos, letras maiúsculas) homóloga à seqüência (4221327-4221406) da região de gene metH (seqüência de referência no sítio da Internet http://genolist.pasteur.ír/Colibri/),
- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotídeos DiclR-metHF e iclR-metHF foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pKD4. O produto de PCR obtido é então introduzido por eletroporação na cepa MGl655 metA*11 AmetJ (pKD46), na qual a enzima Red recombinase foi expressada permitindo a recombinação homóloga. Transformantes resistentes à canamicina são selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos iclF e iclR definidos abaixo.
iclF (SEQID NO 15):
CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC (homóloga à seqüência de 4221558 to 4221533).
iclR (SEQ IDNO 16):
GCTTTTT AATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC (homóloga à seqüência de 4219917 a 4219949).
A cepa resultante foi chamada de MGl 655 metA* 11 Amefl Pírc-meíH.Km.
Construção de MG1655 metA*ll AmetJ ::Cm Vtrc- rae/F;Km Vtrc-metW
Para a construção da cepa MGl 655 metA* 11 Amefl::Cm Vtrc- meíF. Km Vtrc-metH o cassete de resistência à canamicina e cloranfenicol foi eliminado da cepa MG1655 metA*l 1 Amefl::Cm Pírc-meíH.Km.
O plasmídeo pCP20 trazendo FLP recombinase atuando nos sítios FRT do cassete de resistência a cloranfenicol foi introduzido na cepa recombinante por eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda dos dois cassetes foi verificada por análise de PCR. A cepa retida foi chamada de MG1655 metA* 11 Amefl Vtrc-metH.
Para transferir o construto de promotor Vtrcr.metV: Km para dentro da cepa MG1655 metA* 11 Amefl Vtrc-metH, o método de transdução de fago Pl foi usado. O protocolo seguido foi implementado em 2 etapas com a preparação do lisato de fago da cepa MG1655 MG165 5 metA* Il Amefl Vtrc-metF:Km e a subseqüente transdução para dentro da cepa MGl655 metA* 11 Amefl Vtrc-meM.
Preparação de lisato de fago P 1:
Inoculação com 100 μΙ. de uma cultura noturna da cepa MGl655 metA* U Ametl Ptrc-metF :Km de 10 mL de LB + Km 50 μg/mL+ glicose 0,2% + CaCl2 5 mM.
- Incubação por 30 min a 37°C com agitação.
- Adição de 100 μΙ. de lisato de fago Pl preparado da cepa MG1655 (cerca de 1.109 fagos/mL).
Agitação a 37°C por 3 horas até que todas as células fossem lisadas.
Adição de 200 μl de clorofórmio e agitação. Centrifugação por 10 min a 4.500 g para eliminar fragmentos celulares.
Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 μl de clorofórmio.
Armazenagem de lisato a 4°C.
Transdução
- Centrifugação por 10 min at 1500 g de 5 mL de uma cultura noturna da cepa MG1655 metA* 11 Ametl Vtrc-metH em meio LB.
Suspensão da pelota celular em 2,5 mL de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM
Tubos de controle: 100 μL de células
100 μL de fagos Pl de cepa MG1655 metA*U Ametl Ptrc- metF.Km
Tubo de teste: 100 μί de células + 100 μί de fagos Pl da cepa MGl655 metA * 11 Ametl Ptrc-metF:¥im
Incubação por 30 min a 30°C sem agitação.
- Adição de 100 μL de citrato de sódio 1 M em cada tubo e agitação.
Adição de 1 mL de LB.
Incubação por 1 hora a 37°C com agitação.
Espalhamento sobre placas LB + Km 50 μg/mL após centrifugação dos tubos por 3 min a 7.000 rpm.
Incubação a 37°C durante a noite.
Verificação da cepa
Transformantes resistentes à canamicina foram selecionados e a presença do construto de promotor Ptrc-metF:Km foi verificada por Análise de PCR com os oligonucleotídeos PirometFv F e Pírc-metFv R, descritos acima. A cepa retida foi chamada de MGl 655 metA* 11 AmeÜ::Cm Ytrc- metH Ytrc-metF:Km.
Construção de MG1655 metA* 11 AmetJ::Cm Ytrc- cysM:: Km
Para clonar o gene cysM sob o controle do promotor heterólogo Ptrc, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência à canamicina ou cloranfenicol próxima de genes de interesse. Para este propósito os seguintes oligonucleotídeos foram usados: P/rc-cysM F
gcctgatgcgacgcttgcgcgtcttatcaggtctacaggttacaaaccttgccataatatacctccttaccacaca ttatacgagccggatgatt aattgtcaacagctcCATATGAATATCCTCCTTAG (SEQ IDNO 17)
com :
- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (2537627-2537681) do gene cysM (seqüência de referência no sítio da Internet http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
- uma região (itálicos, letras minúsculas) homóloga à seqüência de promotor Ptrc com o RBS (negrito) os boxes -35 e -10 (negrito)
- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
Pírc-cysM R ggttgagtgaatgttaaacgcccggaggcgcttcccgcgatccgggctttt7M TCA CACTGGCTCA CCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCIGTAGGCTGGAGCTGCTTCG (SEQ IDNO 18)
com :
- uma região (letras minúsculas) homóloga à seqüência (2537734-2537684) da região de gene cysM (seqüência de referência no sítio da Internet http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
- uma região (itálicos, letras maiúsculas) homóloga à seqüência do bacteriófago T7 terminus (Genbank VOl 146)
- uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (seqüência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Os oligonucleotídeos Pírc-cysM F e Pírc-cysM R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pKD4. O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na cepa MGl 655 metA*11 AmetJ (pKD46), na qual a enzima Red recombinase foi expressada permitindo recombinação homóloga. Transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotídeos Pirc- cysMv F e PirocysMv R definidos abaixo.
Pírc-cysMv F :
ggtgacaagaatcagttccgc (homóloga à seqüência de 2537262 a 2537282). (SEQ IDNO 19)
Pírc-cysMv R :
GCGTTTATTCGTTGGTCTGC (homóloga à seqüência de 2537833 a 2537814). (SEQ ID NO 20)
A cepa resultante é chamada de MG1655 metA*ll AmetJ J Pírc-cysM::Km.
Construção de MG1655 metA*11 AmetJ Ytrc-metY Ytrc- metW Ptrc-cysM.-Km
Para a construção da cepa MG165 5 metA* 11 AmetJ Ptrc-metF Vtrc-metR VtrccysM.Km os cassetes de resistência à canamicina e a cloranfenicol foram eliminados da cepa MGl655 metA* 11 AmetJiCm Ptrc- raeíF/Km Ptrc-metH usando plasmídeo pCP20, como descrito acima. A cepa retida foi chamada de MGl 655 metA* 11 Ametl Vtrc-metY Vtrc-metU.
Para transferir o construto de promotor Ptrc-cysM: Km para dentro de cepa MGl 655 metA* 11 Ametl Vtrc-metY Vtrc-metH, o método de transdução de fago Pl foi usado. O protocolo seguido foi implementado em duas etapas com a preparação do lisato de fago da cepa MGl 655 MG1655 metA* 11 Ametl Ptrc-cysM:¥Lm e a subseqüente transdução para dentro da cepa MGl655 metA* 11 Ametl Ptrc-metF Vtrc-metW como descrito acima. A cepa retida foi chamada de MG1655 metA* 11 Ametl Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM:Km.
Combinação de expressão intensificada de cysE e metH e expressão otimizada de metF e cysM com alelos metA* 11 e AmetJ
Para a construção de as cepas MGl655 metA* W AmetlwCm (pME 101 -thrA* 1), MG1655 metA*11 AmetlwCm Ptrc-metH:Km (pMElOl- thrA*l-cysE), MG1655 metA* 11 AmetlwCm Ptre-metR Ptrc-met¥:Km (pME 101 -thrA* 1 -cysE) e MG1655 metA* 11 Ametl VtrcmetF Ptrc-metR Ptrc-cysM:Km (pME 101 -thrA* 1 -cysE) o plasmídeos (pME101-í/zrA*l) ou (pME 101 -thrA* 1 -cysE) foram introduzidos nas cepas MGl 655 metA* 11 AmetlwCm, MG1655 metA*l1 AmetlwCm Ptrc-metH:Km, MG1655 metA*ll AmetlwCm Vtrc-metü Ptrc-metF:Km e MG1655 metA*1l Ametl Vtrc-metY Vtrc-metH Vtrc-eysMiKm por transformação.
Avaliação de cepas produtoras de metionina com expressão intensificada de cysE, metH e/ou cysM e/ou metF sob o controle de um promotor heterólogo
Cepas de produção foram inicialmente avaliadas em frascos Erlenmeyer pequenos. Uma pré-cultura foi crescida em meio LB com glicose 2,5 g/L e usada para inocular uma cultura noturna em meio mínimo PCL Esta cultura serviu para inocular uma cultura de 50 mL para uma OD600 de 0,2 em meio PCl suplementado com 0,01 g.L-1 de vitamina B 12. Se indicado sulfato de amônio foi substituído por tiossulfato de amônio 5,6 g/L. Espectinomicina foi adicionada se necessário em uma concentração de 100 mg/L. Em uma OD600 de 4,5 to 5 aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC após derivação com OPA/Fmoc e outros metabólitos relevantes foram analisados usando GC-MS após sililação.
Tabela 1. Composição de meio mínimo PCl
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Como pode ser visto em tabela 2 a quantidade de metionina é aumentada sob sobreexpressão de cysE, cysE e metH ou cysE, metR e expressão alterada de met¥ juntas. Expressão intensificada de cysM pode adicionalmente aumentar a produção de metionina. Certas cepas produziram quantidades maiores de metionina na presença de tiossulfato. TA produção mais alta de metionina é obtida, quando cysE, cysM e metW são sobreexpressados e expressão de metF está sob o controle do promotor Vtrc na presença de tiossulfato. Produção de isoleucina é dramaticamente reduzida sob expressão de cysE e metH, indicando atividade de γ-eliminação reduzida. Sobreexpressão de cysM reduz γ-eliminação em uma cepa sobreexpressando cysE e metü e expressando metF de um promotor heterólogo.
Tabela 2. Metionina e isoleucina em mmol/g DW produzidas em cultura em batelada com sulfato (S) ou tiossulfato (T) como fonte de enxofre por cepas descritas acima, n.d., não determinado
<table>table see original document page 28</column></row><table>
3. Determinação de mudanças em atividades enzimáticas de cysíL e metH
Para validar as mudanças na expressão de cysE e expressão de metH, as atividades das enzimas correspondentes foram determinadas em extratos crus.
Para a determinação das atividades de enzima in vitro, cepas de E. coli foram cultivadas em meio mínimo como descrito acima e colhidas na fase de Iog média. Células foram ressuspensas em tampão fosfato de potássio frio e sonicadas sobre gelo (sonicador Branson, 70W). Após centrifugação, as proteínas contidas nos sobrenadantes foram quantificadas (Bradford, 1976).
Para a determinação de atividade de serina acetil-transferase (cysE) 10 μl de extrato foram ensaiados em fosfato de potássio 100 mM de pH 7,5, Acetil-CoA 4 mM, L-serina 30 mM por 10 minutos a 25°C. Proteína foi precipitada com acetona e O-acetil-serina foi detectada por GC-MS após derivação com um reagente de sililação.
Para a determinação de atividade de metionina sintase {metH) dependente de vitamina B12, 100 μl de extrato foram ensaiados em fosfato de potássio 100 mM pH 7,2, homocisteína 1 mM, metil-tetra-hidro-folato 0,25 mM, vitamina B12 50 μΜ, S-adenosil-metionina 20 μΜ e DTT 25 mM por 10 minutos a 37°C. Proteína foi precipitada com acetona e a metionina produzida foi detectada por GC-MS após derivação com um reagente de sililação.
Como pode ser visto na tabela 3 sobreexpressão dos genes cysE e metH aumenta a atividade de enzima correspondente. Assim a atividade aumentada destes genes leva à produção aumentada de metionina.
Tabela 3. Atividades em mUI/g DW de serina acetil- transferase (cysE) e metionina sintase (metH) em cepas produtoras de metionina cultivadas na presença de tiossulfato.
<table>table see original document page 29</column></row><table>
Validação de produção de metionina sob condições de fermentação
Cepas que produziram quantidades substanciais de metabólitos de interesse foram subseqüentemente testadas sob condições de produção em fermentadores de 300 mL (DASGIP) usando um protocolo de batelada alimentada.
Para este propósito uma cultura de 8 horas crescida em meio LB com glicose 2,5 g/L foi usada para inocular uma pré-cultura noturna em meio mínimo PCl (veja acima). Fermentadores foram cheios com 150 mL de meio mínimo (Bl) e inoculados para uma concentração de biomassa de quase 0,09 g/L com 1,5 mL de pré-cultura concentrada (entre 9 e 12 g/L).
Tabela 4. Composição de meio mínimo Bl
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Tabela 5. Meio mínimo de tipo FB de tipo Tl
<table>table see original document page 30</column></row><table> Tabela 6. Meio mínimo FB tipo S
<table>table see original document page 31</column></row><table>
A temperatura da cultura foi mantida constate em 37°C e o pH foi permanentemente ajustado para valores entre 6,5 e 8, preferencialmente 6,7 usando uma solução de NH4OH. A velocidade de agitação foi mantida em 600 rpm durante a fase de batelada e foi aumentada para até 1.000 rpm no final da fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e 40%, preferencialmente saturação de 30% pelo uso de um controlador de gás. Quando a massa celular alcançou uma concentração de 0,9 a 1,2 g/L a batelada alimentada foi iniciada com uma vazão de fluxo inicial 0,1 e 1,5 mL/h, preferencialmente 0,43 mL/h e um aumento sigmoidal (24 h) para até valores e vazão de fluxo entre 0,5 e 5,8 mL/h, preferencialmente 1,7 mL/h. As condições de alimentação precisa foram calculadas pela fórmula abaixo:
<formula>formula see original document page 31</formula>
onde Q(t) é a vazão de fluxo de alimentação em mL/h para um volume de batelada de 150 mL
Pl está entre 0,025 e 0,35, preferencialmente 0,100.
P2 está entre 0,400 e 5,600, preferencialmente 1,600. Ρ3 está entre 0,068 e 0,95, preferencialmente 0,270.
P4 está entre 1,250 e 17,5, preferencialmente 5,000.
Neste caso meio FB contendo glicose em concentrações entre 300 e 800 g/L (preferencialmente 500g/L) foi usado.
Quando a concentração de biomassa alcançou valores entre 20 e 50 g/L (preferencialmente 35g/L, entre 40 e 80 h) a fermentação foi interrompida e as concentrações de metionina e isoleucina extracelulares foram determinadas usando HPLC.
Tabela 7. Títulos de metionina obtidos em fermentações de batelada alimentada de cepas sobreexpressando cysE, e metH ou metF sob um promotor heterólogo ou uma combinação dos três. Ref corresponde a MGl 655 met A* 11 AmetJ. Cepas foram crescidas na presença de tiossulfato (T) ou sulfato (S).
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Como pode ser visto em tabela 7, expressão intensificada de cysYL, cysE e metH, cysE, metH e metF sob o controle de um promotor heterólogo ou crescimento das cepas na presença de tiossulfato pode significativamente aumentar a produção de metionina. Produção de isoleucina é significativamente reduzida pela sobreexpressão de cysE e/ou metH
A cepa que produziu a quantidade mais alta de metionina no fermentador de 300 mL foi subseqüentemente testada sob as condições de produção em um fermentador de 2,5 L (PIERRE GUERIN) usando um protocolo de batelada alimentada.
Para este propósito cultura de 8 h crescida em meio LB com glicose 2,5 g/L foi usada para inocular uma pré-cultura noturna em meio mínimo PCI. Fermentadores foram cheios com 600 mL de meio mínimo (B2) e inoculados para uma biomassa de 0,9 g/L com 6 mL pré-cultura concentrada (entre 9 e 12 g/L).
A temperatura da cultura foi mantida constante em 37°C e o pH foi permanentemente ajustado para valores entre 6,3 e 8, preferencialmente 6,8 usando uma solução de NH4OH 28%. A velocidade de agitação inicial foi ajustada em 200 rpm durante a fase de batelada e foi aumentada para até 1.200 rpm durante a fase de batelada alimentada. A vazão de fluxo de ar inicial foi ajustada em 40NL/h durante a fase de batelada e foi aumentada para até 250NL/h durante a fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e 40% de saturação, preferencialmente 30% pelo aumento da velocidade de agitação e da vazão de fluxo de ar. Quando a concentração de biomassa alcançou 1,2 a 1,5 g/L, a batelada alimentada foi iniciada com uma vazão de fluxo inicial entre 0,5 e 4 mL/h, preferencialmente 1,0 mL/h e um aumento exponencial (15 h) para até valores de vazão de fluxo entre 3 e 35 mL/h, preferencialmente 20,1 mL/h. Neste ponto, a vazão de fluxo de vazão foi mantida constante por 10 a 45 horas, preferencialmente 30 h. Para a alimentação FB tipo T2 foi usada (veja tabela 8) contendo glicose em concentrações entre 300 e 800 g/L, preferencialmente 750 g/L.
Quando a concentração de biomassa alcançou valores entre 40 e 110 g/L, preferencialmente 90g/L a fermentação foi interrompida e a concentração de metionina extracelular concentração foi determinada usando HPLC. A cepa MG1655 metA* 11 AmetJ Vtrc-metR Vtrc-metF (pMElOl- thrA*l-cyíE) produziu metionina 169 mM sob estas condições.
Tabela 8. Meio mínimo FB T2
<table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table>
Tabela 9. Composição de meio mínimo B2
<table>table see original document page 34</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Metabolic Explorer
<120> Método para a produção de metionina pelo cultico de um
microorganismo modificado para aumentar a produção de cisteina
<130> 349179 D24084
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 1
gccaggctct gattcagggc atcccgctgg ctggcgtgaa aaaagctcat aatatacctc 60 cttattccac acattatacg agccggatga ttaattgtca acagctctgt aggctggagc 120 tgcttcg 127
<210> 2 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 2
ccttcatctt tacatctgga cgtctaaacg gatagatgtg cacaacacaa catataacta 60 caagcgattg atgaggtaag gttcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgccata 120 tgaatatcct ccttag 136
<210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 3
gcccggtact catgttttcg ggtttatgg 29
<210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 4
ccgttattcc agtagtcgcg tgcaatgg
<210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 5
ttatcatgag agtgttgaag ttcggcggta catcagtggc
<210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 6
ttacccgggc cgccgccccg agcacatcaa acccgacgc
<210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 7
ccgacagtaa gacgggtaag cctg
<210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 8
agcttagtaa agccctcgct ag
<210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 9
ccaatctgaa taacatggca atgtccagcg tttctggccc ggg 43
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 10
cccgggccag aaacgctgga cattgccatg ttattcagat tgg 43
<210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 11
ggagggacag ctgatacgaa agaagtccgc gaactggcgc 40
<210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 12
atacgcagct gggacattag atcccatccc catactcaaa tgtatgg 47
<210> 13 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 13
gcaccagaat acgttcattt aactgcgcac gcagttgttc cactttgctg ctcatgtctg 60 tcctccagta catgcaaccc cacacattat acgagccgga tgattaattg tcaacagctc 120 tgtaggctgg agctgcttcg 140
<210> 14 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial
<220> <223> Oligonucleotideo sintético <400> 14
gcttttacca cagatgcgtt tatgccagta tggtttgttg aatttttatt aaatctgggt 60 tgagcgtgtc gggagcaagt catatgaata tcctccttag 100
<210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 15
cctttgaggt cgcatggcca gtcggc 26
<210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 16
gctttttaat agaggcgtcg ccagctcctt gcc 33
<210> 17 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 17
gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag gtctacaggt tacaaacctt gccataatat 60 acctccttac cacacattat acgagccgga tgattaattg tcaacagctc catatgaata 120 tcctccttag 130
<210> 18 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 18
ggttgagtga atgttaaacg cccggaggcg cttcccgcga tccgggcttt ttatcacact 60 ggctcacctt cgggtgggcc tttctgctgt aggctggagc tgcttcg 107
<210> 19 <211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 19
ggtgacaaga atcagttccg c
<210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 20
gcgtttattc gttggtctgc
Claims (27)
1. Método para a produção de metionina, seus derivados, ou precursores pelo cultivo de um microorganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre e recuperação de metionina do meio de cultura, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é modificado para intensificar a produção de cisteína.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é aumentada a expressão de pelo menos um gene envolvido em produção de cisteína.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene envolvido na produção de cisteína é selecionado dentre o grupo consistindo de: • cysA sulfato permease • cysU, cysT componente de transportador ABC de sulfato • cysW proteína transportadora de sulfato ligada à membrana • cysZ ORF a montante de cysK • cysN ATP sulfurilase • cysO sulfato adenil-transferase • cysC adenilil-sulfato cinase • cysH adenilil-sulfato redutase • cysH sulfito redutase, subunidade alfa • cysI sulfito redutase, subunidade beta • cysE serina acetil-transferase • cysK cisteína sintase • cysM O-acetil-sulfidrilase • cysZ transporte de sulfato • sbp Proteína ligante de sulfato periplásmica.
4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos a expressão de cysE é aumentada.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos a expressão de cysM é aumentada.
6. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene, que está envolvido na produção de unidades Cl e o potencial de transferência para homocisteína, é aumentada e/ou conduzida por um promotor heterólogo.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene, que está envolvido na produção de unidades Cl e/ou no potencial de transferência para homocisteína, é selecionado dentre o grupo consistindo de: • metE, metR codificadores de metionina sintase • metF codificador de 5,10-metileno-tetra-hidro-folato-redutase • glyA codificador de serina-hidróxi-metil-transferase • gcvTHP, lpd codificadores de complexo de clivagem de glicina.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a expressão de metE, metW e/ou metF é aumentada e/ou pelo menos um dos genes é expressado de um promotor heterólogo.
9. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que atividade de γ-eliminação é mantida baixa pela otimização do fluxo de biossíntese de cisteína e assim a produção do subproduto isoleucina é reduzida.
10. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é aumentada a expressão de genes adicionais envolvidos na produção de metionina.
11. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é atenuada a expressão de genes diminuidores da produção de metionina.
12. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o repressor de metionina codificado pelo gene metJ é deletado ou mutado e/ou alelos de homo-serina succinil-transferase (MetA) codificadores de enzimas com sensibilidade de retro-alimentação reduzida à S-adenosil-metionina e/ou metionina é/são integrados na cepa.
13. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre no meio de cultura é sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito ou uma combinação de fontes diferentes.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre no meio de cultura é sulfato ou tiossulfato, ou uma mistura dos dois.
15. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de isolamento dos constituintes / aminoácidos desejados do caldo de fermentação e/ou da biomassa opcionalmente permanecendo em porções ou na quantidade total (0-100%) no produto final.
16. Microorganismo usado para a produção fermentativa de metionina ou seus derivados no qual a produção de metionina ou derivados, caracterizado pelo fato de que o microorganismo está otimizado para intensificar a produção de cisteína.
17. Microorganismo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene envolvido na produção de cisteína é aumentada.
18. Microorganismo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene envolvido na produção de cisteína é selecionado dentre o grupo consistindo de: • cysA sulfato permease • cysU, cysT componente de transportador ABC de sulfato • cysW proteína transportadora de sulfato ligada à membrana • CysrL ORF a montante de cysK • çysN ATP sulfurilase • cysO sulfato adenil-transferase • cysC adenilil-sulfato cinase • cysH adenilil-sulfato redutase • cysl sulfito redutase, subunidade alfa • cysl sulfito redutase, subunidade beta • cysE serina acetil-transferase • cysK cisteína sintase • çysM O-acetil-sulfidrilase • cysZ transporte de sulfato • sbp Proteína ligante de sulfato periplásmica.
19. Microorganismo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos a expressão de cysE é aumentada.
20. Microorganismo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos é aumentada a expressão de çysM.
21. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene, que está envolvido na produção de unidades Cleo potencial de transferência para homocisteína, é aumentada e/ou conduzida por um promotor heterólogo.
22. Microorganismo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene, que está envolvido na produção de unidades Cl e/ou no potencial de transferência para homocisteína, é selecionado dentre o grupo consistindo de: • metE, metR codificadores de metionina sintase • metF codificador de 5,10-metileno-tetra-hidro-folato-redutase • g/jyA codificador de serina-hidróxi-metil-transferase • gcvTHP, Ipd codificadores de complexo de clivagem de glicina.
23. Microorganismo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a expressão de metE, metW e/ou metF é aumentada e/ou pelo menos um dos genes é expressado de um promotor heterólogo.
24. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 16 a 23 caracterizado pelo fato de que atividade de γ-eliminação é mantida baixa pela otimização do fluxo de biossíntese de cisteína e assim a produção do subproduto isoleucina é reduzida.
25. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo fato de que a expressão de genes adicionais envolvidos na produção de metionina é aumentada.
26. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 16 a 25, caracterizado pelo fato de que é atenuada a expressão de genes diminuidores da produção de metionina.
27. Microorganismo de acordo com uma das reivindicações 16 a 26, caracterizado pelo fato de que o repressor de metionina codificado pelo gene meti é deletado ou mutado e/ou alelos de homo-serina succinil- transferase (MetA) codificadores de enzimas com sensibilidade de retro- alimentação reduzida à S-adenosil-metionina e/ou metionina é/são integrados na cepa.
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Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6, NA RPI 2196 DE 05/02/2013. |
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| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO POR NAO SE ENQUADRAR NO ART. 229-C DA LPI. |
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| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: EVONIK DEGUSSA GMBH (DE) |
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| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 09/10/2018, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: EVONIK OPERATIONS GMBH (DE) |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 18A ANUIDADE. |
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| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2756 DE 31-10-2023 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |