DE10116881A1

DE10116881A1 - Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren

Info

Publication number: DE10116881A1
Application number: DE2001116881
Authority: DE
Inventors: Thomas Maier; Carsten Gaebert
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2002-10-17

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure mittels einer enzymatischen Biotransformation, bei dem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase zu einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einem pH-Wert im Bereich zwischen pH 5,0 und 7,4 durchgeführt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren durch enzymatische Biotrans formation.

Nicht-proteinogene Aminosäuren sind Aminosäuren, die in der Natur nicht als Bausteine für die Proteinbiosynthese verwendet werden und dadurch klar von den 20 proteinogenen Aminosäuren abzugrenzen sind. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die sehr seltene Aminosäure L-Selenocystein, die durchaus in Pro teinen vorkommt, den nicht-proteinogenen Aminosäuren zugerech net.

Nicht-proteinogene Aminosäuren stellen interessante Verbindun gen, z. B. für die Herstellung von Pharma- und Agrowirkstoffen, dar. Sie können als Wirkstoff oder als Teil eines Wirkstoffs in einer Art molekularer Mimikry die Struktur von natürlichen Aminosäuren imitieren und dadurch zum Beispiel bei Rezeptor- Interaktionen eine Modulation der natürlichen Reaktion bewir ken. Zudem können sie ganz allgemein als chirale Verbindungen im Rahmen des "chiral-pool" als Synthesebausteine dienen.

Bisherige Herstellverfahren für nicht-proteinogene Aminosäuren in enantiomerenreiner Form basieren meist auf aufwändigen Syn thesen, die zudem meist nur Zugang zu einer bestimmten Verbin dung erlauben. Nur wenige Verfahren ermöglichen durch den ein fachen Austausch eines Eduktes die Herstellung verschiedener Verbindungen. In den meisten Fällen handelt es sich um chemi sche Synthesen, die ihrerseits meist schon von chiralen Bau steinen ausgehen. Andere Verfahren kombinieren die chemische Synthese von Razematen mit einer Razematspaltung, die häufig enzymatisch durchgeführt wird.

Daneben sind auch einige enzymatische Verfahren beschrieben, die von prochiralen Verbindungen ausgehen und die stereoselek tive Synthese von nicht-proteinogenen Aminosäuren ermöglichen.

So können mit Hilfe von Transaminasen aus α-Ketosäuren mit L- Glutaminsäure als Amino-Donor verschiedene, nicht-proteinogene Aminosäuren hergestellt werden (Taylor et al. 1998, TIBTECH 16: 412-418). Ein weiteres Beispiel ist die Synthese von L-tert.- Leucin mit Hilfe von Leucin-Dehydrogenase (Drauz 1937, Chimia 51: 310-314).

Ein besonders einfaches Verfahren zur Herstellung von nicht proteinogenen Aminosäuren durch direkte Fermentation von Mik roorganismen ist in der Patentanmeldung DE 100 46 934 (angemel det am 21.09.2000 vom gleichen Anmelder) beschrieben. Hierbei kommen Organismen zum Einsatz, die einen deregulierten Cystein-Stoffwechsel aufweisen und deshalb einen hohen Spiegel an O-Acetyl-L-Serin bereitstellen. Diese Verbindung dient im Cystein-Stoffwechsel als biosynthetischer Vorläufer von L- Cystein. Letzteres entsteht durch Substitution der Acetat- Gruppe an der β-Position gegen einen Thiolrest. Diese als β- Substitution bezeichnete Reaktion wird von Enzymen der Klasse O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen [EC 4.2.99.8] katalysiert. Durch Zufütterung von nukleophilen Substanzen bestimmter Ver bindungsklassen (Thiole, Azole bzw. Isoxazolinone) während der Fermentation gehen diese in die β-Substitution ein, und es wird die Produktion von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren erreicht. Die Struktur der jeweiligen Reste der hergestellten Aminosäu ren werden somit durch die zugeführte, nukleophile Verbindung diktiert.

Ein Problem bei diesem Verfahren ist, dass die zugefütterten, nukleophilen Verbindungen nicht zu hoch dosiert werden dürfen, da andernfalls durch die Verbindung selbst oder durch die re sultierende Aminosäure toxische Effekte auf den Stoffwechsel der Mikroorganismen hervorgerufen werden können. Dies trifft insbesondere für viele Thiolverbindungen zu, da sie als redo xaktive Substanzen in höheren Konzentrationen Toxizität besit zen. Zudem ist der Einsatz von Thiolverbindungen in fermenta tiven Verfahren sehr problematisch, weil sie bei intensiver Belüftung im Fermenter zur Oxidation neigen und ohne techni sche Vorkehrungen eine signifikante Geruchsbelästigung hervorrufen. Auch ein Zufüttern von Azid oder Cyanid, von denen be kannt ist, dass sie in die β-Substitution mit O-Acetyl-L- Serin-Sulfhydrylasen eingehen (Flint et al., 1996, "J. Biol. Chem.", 271: 16053-16067), ist aufgrund ihrer hohen Toxizität nicht möglich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren bereitzu stellen, das einen hoch dosierten Einsatz von nukleophilen Verbindungen - insbesondere auch von toxischen Verbindungen - ermöglicht.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein enzymatisches Biotransforma tionsverfahren, bei dem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophi len Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase zu einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure umge setzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei ei nem pH-Wert im Bereich zwischen pH 5,0 und 7,4 durchgeführt wird.

Durch dieses Verfahren wird die Synthese einer Vielzahl von nicht-proteinogenen, enantiomerenreinen und zum Teil neuarti gen L-Aminosäuren im industriellen Maßstab möglich.

O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen sind bekannt. Sie sind bisher aus verschiedensten Pflanzen und Mikroorganismen isoliert wor den. Am besten untersucht sind die entsprechenden bakteriellen Enzyme von Salmonella typhimurium. In diesem Organismus exis tieren zwei O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase-Enzyme, die mit OASS-A bzw. OASS-B bezeichnet werden. Die zugehörigen Gene sind ebenfalls bekannt und tragen die Bezeichnung CysK bzw. CysM. Obwohl beide Enzyme einen sehr ähnlichen Reaktionsmecha nismus besitzen, beträgt die Identität auf Basis der Aminosäu resequenz nur 45%.

Für OASS-B (CysM) wurde beschrieben, dass sie im Gegensatz zu OASS-A (CysK) in der Lage ist, eine Reaktion von O-Acetyl-L- Serin mit Thiosulfat zu S-Sulfocystein zu katalysieren. Diese Reaktion spielt beim Wachstum der Bakterien mit Thiosulfat als einziger Schwefelquelle eine wichtige Rolle.

Sequenzvergleiche von O-Acetyl-L-Serin-Genen aus verschiedenen Organismen zeigen zudem, dass es zwei phylogenetische Gruppen gibt (Kitabatake et al., 2000, "J. Bacteriol.", 182: 143-145). CysK von Salmonella typhimurium und Escherichia coli bilden eine große Gruppe zusammen mit den O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylasen aus anderen Eubacteria, aus methanogenen Ar chaea und aus Pflanzen. CysM von Salmonella typhimurium und E scherichia coli liegen dagegen in einer sehr kleinen Verwandt schaftsgruppe mit den O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen aus hy perthermophilen Archaea (z. B. Pyrococcus, Sulfolobus, Thermo plasma).

O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen im Sinne der vorliegenden Er findung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die Synthese von L-Cystein aus O-Acetyl-L-Serin und Sulfid katalysieren können. Sowohl CysM- als auch CysK-verwandte Enzyme sind daher O- Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen im Sinne der vorliegenden Erfin dung.

Obwohl einzelne Publikationen zeigen, dass O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylasen aus der CysK-Gruppe ein relativ breites Sub stratspektrum aufweisen (Ikegami & Murakoshi, 1994, "Phytoche mistry", 35: 1089-1104; Flint et al., 1996, "J. Biol. Chem.", 271: 16053-16067), wurde bisher die Möglichkeit des technischen Einsatzes von O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen zur Produktion von nicht-proteinogenen Aminosäuren nicht in Betracht gezogen.

Der entscheidende Grund, der einer technischen Realisierung der enzymatischen Herstellung von nicht-proteinogenen Amino säuren mit O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen bisher entge genstand, liegt in der Instabilität von O-Acetyl-L-Serin gera de in dem pH-Bereich, der dem Aktivitätsbereich der O-Acetyl- L-Serin-Sulfhydrylasen entspricht.

O-Acetyl-L-Serin isomerisiert in Abhängigkeit vom pH-Wert zu N-Acetyl-L-Serin. Die Reaktion ist irreversibel und beispiels weise bei einem pH-Wert von 7,6 mit Raten von 1% × min^-1 auch extrem schnell. Die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt mit abneh mendem pH-Wert, so daß die Verbindung z. B. bei pH 4,0 stabil ist. Der Mechanismus der Reaktion beruht auf einem intramole kularen, nukleophilen Angriff der deprotonierten Aminogruppe am Carbonyl-Kohlenstoff des Acyl-Rests (Tai et al. 1995, "Bio chemistry", 34: 12311-12322).

Das pH-Optimum von O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen liegt dage gen im Bereich von pH 8,0 (Ikegami & Murakoshi, 1994, "Phyto chemistry", 35: 1089-1104; Tai et al. 1995, "Biochemistry", 34: 12311-12322) und somit in einem Bereich der bezüglich der O-Acetyl-Serin-Isomerisierung sehr unvorteilhaft ist.

Aus diesem Grund schlagen Ikegami & Murakoshi eine biomimeti sche Synthese von nicht-proteinogen Aminosäuren mit O-Acetyl- L-Serin, Nukleophil, Pyridoxalphosphat und Metallionen (bevor zugt Ga²⁺) vor. Diese Reaktion ist in einem pH-Bereich von 3,5 -5,5 möglich und gewährleistet somit die Stabilität von O-Acetyl-L-Serin. Mit maximalen Ausbeuten < 45% ist die Effi zienz dieser Methode jedoch nicht sehr hoch. Ein großer Nach teil gegenüber der enzymatischen Synthese ist das Fehlen von Enantioselektivität.

Eine weitere Aufgabe die durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst wird, war es daher, ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen, nicht-proteinogenen Amino säuren bereitzustellen, das trotz der Inkompatibilität von O-Acetyl-L-Serin-Stabilität und Enzymaktivitätsoptimum einen effizienten, enzymatischen Umsatz (<< 45%) bei geringer Isome risierung gewährleistet.

Die Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst, da es sich vorzugsweise dadurch auszeichnet, dass:

- die Reaktion unterhalb des pH-Optimums der O-Acetyl-Serin- Sulfhydrylasen durchgeführt wird und
- das Enzym in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt wird.

Der bevorzugte pH-Bereich für die Herstellung von nicht-pro teinogenen Aminosäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung ist der pH-Bereich zwischen pH 5,0 und 7,4.

Besonders bevorzugt ist der pH-Bereich zwischen pH 6,0 und 7,1.

Der pH-Wert wird bevorzugt durch eine aktive pH-Kontrolle kon stant gehalten, um auch der stöchiometrischen Bildung von Es sigsäure entgegen zu wirken. Die aktive pH-Kontrolle wird vor zugsweise durch eine Meß- und Regeleinheit bewerkstelligt, die bei Abweichung des pH-Wertes vom Sollwert durch Dosierung ei ner Lauge oder Säure den gewünschten pH-Wert wieder einstellt.

Die bisher in der Literatur beschriebenen Reaktionen zur Syn these von nicht-proteinogenen Aminosäuren mit O-Acetyl-Serin- Sulfhydrylasen wurden entgegen dem erfindungsgemäßen Vorgehen im Bereich des pH-Optimums der O-Acetyl-Serin-Sulfhydrylasen, ohne aktive pH-Regulierung und lediglich im analytischen Mass stab durchgeführt. Zudem wurden ausnahmslos Enzyme der phylo genetischen Gruppe der CysK-Enzyme verwendet.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstel lung einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure bei dem O-Acetyl- L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase zu einer nicht-proteinogenen L- Aminosäure umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase CysM eingesetzt wird.

Eine ausreichend hohe Dosierung des Enzyms gewährleistet, dass auch außerhalb des pH-Optimums der Enzymreaktion ein ausrei chender Umsatz stattfindet. Eine solche Enzymkonzentration ist für das Verfahren vorzugsweise dann gegeben, wenn die Volumen aktivität der O-Acetyl-Serin-Sulfhydrylase A_Cys mindestens 10 Units/ml im Ansatz beträgt. Besonders bevorzugt beträgt die Aktivität 20-200 Units/ml. Die Aktivitätsbestimmung er folgt nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Test.

Es konnte im Zuge der vorliegenden Erfindung beobachtet wer den, dass auch O-Acetyl-Serin-Sulfhydrylasen aus der phyloge netischen Gruppe der CysM-Enzyme hervorragende Enzyme für die Herstellung von nicht-proteinogenen Aminosäuren darstellen. Das Spektrum der als Substrat geeigneten Nukleophile ist über raschenderweise sogar noch breiter als dasjenige der CysK- Enzyme.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Enzymreaktion als kontinuierliches Verfahren betrie ben. Hierbei wird während der Reaktion permanent O-Acetyl-L- Serin, O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase und Nukleophil zudosiert und gleichzeitig dem Ansatz eine Lösung, enthaltend die nicht- proteinogenen L-Aminosäure (Produktlösung), entnommen. Letzte res geschieht vorzugsweise derart, dass das Volumen im Reakti onsansatz gleichbleibend ist. Der besondere Vorteil dieser Vorgehensweise ist, dass ein Fließgleichgewicht eingestellt wird, so dass eine permanent niedrige Konzentration von O-Acetyl-L-Serin im Ansatz vorliegt und somit die Isomerisie rung vermindert wird. Vorzugsweise wird eine O-Acetyl-L-Serin- Konzentration von < 1,0 g/l im Ansatz eingestellt. Dieser Wert kann durch Variation der mittleren Verweilzeit der Lösung im Reaktionsansatz gesteuert werden. Die Vorlage an O-Acetyl-L- Serin für die kontinuierliche Umsetzung wird unter saurem pH- Wert gehalten, vorzugsweise bei pH 4-5, um eine ausreichen de Stabilität zu gewährleisten.

O-Acetyl-L-Serin war bisher nur aus chemischer Synthese durch Acetylierung von L-Serin zugänglich und aufgrund der hohen L-Serin-Preise teuer. Die am 15. Feb. 2001 eingereichte Anmel dung DE 101 07 002 des gleichen Anmelders beschreibt ein fermen tatives Verfahren zur Herstellung von O-Acetyl-L-Serin. Damit ist zwar ein kostengünstiges Produktionssystem verfügbar; je doch ist die Produktisolierung aus der Fermenterbrühe aufgrund der Instabilität des O-Acetyl-L-Serins problematisch.

Ein Vorzug der vorliegenden Erfindung ist es, dass eine O-Acetyl-L-Serin-haltige Fermenterbrühe, wie sie z. B. aus einer nach DE 101 07 002 durchgeführten Fermentation erhalten wird, als O-Acetyl-L-Serin-Quelle direkt im erfindungsgemäßen Ver fahren eingesetzt werden kann. Diese Vorgehensweise ist beson ders ökonomisch und vermeidet die Isolierung einer instabilen Verbindung.

Die Herstellung von O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen für die Synthese von nicht-proteinogenen Aminosäuren erfolgt vorzugs weise mit Hilfe von üblichen, rekombinanten DNS-Techniken, wie sie dem Fachmann geläufig sind.

Ein Gen, das für eine O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase kodiert, wird hierfür in einen geeigneten Vektor kloniert und anschlie ßend ein geeigneter Wirtsstamm transformiert. Als Wirtsstamm eignet sich jeder Mikroorganismus, der rekombinanten DNS- Techniken zugänglich ist und der für eine fermentative Her stellung von rekombinanten Proteinen geeignet ist.

Ein bevorzugter Mikroorganismus zur Herstellung von O-Acetyl- L-Serin-Sulfhydrylasen ist Escherichia coli.

Prinzipiell ist sowohl die chromosomale Integration des rekom binanten O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase-Gens als auch die Ver wendung auf einem selbstreplizierenden Plasmid-Vektor möglich.

Bei der Klonierung werden bevorzugt Vektoren verwendet, die bereits genetische Elemente (z. B. regulierbare Promotoren, Terminatoren) enthalten, die eine kontrollierte, stark indu zierbare Expression des O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase-Gens ermöglichen. Besonders bevorzugt sind Plasmid-Vektoren mit ho her Kopienzahl, wie beispielsweise die Escherichia-coli-Vek toren pUC18, pBR322, pACYC184 und ihre Derivate. Als stark in duzierbare Promotoren eigenen sich beispielsweise lac-, tac-, trc-, lambda P_L, ara- oder tet-Promotoren.

Die Produktion von O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen erfolgt beispielsweise durch Kultivierung eines rekombinanten Mikroor ganismenstammes durch Fermentation. Hierbei werden dem Fach mann bekannte Anzuchtverfahren angewendet, wobei die Verfah rensparameter dem jeweiligen Mikroorganismenstamm angepaßt sein müssen. Als Nährmedien können sowohl Vollmedien als auch Minimalmedien zum Einsatz kommen. Es kann sowohl ein batch- als auch ein fed-batch-Prozeß angewendet werden. Bei Verwen dung von induzierbaren Promotorsystemen wird zu einem geeigne ten Zeitpunkt die Expression des O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase-Gens durch Zugabe eines entsprechenden Induktors angeschaltet. Nach einer ausreichenden Produktionsphase werden die O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase-haltigen Zellen durch be kannte Methoden (z. B. Zentrifugation) geerntet.

Das auf diese Art und Weise hergestellte O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase-Enzym kann durch gängige Methoden der Protein reinigung isoliert werden. Dabei sind sowohl klassische Ver fahren (z. B. Präzipitation, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, isoelektrische Fokus sierung) anwendbar als auch moderne Affininitätschroma tographie unter Verwendung von "Affinitätstags". Sequenzen, die für diese Affinitätsanhängsel kodieren, können bereits bei der Klonierung des Gens mit der kodierenden Region fusioniert werden, so dass Fusionsproteine mit entsprechendem Affinitäts anhängsel resultieren. Diese werden dann in einer Ein-Schritt- Reinigung isoliert. Ein Beispiel für geeignete Kombinationen von Affinitätsanhängsel und Affinitätsreinigung ist das Strep- Tag mit Streptavidin-Affinitätschromatographie, käuflich er hältlich bei IBA, Göttingen, D.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann eine O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase in gereinigter Form zum Einsatz kommen. Neben der Reaktion in Lösung ist aber auch eine Immobilisierung des Enzyms an einem Träger möglich. Entsprechende Methoden sind Stand der Technik.

Eine Isolierung der O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase zur Her stellung von nicht-proteinogenen Aminosäuren ist jedoch nicht zwingend notwendig. Es ist ebenso möglich, Mikroorganismenzel len, die O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase-Aktivität besitzen, direkt im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Beispiele für solche Mikroorganismenstämme sind die Escherichia-coli- Stämme DH5α/pFL145 und BLR21(DE3)/pLE4. Sie werden in den Bei spielen 1 und 2 beschrieben und wurden bei der Deutschen Samm lung für Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ in Braunschweig unter der Nr. DSM 14088 bzw. 14089 hinterlegt.

In dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine Biotransformation von O-Acetyl-L-Serin zu einer nicht proteinogenen L-Aminosäure mit ruhenden Zellen. Die Penetrati on der Zellen mit O-Acetyl-L-Serin und einer nukleophilen Ver bindung ist dabei ebenso gegeben wie die Freisetzung des Reak tionsproduktes, der nicht-proteinogenen L-Aminosäure, durch die Zellen.

Falls erwünscht, kann der Stoffaustausch zwischen Zellinnerem und Reaktionsmedium erhöht werden, in dem die Zellen mit Sub stanzen behandelt werden, die eine Permeabilisierung der Zel len bewirken. Solche Substanzen, wie beispielsweise Chloroform oder Toluol und deren Anwendung, sind dem Fachmann bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird eine nicht-proteinogene Aminosäure durch Reaktion von O-Acetyl-L- Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse durch eine O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase gebildet, wobei die O- Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase intrazellulär in einem Mikroorga nismus vorliegt.

Besonders bevorzugt ist die Herstellung von nicht proteinogenen L-Aminosäuren durch Reaktion von fermentativ ge wonnenem, nicht aufgereinigtem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse durch eine O-Acetyl-L- Serin-Sulfhydrylase, wobei die O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase intrazellulär in einem Mikroorganismus vorliegt.

Als nukleophile Verbindungen für die durch O-Acetyl-Serin- Sulfhydrylasen katalysierte β-Substitution werden im erfin dungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Verbindungen eingesetzt, die einen Rest, ausgewählt aus der Gruppe:

enthalten.

Besonders bevorzugt wird dem Reaktionsansatz eine nukleophile Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe der folgenden Verbindun gen, zugegeben:

- Thiosulfate;
- Thiole der allgemeinen Formel (1):
H-S-R¹ (1),
wobei R¹ ein einwertiger substituierter oder nicht-substituierter Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Heteroarylrest mit 1 bis 15 C- Atomen bedeutet;
- Selenide;
- Selenole der allgemeinen Formel (2):
H-Se-R¹ (2)
wobei R¹ die zu Formel (1) genannte Bedeutung hat;
- Azide;
- Cyanide;
- Azole der allgemeinen Formel (3) oder (4):
wobei X und Y gleich oder verschieden sind und CR⁴ oder N be deuten und R⁴-H, -COOH, -OH, -NH₂, -NO₂, -SH, -SO₃ ^-, -F, -Cl, -Br, -I, C₁-C₅-Alkylcarbonyl- sowie deren Ester, Amide oder Sal ze oder R¹ bedeutet und R¹ die zu Formel (1) genannte Bedeutung hat und
wobei R² und R³ gleich oder verschieden sind und R⁴ bedeuten oder wobei C¹ und C² in Formel (4) anstelle der Substituenten R² und R³ mittels einer Brücke [-CR⁵R⁶-]_a mit a gleich 1, 2, 3 oder 4 zu einem Ring verknüpft sind, wobei
R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden sind und R⁴ bedeuten und eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR⁵R⁶-] durch Sauerstoff, Schwefel oder einen gegebenenfalls mit C₁-C₅-Alkyl- substi tuierten Iminorest ersetzt sein können und
zwei benachbarte Gruppen [-CR⁵R⁶-] durch eine Gruppe [-CR⁵=CR⁶-] oder durch eine Gruppe [-CR⁵=N-] ersetzt sein kön nen,
- Isoxazolinone der allgemeinen Formel (5) oder (6):
wobei X, R¹, R² und R³ die bereits genannte Bedeutung haben und
wobei C¹ und C² in Formel (6) anstelle der Substituenten R² und R³ mittels einer wie für Formel (4) definierten Brücke zu ei nem Ring verknüpft sein kann.

Beispiele für Thiosulfate sind Natriumthiosulfat, Kaliumthio sulfat oder Ammoniumthiosulfat.

Beispiele für Thiole sind Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropanol, 3- Mercaptopropionsäure, 3-Mercapto-1-propansulfonsäure, Mercap toethansulfonsäure, 2-Mercaptoethylamin, Thioglycolsäure, Thi omilchsäure, Thioessigsäure, Mercaptobernsteinsäure, Mercap tobrenztraubensäure, Dithiothreitol, Dithioerythritol, 1- Thioglycerin, Thiophenol, 4-Fluorthiophenol, 4- Chlorthiophenol, 4-Mercaptophenol, p-Thiokresol, 5-Thio-2- nitrobenzoesäure, 2-Mercaptothiazol, 2-Mercaptothiazolin, 2- Mercaptoimidazol, 3-Mercapto-1,2,4-Triazol, 2-Thiophenthiol, 2-Mercaptopyridin, 2-Mercaptopyrimidin, 2-Thiocytosin, 2- Mercaptonicotinsäure, 2-Mercapto-1-methylimidazol, 2- Mercaptobenzothiazol, 2-Mercaptobenzoxazol, 6-Mercaptopurin.

Bespiele für Selenole sind Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe Methylselenol, Ethylselenol, Propylselenol, Phenylsele nol.

Beispiele für Azide sind Natriumazid, Kaliumazid oder Ammoniu mazid.

Beispiele für Cyanide sind Kaliumcyanid, Natriumcyanid oder Ammoniumcyanid.

Beispiele für Azole sind Verbindungen, ausgewählt aus der Grup pe 1,2-Pyrazol, 3-Methylpyrazol, 4-Methylpyrazol, 3,5- Dimethylpyrazol, 3-Aminopyrazol, 4-Aminopyrazol, Pyrazol-4- carbonsäure, Pyrazol-3,5-dicarbonsäure, 1,2,3-Triazol, 1,2,4- Triazol, 3-Amino-1,2,4-Triazol, 1,2,3,4-Tetrazol, Iridazol, In dazol-3-carbonsäure, Indazol-5-carbonsäure, 5-Aminoindazol, Benzotriazol, Benzotriazol-5-carbonsäure, 5-Aminobenzotriazol, Aminopyrazolopyrimidin, 8-Azaguanin, 8-Azaadenin.

Beispiele für Isoxazolinone sind Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe Isoxazolin-5-on, 3-Methylisoxazolin-5-on, 4- Methylisoxazolin-5-on, 4,5-Dimethylisoxazolin-2-on, 1,2,4- Oxadiazolidin-3,5-dion.

Die Konzentration der nukleophilen Verbindung wird im Ansatz vorzugsweise so gewählt, dass sie in äquimolarer Konzentration zu O-Acetyl-L-Serin vorliegt.

Die Reaktionstemperatur wird vorzugsweise zwischen 5°C und 70°C gewählt. Der besonders bevorzugte Temperaturbereich liegt zwischen 20°C und 40°C.

Als Lösungsmittel für die Reaktion wird bevorzugt Wasser ver wendet.

Als Reaktionsprodukte werden vorzugsweise L-Aminosäuren der allgemeinen Formel (7) in L-Konfiguration gebildet:

wobei Z ein einwertiger Rest, ausgewählt aus den Formeln (8) bis (19):

sowie deren Ester, Ether oder Salze ist,
und R¹, R², R³, R⁴, X und Y die bereits zu den Formeln (1) bis (6) genannte Bedeutung haben.

Vorzugsweise wird eine lösliche, nicht-proteinogene L- Aminosäure nach Beendigung des erfindungsgemäßen Verfahrens und nach einer Trennung der vorzugsweise wässrigen Lösung mit tels bekannter Methoden in Biomasse und einen Kulturüberstand aus dem Kulturüberstand isoliert. Solche Methoden zur Isolie rung von Aminosäuren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Sie umfassen z. B. Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorp tion, Ionenaustauscher-Chromatographie, Präzipitation, Kris tallisation. Beim Vorliegen einer schwerlöslichen, nicht proteinogenen Aminosäure wird vorzugsweise eine klassierende Zentrifugation, wie sie dem Fachmann bekannt ist, durchge führt, wobei die Biomasse möglichst im Zentrifugationsü berstand verbleibt. Das abgeschiedene Produkt wird vorzugswei se durch klassische Methoden gelöst und umgefällt.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Klonierung der CysK- bzw. CysM-Gene aus Escheri chia coli als Fusionsgen mit StrepTag-Sequenz

Zur Klonierung der CysK- bzw. CysM-Gene aus Escherichia coli wurden zunächst Polymerase-Ketten-Reaktionen mit den folgenden phosphorothionat-geschützten Oligonukleotid-Primer-Paaren mit Hilfe der Pwo-DNA-Polymerase durchgeführt.
CysKS1: 5'-gat cga ggt ctc gaa tga gta aga ttt ttg aag a-3' SEQ. ID. NO. 1
CysKS2: 5'-gat cga ggt ctc ggc gct ctg ttg caa ttc ttt ctc ag- 3' SEQ. ID. NO. 2 bzw.
CysMS3: 5'-gat cga ggt ctc gaa tga gta cat tag aac aaa c-3 SEQ. ID. NO.3
CysMS5: 5'-gat cga ggt ctc ggc gct aat ccc cgc ccc ctg gct aa- 3' SEQ. ID. NO. 4

Dabei wurden über die Primer-Sequenzen Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease BsaI (unterstrichene Nukleotide) ein geführt. Als Matritze diente chromosomale DNA von E. coli W3110 (ATTC 27325). Die erhaltenen Amplifikate wurden mit dem Restriktionsenyzm BsaI verdaut und anschließend in den mit Eco31I-behandelten Vektor pASK-IBA3 (Institut für Bioanalytik, Göttingen, D) kloniert. Dieser Vektor erlaubt eine Klonierung als Genfusion mit einer Sequenz am 3'-Ende, die für ein Affi nitätspeptid (WSHPQFEK SEQ.ID.NO. 5) mit der Bezeichnung StrepTagII kodiert. Die Expression der Genfusion mit Hilfe des tet-Promotors führt zu einem Protein mit C-terminalem Strep- TagII-Anhängsel. Letzteres kann zur Isolierung des Proteins benutzt werden, da das StrepTagII eine Bindung an Streptavi din-Säulen vermittelt.

Beispiel 2 Reinigung der CysK- bzw. CysM-Proteine

Mit dem CysM-StrepTag-Konstrukt (pFL145) konnte im E.-coli- Stamm DH5α (Clonetech, Heidelberg, D) eine sehr gute Ge nexpression verzeichnet werden. Dabei wurde die Anzucht und Expression nach den Angaben der Firma Institut für Bioanaly tik, Göttingen, D, durchgeführt. Der Stamm DH5α/pFL145 wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ gemäß Budapester Vertrag unter der Nummer DSMZ 14088 hinterlegt. Im Falle des CysK-StrepTag-Konstruktes (pLE1) war dagegen die Expression nur sehr schwach. Durch Umklonieren der Genfusion als XbaI-HindIII-Fragment in einen Vektor mit T7- Promotor (pRSET5a)(Stratagene, Heidelberg, D) und Expression im Stamm BLR21(DE3) (Novagen, Darmstadt, D) konnte jedoch auch in diesem Fall (pLE4) eine gute Bildung des Genproduktes er zielt werden. Der Stamm BLR21(DE3)/pLE4 wurde bei der Deut schen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ gemäß Budapester Vertrag unter der Nummer DSMZ 14089 hinterlegt. Die Isolierung der CysK- bzw. CysM-Proteine erfolgte durch Af finitätschromatographie an Streptavidinsäulen, wobei prinzi piell nach den Herstellerangaben der Firma Institut für Bio analytik, Göttingen, D, verfahren wurde. Die Ausbeute betrug bei Verwendung von 250 ml Kultur 3 mg gereinigtes CysK-Protein bzw. 4,5 mg gereinigtes CysM-Protein. Beide Proteine wiesen aufgrund des Pyridoxalphosphat-Cofaktors eine deutliche Gelb färbung auf und besaßen ein Absorptionsmaximum bei 420 nm.

Die Messung der Aktivität von O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen erfolgt durch Nachweis des "natürlichen" Reaktionsproduktes L- Cystein (Cys) oder bei CysM alternativ auch als S-Sulfo-L Cystein (S-Cys). Beide Produkte lassen sich sehr spezifisch und sehr sensitiv mit dem Test nach Gaitonde (1967, "Biochem. J.", 104: 627-633) nachweisen. Für beide Verbindungen mussten separate Eichkurven aufgenommen werden, da der Farbkomplex mit Sulfocystein eine geringere Intensität aufweist.

Ein typischer Testansatz enthielt 10 mM O-Acetyl-Serin (Zugabe aus einer 200-mM-Stammlösung in 500 mM Natrium-Succinat-Puffer pH 5,5), 10 mM Natriumsulfid oder Natriumthiosulfat, 100 mM Kalium-Phosphat-Puffer pH 7,0, 5 µg/ml gereinigtes Enyzm und wird bei 37°C inkubiert. Die spezifische Aktivität A wird in Units/mg Protein angegeben d. h. in µmol Produkt × min^-1 × mg^-1 Protein.

Die gemessene, spezifische Aktivität mit den in Beispiel 2 iso lierten Proteinen betrug:
CysK: A_Cys 140 Units/mg
CysM: A_Cys 199 Units/mg
CysM: A_S-Cys 145 Units/mg

Bei der Bestimmung der Aktivität von O-Acetyl-Serin- Sulfhydrylasen in ruhenden Zellen wurde zunächst eine Zellsus pension mit einer optischen Dichte von 20,0 (gemessen bei 600 nm) eingestellt. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von Chloroform ad 10 Vol % permeabilisiert und 5 min bei Raum temperatur inkubiert. Für den Enzymtest wurde dann eine opti sche Dichte von 1,0 eingestellt und mit den Zellen, wie oben beschrieben, die Reaktion mit O-Acetyl-L-Serin und Sulfid bzw. Thiosulfat durchgeführt. Die spezifische Aktivität der Zellen A wird hierbei angegeben in µmol × min^-1 × (ml Zellsuspension mit optischer Dichte von 1,0 bei 600 nm)^-1; in abgekürzter Form: Units/ml OD.

Beispiel 4 Untersuchung der Katalysemöglichkeiten der O- Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylasen CysK bzw. CysM

Um mit Hilfe der O-Acetyl-Serin-Sulfhydrylasen nicht- proteinogene Aminosäuren herzustellen, wurden andere nukle ophile Verbindungen anstelle von Sulfid oder Thiosulfat in die Reaktion eingesetzt. Zu deren Nachweis wurde eine Vorsäulende rivatisierung für Aminosäuren mit ortho-Phthaldialdehyd durch geführt. Mit dieser Methode konnte ein breites Screening auf geeignete, nukleophile Substrate durchgeführt werden.

Die Ansätze enthielten 4 mM O-Acetyl-Serin (Zugabe aus einer 200-mM-Stammlösung in 500 mM NaSuccinat-Puffer pH 5,5), 20 mM Nukleophil, 100 mM K-Phosphat-Puffer pH 7,0, 5 µg/ml gereinig tes Enyzm. Die Reaktion wurde mit 1/100 Volumen Essigsäure (96% v/v) abgestoppt und durch HPLC mit einer HP-Aminoquant-Säule (200 mm × 2,1 mm) nach Herstellerangaben von Hewlett Packard, Waldbronn, D, analysiert.

Um die gebildeten Produkte zu charakterisieren, wurde die Mo lekülmasse mittels HPLC-MS nachgewiesen. Hierfür diente eine Lung-C18-Säule (Phenomenex, Aschaffenburg, D) mit Ameisensäure (0,1% v/v) als mobile Phase. Die Ionisierung wurde im positi ven Elektrospray-Modus durchgeführt.

Die folgende Tabelle zeigt die Reaktivität der beiden Enzyme CysK bzw. CysM gegenüber verschiedenen Nukleophilen und die be stimmte Masse in der HPLC-MS-Analyse (MH+).

Beispiel 5 Fermentative Herstellung der O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase CysM

Als Vorkultur für die Fermentation wurden 20 ml LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl), das zusätzlich 100 mg/l Ampicillin enthielt, mit dem Stamm DH5α/pFL145 (s. o.) beimpft und bei 30°C und 150 rpm in einem Schüttler über Nacht inkubiert. Anschließend wurde der gesamte Ansatz in 100 ml SM1-Medium (12 g/l K₂HPO₄; 3 g/l KH₂PO₄; 5 g/l (NH₄)₂SO₄; 0,3 g/l MgSO₄ × 7H₂O; 0, 015 g/l CaCl₂ × 2H₂O; 0,002 g/l FeSO₄ × 7 H₂O; 1 g/l Na₃Citrat × 2H₂O; 0,1 g/l NaCl; 1 ml/l Spurenele mentlösung, bestehend aus 0,15 g/l Na₂MoO₄ × 2H₂O; 2,5 g/l Na₃BO₃; 0,7 g/l CoCl₂ × 6H₂O; 0,25 g/l CuSO₄ × 5H₂O; 1,6 g/l MnCl₂ × 4H₂O; 0,3 g/l ZnSO₄ × 7H₂O), das mit 5 g/l Glukose; 0,5 mg/l Vitamin B₁ und 100 mg/l Ampicillin supplementiert wurde, überführt. Die weitere Inkubation der Vorkultur erfolg te bei 30°C für 8 Stunden bei 150 rpm.

Als Fermenter diente ein Biostat-M-Gerät der Firma Braun Bio tech (Melsungen, D) mit einem maximalen Kulturvolumen von 2 l. Mit der beschriebenen Vorkultur (optische Dichte bei 600 nm von ca. 2) wurde der Fermenter mit 900 ml Fermentationsmedium (15 g/l Glukose; 10 g/l Trypton; 5 g/l Hefeextrakt; 5 g/l (NH₄)₂SO₄; 1,5 g/l KH₂PO₄; 0,5 g/l NaCl; 0,3 g/l MgSO₄ × 7H₂O; 0,015 g/l CaCl₂ × 2H₂O; 0,075 g/l FeSO₄ × 7H₂O; 1 g/l Na₃Citrat × 2H₂O und 1 ml/l Spurenelementlösung s. o., 5 mg/l Vitamin B1 und 100 mg/l Ampicillin, eingestellt auf pH 7,0 mit 25%-igem Ammoniak) beimpft. Während der Fermentation wurde eine Temperatur von 32°C eingestellt und der pH-Wert durch Zudosierung von 25% v/v Ammoniak bei einem Wert von 7,0 kon stant gehalten. Die Kultur wurde mit entkeimter Druckluft bei 1,5 vol/vol/min begast und mit einer Rührerdrehzahl von 200 rpm gerührt. Nach Absinken der Sauerstoffsättigung auf einen Wert von 50% wurde die Drehzahl über ein Kontrollgerät bis zu einem Wert von 1200 rpm erhöht, um 50% Sauerstoffsättigung zu erhalten (Bestimmt mit einer pO₂-Sonde, kalibriert auf 100% Sättigung bei 900 rpm). Sobald der Glukose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 15 g/l auf ca. 5-10 g/l abgesunken war, erfolg te eine Zudosierung einer 56% w/v Glukose-Lösung. Die Fütte rung erfolgte mit einer Flußrate von 3-6 ml/h, wobei die Glu kosekonzentration im Fermenter zwischen 0,5-10 g/l gehalten wurde. Die Glukose-Bestimmung wurde mit dem Glukoseanalysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt. Beim Erreichen einer optischen Dichte von 30 wurde die Enzymproduk tion durch die Zugaben von 3 mg/l Tetracyclin induziert. Die Induktionsdauer betrug 7 Stunden. Nach dieser Zeit wurden Pro ben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kultur medium abgetrennt und gewaschen. Die resultierende Zellsuspen sion wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, analysiert. Die O- Acetyl-Serin-Sulfhydrylase-Aktivität, gemessen mit Thiosulfat A_S-Cys, betrug 30 Units/ml OD.

Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 6 Fermentative Herstellung der O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase CysK

Für die Herstellung des CysK-Enyzms wurde prinzipiell vorge gangen wie in Beispiel 5 beschrieben. Allerdings wurde hier der Stamm BLR21(DE3)/pLE4 verwendet. Nach Verbrauch der vorge legten 15 g/l Glukose wurde eine Fütterung mit einer 60%-igen (v/v) Glycerinlösung aufgenommen. Die Flußrate betrug 9,5 ml/h. Gleichzeitig wurde die Enzymproduktion durch Zugabe von 0,4 mM Isopropyl-β-thiogalaktosid (IPTG) induziert. Nach einer Induktionszeit von 21 Stunden wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt und gewaschen. Die resultierende Zellsuspension wurde, wie in Bei spiel 3 beschrieben, analysiert. Die spezifische O-Acetyl- Serin-Sulfhydrylase-Aktivität, gemessen mit Sulfid A_Cys, betrug 5 Units/ml OD.

Beispiel 7 Enzymatische Herstellung von S-Phenyl-L-Cystein mit ruhenden Zellen

In einem temperierbaren Gefäß mit pH-Sonde und pH-Steuerung wurde zunächst O-Acetyl-L-Serin-Hydrochlorid (Sigma, Deisenho fen, D) in 100 ml Wasser gelöst, so dass eine Endkonzentration von 200 mM (29,4 g/l) O-Acetyl-L-Serin vorlag. Danach wurde unter Rührung 200 mM Thiophenol zugegeben. Anschließend wurde der Ansatz durch Titration mit 5 M NaOH zügig auf einen pH- Wert von 6,7 gebracht und sofort eine Zellsuspension des CysM- Produktionsstammes DH5α/pFL145 eingemischt. Die Zellsuspension besaß eine spezifische Aktivität A_S-Cys von 30 Units/ml OD. Die optische Dichte (gemessen bei 600 nm) der Zellen im Ansatz betrug 2,0 und damit die O-Acetyl-Serin-Aktivität einen Wert A_S-Cys von 60 Units/ml. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch Dosierung von 5 M NaOH über das pH-Kontrollsystem kon stant gehalten.

Während der Reaktion wurde die Bildung eines weißen Präzipita tes beobachtet. Nach 30 min wurde eine Probe entnommen und mit 1%-iger (v/v) Essigsäure versetzt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt, in gleichem Volumen 21%-iger (v/v) Phosphorsäure gelöst und durch HPLC analysiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde ebenfalls chroma tographiert. Die Analyse wurde mittels reversed phase HPLC an einer LUNA-5-µ-C18(2)-Säule (Phenomenex, Aschaffenburg, D) durchgeführt. Als Eluent diente verdünnte Phosphorsäure (0,1 ml konz. Phosphorsäure/l) bei einer Flußrate von 0,5 ml/min. Der Gehalt an S-Phenyl-L-Cystein betrug im Überstand 1,6 g/l und im Niederschlag 24,8 g/l. Dies entspricht einer Gesamtre aktionsausbeute von 67%, bezogen auf O-Acetyl-L-Serin. Der Ansatz wurde auch mit reduziertem Einsatz an O-Acetyl- Serin-Sulfhydrylase auf 30 bzw. 10 Units/ml durchgeführt. Dies führte jedoch zu einer verlangsamten Enyzmreaktion und aufgrund der Isomerisierung von O-Acetyl-L-Serin zu verminder ten Ausbeuten von 52 bzw. 15%.

Beispiel 8 Enzymatische Herstellung von S-Phenyl-L-Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zel len

Anstatt O-Acetyl-L-Serin als Reinsubstanz zu verwenden, wurde dieser Versuch in O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe durchgeführt. Diese wurde durch eine Fermentation, wie in der Patentanmeldung DE 101 07 002 beschrieben, gewonnen. Am Ende der Fermentation wurde zur Stabilisierung von O-Acetyl-h-Serin ein pH-Wert von 4,0 mit 21%-iger (v/v) Phosphorsäure eingestellt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und die Fer menterbrühe durch Eindampfen auf eine Konzentration von 30 g/l O-Acetyl-L-Serin gebracht. Anschließend wurden zu 100 ml Brühe 200 mM Thiophenol und nach Titration auf pH 6,7 Zellen des CysM-Produktionsstammes DH5α/pFL145 eingemischt. Die Aktivität A_S-Cys betrug 60 Units/ml. Danach wurde wie in Beispiel 7 wei terverfahren. Die Ausbeute bezogen auf O-Acetyl-L-Serin betrug 65%.

Ein identischer Ansatz mit Zellen des CysK-Produktionstammes BLR21(DE3)/pLE4 lieferte bei Einsatz von A_Cys 95 Units/ml ei ne Ausbeute von 72%.

Beispiel 9 Kontinuierliche, enzymatische Herstellung von S- Phenyl-L-Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zellen

Ein Ziel der Reaktionsführung ist es, möglichst hohe Umsätze, bezogen auf das teure und instabile Edukt O-Acetyl-L-Serin, zu erreichen. Um dies zu gewährleisten, wurde ein kontinuierliches Verfahren ausgearbeitet. Dabei wird zunächst vorgegangen, wie in Beispiel 8 beschrieben; lediglich der Einsatz an CysM- Aktivität A_S-Cys wurde auf 120 Units/ml erhöht. Nach 20 min Reaktionszeit wurde über Dosierungseinheiten O-Acetyl-L-Serin- haltige Fermenterbrühe (30 g/l), Thiophenol und eine Zellsus pension des CysM-Produktionsstammes DH5α/pFL145 (240 OD bei 600 nm, in Kalium-Phosphatpuffer pH 7,0) zugegeben. Die Fluß raten betrugen 150, 2,5 bzw. 3 ml/h. Gleichzeitig wurde damit gestartet, kontinuierlich Produktlösung aus dem Reaktionsgefäß mit einer Flußrate von 155,5 ml/h zu entnehmen. Die Flußraten wurden so gewählt, dass das Reaktionsvolumen im Reaktor kon stant blieb und die mittlere Verweilzeit im Reaktor 30 min be trug. Mit diesem Vorgehen stellte sich im Ansatz ein Fließ gleichgewicht mit einer konstanten O-Acetyl-L-Serin- Konzentration von 1,0 g/l ein. Aufgrund dieser niedrigen Kon zentration - bei der das Enzym aufgrund seines noch niedrige ren KM-Wertes noch sehr gute Aktivität besitzt - konnte die Isomerisierung zu N-Acetyl-L-Serin erfolgreich minimiert wer den. Die Reaktionsausbeute, bezogen auf O-Acetyl-L-Serin, betrug 85%.

Beispiel 10 Enzymatische Herstellung von Azido-L-Alanin mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM Natriumazid eingesetzt. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend einer Aktivität von 180 Units/ml im An satz wurde ein Umsatz von 45% bestimmt.

Beispiel 11 Enzymatische Herstellung von Cyano-L-Alanin mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM Kaliumcyanid eingesetzt. Die Zugabe des Cyanids erfolg te erst, nachdem der Ansatz auf einen pH-Wert von 6,7 einge stellt wurde. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entspre chend einer Aktivität von 180 Units/ml im Ansatz wurde ein Um satz von 65% bestimmt.

Beispiel 12 Enzymatische Herstellung von S-Sulfo-L-Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zel len

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM Natriumthiosulfat eingesetzt. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend einer Aktivität von 40 Units/ml im An satz wurde ein Umsatz von 91% bestimmt.

Beispiel 13 Enzymatische Herstellung von S-Thiazol-2-yl-L- Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ru henden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM 2-Mercaptothiazol eingesetzt. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend einer Aktivität von 180 Units/ml im Ansatz wurde ein Umsatz von 62% bestimmt.

Beispiel 14 Enzymatische Herstellung von S-1,2,4-Triazol-3- yl-L-Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zellen.

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM 3-Mercapto-1,2,4-triazol eingesetzt. Nach 30 min Reak tionszeit mit Zellen entsprechend einer Aktivität von 180 U nits/ml im Ansatz wurde ein Umsatz von 74% bestimmt.

Beispiel 15 Enzymatische Herstellung von Seleno-L-Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM Natriumselenid eingesetzt. Das Natriumselenid wurde durch Reduktion von Natriumselenit mit Natriumborhydrid herge stellt. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend ei ner Aktivität von 180 Units/ml im Ansatz wurde ein Umsatz von 75% bestimmt.

Beispiel 16 Enzymatische Herstellung von Phenyl-seleno-L- Cystein mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ru henden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 mit CysM-haltigen Zellen verfahren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM Phenylselenol eingesetzt. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen eintsprechend einer Aktivität von 180 Units/ml im An satz wurde ein Umsatz von 62% bestimmt.

Beispiel 17 Enzymatische Herstellung von 1,2,4-Triazol-1-yl- L-Alanin mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fermenterbrühe und ru henden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 verfah ren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM 1,2,4-Triazol ein gesetzt. Für diese Reaktion wurden die Zellen durch eine Be handlung mit 10% (v/v) Chloroform permeabilisiert. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend einer Aktivität von 180 Units/ml im Ansatz wurde ein Umsatz von 48% bestimmt.

Beispiel 18 Enzymatische Herstellung von 5-Carboxy-1,2,3- Benzotriazol-2-yl-L-Alanin mit O-Acetyl-L-Serin-haltiger Fer menterbrühe und ruhenden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 verfah ren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM 5-Carboxy-1,2,3- Benzotriazol eingesetzt. Für diese Reaktion wurden die Zellen durch eine Behandlung mit 10% Chloroform permeabilisiert. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend einer Akti vität von 180 Units/ml im Ansatz wurde ein Umsatz von 54% be stimmt.

Beispiel 19 Enzymatische Herstellung von 1,2,4-Oxadiazolidin- 3,5-dionyl-L-alanin (= Quisqualsäure) mit O-Acetyl-L-Serin- haltiger Fermenterbrühe und ruhenden Zellen

In diesem Beispiel wurde prinzipiell wie in Beispiel 8 verfah ren. Anstelle von Thiophenol wurden 200 mM 1,2,4- Oxadiazolidin-2,5-dion eingesetzt. Für diese Reaktion wurden die Zellen durch eine Behandlung mit 10% Chloroform permeabilisiert. Nach 30 min Reaktionszeit mit Zellen entsprechend ei ner Aktivität von 180 Units/ml im Ansatz wurde ein Umsatz von 11% bestimmt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer nicht-proteinogenen L- Aminosäure mittels einer enzymatischen Biotransformation bei dem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase zu einer nicht- proteinogenen L-Aminosäure umgesetzt wird, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren bei einem pH-Wert im Bereich zwi schen pH 5,0 und 7,4 durchgeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einem pH-Wert im Bereich zwischen pH 6,0 bis 7,1 durchgeführt wird.

3. Verfahren zur Herstellung einer nicht-proteinogenen L- Aminosäure bei dem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase zu einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure umge setzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase CysM eingesetzt wird.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die O-Acetyl-Serin-Sulfhydrylase eine Volumen aktivität A_Cys von mindestens 10 Units/ml im Ansatz be sitzt.

5. Verfahren zur Herstellung einer nicht-proteinogenen L- Aminosäure bei dem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase zu einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure umge setzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß permanent O-Acetyl-L- Serin, O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase und Nukleophil zudo siert und gleichzeitig eine Lösung, enthaltend die nicht- proteinogenen L-Aminosäure, entnommen wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase in gereinig ter Form eingesetzt wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase nach einer Immobilisierung an einem Träger eingesetzt wird.

8. Verfahren zur Herstellung einer nicht-proteinogenen L- Aminosäure bei dem O-Acetyl-L-Serin mit einer nukleophilen Verbindung unter Katalyse einer O-Acetyl-L-Serin- Sulfhydrylase zu einer nicht-proteinogenen L-Aminosäure umge setzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als O-Acetyl-L-Serin eine O-Acetyl-L-Serin-haltige Fermenterbrühe eingesetzt wird.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase in Form von ruhenden Mikroorganismenzellen, die eine O- Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase-Aktivität besitzen, eingesetzt wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge kennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung einen Rest, aus gewählt aus der Gruppe:
enthält.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der Thiosulfate, der Thiole der allgemeinen Formel (1):
H-S-R¹ (1),
wobei R¹ einwertiger, substituierter oder nicht substituierter Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Heteroarylrest mit 1 bis 15 C- Atomen bedeutet,
der Selenide, der Selenole der allgemeinen Formel (2):
H-Se-R¹ (2),
wobei R¹ die zu Formel (1) genannte Bedeutung hat, der Azide, der Cyanide, der Azole der allgemeinen Formel (3) oder (4):
wobei X und Y gleich oder verschieden sind und CR⁴ oder N be deuten und R⁴ -H, -COOH, -OH, -NH₂, -NO₂ ^-, -SH, -SO₃ ^-, -F, -Cl, -Br, -I, C₁-C₅-Alkylcarbonyl- sowie deren Ester, Amide oder Salze oder R¹ bedeutet und R¹ die zu Formel (1) genannte Be deutung hat und
wobei R² und R³ gleich oder verschieden sind und R⁴ bedeuten oder wobei C¹ und C² in Formel (4) anstelle der Substituenten R² und R³ mittels einer Brücke [-CR⁵R⁶-]_a mit a gleich 1, 2, 3 oder 4 zu einem Ring verknüpft sind, wobei
R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden sind und R⁴ bedeuten und eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR⁵R⁶-] durch Sauerstoff, Schwefel oder einen ggf. mit C₁-C₅-Alkyl- substi tuierten Iminorest ersetzt sein können und
zwei benachbarte Gruppen [-CR⁵R⁶-] durch eine Gruppe [-CR⁵=CR⁶-] oder durch eine Gruppe [-CR⁵=N-] ersetzt sein können,
der Isoxazolinone der allgemeinen Formel (5) oder (6):
wobei X, R¹, R² und R³ die bereits genannte Bedeutung haben und
wobei C¹ und C² in Formel (6) anstelle der Substituenten R² und R³ mittels einer wie für Formel (4) definierten Brücke zu einem Ring verknüpft sein kann.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeich net, daß die nukleophile Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropanol, 3- Mercaptopropionsäure, 3-Mercapto-1-propansulfonsäure, Mercaptoethansulfonsäure, 2-Mercaptoethylamin, Thioglycolsäure, Thiomilchsäure, Thioessigsäure, Mercaptobernsteinsäure, Mer captobrenztraubensäure, Dithiothreitol, Dithioerythritol, 1- Thioglycerin, Thiophenol, 4-Fluorthiophenol, 4- Chlorthiophenol, 4-Mercaptophenol, p-Thiokresol, 5-Thio-2- nitrobenzoesäure, 2-Mercaptothiazol, 2-Mercaptothiazolin, 2- Mercaptoimidazol, 3-Mercapto-1,2,4-Triazol, 2-Thiophenthiol, 2-Mercaptopyridin, 2-Mercaptopyrimidin, 2-Thiocytosin, 2- Mercaptonicotinsäure, 2-Mercapto-1-methylimidazol, 2- Mercaptobenzothiazol, 2-Mercaptobenzoxazol, 6-Mercaptopurin, Natriumthiosulfat, Kaliumthiosulfat, Ammoniumthiosulfat, Natriumazid, Kaliumazid, Ammoniumazid, Kaliumcyanid, Natrium cyanid, Ammoniumcyanid, Methylselenol, Ethylselenol, Propyl selenol, Phenylselenol, 1,2-Pyrazol, 3-Methylpyrazol, 4- Methylpyrazol, 3,5-Dimethylpyrazol, 3-Aminopyrazol, 4- Aminopyrazol, Pyrazol-4-carbonsäure, Pyrazol-3,5- dicarbonsäure, 1,2,3-Triazol, 1,2,4-Triazol, 3-Amino-1,2,4- Triazol, 1,2,3,4-Tetrazol, Indazol, Indazol-3-carbonsäure, Indazol-5-carbonsäure, 5-Aminoindazol, Benzotriazol, Ben zotriazol-5-carbonsäure, 5-Aminobenzotriazol, Aminopyrazolo pyrimidin, 8-Azaguanin, 8-Azaadenin, Isoxazolin-5-on, 3- Methylisoxazolin-5-on, 4-Methylisoxazolin-5-on, 4,3- Dimethylisoxazolin-2-on, 1,2,4-Oxadiazolidin-3,5-dion.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch ge kennzeichnet, daß die Konzentration der nukleophilen Verbin dung so gewählt ist, dass sie in einer äquimolaren Konzentra tion zu O-Acetyl-L-Serin vorliegt.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch ge kennzeichnet, daß es bei einer Temperatur zwischen 5°C und 70°C durchgeführt wird.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die unnatürliche L-Aminosäure ausge wählt ist aus der Gruppe der Aminosäuren der allgemeinen Formel (7) in L-Konfiguration:
wobei Z ein einwertiger Rest gemäß einer der Formeln (8) bis (19):
sowie deren Ester, Ether oder Salze ist,
und R¹, R², R³, R⁴, X und Y die zu den Formeln (1) bis (6) genannte Bedeutung haben.

16. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-proteinogene L- Aminosäure nach Beendigung des Verfahrens mittels bekannter Methoden isoliert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung mittels Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher-Chromatographie, Präzipitation oder Kristallisation erfolgt.