KR20020079402A

KR20020079402A - 비단백질성 ｌ-아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR20020079402A
Application number: KR1020020017373A
Authority: KR
Inventors: 마이에르토마스; 가에베르트카르스텐
Original assignee: 콘소티움 퓌르 에렉트로헤미쉐 인두스트리 게엠베하
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2002-10-19
Also published as: US6579705B2; RU2230789C2; CN1200110C; AU3140702A; EP1247869A1; JP2006325607A; JP2002315595A; AU773173B2; KR100469592B1; CN1379111A; PL353085A1; RU2002108336A; HU0201152D0; DE50208306D1; HUP0201152A2; MXPA02003402A; ATE341640T1; US20020177196A1; HUP0201152A3; CA2379701A1

Abstract

O-아세틸-L-세린과 친핵화합물(nucleophilic compound)을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소(sulfhydrylase)를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 효소에 의한 바이오형질전환(biotransformation)에 따르는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법으로 PH5.0~7.4의 범위내에서 그 방법을 실시한다.

Description

비단백질성 Ｌ-아미노산의 제조방법{process for preparing non-proteinogenic Ｌ-amino acids}

본 발명은 효소에 의한 바이오형질전환에 따르는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

비단백질성 아미노산은 단백질 생합성의 구성블록으로 그자체 사용되지 아니하여 20종의 단백질성 아미노산과 명백하게 분리(demarcation)되도록 하는 아미노산이다.

본 발명의 기술적인 의미에서, 여러가지의 단백질에서 발생하는 대단히 희소한 아미노산 L-셀레노시스테인은 비단백질성 아미노산으로 분류된다.

비단백질성 아미노산은 예로서 약학 및 농업분야의 활성화합물을 제조하는 관심있는 화합물이다.

이들의 비단백질성 아미노산은 활성화합물로서 또는 활성화합물의 일부로서 분자의태(molecular mimicry)의 타입으로 자연아미노산(natural amino acids)의 구조체를 모방할 수 있어 예로서 수용체 상호작용(receptor interactions)의 경우 자연반응(natural veaction)을 변조(modulation)할 수 있다.

또, 키랄화합물로서 이들의 화합물은 일반적으로 "키랄풀(chiral pool)"의 범위내에서 합성구축블록(synthetic building blocks)으로 사용할 수 있다.

거울상 이성질체 순도형태(enantiomerically pure form)의 비단백질성 아미노산의 제조방법은 대부분 합성을 기준으로 하며, 이들의 합성은 동화작용을 하고, 또 통상적으로 하나의 소정의 화합물에 접근하도록 할 뿐이다.

다만 수종의 방법에 의해 서로 다른 화합물을 출발화합물의 간단한 치환에 의해 제조하도록 한다.

대부분의 경우, 합성은 화학적인 합성으로, 이 합성은 키랄구축블록에서 통상부분적으로 처리하였다.

또 다른 방법에서는 라세미체(racemates)의 화학적 합성과 효소에 의해 자주 실시하는 라세미체분할(racemate resolution)을 조합하는 방법이 있다.

또, 프로키랄화합물(prochiral compounds)을 사용하며 비단백질성 아미노산이 입체선택성 합성을 하도록 하는 효소에 의한 방법은 이미 설명한 바 있다.

따라서, 아미노도너(amino donor)로서 L-글루타민산을 사용하여 α-케토산에서 여러가지의 비단백질성 아미노산을 제조하는 아미노기 전이효소(transaminases)를 사용할 수 있다(참고문헌: Taylor 등; 1998, TIBTECH 16: 412-418).

또 다른 예로는 류신탈수소효소(leucine dehydrogenase)를 사용하는 L-t-류신의 합성이 있다(참고문헌: Drauz 1997,Chimia 51: 310-314).

특허문헌으로 DE 10046934 명세서(본원 출원인과 동일한 출원인에 의해2000.09.21자로 특허등록을 받았음)에서는 미생물의 직접 발효에 의한 비단백질성 아미노산의 간단한 제조방법에 대하여 기재되어있다.

이 제조방법에서는 미생물을 사용하여, 미생물의 시스테인 대사의 조절을 해제시켜 레벨이 높은 O-아세틸-L-세린을 공급하였다.

시스테인 대사에서 이화합물은 L-시스테인의 생합성 전구물질로 사용하였다.

후자, 즉 L-시스테인의 생합성 전구물질은 티올래디컬로 β위치에 있는 아세테이트기를 치환시켜 생성하였다.

이 반응은 β치환으로, O-아세틸-L-세린 SH효소(sulfhydrylase)분류[EC 4.2.99.8]의 효소에 의해 촉진시켰다.

소정의 화합물분류(티올, 아졸 및/또는 이소옥사졸디논)에 속하는 친핵물질을 발효중에 공급할 경우, 이들의 화합물이 β치환반응에 도입됨으로 비단백질성 L-아미노산이 제조된다.

이와같이, 제조한 아미노산의 각각의 래디컬의 구조는 공급하는 친핵화합물에 의해 좌우된다.

이 방법은 친핵화합물 그 자체 또는 그 얻어진 아미노산이 미생물의 대사에 대하여 독성효과를 유도해 낼 수 있기 때문에, 공급하는 친핵화합물을 너무 많은 양으로 계량하여 혼합할 필요가 없다는 기술적인 문제점이 있다.

특히, 이 방법은 레독스(redox)활성물질로서 이들의 물질이 고농도에서 독성을 갖고 있기때문에 여러가지의 티올화합물에 처리하였다.

또, 발효방법에서 티올화합물의 사용에는 기술적으로 문제점이 극히 많다.

그 이유는 발효조를 집중적으로 통기시켰을때 티올화합물은 산화경향이 있고 기계적 구성이 없을 경우 불쾌한 냄새를 다량으로 발생하기 때문이다.

아지드 또는 시아나이드 화합물은 독성이 높기 때문에 공급이 불가능하며, 이들의 화합물은 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용할 경우 β치환의 도입은 공지되어있다(참고문헌: Flint등, 1996, J. Biol. Chem. 271: 16053-16067).

본 발명의 목적은 친핵화합물, 특히 높은 량으로 혼합하는 독성화합물을 사용할 수 있도록 하는 비단백질성 아미노산의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 O-아세틸-L-세린를 친핵화합물과 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻은 효소에 의한 바이오 형질전환방법(biotransformation method)에서 처리를 pH5.0 ~ 7.4에서 실시함을 특징으로 하는 방법에 의해 달성한다.

이 발명에 의해 다량의 비단백질성의 거울상이성질체순도를 가진 L-아미노산 (일부를 새로운 화합물임)을 공업적으로 합성할 수 있다.

O-아세틸-L-세린 SH효소는 공지되어있다.

이들의 SH효소는 대단히 넓은 범위의 각종의 식물체 및 미생물에서 분리하였다.

최대범위로 연구조사한 이들의 SH효소에는 살모넬라 타이피무륨(Salmonella typhimurium)으로 부터 분리시킨 그 대응하는 세균효소(bacterial enzymes)가 있다.

그 유기체중에서, 2종의 O-아세틸-L-세린 SH효소가 존재하여, 각각 OASS-A 와 OASS-B로 지정하였다.

그 관련유전자는 동일하게 공지되어있으며, 각각 CysK와 CysM으로 칭하였다.

두효소가 대단히 유사한 반응메카니즘을 가지나, 이들의 아미노산서열을 기준으로 하여 볼때 45%의 동일성을 나타낼 뿐이다.

OASS-B(CysM)은 CASS-A(CysK)와 비교하여 O-아세틸-L-세린과 티오설페이트의 반응을 촉진시켜 S-설포시스테인을 얻을수 있다는 연구보고가 있다.

이 반응은 티오설페이트가 유일한 황원(sulfur source)으로 될 경우 그 세균성장에 중요한 역할을 한다.

또, 여러가지의 유기체에서 O-아세틸-L-세린유전자의 대비에서는 2종의 계통군(phylogenetic groups)이 존재하는 것으로 나타내었다(키타바타케등, 2000, J. Bacteriol. 192: 143-145).

살모넬라타이피무륨 CysK와 에쉐리키아콜리(Escherichia coli) CysK는 O-아세틸-L-세린 SH효소를 함께 가진 대군(large groups)을 다른 진정세균 (Eubacteria), 메탄발생아캐아(methanogenic Archaea) 및 식물(plants)에서 형성한다.

대비할때, 살모넬라타이무륨 CysM과 에쉐리키아콜리 CysM은친온열아캐아(hyperthermophilic Archaea)[즉, 피로콕코커스(Pyrococcus), 설폴로버스(Sulfolobus) 및 서모플라즈마(thermoplasma)]의 O-아세틸-L-세린 SH효소와 함께 범위가 극히 협소한 계통군내에 존재한다.

본 발명의 범위내에서 O-아세틸-L-세린 SH효소는 O-아세틸-L-세린과 설파이드로부터 L-시스테인의 합성을 촉진시킬 수 있도록 하는데 그 특징이 있다.

따라서, CysM-관련 및 CysK-관련효소는 본 발명의 범위내에서 O-아세틸-L-세린 SH효소이다.

수종의 참고문헌에서는 CysK 그룹(group)에서 O-아세틸-L-세린 SH효소가 비교적 폭넓은 기재 스펙트럼(substrate spectrum)이 기재되어 있으나(이케가미 및 무라코시, 1994, Phytochemistry 35:1089-1104; Flint 등, 1996. J. Biol. Chem. 271:16053-16067), 비단백질성 아미노산의 제조용으로 O-아세틸-L-세린 SH효소의 공업적인 사용 가능성에 대하여 종래에는 깊이있게 고려된바 없다.

비단백질성 아미노산의 효소에 의한 제조를 공업적으로 실시하기 위한 O-아세틸-L-세린 SH효소의 사용방법에서 종래에 기술적인 문제가 되는 중요한 이유는 O-아세틸-L-세린 SH효소의 활성범위에 대응하는 pH범위내에서 O-아세틸-L-세린이 불안정하다는데 있다.

O-아세틸-L-세린은 pH에 따라 N-아세틸-L-세린으로 이성화한다.

반응은 비가역적이며, 예로서 pH7.6에서 가장 신속하게 속도 1%×min^-1를 가진다.

반응속도는 pH가 낮아짐에 따라 저하되어 O-아세틸-L-세린 화합물은 예로서 pH 4.0에서 안정성이 있다.

반응메카니즘은 아실래디컬의 카르보닐탄소상에서 탈프로톤아미노기(deprotonated amino group)의 분자간의 친핵공격(intra molecular, nucleophilic attack)을 기준으로 한다(참고문헌:Tai등, 1995, Biochemistry 34:12311-12322). 대비할때, O-아세틸-L-세린 SH효소의 최적 pH는 pH8.0의 영역으로(Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemistry 35:12311-12322), O-아세틸-L-세린의 이성화반응에서 가장 바람직하지 않은 영역이다.

이와같은 이유에서, 이케가미(Ikegami)와 무라코시(Murakoshi)는 O-아세틸-L-세린, 친핵 화합물, 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate)및 금속이온(Ga²⁺가 바람직함)을 사용하여 비단백질성 아미노산의 생의태합성방법 (biomimetic synthesis)을 제안하였다.

이 반응은 pH 범위 3.5~4.5에서 실시할수 있다.

반응결과, O-아세틸-L-세린의 안정성을 명백하게 보장받을수 있었다.

그러나, 최대수율<45%로서, 이 방법의 효율은 가장 높지 않다.

효소에 의한 합성방법과 비교할때 중요한 결점은 거울상이성질선택성 (enantioselectivity)의 결여(lackness)에 있다.

따라서, 본 발명에 의한 방법에 따라 달성되는 또 다른 목적은 거울상이성질체 순도를 가진 효소에 의한 비단백질성 아미노산의 제조방법을 제공한다.

이 방법에서는 O-아세틸-L-세린 안정성과 최적의 효소활성에 대한 불화합성(불(不和合性:incompatibility)에도 불구하고 레벨이 낮은 이성화반응과 관련하여 유효한 효소수율(>>45%)을 명백하게 보장받을수 있다.

본 발명의 방법에서는 반응을 O-아세틸-L-세린 SH효소의 최적 pH이하로 실시하며 그 효소를 상당히 많은 용량으로 사용하는데 특징이 있기 때문에 본 발명의 방법에 의해 그 목적을 달성할 수 있다.

본 발명의 범위내에서 비단백질성 아미노산의 제조에서의 pH 범위는 pH 5.0~7.4이다.

그 pH범위는 pH 6.0~7.1이 바람직하다.

그 pH범위는 pH 6.0~6.99가 특히 바람직하다.

그 pH는 아세트산의 생성을 방지하기 위하여 pH의 활성을 조절함으로써 일정하게 유지하는것이 바람직하다.

pH의 활성조절은 측정 제어장치에 의해 바람직하게 얻어지며, 이 측정제어장치는 pH가 소정의 값에서 편차가 있을때 알칼리성 도는 산성으로 측정하여 pH를 재설정한다.

본 발명에 의해 사용되는 방법과 달리, 앞서 인용한 참고문헌에서 기재되어 있는 비단백질성 아미노산을 합성하는데 있어서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하는 반응은 O-아세틸-L-세린 SH효소의 최석 pH영역에서 pH의 활성조절없이 분석화학적으로 실시하였다.

또, 이들의 반응은 Cysk 효소에 속하는 계통군의 효소를 사용하였다.

따라서, 본 발명은 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서 O-아세틸-L-세린 SH효소로서 CysM 를 사용함을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.

그 효소의 적합한 높은 용량에 의해, 효소반응의 최적 pH밖에서도 만족스러운 수율을 얻을수 있다.

O-아세틸-L-세린 SH효소의 용량 활성 Acys 가 혼합액중에서 최소 2 단위/㎖일때 본 발명의 방법으로 이와같은 효소농도를 얻는 것이 바람직하다.

그 활성은 2~200 단위/㎖가 특히 바람직하다.

그 활성은 실시예 3의 테스트를 사용하여 측정한다.

본 발명의 처리공정을 밟을때, CysM 효소에 속하는 계통군의 O-아세틸-L-세린 SH효소가 비단백질성 아미노산의 제조에 사용하는 가장 우수한 효소라는 것을 관찰할 수 있다.

기재로서 사용에 적합한 친핵화합물의 스펙트럼(spectrum)은 CysK 효소보다 더 넓다.

본 발명의 특히 바람직한 구성에서, 효소반응은 연속 프로세스로 실시한다.

이 경우, O-아세틸-L-세린 , O-아세틸-L-세린 SH효소 및 친핵화합물을 일정하게 계량하게 혼합함과 동시에 그 얻어진 혼합액중에서 비단백질성 L-아미노산 함유용액(생성물 용액)을 제거한다.

반응 혼합액의 용량이 동일하게 있도록 함으로써 후자(생성물 용액)가 바람직하게 얻어진다.

특히, 이 처리공정의 잇점은 반응혼합액중에서 O-아세틸-L-세린의 저농도가 일정하게 유지되도록 정상상태를 설정하여 이성화반응(isomerization)을 감소시키는데 있다.

반응혼합액중에서 O-아세틸-L-세린의 농도는 <1.0g/ℓ로 조절한다.

이 농도값은 반응혼합액중에서 생성물용액의 평균 체재시간(mean dwell time)을 변화시켜 조정할 수 있다.

O-아세틸-L-세린의 연속반응용 탱크(reservoir)는 충분한 안정성을 확실하게 얻기 위하여, 산성 pH, 바람직하게는 pH 4-5에서 유지시키는 것이 바람직하다.

종래에는 O-아세틸-L-세린이 L-세린의 아세틸화반응에 의한 화학적 합성으로부터 제조되어, L-세린의 코스트가 고가이므로 제조비용이 높았다.

특허문헌 DE 10107002(본원 출원인과 동일하며, 2001. 12. 15. 출원하였음)명세서에서는 발효에 의한 O-아세틸-L-세린의 제조방법에 대하여 기재되어 있다.

이 특허문헌(출원명세서)에서는 제조코스트에 유리한 제조시스템을 이용할 수 있으나, O-아세틸-L-세린의 불안정성으로 인하여 생성물을 발효조배지에서 분리하는데 기술적으로 어려움이 있다.

본 발명의 잇점은 예로서 위의 특허문헌 DE 10107002 에 기재되어 있는 바돠같이 실시한 발효처리에서 얻어진 O-아세틸-L-세린함유 발효조배지를 본 발명에 의한 방법에서 O-아세틸-L-세린원(sousce)으로 직접 사용할 수 있다.

이와같은 방법은 특히 경제적이며, 불안정한 화합물에 의한 분리처리를 회피할 수 있다.

비단백질성 아미노산의 합성에 쓰이는 O-아세틸-L-세린 SH효소는 통상의 기술자가 알고 있는 통상의 재조합 DNA기술을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.

여기서, O-아세틸-L-세린 SH효소를 엔코팅한 유전자는 적합한 벡터에 클로닝(cloning)시키며, 그 다음으로 적합한 숙주균주(host strain)를 형질전환하였다.

재조합 DNA기술에 접근할 수 있고 발효에 의한 재조합 단백질의 제조에 적합한 어떤 미생물이라도 숙주균주로서 사용에 적합하다.

에쉐리키아콜리는 O-아세틸-L-세린 SH효소를 제조하는 바람직한 미생물이다.

원칙적으로, 재조합 O-아세틸-L-세린 SH효소 유전자는 크로모솜(염색체)에 결합시킬수 있고(integrate), 그밖에 자기복제(self-replicating)플라스미드벡터에 사용할 수 있다.

클로닝(cloning)에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소 유전자에 의해 조절할 수 있고 강력하게 유도할 수 있게 발현할 수 있는 유전자요소(gentic elements)[즉 조절할 수 있는 촉진제, 종료암호(terminators)]를 이미 포함한 벡터의 사용이 바람직하다.

에쉐리키아골리 벡터 pUC18, pBR322, pACYC184 및 이들의 유도체등 복제수가 높은 플라스미드 벡터가 특히 바람직하다.

강력하게 유도할 수 있는 적합한 촉진제의 예로는 lac,tac,trc, 람다 P_L,ara 및 tet 촉진제가 있다.

O-아세틸-L-세린 SH효소는 예로서 발효에 의한 재조합 미생물 균주를 배양시켜 생산한다.

이것과 관련하여, 소정의 미생물 균주에 적합하도록 할 필요가 있는 방법상의 파라미터를 가지며 통상의 기술자에 의해 공지되어 있는 증식방법(propagating methods)을 사용한다.

영양배지로서 완전배지(complete media)와 최소배지(mininal media)를 사용할 수 있고, 배치프로세스(batch process)또는 공급-배치 프로세스(fed-batch process)를 사용할 수 있다.

유도할 수 있는 촉진제계(promoter system)를 사용할 경우 O-아세틸-L-세린 SH효소 유전자의 발현(expression)은 적합한 유도제(inducer)를 첨가시켜 적합한 시점에서 전환시킨다.

적합한 생산단계 다음으로, O-아세틸-L-세린 SH효소 함유세포는 공지의 방법(즉, 원심분리)를 사용하여 얻어진다.

이와같이 하여 제조한 O-아세틸-L-세린 SH효소는 통상의 단백질 정제방법을 사용하여 분리시킬수 있다.

이것과 관련하여, 종래의 방법(즉, 침전, 이온교환 크로마토그래피, 수소성 상호작용 크로마토그래피 및 등전집속)과 "친화성태그"(affinity tags)를 사용하는 최근의 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

이들의 친화성태그를 엔코딩한 서열은 유전자를 클로닝할때 코딩영역에융합(fusion)할 수 있어, 그 대응하는 친화성태그를 포함하는 융합단백질을 얻을수 있다.

그다음, 이들의 단백질은 1단계 정제공정으로하여 분리시킨다.

친수성 태그와 친수성 정제의 적합한 조합의 한 예로는 스트렙-태그(strep-Tag)와 스트렙타비딘(strep tavidin)친화성 크로마토그래피가 있으며, 시판제품에서 구입할 수 있다(상품으로는 독일 괴팅겐에 있는 IBA 회사에서 제조한 상품이 있음). 본 발명에 의한 방법에서 정제형태의 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용할 수 있다.

그러나, 용액중에서의 반응이외에 지지체상에서 그 효소를 고정할수도 있다.

적합한 방법은 종래의 기술에 속한다.

비단백질성 아미노산의 제조에 쓰이는 O-아세틸-L-세린 SH효소의 분리가 절대적으로 필요한 것은 아니다.

또, 본 발명에 의한 제조방법에서 O-아세틸-L-세린 SH효소 활성을 가진 미생물 세포를 직접 사용할수 있다.

이와같은 미생물 균주의 예로는 에쉐리키아 콜리균주 DH5α/pFL145 및 BLR21(DE3)/pLE4 가 있다.

이들의 균주는 실시예 1및 2에 기재되어 있으며, 기탁번호 DSM14088 및 14089로 각각 독일 DSMZ 에 기탁되어 있다.

본 발명에 의한 방법의 변형예에서는 휴지세포(resting cell)를 사용하여 O-아세틸-L-세린을 비단백질성 L-아미노산으로 바이오형질전환(biotransformation)을 한다.

이와 관련하여, O-아세틸-L-세린과 친핵화합물의 휴지세포내 침투에 의해 세포에 의한 반응생성물, 즉 비단백질성 L-아미노산의 방출을 즉시 보장받을수 있다.

필요할 경우, 그 세포의 내부와 반응배지사이에서 물질전달은 그 세포를 투과하도록 하는 물질과 세포를 처리함으로써 증가시킬수 있다.

이들의 물질, 예로서 클로로포름 또는 톨루엔과 이들의 사용은 통상의 기술자에 의해 공지되어 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 구성에서, 비단백질성 아미노산은 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에, 촉매로서 미생물의 세포내에 존재하는 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용함으로써 생성된다.

발효에 의해 얻어진 비정제한 O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 미생물의 세포내에 존재한 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하는 비단백질성 L-아미노산의 제조가 특히 바람직하다.

본 발명에 의한 방법에 사용되고 O-아세틸-L-세린 SH효소에 의해 촉진되는 β치환반응용 친핵화합물은 다음의 그룹에서 선택되는 래디컬을 포함한 화합물이바람직하다.

다음 화합물의 그룹에서 선택되는 친핵화합물을 반응혼합액에 첨가하는 것이 특히 바람직하다.

- 티오 설페이트

- 다음 일반식(1)의 티올

H - S - R¹(1)

위식에서, R¹은 탄소원자 1~15개를 가진 1가의 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 아릴 또는 헤테르아릴 래디컬이다.

- 셀레나이드

- 다음 일반식(2)의 셀레놀(selenols)

H - Se - R¹(2)

위식에서, R¹은 일반식(1)의 정의를 가진다.

- 아지드(azides)

- 시아나이드(cyanides)

- 다음 일반식(3)또는 (4)의 아졸(azoles)

위식에서, X 및 Y는 같거나 다르며, CR⁴또는 N이며, R⁴는 -H, -COOH, -OH , -NH₂, -NO₂, -SH, -SO₃-, -F, -Cl, -Br, -I, C₁-C₅-알킬카르보닐-및 이들의 에스테르, 아미드 또는 염, 또는 R¹이다.

R¹은 일반식(1)의 정의를 가진다.

R²및 R³는 같거나 다르며, R⁴이다.

일반식(4)에서 C¹및 C²는 치환체 R²및 R³대신 브리지(bridge)[-CR⁵R⁶-]a (여기서 a는 1,2,3 또는 4 임)에 의해 결합되어 하나의 링(ring)을 형성한다.

R⁵및 R⁶는 같거나 다르며 R⁴이고, 1개이상의 인접하지 않은 기 (non-adjacent groups)[-CR⁵R⁶-]는 산소, 황 또는 이미노래디컬(C₁-C₅-알킬-에 의해 선택치환됨)에 의해 치환시킬수 있고, 2개의 인접기[-CR⁵R⁶-]는 하나의기[-CR⁵=CR⁶-]또는 [-CR⁵=N-]와 치환할 수 있다.

- 다음일반식(5)또는 (6)의 이소옥사졸리논

위식에서, X,R¹,R²및 R³는 위에서 설명한 정의를 가지며, 일반식(6)의 C¹및 C²는 치환체 R²및 R³대신 일반식(4)의 브리지에 의해 연결되어 하나의 링(ring)을 형성할 수 있다.

티오설페이트의 예로는 소듐 티오설페이트, 포타슘 티오설페이트 및 암모늄 티오설페이트가 있다.

티올의 예로는 다음의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

2-메르캅토에타놀,3-메르캅토 프로파놀,

3-메르캅토 프로피온산,3-메르캅토-1-프로판 설폰산,

메르캅토에탄설폰산,2-메르캅토에틸아민,

티오글리콜산,티오락틴산,

티오아세트산,메르캅토석신산,

메르캅토피루빈산,디티오트레이톨,

디티오에리트리톨,1-티오글리세롤,

티오페놀,4-플루오로티오페놀,4-클로로티오페놀,

4-메르캅토페놀,P-티오크레졸,5-티오-2-니트로벤조산,

2-메르캅토티아졸,2-메르캅토티아졸린,2-메르캅토이미타졸,

3-메르캅토-1,2,4-트리아졸,2-티오페네티올,2-메르캅토피리딘,

2-메르캅토피리미딘,2-티오사이토신,2-메르캅토니코틴산,

2-메르캅토-1-메틸이미다졸,2-메르캅토벤조티아졸,

2-메르캅토벤조옥사졸 및 6-메르캅토푸린

셀레놀의 예로는 메틸셀레놀, 에틸셀레놀,프로필셀레놀 및 페닐셀레놀의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

아지드의 예로는 소듐아지드, 포타슘아지드 및 암모늄아지드가 있다.

시아나이드의 예로는 포타슘 시아나이드, 소듐시아나이드 및 암모늄시아나이드가 있다.

아졸의 예로는 1,2-피라졸, 3-메틸피라졸, 4-메틸피라졸, 3,5-디메틸피라졸, 3-아미노피라졸, 4-아미노피라졸, 피라졸-4-카르복실산, 피라졸-3,5-디카르복실산, 1,2,3-트리아졸,1,2,4-트리아졸, 3-아미노-1,2,4-트리아졸, 1,2,3,4-테트라졸, 인다졸, 인다졸-3-카르복실산, 인다졸-5-카르복실산, 5-아미노산인다졸, 벤조트리아졸, 벤조트리아졸-5-카르복실산, 5-아미노벤조트리아졸, 아미노피라졸로피리미딘, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

이소옥사졸리논의 예로는 이소옥사졸린-5-온, 3-메틸이소옥사졸린-5-온, 4-메틸이소옥사졸린-5-온, 4,5-디메틸이소옥사졸린-2-온 및 1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-온의 그룹에서 선택한 화합물이 있다.

혼합용액중에서 친핵화합물의 농도는 O-아세틸-L-세린과 등몰의 농도로 존재하도록 선택하는 것이 바람직하다.

반응온도는 5℃~70℃의 범위가 되도록 선택하는 것이 바람직하다.

그 온도범위는 20℃~40℃가 특히 바람직하다.

물은 반응의 용제로서 사용하는 것이 바람직하다.

생성되는 반응생성물은 L구성에서 다음 일반식(7)의 L-아미노산이 바람직하다.

위식에서, Z는 다음식(8)~(19)에서 선택한 1가 래디컬 및 그 에스테르, 에테르 또는 염이다.

위식에서 R¹,R²,R³,R⁴, X 및 Y는 일반식(1)~(6)에서 설명한 정의를 가진다.

본 발명에 의한 처리를 종료시킨후와 공지의 방법을 사용하여 바람직한 수용액을 바이오매스(biomass)와 배양상징액으로 분리시킨후에 배양상징액에서 용해할수 있는 비단백질성-L-아미노산을 분리하는 것이 바람직하다.

이와같은 아미노산의 분리방법은 동일하게 통상의 기술자에 의해 공지되어 있다.

이들의 분리방법에는 예로써 여과, 원심분리, 추출, 흡착, 이온교환크로마토그래피, 침전 및 결정화가 있다.

난용성의 비단백질성아미노산의 경우, 통상의 기술자에 의해 공지되어 있는 바와 같이 등급원심분리(grading centrifugation)를 실시하여 그 바이오매스가 가급적 모두 원심분리상징액에 있도록 하는 것이 바람직하다.

분리시킨 생성물은 표준방법을 사용하여 용해시킨 다음 재침전시키는 것이 바람직하다.

다음 실시예를 들어 본 발명을 명백하게 설명한다.

실시예 1 ; 스트렙태그(StrepTag)서열함유융합유전자로서 에쉐리키아콜리 CysK 및 CysM유전자의 클로닝(Cloning)

에쉐리키아콜리 CysK 및 CysM유전자를 클로닝하기 위하여, 다음의 포스포로티오에이트보호올리고뉴클레오티드 프라이머쌍(phosphorothioate-protected oligon ucleotide primer pairs)과 PwoDNA중합효소를 사용하여 우선 중합효소사슬반응 (Polymerase chain reaction)을 실시하였다.

cysKs1 : 5'-gat cga ctc gaa tga gta aga ttt ttg aag a-3' SEQ.ID.NO. 1

cysKS2 : 5'-gat cgaggt ctcggc gct ctg ttg caa ttc ttt ctc ag-3'SEQ.ID.NO. 2 및

cysMS3 : 5'-gat cgaggt ctcgaa gta cat tag aax aaa c-3 SEQ.ID.NO. 3

cysMS5 : 5'-gat cgaggt ctcggc gct aat ccc cgc ccc ctg gct aa-3' SEQ.ID.NO. 4

이와 관련하여, 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)BasI(밑줄친 뉴클레오티드)의 분리부위를 프라이머(primer)서열에 의해 도입하였다.

에·콜리(E·coli)W3110(ATTC 27325)의 염색체 DNA는 템플레이트(template)로 사용하였다. 그 결과 얻어진 증폭인자는 제한효소 BsaI로 소화시킨 다음, Eco31I-처리벡터 (PASK-IBA3(독일, 피링겐에 있는 연구소로서, Institute for Bioanalysis)에 클로닝하였다.

이 벡터에 의해 스트렙태그 Ⅱ(StrepTag Ⅱ)로 지정되어 있는 친화성 탭티드 (WSHPWFEK SEQ.ID.NO.5)를 엔코딩하는 3'단부의 서열을 가진 유전자융합으로 유전자를 클로닝하도록 하였다.

유전자융합을 발현하는 tet촉진제를 사용하여 C-말단스트렙태그Ⅱ를 가진 단백질을 얻었다. 후자는 스트렙태그Ⅱ가 스트렙타비딘(streptavidin) 컬럼(columns)의 결합을 조절하기 때문에 단백질의 분리에 사용할 수 있다.

실시예 2 : CysK 및 CysM 단백질의 정제

CysM-스트렙태그(StrepTag) 구성(pFL145)을 사용하여, 에·콜리균주DH5α (Clonetech, 독일)에서 가장 우수한 유전자발현을 얻을 수 있었다.

증식(propagation)과 발현은 독일연방공화국 괴팅겐에 있는 회사(Institut fuer Bioanalytik)에 의해 작성한 지시서에 따라 실시하였다.

균주 DH5α/pFL145는 기탁번호 DSMZ14088로 DSMZ에 기탁되어 있다. CysK-스트렙태그구성(pLE1)의 경우 대비할때 발현은 대단히 미약(weak)하였다. 그러나, 이 경우(pLE4) XbaI/HindIII 단편으로, 유전자융합을 T7촉진제(pRSET5a)(Stratage ne, 독일)함유 백터에 리클로닝(recloning)하여, 균주 BLR21(DE3)(Novagen, 독일)에서 발현시킴으로써 유전자생성물을 생성하였다.

균주 BLR21(DE3)/pLE4는 기탁번호 DSMZ14089로 DSMZ에 기탁되어 있다.

CysK 및 CysM 단백질은 스트렙타비딘(Streptavidin)컬럼(columns)상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

이 처리공정은 원칙적으로 제조업자의 지시서(독일연방공화국 괴팅겐에 있는 회사(Institut fuer Bioanalytik)에 의해 작성한 지시서임)에 따라 실시하였다.

배양액 250㎖를 사용하였을때 수율은 각각 정제한 CysK 단백질3㎎ 또는 정제한 CysM 단백질 4.5㎎이었다.

피리드옥살포스페이트 보조인자(cofactor)로 인하여, 2종단백질은 진한 황색의 착색을 나타내었으며, 420㎚에서 최대흡수를 가졌다.

실시예 3 ; 효소고유활성도 측정

O-아세틸-L-세린 SH효소의 활성은 "중성"반응생성물 L-시스테인(Cys)을 검출하거나, 또는 CysM의 경우 S-설포-L-시스테인(S-Cys)으로 반응생성물을 검출하여측정하였다. 2종의 단백질은 참고문헌(Gaitonde, 1967, Biochem. J. 104 : 627-633)에 기재되어 있는 테스트를 사용하여 극히 특정하게 그리고 극히 강도높게 검출할 수 있었다.

각각의 표준곡선은 2종의 화합물에 대하여 표준화곡선으로 보정하였다. 그 이유는 설포시스테인의 칼라복합체(color complex)의 강도가 낮기 때문이다.

10mM O-아세틸-세린(PH5.5의 500mM소듐석시네이트완충액중에서 200mM 원액에 첨가함), 10mM소듐설파이드 또는 소듐티오설페이트, PH7.0의 100mM 포타슘포스페이트완충액 및 1㎖당 정제효소 5㎍을 포함한 테스트혼합액을 37℃에서 배양하였다.

고유활성도(specific activity)A는 단백질 1mg당 단위로 나타낸다. 즉, 생성물 ㎛o1 ×min^-1×단백질 ㎎^-1으로 나타낸다.

A_cys는 설파이드를 사용하는 시스테인의 생성에 대한 고유활성도를 나타낸다.

A_s-cys는 티오설페이트를 사용하는 S-설포시스테인의 셍성에 대한 고유활성도를 나타낸다.

실시예 2에서 분리한 단백질을 사용하는 고유활성도는 다음과 같다.

CysK : A_cys140 단위/mg

CysM : A_cys199 단위/mg

CysM : A_s-cys145 단위/mg

휴지세포에서 O-아세틸 세린 SH효소의 고유활성도를 측정할때, 세포현탁액의흡광도(optical density)를 우선 20.0으로 조절하였다(600nm에서 측정함). 다음으로 농도 10Vol%의 클로로포름을 첨가시켜 그 휴지세포를 투과하였다.

그리고 그 얻어진 혼합액을 5분간 실온에서 배양하였다.

그 효소테스트에 있어서는 흡광도를 1.0으로 조절시킨 다음, 위에서 설명한 휴지세포를 사용하여 O-아세틸-L-세린과 설파이드 또는 티오셀페이트의 반응을 실시하였다. 따라서 휴지세포의 고유활성도 A는 ㎛o1 ×min^-1×(600nm에서 흡광도 1.0을 가진 세포현탁액 ㎖)로 나타낸다. 즉, 단위/㎖OD로 나타낸다.

실시예 4 : O-아세틸-L-세린 SH효소 CysK 및 CysM에 대한 촉매가능성 조사

O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성아미노산을 제조하기 위하여, 설파이드 또는 티오설페이트 대신 다른 친핵화합물을 반응에 사용하였다.

이들의 친핵화합물을 검출하기 위하여, 오르토-프탈디알데히드를 사용하여 아미노산에 대한 전치컬럼유도체화반응(precolumn derivatization)을 실시하였다.

이 방법을 사용하여, 적합한 친핵기재에 대하여 광범위한 선별을 실시하였다.

혼합액에는 4mM O-아세틸-L-세린(200mM원액에서, PH5.5의 500mM 소듐석시네이트완충액중에 첨가함), 20mM 친핵화합물, PH7.0의 100mM포타슘포스페이트 완충액, 1㎖당 정제한 효소 5㎍을 포함시켰다.

반응을 아세트산(96%v/v)용량의 1/100로 정지시키고 제조업자의 지시서(독일발트브론의 회사(Hewlett Packard)에 의해 작성한 지시서)에 따라 HP 아미노성분컬럼(200mm ×2.1mm)을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다.

생성한 생성물을 특성화하기 위하여 HPLC-MS를 사용하여 분자량을 확정하였다. 루나(Luna)C18컬럼(Phenomenex회사제품, 독일 아스하펜부르그에 있음)을 이 분자량설정에 사용하였으며, 포름산(0.1%v/v)을 가동상(mobile phase)으로 사용하였다.

포지티브엘렉트로스프레이모드(positive electrospray mode)로 이온화반응을 실시하였다.

다음의 표는 여러가지의 친핵화합물에 대한 2종효소, 즉 CysK 및 CysM의 반응성과 HPLC-MS분석으로 측정한 질량(MH+)을 나타낸다.

(주): ＊ +++ 30분후 70%이상의 전환율

++ 30분후 40%이상의 전환율

+ 30분후 10%이상의 전환율

- 30분후 5%미만의 전환율

실시예 5 : 발효에 의한 O-아세틸-L-세린 SH효소 CysM의 제조

발효용 예비배지로, 1ℓ당 앰피실린 100㎎을 추가로 포함한 LB배지(1ℓ당 트립톤 10g, 1ℓ당 이스트엑스 5g, 1ℓ당 NaC1 10g)20㎖에 균주, DH5α/pFL145(위 기재참조)를 접종시킨다음, 30℃에서 150rpm으로 회전하는 교반기중에서 하루밤 배량하였다.

그 다음, 그 혼합액 전부를 SM1배지(100㎖)에 이식하였다.

SM1배지는 아래의 구성성분을 가지며, 1ℓ당 글루코오스 5g, 1ℓ당 비타민 B₂0.5㎎, 1ℓ앰피실린 100㎎을 보충하였다.

SM1배지는 1ℓ당 K₂PO₄12g, 1ℓ당 KH₂PO₄3g, 1ℓ당(NH₄)₂SO₄5g, 1ℓ당 MgSO₄×7H₂O 0.3g, 1ℓ당 CaCl₂×2H₂O 0.015g, 1ℓ당 FeSO₄×7H₂O 0.002g, 1ℓ당 소듐시트레이트×2H₂O 1g, 1ℓ당 NaCl 0.1g, 1ℓ당 미량원소용액 1㎖로이루어지며, 미량원소용액은 1ℓ당 Na₂MoO₄×2H₂O 0.15g, 1ℓ당 Na₃BO₃2.5g, 1ℓ당 CoCl₂×6H₂O 0.7g, 1ℓ당 CuSo₄×5H₂O 0.25g, 1ℓ당 MnCl₂×4H₂O 1.6g, 1ℓ당 ZnSO₄×7H₂O 0.3g 으로 이루어진 용액이다.

그 예비배지를 온도 30℃에서 8시간동안 150rpm으로 하여 더 배양하였다.

사용한 발효조(발효장치)는 바이오스태트 M(Biostat M)장치이다(제조회사,Braun Biotech; 독일 멜순겐에 있음). 이 장치는 최대 배양용량이 2ℓ이다.

발효조에는 발효배지 900㎖ 가 있으며, 위에서 설명한 예비배지(600nm에서 흡광도 약 2임)로 접종하였다.

이 발효배지는 1ℓ당 글루코오스 15g, 1ℓ당 트립톤 10g, 1ℓ당 이스트엑스 5g, 1ℓ당 (NH₄)₂SO₄5g, 1ℓ당 KH₂PO₄1.5g, 1ℓ당 NaCl 0.5g, 1ℓ당 MgSO₄×7H₂O 0.3g, 1ℓ당 CaCl₂×2H₂O 0.015g, 1ℓ당 FeSO₄×7H₂O 0.075g, 1ℓ당 소듐시트레이트×2H₂O 1g 및 1ℓ당 미량원소용액 1㎖(미량원소용액 성분은 위에서 설명한것과 같음), 1ℓ당 비타민 B₁5㎖, 1ℓ당 앰피실린 100mg 으로 이루어지며, 25% 암모니아에 의해 PH 7.0으로 조절하였다.

발효할때 온도를 32℃로 고정하였으며, pH는 25%v/v 암모니아로 혼합시켜 pH 7.0으로 일정하게 유지하였다.

그 얻어진 배양액은 1.5Vol/Vol/min 의 살균시킨 압축공기로 처리시키면서 회전교반기속도 200rpm으로 교반하였다.

산소포화가 50%로 되었을때, 50%의 산소포화를 유지하기 위하여 감시장치(monitoring device)에 의해 1200rpm으로 회전속도를 증가시켰다.(산소포화는 900rpm에서 100%포화 눈금을 가진 pO₂프로브(probe)를 사용하여 측정함).

발효조내 글루코오스 농도가 초기농도 15g/ℓ에서 약 5~10g/ℓ로 저하되는 즉시 글루코오스 56% w/v용액을 계량하여 혼합하였다.

발효조내 글루코오스 농도를 0.5~10g/ℓ로 유지시키면서 유량 3~6㎖/h로 공급하였다.

글루코오스는 글루코오스 분석기(Yellow Springs 사제품, 미국 오하이오주)를 사용하여 측정하였다.

흡광도(optical density)30으로 되었을때 1ℓ당 테트라시클린 3mg 을 첨가시켜 효소생성을 유도하였다.

유도시간은 7시간이었다.

이 시간후에 샘플을 채취하여 세포를 원심분리에 의해 배지에 분리하고 세척하였다.

얻어진 세포 현탁액을 실시예 3에서와 같이 분석하였다.

티오 설페이트로 측정한 O-아세틸 세린 SH효소의 활성도, A_s-cys는 12 단위/mlOD이었다.

그 세포는 원심분리에 의해 얻어지며, 액상질소중에서 충격냉동 (shock-frozen)시키고 -20℃ 에서 저장하였다.

실시예 6 : 발효에 의한 O-아세틸-L-세린 SH효소 CysM의 제조

Cysk 효소의 제조공정은 원칙적으로 실시예 5에서의 공정과 같다.

그러나, 이 실시예의 경우 균주 BLR21(DE 3)/PLE4 를 사용하였다.

그러나, 초기에 넣은 1ℓ당 글루코오스 15g 을 모두 소비시킨다음, 글리세롤60%(v/v)용액을 공급하였다.

유량은 9.5㎖/h 이었다.

동시에, 0.4mM 이소프로필-β-티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가시켜 효소의 생성을 유도하였다.

유도시간 21시간후에 샘플을 채취하여 그 세포를 원심분리에 의해 배지에서 분리시킨다음 세척하였다.

그 결과 얻어진 세포현탁액을 실시예 3에서와 같이하여 분석하였다.

설파이드로 측정한 O-아세틸 세린 SH효소의 고유활성도, Acys는 2단위/㎖OD 이었다.

그 세포를 원심분리에 의해 얻어, 액상질소중에서 충격냉동시켜 -20℃에서 저장하였다.

실시예 7 : 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-페닐-L-시스테인의 제조

PH 프로브(probe)와 PH조절기를 장치한 온도제어 용기내에서 물 100㎖중에 O-아세틸-L-세린 히드로 클로리드(Sigma 사제품, 독일 데이센호펜시에 있음)를 우선 용해시켜 200mM(29.4g/ℓ)O-아세틸-L-세린의 최종농도를 얻었다.

그다음, 200mM 티오페놀을 첨가시키면서 교반하였다.

그 다음으로, 얻어진 혼합액은 5M NaCH 로 적가시켜 신속하게 PH 6.7으로 한 다음, CysM 생성균주 DH5α/pFL145 의 세포현탁액을 즉시 혼합하였다.

그 세포현탁액은 고유활성도 As-cys 가 12 단위/mlOD 이었다.

그 혼합액중에서 세포의 흡광도(600nm 에서 츠정)는 2.0이었으며, O-아세틸 세린의 고유활성도 As-cys 는 24 단위/mlOD 이었다.

그 반응중에, pH는 pH 제어기에 의해 5M NaOH 의 혼합으로 일정하게 유지하였다.

그 반응중에 백색침전물의 생성이 확인되었다.

30분후, 샘플을 채취하여 1%(v/v)아세트산으로 처리하였다.

그 침전물은 원심분리에 의해 분리시켜 동용량의 21%(v/v)인산중에 용해하여 HPLC에 의해 분석하였다.

또, 원심분리 상징액은 크로마토그래피분석 처리를 하였다.

그 분석처리는 루나(LUNA)5μC18(2) 컬럼(Phenomenex 제품, 독일)상에서 액상 HPLC에 의해 실시하였다.

유량 0.5ml/min의 묽은 인산(1ℓ당 진한 인산 0.1㎖)을 용리액(eluent)으로 사용하였다.

S-페닐-L-시스테인의 함량은 상징액중에서 1.6g/ℓ이었으며, 침전물에서 24.8g/ℓ이었다.

이것은 O-아세틸-L-세린을 기준으로 하여 총반응수율 67%에 대응한다.

사용한 O-아세틸 세린 SH효소의 고유활성도를 각각 12 단위/㎖ 와 2 단위/㎖로 감소시켜 제조하였다.

그러나, 이것은 효소반응이 지연되어 O-아세틸-L-세린의 이성화로 인하여 각각 수율 52% 와 15% 로 감소되었다.

실시예 8 : O-아세틸-L-세린 함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 발효에 의한 S-페닐-L-시스테인의 제조

순수물질로서 O-아세틸-L-세린대신, O-아세틸-L-세린함유 발효배지에서 이 실시예의 실험을 실시하였다.

이 발효배지는 특허문헌 DE 10107002 명세서에 기재되어 있는 바와같이 발효에 의해 얻었다.

발효가 완료되었을때, O-아세틸-L-세린을 안정화하기 위하여 pH를 21%(v/v) 인산에 의해 pH 4.0으로 조정하였다.

휴지세포를 원심분리에 의해 분리시키고 발효배지를 증류에 의해 1ℓ당 O-아세틸-L-세린 30g의 농도로 하였다.

그 다음으로, PH 6.7로 될때까지 적정후 200mM티오페놀과 CysM 생성 균주 DH 5α/pFL145 의 세포를 배지 100㎖와 혼가하였다.

고유활성도 As-cys 는 24 단위/ml 이었다.

그 다음, 실시예 7에서와 같이 또 다른 공정으로 처리하였다.

O-아세틸-L-세린을 기준으로 한 수율은 65% 이었다.

고유활성도 Acys 38단위/㎖를 사용할 경우 CysK 생성 균주 BLR21(DE 3)/pLE4 의 세포를 함유한 동일 혼합액은 수율 72% 를 얻었다.

실시예 9 : O-아세틸-L-세린 함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-페닐-L-시스테인의 연속제조

이 반응의 실시목적은 고가의 불안정한 출발화합물 O-아세틸-L-세린을 기재로 하여 가급적 높은 대사회전(turnover)을 얻도록 하는데 있다.

대사회전을 확보하기 위하여 연속처리를 실시하였다.

이 처리에서, 처리공정은 사용한 CysM 고유활성도 As-cys 를 48 단위/㎖로 증가시키는 것을 제외하고 초기에는 실시예 8에서와 같이 하였다.

반응시간 20분후에, O-아세틸-L-세린함유 발효배지 (30g/ℓ), 티오페놀 및 CysM 생성균주 DH5α/pFL145의 세포현탁액(pH 7.0의 포타슘포스페이트 완충액중에서, 600nm 에서의 흡광도 240)을 계량 혼합장치에 의해 첨가하였다.

유량은 각각 150, 2.5 및 3㎖/h 이었다.

동시에, 유량 155.5㎖/h 에서 반응용기에서의 생성물 용액의 연속적인 제거를 개시하였다.

반응기내 반응용액을 일정하게 있도록 하고 반응기내에서 평균체재시간이 30분으로 되도록 그 유량을 선택하였다.

이 처리공정을 사용하여, 일정한 O-아세틸-L-세린농도 1.0g/ℓ의 혼합액중에서 정상상태를 설정하였다.

이와같이 저농도결과, 저농도에서 효소는 KM값이 더 낮아져 극히 우수한 활성을 갖게되어, N-아세틸-L-세린의 이성화를 계속해서 최소화할 수 있었다.

O-아세틸-L-세린을 기준으로 하여 반응의 수율은 85%이었다.

실시예 10 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 아지도-L-알라닌의 제조

이 실시예의 다음 처리공정은 CysM함유 세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 처리하였다.

티오페놀대신, 200mM 소듐아지드를 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에서 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 45%로 측정되었다.

실시예 11 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 시아노-L-알라닌의 제조

CysM 함유세포를 사용하여 실시에 8에서와 같이 이 실시예의 처리공정을 실시하였다.

티오페놀대신 200mM 포타슘 시아나이드를 사용하였다.

혼합액의 pH를 6.7로 조정한 다음 포타슘 시아나이드만을 첨가하였다.

반응시간 30분후, 이 혼합액중에서 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 65%로 측정되었다.

실시예 12 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-설포-L-시스테인의 제조

이 실시예의 다음 처리공정은 CysM 함유세포를 사용하여 실시예 8의 공정과 동일하게 처리하였다.

티오페놀 대신, 200mM 소듐 티오설페이트를 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 16단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 그 전환율은 91%로 측정되었다.

실시예 13 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-티아졸-2-일-L-시스테인의 제조

CysM 함유 세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 이 실시예의 처리공정을 실시하였다.

티오페놀대신 200mM 2-메르캅토티아졸을 사용하였다.

반응시간 30분후에 혼합액중에 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 62%로 측정되었다.

실시예 14 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 S-1,2,4-트리아졸-3-일-L-시스테인의 제조

CysM 함유 세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 이 실시예의 공정을 처리하였다.

티오페놀대신, 200mM 3-메르캅토-1,2,4-트리아졸을 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 74%로 측정되었다.

실시예 15 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에의한 셀레노-L-시스테인의 제조

CysM 함유세포를 사용하여 실시예 8에서와 같이 이 실시예의 공정을 처리하였다.

티오페놀대신, 200mM 소듐셀레니드를 사용하였다.

소듐 셀레나이트를 소듐 보로히드리드로 환원시켜 소듐 셀레니드를 제조하였다.

반응시간 30분후 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 74%로 측정되었다.

실시예 16 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 페닐-설레노-L-시스테인의 제조

티오페놀대신 200mM페닐셀레놀을 사용하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 62%로 측정되었다.

실시예 17 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 1,2,4-트리아졸-1-일-L-알라닌의 제조

이 실시예의 처리공정은 실시예 8에서와 같이 실시하였다.

티오페놀 대신 200mM 1,2,4-트리아졸을 사용하였다.

이 반응에서 세포는 10%(v/v)클로로포름으로 처리하여 투과시켰다.

반응시간 30분후, 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 48%로 측정되었다.

실시예 18 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 5-카르복시-1,2,3-벤조 트리아졸-2-일-L-알리닌의 제조

이 실시예의 공정을 실시예 8에서와 같이 실시하였다.

티오페놀 대신 200mM 5-카르복시-1,2,3-벤조트리아졸을 사용하였다.

이 반응에서, 세포는 10%클로로포름의 처리에 의해 투과하였다.

반응시간 30분후, 혼합액중에서 활성도 72단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 54%로 측정되었다.

실시예 19 : O-아세틸-L-세린함유 발효배지와 휴지세포를 사용하는 효소에 의한 1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디오닐-L-알라닌(퀴스쿼르산)의 제조

실시예 8에서와 같이 이 실시예의 공정을 처리하였다.

티오페놀 대신 200mM 1,2,4-옥소디아졸리딘-2,5-디온을 사용하였다.

이 반응에서 세포는 10%클로로포름으로 처리하여 투과하였다.

반응시간 30분후에, 혼합액중에 활성도 72 단위/㎖에 대응하는 세포를 사용하여 전환율은 11%로 측정되었다.

본 발명의 제조방법에 의해, 친핵화합물, 특히 높은 량의 독성화합물을 사용할 수 있고, pH는 pH 5.0~pH7.4의 범위에 실시할 수 있으며, O-아세틸-L-세린 SH효소는 CysM을 사용하며, 혼합액중에서 최소 2단위/㎖의 고유활성도 Acys 를 갖도록 하며, 지지체상에서 고정화시켜 사용하고, O-아세틸-L-세린 SH효소활성도를 가진 미생물 휴지세포형태로 사용할 수 있다.

서열리스팅(listing)

<110> 콘소튬 퓌르 엘렉트로헤미쉐 인두스트리 게엠베하

<120> 비단백질성 L-아미노산의 제조방법

<130> 합성아미노산 Ⅱ

<140>

<141>

<160> 5

<170> 페이턴트인 버스.(Patent In Vers,)2.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 인공서열(Artificial sequencs)

<220>

<223> PCR의 프라이머(primer)

<400> 1

gatcgaggtc tcgaatgagt aagatttttg aaga34

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 인공서열

<220>

<223> PCR의 프라이머

<400> 2

gatcgaggtc tcggcgctct gttgcaattc tttctcag38

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 인공서열

<220>

<223> PCR의 프라이머

<400> 3

gatcgaggtc tcgaatgagt acattagaac aaac34

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 인공서열

<220>

<223> PCR의 플이머

<400> 4

gatcgaggtc tcggcgctaa tccccgcccc ctggctaa38

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 인공서열

<220>

<223> 단백질 정제용 스트렙 태그 Ⅱ 친화성텝티드

<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

Claims

O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH 효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 효소의 바이오형질전환 (enzymic biotrans formation)에 의한 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서, pH 5.0~pH 7.4의 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, pH6.0~pH7.1의 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법
제 1항에 있어서, pH6.0~pH6.99의 범위의 pH에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 정제형태로 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 지지체상에서 고정화시킨후에 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 O-아세틸-L-세린 SH효소 활성도를 가진 미생물 휴지세포의 형태로 사용함을 특징으로 하는 제조방법
제 1항에 있어서, 친핵 화합물에는의 그룹에서 선택한 하나의 래디컬을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 친핵화합물은 티오설페이트, 다음 일반식(1)의 티올, 셀레니드, 다음 일반식(2)의 셀레놀, 아지드,시아나이드,다음 일반식(3)또(4)의 아졸, 다음일반식(5)또는(6)의 이소옥사졸리논의 그룹에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법.

위식에서,

R¹은 탄소원자 1~15개를 가진 1가의 포화 또는 불포화 알킬, 알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴 래디컬이고, X 및 Y는 같거나 다르며, CR⁴또는 N이고 R⁴는 -H, -COOH, -OH, -NH₂, -NO^- ₂, -SH, -SO^- ₃, -F, -Cl , -Br, -I, C₁-C₅-알킬카르보닐- 및 이들의 에스테르, 아미드 또는 염, 또는 R¹이다.

R²및 R³는 같거나 다르며 R⁴이다.

일반식(4)에서 C¹및 C²가 치환체 R²및 R³대신 브리지(bridge)[-CR⁵R⁶-]a(a는 1,2,3 또는 4임)에 의해 결합되어 하나의 링(ring)을 형성한다.

R⁵및 R⁶는 같거나 다르며, R⁴이다.

1개이상의 인접하지 않은 기[-CR⁵R⁶-]는 산소, 황 또는 C₁-C₅-알킬에 의해 선택치환되는 이미노래디컬로 대치시킬수 있고, 2개의 인접기[-CR⁵R⁶-]는 기 [-CR⁵=CR⁶-] 또는 기 [-CR⁵=N-]로 대치할 수 있다.

일반식(6)의 C¹및 C²는 치환체 R²및 R³대신, 일반식(4)의 정의에서와 같이 브리지에 의해 결합하여 하나의 링을 형성한다.
제 7항 또는 제 8항에 있어서, 친핵화합물은 2-메르캅토에타놀, 3-메르캅토 프로파놀, 3-메르캅토프로피온산, 3-메르캅토-1-프로판 설폰산, 메르캅토에탄설폰산, 2-메르캅토에틸아민, 티오글리콜산, 티오락트산, 티오아세트산, 메르캅토석신산, 메르캅토피루빈산, 디티오트레이톨,디티오에리트리톨,1-티오글리세롤 ,티오페놀,4-플루오로티오페놀,4-클로로티오페놀,4-메르캅토페놀,P-티오크레졸,5-티오-2-니트로벤조산,2-메르캅토티아졸,2-메르캅토티아졸린,2-메르캅토이미다졸,3-메르캅토-1,2,4-트리아졸,2-티오펜티올,2-메르캅토피리딘,2-메르캅토피리미딘,2-티오사이토신,2-메르캅토니코틴산,2-메르캅토-1-메틸이미다졸,2-메르캅토벤조티아졸,2-메르캅토벤조옥사졸,6-메르캅토푸린,소듐티오설페이트,포타슘티오설페이트,암모늄티오설페이트,소듐아지드,포타슘아지드,암모늄아지드,포타슘시아나이드 소듐시아나이드 ,암모늄시아니드,메틸셀레놀,에틸셀레놀,프로필셀레놀,페닐셀레놀,1,2-피라졸,3-메틸피라졸,4-메틸피라졸,3,5-디메틸피라졸,3-아미노피라졸,4-아미노피라졸,피라졸 -4-카르복실산, 피라졸-3,5-디카르복실산,1,2,3-트리아졸,1,2,4-트리아졸,3-아미노 -1,2,4-트리아졸,1,2,3,4-테트라졸,인다졸,인다졸-3-카르복실산,인다졸-5-카르복실산,5-아미노인다졸,벤조트리아졸,벤조트리아졸-5-카르복실산,5-아미노벤조트리아졸,아미노피라졸피리미딘,8-아자구아닐,8-아자아데닌,이소옥사졸린-5-온,3-메틸이소옥사졸린-5-온, 4-메틸이소옥사졸린-5-온,4,5-디메틸이소옥사졸린-2-온 및 1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디온의 그룹에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 친핵화합물이 O-아세틸-L-세린과 등몰인 농도로 존재하도록 친핵화합물의 농도를 선택함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 5℃~70℃의 온도에서 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 비단백질성 L-아미노산은 L 구조에 있어서 다음 일반식(7)의 아미노산, 그 에스테르, 에테르 및 염의 그룹에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법.

위식에서, Z는 다음식(8)~(19)중 하나에 의한 1가 래디컬이다.

위식에서 R¹,R²,R³,R⁴,X 및 Y는 일반식(1)~(6)에서의 정의와 같다.
제 1항에 있어서, 제조처리를 종료한후 비단백질성 L-아미노산의 분리는 공지의 방법을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 13항에 있어서, 분리는 여과, 원심분리,추출,흡수,이온교환 크로마트그래피, 침전 또는 결정화에 의해 실시함을 특징으로 하는 제조방법.
O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소로서 CysM을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 15항에 있어서, O-아세틸-L-세린 SH효소는 혼합액중에서 최소 2 단위/㎖의 고유활성도 Acys 를 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질성 L-아미노산을 얻는 비단백질성 L-아미노산의 제조방법에 있어서, O-아세틸-L-세린, O-아세틸-L-세린 SH효소 및 친핵화합물을 일정하게 계량하여 혼합시킴과 동시에 비단백질성 L-아미노산 함유용액을 제거함을 특징으로 하는 제조방법.
O-아세틸-L-세린과 친핵화합물을 반응시킴과 동시에 촉매로서 O-아세틸-L-세린 SH효소를 사용하여 비단백질 L-아미노산을 얻는 비단백질 L-아미노산의 제조방법에 있어서, O-아세틸-L-세린함유 발효배치는 O-아세틸-L-세린으로 사용함을 특징으로 하는 제조방법.