JP2002315595A - 非タンパク質ｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
非タンパク質ｌ−アミノ酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 求核性化合物、特に毒性の化合物を高濃度で
使用できる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供
すること 【解決手段】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合
物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの
触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にす
る酵素による生体内変換を用いて非タンパク質Ｌ−アミ
ノ酸を製造する方法において、前記の方法をｐＨ５．０
〜７．４の範囲内のｐＨ値で実施することを特徴とす
る、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
使用できる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供
すること 【解決手段】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合
物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの
触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にす
る酵素による生体内変換を用いて非タンパク質Ｌ−アミ
ノ酸を製造する方法において、前記の方法をｐＨ５．０
〜７．４の範囲内のｐＨ値で実施することを特徴とす
る、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素を用いた生体
内変換による非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法に関
する。
内変換による非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】非タンパク質アミノ酸は、天然において
タンパク質生合成のための成分として使用されずかつ２
０種のタンパク質アミノ酸とは明確に区別される。本発
明の範囲内で、絶対にタンパク質中に現れる極めて希な
アミノ酸のＬ−セレノシステインは、非タンパク質アミ
ノ酸に分類される。
タンパク質生合成のための成分として使用されずかつ２
０種のタンパク質アミノ酸とは明確に区別される。本発
明の範囲内で、絶対にタンパク質中に現れる極めて希な
アミノ酸のＬ−セレノシステインは、非タンパク質アミ
ノ酸に分類される。
【０００３】非タンパク質アミノ酸は、例えば薬理作用
物質及び農薬作用物質の製造のための重要な化合物であ
る。この非タンパク質アミノ酸は、分子の擬態の種類の
作用物質として又は作用物質の一部として天然のアミノ
酸の構造を模倣することができ、それにより例えばレセ
プター相互作用において天然の反応を調節することがで
きる。さらに、この非タンパク質アミノ酸は全く一般的
にキラル化合物としてキラルプール「chiral pool」の
範囲内で合成成分として用いることができる。
物質及び農薬作用物質の製造のための重要な化合物であ
る。この非タンパク質アミノ酸は、分子の擬態の種類の
作用物質として又は作用物質の一部として天然のアミノ
酸の構造を模倣することができ、それにより例えばレセ
プター相互作用において天然の反応を調節することがで
きる。さらに、この非タンパク質アミノ酸は全く一般的
にキラル化合物としてキラルプール「chiral pool」の
範囲内で合成成分として用いることができる。
【０００４】エナンチオマー純粋の形のこの非タンパク
質アミノ酸の今までの製造方法は、大抵は煩雑な合成に
基づいており、この合成はさらに大抵は特定の化合物だ
けを得ることができるにすぎない。出発化合物の簡単な
交換により多様な化合物を製造することができるのはわ
ずかな方法だけである。たいていの場合には、それ自体
大抵すでにキラル成分から出発する化学合成である。他
の方法はラセミ体の化学合成を、頻繁に酵素を用いて実
施するラセミ分割と組み合わせる。
質アミノ酸の今までの製造方法は、大抵は煩雑な合成に
基づいており、この合成はさらに大抵は特定の化合物だ
けを得ることができるにすぎない。出発化合物の簡単な
交換により多様な化合物を製造することができるのはわ
ずかな方法だけである。たいていの場合には、それ自体
大抵すでにキラル成分から出発する化学合成である。他
の方法はラセミ体の化学合成を、頻繁に酵素を用いて実
施するラセミ分割と組み合わせる。
【０００５】その他に、プロキラル化合物から出発し、
非タンパク質アミノ酸のステレオ選択合成を可能にする
若干の酵素による方法も記載されている。
非タンパク質アミノ酸のステレオ選択合成を可能にする
若干の酵素による方法も記載されている。
【０００６】トランスアミナーゼを用いて、α−ケト酸
から、アミノ−ドナーとしてＬ−グルタミン酸を用いて
多様な非タンパク質アミノ酸を製造することができる
（Taylor et al. 1998, TIBTECH 16: 412-418）。他の
方法は、ロイシン−デヒドロゲナーゼを用いたＬ−ｔ−
ロイシンの合成である（Drauz 1997, Chimia 51: 310-3
14）。
から、アミノ−ドナーとしてＬ−グルタミン酸を用いて
多様な非タンパク質アミノ酸を製造することができる
（Taylor et al. 1998, TIBTECH 16: 412-418）。他の
方法は、ロイシン−デヒドロゲナーゼを用いたＬ−ｔ−
ロイシンの合成である（Drauz 1997, Chimia 51: 310-3
14）。
【０００７】微生物を用いた直接発酵による非タンパク
質アミノ酸の製造のための特に簡単な方法は、特許出願
ＤＥ１００４６９３４（同一出願人の２０００年９月２
１日出願）に記載されている。この場合、制限解除され
たシステイン−物質代謝を示し、従って高レベルのＯ−
アセチル−Ｌ−システインを提供する微生物が使用され
る。この化合物はシステイン−物質代謝においてＬ−シ
ステインの生合成前駆体として用いられる。Ｌ−システ
インはβ位のアセテート基をチオール基に置換すること
により生じる。β置換といわれるこの反応は、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ［ＥＣ ４．
２．９９．８］の種類の酵素により触媒される。発酵の
間での特定の種類の化合物（チオール、アゾールもしく
はイソオキサゾリノン）の求核性化合物の添加により、
これらの化合物がβ置換に導入され、非タンパク質Ｌ−
アミノ酸の産生に達する。製造されたアミノ酸のそれぞ
れの基の構造は、従って供給された求核性化合物によっ
て決定される。
質アミノ酸の製造のための特に簡単な方法は、特許出願
ＤＥ１００４６９３４（同一出願人の２０００年９月２
１日出願）に記載されている。この場合、制限解除され
たシステイン−物質代謝を示し、従って高レベルのＯ−
アセチル−Ｌ−システインを提供する微生物が使用され
る。この化合物はシステイン−物質代謝においてＬ−シ
ステインの生合成前駆体として用いられる。Ｌ−システ
インはβ位のアセテート基をチオール基に置換すること
により生じる。β置換といわれるこの反応は、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ［ＥＣ ４．
２．９９．８］の種類の酵素により触媒される。発酵の
間での特定の種類の化合物（チオール、アゾールもしく
はイソオキサゾリノン）の求核性化合物の添加により、
これらの化合物がβ置換に導入され、非タンパク質Ｌ−
アミノ酸の産生に達する。製造されたアミノ酸のそれぞ
れの基の構造は、従って供給された求核性化合物によっ
て決定される。
【０００８】この方法の場合の問題は、供給される求核
性化合物の供給量が高すぎてはならないことである、そ
れというのもこの化合物自体により又は生じたタンパク
質により、微生物の物質代謝に関して毒性の作用を引き
起こしかねないためである。特に多くのチオール化合物
に対してこのことが該当する、それというのも、このチ
オール化合物はレドックス活性物質として比較的高濃度
で毒性を有するためである。さらに、発酵方法にチオー
ル化合物を使用することは極めて問題である、それとい
うのも発酵槽中への強力な通気の際に酸化する傾向があ
り、技術的予防対策なしに著しい臭気が生じるためであ
る。求核性化合物の内でアジ化物又はシアン化物の供給
も、これらの化合物をＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼを用いたβ置換に導入することが公知で
あるが（Flint et al., 1996, J.Biol. Chem. 271:1605
3-16067）、その高い毒性のために不可能である。
性化合物の供給量が高すぎてはならないことである、そ
れというのもこの化合物自体により又は生じたタンパク
質により、微生物の物質代謝に関して毒性の作用を引き
起こしかねないためである。特に多くのチオール化合物
に対してこのことが該当する、それというのも、このチ
オール化合物はレドックス活性物質として比較的高濃度
で毒性を有するためである。さらに、発酵方法にチオー
ル化合物を使用することは極めて問題である、それとい
うのも発酵槽中への強力な通気の際に酸化する傾向があ
り、技術的予防対策なしに著しい臭気が生じるためであ
る。求核性化合物の内でアジ化物又はシアン化物の供給
も、これらの化合物をＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼを用いたβ置換に導入することが公知で
あるが（Flint et al., 1996, J.Biol. Chem. 271:1605
3-16067）、その高い毒性のために不可能である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、求核
性化合物、特に毒性の化合物を高濃度で使用できる非タ
ンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することであっ
た。
性化合物、特に毒性の化合物を高濃度で使用できる非タ
ンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することであっ
た。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記の課題は、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリンを求核性化合物と、Ｏ−アセチル−Ｌ
−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下に反応させ
て非タンパク質アミノ酸にする酵素による生体内変換法
において、ｐＨ値をｐＨ５．０〜７．４の範囲内で実施
することを特徴とする方法より解決される。
チル−Ｌ−セリンを求核性化合物と、Ｏ−アセチル−Ｌ
−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下に反応させ
て非タンパク質アミノ酸にする酵素による生体内変換法
において、ｐＨ値をｐＨ５．０〜７．４の範囲内で実施
することを特徴とする方法より解決される。
【００１１】この方法により、多数の非タンパク質の、
エナンチオマー純粋な、部分的に新規のＬ−アミノ酸を
工業的規模で合成することが可能である。
エナンチオマー純粋な、部分的に新規のＬ−アミノ酸を
工業的規模で合成することが可能である。
【００１２】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼは公知である。これは今まで多様な植物及び微生
物から単離されている。ネズミチフス菌（Salmonella t
yphimurium）の相応する細菌性酵素が最もよく調査され
ている。この生物中では２種のＯ−アセチル−Ｌ−セリ
ン−スルフヒドリラーゼ−酵素が発現し、これらはＯＡ
ＳＳ−ＡもしくはＯＡＳＳ−Ｂと命名されている。この
所属する遺伝子は同様に公知であり、ｃｙｓＫもしくは
ｃｙｓＭの名称を有する。両方の酵素は著しく類似の反
応メカニズムを有するが、アミノ酸配列をベースとする
同一性は４５％にすぎない。
ラーゼは公知である。これは今まで多様な植物及び微生
物から単離されている。ネズミチフス菌（Salmonella t
yphimurium）の相応する細菌性酵素が最もよく調査され
ている。この生物中では２種のＯ−アセチル−Ｌ−セリ
ン−スルフヒドリラーゼ−酵素が発現し、これらはＯＡ
ＳＳ−ＡもしくはＯＡＳＳ−Ｂと命名されている。この
所属する遺伝子は同様に公知であり、ｃｙｓＫもしくは
ｃｙｓＭの名称を有する。両方の酵素は著しく類似の反
応メカニズムを有するが、アミノ酸配列をベースとする
同一性は４５％にすぎない。
【００１３】ＯＡＳＳ−Ｂ（ＣｙｓＭ）は、ＯＡＳＳ−
Ａ（ＣｙｓＫ）とは反対に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
をチオ硫酸塩と反応させてＳ−スルホシステインにする
反応を触媒することができる。この反応は、唯一のイオ
ウ源としてチオ硫酸塩を用いた細菌の成長の際に、重要
な役割を有する。
Ａ（ＣｙｓＫ）とは反対に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
をチオ硫酸塩と反応させてＳ−スルホシステインにする
反応を触媒することができる。この反応は、唯一のイオ
ウ源としてチオ硫酸塩を用いた細菌の成長の際に、重要
な役割を有する。
【００１４】多様な生物からのＯ−アセチル−Ｌ−セリ
ン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の配列比較は、さらに
２種の系統発生的グループが存在することを示している
（Kitabatake et al., 2000, J. Bacteriol. 182:143-1
45）。ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び
大腸菌（Escherichia coli）のＣｙｓＫは他のユーバク
テリウ、メタン生成古細菌及び植物からのＯ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼと一緒に大きなグル
ープを形成する。それに対して、ネズミチフス菌（Salm
onella typhimurium）及び大腸菌（Escherichia coli）
のＣｙｓＭは、超好熱性古細菌（例えば、Pyrococcus,
Sulfolobus, Thermoplasma）からのＯ−アセチル−Ｌ−
セリン−スルフヒドリラーゼと一緒に極めて小さな類縁
グループにある。
ン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の配列比較は、さらに
２種の系統発生的グループが存在することを示している
（Kitabatake et al., 2000, J. Bacteriol. 182:143-1
45）。ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び
大腸菌（Escherichia coli）のＣｙｓＫは他のユーバク
テリウ、メタン生成古細菌及び植物からのＯ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼと一緒に大きなグル
ープを形成する。それに対して、ネズミチフス菌（Salm
onella typhimurium）及び大腸菌（Escherichia coli）
のＣｙｓＭは、超好熱性古細菌（例えば、Pyrococcus,
Sulfolobus, Thermoplasma）からのＯ−アセチル−Ｌ−
セリン−スルフヒドリラーゼと一緒に極めて小さな類縁
グループにある。
【００１５】本発明の範囲内でＯ−アセチル−Ｌ−セリ
ン−スルフヒドリラーゼ（O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydry
lase）は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとスルフィドとか
らのＬ−システインの合成を触媒することができること
を特徴とする。ＣｙｓＭ−類縁の並びにＣｙｓＫ−類縁
の酵素は従って本発明の範囲内でＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−スルフヒドリラーゼである。
ン−スルフヒドリラーゼ（O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydry
lase）は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとスルフィドとか
らのＬ−システインの合成を触媒することができること
を特徴とする。ＣｙｓＭ−類縁の並びにＣｙｓＫ−類縁
の酵素は従って本発明の範囲内でＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−スルフヒドリラーゼである。
【００１６】ＣｙｓＫ−グループのＯ−アセチル−Ｌ−
セリン−スルフヒドリラーゼが比較的広い基質スペクト
ルを有していることが個々の文献（Ikegami & Murakosh
i, 1994, Phytochemistry 35: 1089-1104; Flint et a
l., 1996,J. Biol. Chem. 271:16053-16067）に示され
ているにもかかわらず、今までに、非タンパク質アミノ
酸の産生のための工業的使用の可能性は考慮されていな
かった。
セリン−スルフヒドリラーゼが比較的広い基質スペクト
ルを有していることが個々の文献（Ikegami & Murakosh
i, 1994, Phytochemistry 35: 1089-1104; Flint et a
l., 1996,J. Biol. Chem. 271:16053-16067）に示され
ているにもかかわらず、今までに、非タンパク質アミノ
酸の産生のための工業的使用の可能性は考慮されていな
かった。
【００１７】非タンパク質アミノ酸の酵素による製造の
工業的実現を今まで妨げていた決定的理由は、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの活性範囲に該
当するｐＨ−範囲内でのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの不
安定性にある。
工業的実現を今まで妨げていた決定的理由は、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの活性範囲に該
当するｐＨ−範囲内でのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの不
安定性にある。
【００１８】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンはｐＨに依存し
てＮ−アセチル−Ｌ−セリンに異性化する。この反応
は、不可逆的で、例えば７．６のｐＨ値では１％×ｍｉ
ｎ- １の速度で極端に急速である。この反応速度はｐＨ
値の低下と共に低下するため、この化合物は例えばｐＨ
４．０で安定である。この反応のメカニズムは、アシル
基のカルボニル−炭素での脱プロトンしたアミノ基の分
子内の求核攻撃に基づく（Tai et al. 1995, Biochemis
try 34: 12311-12322）。
てＮ−アセチル−Ｌ−セリンに異性化する。この反応
は、不可逆的で、例えば７．６のｐＨ値では１％×ｍｉ
ｎ- １の速度で極端に急速である。この反応速度はｐＨ
値の低下と共に低下するため、この化合物は例えばｐＨ
４．０で安定である。この反応のメカニズムは、アシル
基のカルボニル−炭素での脱プロトンしたアミノ基の分
子内の求核攻撃に基づく（Tai et al. 1995, Biochemis
try 34: 12311-12322）。
【００１９】それに対して、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値は、ｐＨ８．０の範
囲内にあり（Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemis
try35: 1089-1104; Tai et al.1995, Biochemistry 34:
12311-12322）、従って、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに
関する異性化の範囲内で極めて不利である。
−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値は、ｐＨ８．０の範
囲内にあり（Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemis
try35: 1089-1104; Tai et al.1995, Biochemistry 34:
12311-12322）、従って、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに
関する異性化の範囲内で極めて不利である。
【００２０】この理由から、Ikegami & MurakoshiはＯ
−アセチル−Ｌ−セリン、求核試薬、ピリドオキサルホ
スフェート及び金属イオン（有利にＧａ２＋）を用いる
非タンパク質アミノ酸のバイオミメティック合成を提案
した。この反応は３．５〜５．５のｐＨ範囲内で可能で
あり、従ってＯ−アセチル−Ｌ−セリンの安定性を保障
する。＜４５％の最大収率によりこの方法は有効である
が、しかしながら極めて高くはない。酵素合成と比較し
た著しい欠点は、エナンチオ選択性の欠如である。
−アセチル−Ｌ−セリン、求核試薬、ピリドオキサルホ
スフェート及び金属イオン（有利にＧａ２＋）を用いる
非タンパク質アミノ酸のバイオミメティック合成を提案
した。この反応は３．５〜５．５のｐＨ範囲内で可能で
あり、従ってＯ−アセチル−Ｌ−セリンの安定性を保障
する。＜４５％の最大収率によりこの方法は有効である
が、しかしながら極めて高くはない。酵素合成と比較し
た著しい欠点は、エナンチオ選択性の欠如である。
【００２１】従って、本発明により解決されるもう一つ
の課題は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−安定性と酵素活
性スペクトルとの非相容性にもかかわらず、わずかな異
性化で効果的な酵素転化率（＞＞４５％）を保障する、
エナンチオマー純粋の非タンパク質アミノ酸の酵素を用
いた製造方法を提供することである。
の課題は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−安定性と酵素活
性スペクトルとの非相容性にもかかわらず、わずかな異
性化で効果的な酵素転化率（＞＞４５％）を保障する、
エナンチオマー純粋の非タンパク質アミノ酸の酵素を用
いた製造方法を提供することである。
【００２２】前記の課題は、本発明による方法により解
決される、それというのも、この反応はＯ−アセチル−
Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値を下回っ
て実施され、かつこの酵素は十分に高い量で使用される
ためである。
決される、それというのも、この反応はＯ−アセチル−
Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値を下回っ
て実施され、かつこの酵素は十分に高い量で使用される
ためである。
【００２３】本発明の範囲内で、非タンパク質アミノ酸
の製造のための有利なｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜７．４
のｐＨ範囲である。
の製造のための有利なｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜７．４
のｐＨ範囲である。
【００２４】このｐＨ範囲はｐＨ６．０〜７．１の間に
あるのが特に有利である。
あるのが特に有利である。
【００２５】このｐＨ範囲はｐＨ６．０〜６．９９の間
にあるのがさらに特に有利である。
にあるのがさらに特に有利である。
【００２６】このｐＨ値は酢酸の化学量論的形成にも対
抗するため、能動的ｐＨコントロールにより一定に保持
するのが有利である。能動的ｐＨコントロールは有利に
測定ユニット及び制御ユニットにより達成することがで
き、前記のユニットはｐＨ値が規準値から逸れた場合に
アルカリ液又は酸を供給することにより所望のｐＨ値に
調整する。
抗するため、能動的ｐＨコントロールにより一定に保持
するのが有利である。能動的ｐＨコントロールは有利に
測定ユニット及び制御ユニットにより達成することがで
き、前記のユニットはｐＨ値が規準値から逸れた場合に
アルカリ液又は酸を供給することにより所望のｐＨ値に
調整する。
【００２７】今まで、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼを用いた非タンパク質アミノ酸の合成の
ための文献に記載された反応は、本発明による方法とは
反対に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラー
ゼの最適ｐＨ値の範囲内で、能動的ｐＨコントロールな
しで単に分析的規模で実施された。さらに、例外なくＣ
ｙｓＫ−酵素の系統分類グループの酵素を使用してい
た。
フヒドリラーゼを用いた非タンパク質アミノ酸の合成の
ための文献に記載された反応は、本発明による方法とは
反対に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラー
ゼの最適ｐＨ値の範囲内で、能動的ｐＨコントロールな
しで単に分析的規模で実施された。さらに、例外なくＣ
ｙｓＫ−酵素の系統分類グループの酵素を使用してい
た。
【００２８】従って、本発明は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質
Ｌ−アミノ酸にする非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方
法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼとしてＣｙｓＭを使用する方法にも関する。
リンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質
Ｌ−アミノ酸にする非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方
法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼとしてＣｙｓＭを使用する方法にも関する。
【００２９】この酵素の十分に高い用量は、酵素反応の
最適ｐＨ値の範囲外でも十分な転化反応が行われること
を保障する。このような酵素濃度は本発明にとって、Ｏ
−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの体積活
性ＡＣｙｓがバッチ中で少なくとも２ユニット／ｍｌで
ある場合に特に有利である。２〜２００ユニット／ｍｌ
の活性が特に有利である。この活性測定は例３に記載さ
れた試験によって行った。
最適ｐＨ値の範囲外でも十分な転化反応が行われること
を保障する。このような酵素濃度は本発明にとって、Ｏ
−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの体積活
性ＡＣｙｓがバッチ中で少なくとも２ユニット／ｍｌで
ある場合に特に有利である。２〜２００ユニット／ｍｌ
の活性が特に有利である。この活性測定は例３に記載さ
れた試験によって行った。
【００３０】本発明による方法の展開において、Ｃｙｓ
Ｍ−酵素の系統的グループからのＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−スルフヒドリラーゼも、非タンパク質アミノ酸の
製造のための優れた酵素であることが観察される。基質
として適した求核試薬のスペクトルはＣｙｓＫ−酵素の
スペクトルよりもさらに広いことが意想外であった。
Ｍ−酵素の系統的グループからのＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−スルフヒドリラーゼも、非タンパク質アミノ酸の
製造のための優れた酵素であることが観察される。基質
として適した求核試薬のスペクトルはＣｙｓＫ−酵素の
スペクトルよりもさらに広いことが意想外であった。
【００３１】本発明の特に有利な実施態様においてこの
酵素反応は連続的方法として運転される。この場合、反
応の間に持続的にＯ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ及び求核試薬を
供給し、同時にバッチから非タンパク質Ｌ−アミノ酸を
含む溶液（生成物溶液）を取り出す。この取り出しは有
利に反応バッチ中の体積は変化しないように行うのが有
利である。この方法の特別な利点は、流量の平衡が調整
されるため、バッチ中にはＯ−アセチル−Ｌ−セリンの
持続的に低い濃度が存在し、従って異性化は回避され
る。バッチ中で＜１．０ｇ／ｌのＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−濃度を調整するのが有利である。この値は、溶液
の反応バッチ中での平均滞留時間のバリエーションによ
って制御することができる。連続的反応のためのＯ−ア
セチル−Ｌ−セリンの貯蔵は、十分な安定性を保障する
ために酸性のｐＨ値下に、有利にｐＨ４〜５に保持され
る。
酵素反応は連続的方法として運転される。この場合、反
応の間に持続的にＯ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ及び求核試薬を
供給し、同時にバッチから非タンパク質Ｌ−アミノ酸を
含む溶液（生成物溶液）を取り出す。この取り出しは有
利に反応バッチ中の体積は変化しないように行うのが有
利である。この方法の特別な利点は、流量の平衡が調整
されるため、バッチ中にはＯ−アセチル−Ｌ−セリンの
持続的に低い濃度が存在し、従って異性化は回避され
る。バッチ中で＜１．０ｇ／ｌのＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−濃度を調整するのが有利である。この値は、溶液
の反応バッチ中での平均滞留時間のバリエーションによ
って制御することができる。連続的反応のためのＯ−ア
セチル−Ｌ−セリンの貯蔵は、十分な安定性を保障する
ために酸性のｐＨ値下に、有利にｐＨ４〜５に保持され
る。
【００３２】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは今までＬ−セ
リンのアセチル化による化学合成から得られており、高
いＬ−セリン価格によって高価であった。２００１年２
月１５日出願の同一出願人の出願明細書ＤＥ１０１０７
００２は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵による製造
方法を記載している。従って、コストの低い製造システ
ムは使用可能であるが、発酵ブイヨンから生成物の単離
はＯ−アセチル−Ｌ−セリンの不安定性に基づき問題で
あった。
リンのアセチル化による化学合成から得られており、高
いＬ−セリン価格によって高価であった。２００１年２
月１５日出願の同一出願人の出願明細書ＤＥ１０１０７
００２は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵による製造
方法を記載している。従って、コストの低い製造システ
ムは使用可能であるが、発酵ブイヨンから生成物の単離
はＯ−アセチル−Ｌ−セリンの不安定性に基づき問題で
あった。
【００３３】本発明の利点は、例えばＤＥ１０１０７０
０２により実施された発酵から得られたＯ−アセチル−
Ｌ−セリン含有発酵ブイヨンを、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リン−供給源として直接本発明による方法に使用するこ
とができることである。この方法は特に経済的であり、
不安定な化合物の単離を回避できる。
０２により実施された発酵から得られたＯ−アセチル−
Ｌ−セリン含有発酵ブイヨンを、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リン−供給源として直接本発明による方法に使用するこ
とができることである。この方法は特に経済的であり、
不安定な化合物の単離を回避できる。
【００３４】非タンパク質アミノ酸の合成のためのＯ−
アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの製造は、
有利に、当業者に周知であるような通常の組換えＤＮＡ
技術を用いて行われる。
アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの製造は、
有利に、当業者に周知であるような通常の組換えＤＮＡ
技術を用いて行われる。
【００３５】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼをコードする遺伝子は、このため適当なベクター
中にクローニングされ、引き続き適当な宿主を形質転換
する。宿主として、組換えＤＮＡ技術に用いられる各微
生物及び組換えタンパク質の発酵による製造のために適
した各微生物が適している。
ラーゼをコードする遺伝子は、このため適当なベクター
中にクローニングされ、引き続き適当な宿主を形質転換
する。宿主として、組換えＤＮＡ技術に用いられる各微
生物及び組換えタンパク質の発酵による製造のために適
した各微生物が適している。
【００３６】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼの製造のために有利な微生物は大腸菌（Escheric
hia coli）である。
ラーゼの製造のために有利な微生物は大腸菌（Escheric
hia coli）である。
【００３７】原則として、組換えＯ−アセチル−Ｌ−セ
リン−スルフヒドリラーゼ遺伝子の染色体挿入並びに自
己複製性のプラスミドベクターに関する使用も可能であ
る。
リン−スルフヒドリラーゼ遺伝子の染色体挿入並びに自
己複製性のプラスミドベクターに関する使用も可能であ
る。
【００３８】クローニングの際に、すでに、Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の制御さ
れた著しく誘導可能な発現を可能にする遺伝的要素（例
えば調節可能なプロモータ、ターミネータ）を有するベ
クターを使用するのが有利である。高いコピー数を有す
るプラスミド−ベクター、例えばEschericia coliベク
ターｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４及び
これらの誘導体が特に有利である。著しく誘導可能なプ
ロモータとして、例えばｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ
−、ｌａｍｂｄａ ＰＬ、ａｒａ−又はｔｅｔ−プロモ
ータが適している。
ル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の制御さ
れた著しく誘導可能な発現を可能にする遺伝的要素（例
えば調節可能なプロモータ、ターミネータ）を有するベ
クターを使用するのが有利である。高いコピー数を有す
るプラスミド−ベクター、例えばEschericia coliベク
ターｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４及び
これらの誘導体が特に有利である。著しく誘導可能なプ
ロモータとして、例えばｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ
−、ｌａｍｂｄａ ＰＬ、ａｒａ−又はｔｅｔ−プロモ
ータが適している。
【００３９】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼの産生は例えば組換え微生物株の培養により発酵
によって行う。この場合、当業者に公知の培養方法が適
用され、この際、このプロセスパラメータはそれぞれの
微生物株に適合させなければならない。培養基として、
完全培地並びに最少培地を使用することができる。バッ
チプロセス並びにフィードバッチプロセス（fed-batch-
Prozess）を適用することができる。誘導可能なプロモ
ータ系を使用する場合、適当な時点でＯ−アセチル−Ｌ
−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の発現が、相応
するインダクタの添加によりスイッチオンされる。十分
な産生期間の後に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフ
ヒドリラーゼ含有細胞は公知の方法（遠心分離）によっ
て収穫される。
ラーゼの産生は例えば組換え微生物株の培養により発酵
によって行う。この場合、当業者に公知の培養方法が適
用され、この際、このプロセスパラメータはそれぞれの
微生物株に適合させなければならない。培養基として、
完全培地並びに最少培地を使用することができる。バッ
チプロセス並びにフィードバッチプロセス（fed-batch-
Prozess）を適用することができる。誘導可能なプロモ
ータ系を使用する場合、適当な時点でＯ−アセチル−Ｌ
−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の発現が、相応
するインダクタの添加によりスイッチオンされる。十分
な産生期間の後に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフ
ヒドリラーゼ含有細胞は公知の方法（遠心分離）によっ
て収穫される。
【００４０】この方法により製造されたＯ−アセチル−
Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−酵素はタンパク質精
製の通常の方法によって単離することができる。この場
合、典型的な方法（例えば、沈殿、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電
点電気泳動）も使用可能であり並びに「アフィニティタ
グ（Affinitaetstags）」の使用下での近代的なアフィ
ニティークロマトグラフィーも使用可能である。このア
フィニティ付加物をコードする配列は、遺伝子のクロー
ニングの際にコードされる領域と融合されていてもよ
く、その結果、相応するアフィニティ付加物を有する誘
導タンパク質が得られる。これは次いで１工程精製（Ei
n-Schritt-Reinigung）において単離される。アフィニ
ティ付加物とアフィニティ精製との適当な組合せの例
は、ＳｔｒｅｐＴａｇとストレプトアビジン−アフィニ
ティクロマトグラフィーとの組合せであり、IBA, Goett
ingen,Dにより市販されている。
Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−酵素はタンパク質精
製の通常の方法によって単離することができる。この場
合、典型的な方法（例えば、沈殿、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電
点電気泳動）も使用可能であり並びに「アフィニティタ
グ（Affinitaetstags）」の使用下での近代的なアフィ
ニティークロマトグラフィーも使用可能である。このア
フィニティ付加物をコードする配列は、遺伝子のクロー
ニングの際にコードされる領域と融合されていてもよ
く、その結果、相応するアフィニティ付加物を有する誘
導タンパク質が得られる。これは次いで１工程精製（Ei
n-Schritt-Reinigung）において単離される。アフィニ
ティ付加物とアフィニティ精製との適当な組合せの例
は、ＳｔｒｅｐＴａｇとストレプトアビジン−アフィニ
ティクロマトグラフィーとの組合せであり、IBA, Goett
ingen,Dにより市販されている。
【００４１】本発明による方法において、Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは精製された形で使
用することができる。溶液中での反応の他に、酵素を担
体へ固定することも可能である。相応する方法は先行技
術である。
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは精製された形で使
用することができる。溶液中での反応の他に、酵素を担
体へ固定することも可能である。相応する方法は先行技
術である。
【００４２】しかしながら、非タンパク質アミノ酸の製
造のためのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラ
ーゼの単離は必須ではない。同様に、Ｏ−アセチル−Ｌ
−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性を有する微生物細
胞を本発明による方法に直接使用することも可能であ
る。このような微生物株の例は、大腸菌（Escherichiac
oli）株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５及びＢＬＲ２１（ＤＥ
３）／ｐＬＥ４である。これらは実施例１及び２に記載
されており、ブラウンシュバイクのドイツ微生物及び細
胞培養のための寄託機関ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung
fuer Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ in Bra
unschweig）に寄託番号ＤＳＭ１４０８８及び１４０８
９のもとで寄託されている。
造のためのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラ
ーゼの単離は必須ではない。同様に、Ｏ−アセチル−Ｌ
−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性を有する微生物細
胞を本発明による方法に直接使用することも可能であ
る。このような微生物株の例は、大腸菌（Escherichiac
oli）株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５及びＢＬＲ２１（ＤＥ
３）／ｐＬＥ４である。これらは実施例１及び２に記載
されており、ブラウンシュバイクのドイツ微生物及び細
胞培養のための寄託機関ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung
fuer Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ in Bra
unschweig）に寄託番号ＤＳＭ１４０８８及び１４０８
９のもとで寄託されている。
【００４３】本発明による方法のこの変法において、Ｏ
−アセチル−Ｌ−セリンの非タンパク質Ｌ−アミノ酸へ
の生体内変換は休止細胞を用いて行う。Ｏ−アセチル−
Ｌ−セリン及び求核性化合物の細胞への侵入は、この場
合、反応生成物の非タンパク質Ｌ−アミノ酸の放出と同
様に細胞を通して行われる。
−アセチル−Ｌ−セリンの非タンパク質Ｌ−アミノ酸へ
の生体内変換は休止細胞を用いて行う。Ｏ−アセチル−
Ｌ−セリン及び求核性化合物の細胞への侵入は、この場
合、反応生成物の非タンパク質Ｌ−アミノ酸の放出と同
様に細胞を通して行われる。
【００４４】所望の場合には、細胞の易透化を引き起こ
す物質で細胞を処理することにより、細胞内部と反応媒
体との間の物質代謝を高めることができる。このような
物質は、例えばクロロホルム又はトルエンであり、この
使用は当業者に公知である。
す物質で細胞を処理することにより、細胞内部と反応媒
体との間の物質代謝を高めることができる。このような
物質は、例えばクロロホルム又はトルエンであり、この
使用は当業者に公知である。
【００４５】この方法の有利な実施態様において、非タ
ンパク質アミノ酸を、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼの触媒作用下でＯ−アセチル−Ｌ−セリ
ンと求核性化合物との反応により生成し、その際、Ｏ−
アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは微生物の
細胞内に存在する。
ンパク質アミノ酸を、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スル
フヒドリラーゼの触媒作用下でＯ−アセチル−Ｌ−セリ
ンと求核性化合物との反応により生成し、その際、Ｏ−
アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは微生物の
細胞内に存在する。
【００４６】発酵により得られる精製されていないＯ−
アセチル−Ｌ−セリンを、求核性化合物と、Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼによる触媒作用下
で反応させることによる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製
造は特に有利であり、その際、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリ
ン−スルフヒドリラーゼは微生物の細胞内に存在する。
アセチル−Ｌ−セリンを、求核性化合物と、Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼによる触媒作用下
で反応させることによる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製
造は特に有利であり、その際、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリ
ン−スルフヒドリラーゼは微生物の細胞内に存在する。
【００４７】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼにより触媒されるβ−置換のための求核性化合物
として、本発明による方法において、次のグループ：
ラーゼにより触媒されるβ−置換のための求核性化合物
として、本発明による方法において、次のグループ：
【００４８】
【化６】
【００４９】から選択される基を有する有利な化合物が
使用される。
使用される。
【００５０】反応バッチに、次の化合物 − チオ硫酸塩 − 一般式（１） Ｈ−Ｓ−Ｒ１ （１） ［式中、Ｒ１は、１〜１５個のＣ原子を有する一価の置
換又は非置換のアルキル基、アルコキシ基、アリール基
又はヘテロアリール基を表す］のチオール − セレニド − 一般式（２） Ｈ−Ｓｅ−Ｒ１ （２） ［式中、Ｒ１は式（１）に記載した意味を表す］のセレ
ノール − アジ化物 − シアン化物 − 一般式（３）又は（４）
換又は非置換のアルキル基、アルコキシ基、アリール基
又はヘテロアリール基を表す］のチオール − セレニド − 一般式（２） Ｈ−Ｓｅ−Ｒ１ （２） ［式中、Ｒ１は式（１）に記載した意味を表す］のセレ
ノール − アジ化物 − シアン化物 − 一般式（３）又は（４）
【００５１】
【化７】
【００５２】［式中、Ｘ及びＹは同じ又は異なり、ＣＲ
４又はＮを表し、Ｒ４は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−
ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３ -、−Ｆ、−Ｃ
ｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、Ｃ１〜Ｃ５−アルキルカルボニル−
並びにそのエステル、アミド又は塩又はＲ１を表し、Ｒ
１は式（１）について挙げられた意味を表し、Ｒ２及び
Ｒ３は同じ又は異なり、Ｒ４を表すか、又は式（４）中
のＣ１及びＣ２はＲ２又はＲ３の置換基の代わりに架橋
［−ＣＲ５Ｒ６−］ａによって環を形成するように結合
しており、その際、ａは１、２、３又は４を表し、Ｒ５
及びＲ６は同じ又は異なり、Ｒ４を表し、１個又は数個
の隣接しない基［−ＣＲ５Ｒ６−］は酸素、硫黄又は場
合によりＣ１〜Ｃ５アルキル置換されたイミノ基により
置換されていてもよくかつ２個の隣接する基［−ＣＲ５
Ｒ６−］は基［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］又は基［−ＣＲ５
＝Ｎ−］により置き換えられていてもよい］のアゾール − 一般式（５）又は（６）
４又はＮを表し、Ｒ４は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−
ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３ -、−Ｆ、−Ｃ
ｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、Ｃ１〜Ｃ５−アルキルカルボニル−
並びにそのエステル、アミド又は塩又はＲ１を表し、Ｒ
１は式（１）について挙げられた意味を表し、Ｒ２及び
Ｒ３は同じ又は異なり、Ｒ４を表すか、又は式（４）中
のＣ１及びＣ２はＲ２又はＲ３の置換基の代わりに架橋
［−ＣＲ５Ｒ６−］ａによって環を形成するように結合
しており、その際、ａは１、２、３又は４を表し、Ｒ５
及びＲ６は同じ又は異なり、Ｒ４を表し、１個又は数個
の隣接しない基［−ＣＲ５Ｒ６−］は酸素、硫黄又は場
合によりＣ１〜Ｃ５アルキル置換されたイミノ基により
置換されていてもよくかつ２個の隣接する基［−ＣＲ５
Ｒ６−］は基［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］又は基［−ＣＲ５
＝Ｎ−］により置き換えられていてもよい］のアゾール − 一般式（５）又は（６）
【００５３】
【化８】
【００５４】［式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はすでに
記載した意味を表し、式（６）中のＣ １及びＣ２は置換
基Ｒ２及びＲ３の代わりに式（４）について定義された
架橋を用いて１つの環を形成するように結合していても
よい］のイソキサゾリンノンのグループから選択される
求核性化合物を添加するのが特に有利である。
記載した意味を表し、式（６）中のＣ １及びＣ２は置換
基Ｒ２及びＲ３の代わりに式（４）について定義された
架橋を用いて１つの環を形成するように結合していても
よい］のイソキサゾリンノンのグループから選択される
求核性化合物を添加するのが特に有利である。
【００５５】チオ硫酸塩の例は、チオ硫酸ナトリウム、
チオ硫酸カリウム又はチオ硫酸アンモニウムである。
チオ硫酸カリウム又はチオ硫酸アンモニウムである。
【００５６】チオールの例は、２−メルカプトエタノー
ル、３−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロ
ピオン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、
メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルア
ミン、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオ酢酸、メルカ
プトコハク酸、メルカプトピルビン酸、ジチオトレイト
ール、ジチオエリトリトール、１−チオグリセリン、チ
オフェノール、４−フルオロチオフェノール、４−クロ
ロチオフェノール、４−メルカプトフェノール、ｐ−チ
オクレゾール、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、２−メ
ルカプトチアゾール、２−メルカプトチアゾリン、２−
メルカプトイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４
−チアゾール、２−チオフェンチオール、２−メルカプ
トピリジン、２−メルカプトピリミジン、２−チオシト
シン、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプト−１
−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンゾチアゾー
ル、２−メルカプトベンゾオキサゾール、６−メルカプ
トプリンのグループから選択される化合物である。
ル、３−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロ
ピオン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、
メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルア
ミン、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオ酢酸、メルカ
プトコハク酸、メルカプトピルビン酸、ジチオトレイト
ール、ジチオエリトリトール、１−チオグリセリン、チ
オフェノール、４−フルオロチオフェノール、４−クロ
ロチオフェノール、４−メルカプトフェノール、ｐ−チ
オクレゾール、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、２−メ
ルカプトチアゾール、２−メルカプトチアゾリン、２−
メルカプトイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４
−チアゾール、２−チオフェンチオール、２−メルカプ
トピリジン、２−メルカプトピリミジン、２−チオシト
シン、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプト−１
−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンゾチアゾー
ル、２−メルカプトベンゾオキサゾール、６−メルカプ
トプリンのグループから選択される化合物である。
【００５７】セレノールの例は、メチルセレノール、エ
チルセレノール、プロピルセレノール、フェニルセレノ
ールのグループから選択される化合物である。
チルセレノール、プロピルセレノール、フェニルセレノ
ールのグループから選択される化合物である。
【００５８】アジ化物の例は、アジ化ナトリウム、アジ
化カリウム又はアジ化アンモニウムである。
化カリウム又はアジ化アンモニウムである。
【００５９】シアン化物の例は、シアン化カリウム、シ
アン化ナトリウム又はシアン化アンモニウムである。
アン化ナトリウム又はシアン化アンモニウムである。
【００６０】アゾールの例は、１，２−ピラゾール、３
−メチルピラゾール、４−メチルピラゾール、３，５−
ジメチルピラゾール、３−アミノピラゾール、４−アミ
ノピラゾール、ピラゾール−４−カルボン酸、ピラゾー
ル−３，５−ジカルボン酸、１，２，３−トリアゾー
ル、１，２，４−トリアゾール、３−アミノ−１，２，
４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、イ
ンダゾール、インダゾール−３−カルボン酸、インダゾ
ール−５−カルボン酸、５−アミノインダゾール、ベン
ゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−５−カルボン
酸、５−アミノベンゾトリアゾール、アミノピラゾロピ
リミジン、８−アザグアニジン、８−アザアデニンのグ
ループから選択される化合物である。
−メチルピラゾール、４−メチルピラゾール、３，５−
ジメチルピラゾール、３−アミノピラゾール、４−アミ
ノピラゾール、ピラゾール−４−カルボン酸、ピラゾー
ル−３，５−ジカルボン酸、１，２，３−トリアゾー
ル、１，２，４−トリアゾール、３−アミノ−１，２，
４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、イ
ンダゾール、インダゾール−３−カルボン酸、インダゾ
ール−５−カルボン酸、５−アミノインダゾール、ベン
ゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−５−カルボン
酸、５−アミノベンゾトリアゾール、アミノピラゾロピ
リミジン、８−アザグアニジン、８−アザアデニンのグ
ループから選択される化合物である。
【００６１】イソオキサゾリノンの例は、イソオキサゾ
リン−５−オン、３−メチルイソオキサゾリン−５−オ
ン、４−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４，５−
ジメチルイソオキサゾリン−２−オン、１，２，４−オ
キサジアゾリジン−３，５−ジオンのグループから選択
される化合物である。
リン−５−オン、３−メチルイソオキサゾリン−５−オ
ン、４−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４，５−
ジメチルイソオキサゾリン−２−オン、１，２，４−オ
キサジアゾリジン−３，５−ジオンのグループから選択
される化合物である。
【００６２】求核性化合物の濃度はバッチ中で有利に、
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンと等モル濃度で存在するよう
に選択される。
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンと等モル濃度で存在するよう
に選択される。
【００６３】反応温度は有利に５℃〜７０℃に選択され
る。特に有利な温度範囲は２０℃〜４０℃である。
る。特に有利な温度範囲は２０℃〜４０℃である。
【００６４】反応のための溶剤として有利に水が使用さ
れる。
れる。
【００６５】反応生成物として、有利にＬ配置の一般式
（７）
（７）
【００６６】
【化９】
【００６７】［式中、Ｚは次の式（８）〜（１９）
【００６８】
【化１０】
【００６９】並びにそのエステル、エーテル又は塩から
選択される一価の基を表し、及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ
４、Ｘ及びＹはすでに式（１）〜（６）に挙げられた意
味を表す］のＬ−アミノ酸が生成される。
選択される一価の基を表し、及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ
４、Ｘ及びＹはすでに式（１）〜（６）に挙げられた意
味を表す］のＬ−アミノ酸が生成される。
【００７０】可溶性の非タンパク質Ｌ−アミノ酸は本発
明による方法の完了後及び有利に水溶液の分離後にバイ
オマス及び培養上澄液中で公知の方法を用いて培養上澄
液から単離される。このようなアミノ酸の単離のための
方法は同様に当業者に公知である。この方法は例えば濾
過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフ
ィー、沈殿、晶出である。難溶性の非タンパク質アミノ
酸が存在する場合に、有利に、当業者に公知のような慣
用の遠心分離が実施され、その際、バイオマスはできる
限り遠心分離上澄液中に残留する。分離された生成物は
有利に慣用の方法により溶解及び再沈殿させる。
明による方法の完了後及び有利に水溶液の分離後にバイ
オマス及び培養上澄液中で公知の方法を用いて培養上澄
液から単離される。このようなアミノ酸の単離のための
方法は同様に当業者に公知である。この方法は例えば濾
過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフ
ィー、沈殿、晶出である。難溶性の非タンパク質アミノ
酸が存在する場合に、有利に、当業者に公知のような慣
用の遠心分離が実施され、その際、バイオマスはできる
限り遠心分離上澄液中に残留する。分離された生成物は
有利に慣用の方法により溶解及び再沈殿させる。
【００７１】
【実施例】次の実施例は、本発明をさらに詳説するため
に用いられる。
に用いられる。
【００７２】例１：ＳｔｒｅｐＴａｇ−配列を有する融
合遺伝子としての大腸菌からのｃｙｓＫ−遺伝子もしく
はｃｙｓＭ−遺伝子のクローニング 大腸菌からのｃｙｓＫ−遺伝子もしくはｃｙｓＭ−遺伝
子のクローニングのために、まずＰｗｏ−ＤＮＡ−ポリ
メラーゼを用いて次のホスホロチオエート保護したオリ
ゴヌクレオチド−プライマー−ペアのポリメラーゼ連鎖
反応を実施した。
合遺伝子としての大腸菌からのｃｙｓＫ−遺伝子もしく
はｃｙｓＭ−遺伝子のクローニング 大腸菌からのｃｙｓＫ−遺伝子もしくはｃｙｓＭ−遺伝
子のクローニングのために、まずＰｗｏ−ＤＮＡ−ポリ
メラーゼを用いて次のホスホロチオエート保護したオリ
ゴヌクレオチド−プライマー−ペアのポリメラーゼ連鎖
反応を実施した。
【００７３】
【外１】
【００７４】この場合、プライマー配列を介して制限エ
ンドヌクレアーゼＢｓａＩ（下線のヌクレオチド）のた
めの切断箇所を導入した。鋳型として、E. coli W3110
（ATTC 27325）の染色体ＤＮＡを用いた。得られた増幅
物を制限酵素ＢｓａＩを用いて消化し、引き続きＥｃｏ
３１Ｉ−処理したベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３（instit
ut fuer Bioanalytik, Goettingen, D）中にクローニン
グした。このベクターは、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの名称
のアフィニティペプチド（WSHPQFEK 配列番号５）をコ
ードする配列を３′末端に遺伝子融合物としてクローニ
ングすることができる。ｔｅｔ−プロモータを用いたこ
の遺伝子融合物の発現はＣ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ−
付属遺伝子を有するタンパク質を生じる。後者はタンパ
ク質の単離のために利用することができる、それという
のもＳｔｒｅｐＴａｇＩＩはストレプトアビジン−カラ
ムへの結合を媒介するためである。
ンドヌクレアーゼＢｓａＩ（下線のヌクレオチド）のた
めの切断箇所を導入した。鋳型として、E. coli W3110
（ATTC 27325）の染色体ＤＮＡを用いた。得られた増幅
物を制限酵素ＢｓａＩを用いて消化し、引き続きＥｃｏ
３１Ｉ−処理したベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３（instit
ut fuer Bioanalytik, Goettingen, D）中にクローニン
グした。このベクターは、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの名称
のアフィニティペプチド（WSHPQFEK 配列番号５）をコ
ードする配列を３′末端に遺伝子融合物としてクローニ
ングすることができる。ｔｅｔ−プロモータを用いたこ
の遺伝子融合物の発現はＣ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ−
付属遺伝子を有するタンパク質を生じる。後者はタンパ
ク質の単離のために利用することができる、それという
のもＳｔｒｅｐＴａｇＩＩはストレプトアビジン−カラ
ムへの結合を媒介するためである。
【００７５】例２：ＣｙｓＫタンパク質もしくはＣｙｓ
Ｍタンパク質の精製 ｃｙｓＭ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−構築物（ｐＦＬ１４５）
を用いてE. coli株ＤＨ５α（Clonetech, Heidelberg,
D）中で著しく良好な遺伝子発現を行うことができた。
この場合、培養及び発現はInstitut fuer Bioanalytik
社, Goettingen,Dの指示に従って実施した。株ＤＨ５α
／ｐＦＬ１４５はドイツ微生物及び細胞培養の寄託機関
（ＤＳＭＺ）にブタペスト条約に従い、寄託番号ＤＳＭ
Ｚ１４０８８で寄託されている。ｃｙｓＫ−Ｓｔｒｅｐ
Ｔａｇ−構築物（ｐＬＥ１）の場合にはそれに対してこ
の発現は著しく弱い。ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−フラ
グメントとしての遺伝子融合物をＴ７−プロモータ（ｐ
ＲＳＥＴ５ａ）（Stratagene, Heidelberg, D）を有す
るベクター中へ再クローニングし、株ＢＬＲ２１（ＤＥ
３）（Novagen, Darmstadt, D）中での発現により、こ
の場合（ｐＬＥ４）に遺伝子産物の良好な形成が達成さ
れた。株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）／ｐＬＥ４はドイツ微生
物及び細胞培養の寄託機関（ＤＳＭＺ）にブタペスト条
約に従い、寄託番号ＤＳＭＺ１４０８９で寄託されてい
る。ＣｙｓＫタンパク質もしくはＣｙｓＭタンパク質の
単離は、ストレプトアビジンカラムを用いたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより行い、その際、原則として
Institut fuer Bioanalytik社,Goettingen, Dの製造元
の指示に従って方法を実施した。収量は培養２５０ｍｌ
を使用した場合、精製されたＣｙｓＫタンパク質３ｍｇ
もしくは精製されたＣｙｓＭタンパク質４．５ｍｇであ
った。両方のタンパク質はピリドオキサルホスフェート
−コファクターに基づき、明らかに黄色の呈色を生じ、
４２０ｎｍでの最大吸光を示した。
Ｍタンパク質の精製 ｃｙｓＭ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−構築物（ｐＦＬ１４５）
を用いてE. coli株ＤＨ５α（Clonetech, Heidelberg,
D）中で著しく良好な遺伝子発現を行うことができた。
この場合、培養及び発現はInstitut fuer Bioanalytik
社, Goettingen,Dの指示に従って実施した。株ＤＨ５α
／ｐＦＬ１４５はドイツ微生物及び細胞培養の寄託機関
（ＤＳＭＺ）にブタペスト条約に従い、寄託番号ＤＳＭ
Ｚ１４０８８で寄託されている。ｃｙｓＫ−Ｓｔｒｅｐ
Ｔａｇ−構築物（ｐＬＥ１）の場合にはそれに対してこ
の発現は著しく弱い。ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−フラ
グメントとしての遺伝子融合物をＴ７−プロモータ（ｐ
ＲＳＥＴ５ａ）（Stratagene, Heidelberg, D）を有す
るベクター中へ再クローニングし、株ＢＬＲ２１（ＤＥ
３）（Novagen, Darmstadt, D）中での発現により、こ
の場合（ｐＬＥ４）に遺伝子産物の良好な形成が達成さ
れた。株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）／ｐＬＥ４はドイツ微生
物及び細胞培養の寄託機関（ＤＳＭＺ）にブタペスト条
約に従い、寄託番号ＤＳＭＺ１４０８９で寄託されてい
る。ＣｙｓＫタンパク質もしくはＣｙｓＭタンパク質の
単離は、ストレプトアビジンカラムを用いたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより行い、その際、原則として
Institut fuer Bioanalytik社,Goettingen, Dの製造元
の指示に従って方法を実施した。収量は培養２５０ｍｌ
を使用した場合、精製されたＣｙｓＫタンパク質３ｍｇ
もしくは精製されたＣｙｓＭタンパク質４．５ｍｇであ
った。両方のタンパク質はピリドオキサルホスフェート
−コファクターに基づき、明らかに黄色の呈色を生じ、
４２０ｎｍでの最大吸光を示した。
【００７６】例３：酵素活性の測定 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの活性
の測定は、「天然の」反応生成物Ｌ−システイン（Ｃｙ
ｓ）の検出により行うか又はＣｙｓＭの場合には他にＳ
−スルホ−Ｌ−システイン（Ｓ−Ｃｙｓ）として行っ
た。両方の生成物は、著しく特異的にかつ著しく敏感に
Gaitonde（1967, Biochem. J. 104: 627-633）による試
験を用いて測定される。両方の化合物に対して、別々の
検量線を記録した、それというのもスルホシステインを
用いた着色複合体は僅かな強度を有するためである。
の測定は、「天然の」反応生成物Ｌ−システイン（Ｃｙ
ｓ）の検出により行うか又はＣｙｓＭの場合には他にＳ
−スルホ−Ｌ−システイン（Ｓ−Ｃｙｓ）として行っ
た。両方の生成物は、著しく特異的にかつ著しく敏感に
Gaitonde（1967, Biochem. J. 104: 627-633）による試
験を用いて測定される。両方の化合物に対して、別々の
検量線を記録した、それというのもスルホシステインを
用いた着色複合体は僅かな強度を有するためである。
【００７７】一般的な試験バッチは、Ｏ−アセチル−Ｌ
−セリン（ナトリウム−スクシネート−緩衝液５００ｍ
Ｍ中の株溶液２００ｍＭからの添加物、ｐＨ５．５）１
０ｍＭ、硫化ナトリウム又はチオ硫酸ナトリウム１０ｍ
Ｍ、カリウム−ホスフェート−緩衝液（ｐＨ７．０）１
００ｍＭ、精製された酵素５μｇ／ｍｌを含有し、これ
を３７℃でインキュベートした。特異的活性Ａをユニッ
ト／ｍｇタンパク質で表示し、つまりμｍｏｌ産物×ｍ
ｉｎ- １×ｍｇ- １タンパク質で表示した。ＡＣ ｙｓはス
ルフィドを用いたシステイン形成の特異的活性を意味す
る。ＡＳ - Ｃｙ ｓはチオ硫酸塩を用いたＳ−スルホ−シ
ステイン形成の特異的活性を意味する。例２中で単離さ
れたタンパク質を用いるこの特異的活性は次のようであ
った： ＣｙｓＫ：ＡＣｙｓ １４０ユニット／ｍｇ ＣｙｓＭ：ＡＣｙｓ １９９ユニット／ｍｇ ＣｙｓＭ：ＡＳ - Ｃｙｓ １４５ユニット／ｍｇ 休止細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼの活性を測定する場合、まず、２０．０の光学密
度（６００ｎｍで測定）を有する細胞懸濁液を調整し
た。引き続き、この細胞をクロロホルムの添加により１
０体積％まで浸透させ、室温で５分間インキュベートし
た。次いで酵素の対して１．０の光学密度を調整し、細
胞を用いて上記したようにＯ−アセチル−Ｌ−セリン及
びスルフィドもしくはチオ硫酸塩との反応を実施した。
この細胞の特異的活性Ａはこの場合μｍｏｌ×ｍｉｎ-
１（６００ｎｍで１．０の光学密度を有する細胞懸濁液
ｍｌ）；短縮形：ユニット／ｍｌ ＯＤで示した。
−セリン（ナトリウム−スクシネート−緩衝液５００ｍ
Ｍ中の株溶液２００ｍＭからの添加物、ｐＨ５．５）１
０ｍＭ、硫化ナトリウム又はチオ硫酸ナトリウム１０ｍ
Ｍ、カリウム−ホスフェート−緩衝液（ｐＨ７．０）１
００ｍＭ、精製された酵素５μｇ／ｍｌを含有し、これ
を３７℃でインキュベートした。特異的活性Ａをユニッ
ト／ｍｇタンパク質で表示し、つまりμｍｏｌ産物×ｍ
ｉｎ- １×ｍｇ- １タンパク質で表示した。ＡＣ ｙｓはス
ルフィドを用いたシステイン形成の特異的活性を意味す
る。ＡＳ - Ｃｙ ｓはチオ硫酸塩を用いたＳ−スルホ−シ
ステイン形成の特異的活性を意味する。例２中で単離さ
れたタンパク質を用いるこの特異的活性は次のようであ
った： ＣｙｓＫ：ＡＣｙｓ １４０ユニット／ｍｇ ＣｙｓＭ：ＡＣｙｓ １９９ユニット／ｍｇ ＣｙｓＭ：ＡＳ - Ｃｙｓ １４５ユニット／ｍｇ 休止細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリ
ラーゼの活性を測定する場合、まず、２０．０の光学密
度（６００ｎｍで測定）を有する細胞懸濁液を調整し
た。引き続き、この細胞をクロロホルムの添加により１
０体積％まで浸透させ、室温で５分間インキュベートし
た。次いで酵素の対して１．０の光学密度を調整し、細
胞を用いて上記したようにＯ−アセチル−Ｌ−セリン及
びスルフィドもしくはチオ硫酸塩との反応を実施した。
この細胞の特異的活性Ａはこの場合μｍｏｌ×ｍｉｎ-
１（６００ｎｍで１．０の光学密度を有する細胞懸濁液
ｍｌ）；短縮形：ユニット／ｍｌ ＯＤで示した。
【００７８】例４：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフ
ヒドリラーゼＣｙｓＫもしくはＣｙｓＭの触媒作用能力
の試験 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを用い
て非タンパク質アミノ酸を製造するために、他の求核性
化合物をスルフィド又はチオ硫酸塩の代わりに反応中で
使用した。この検出のために、アミノ酸に対する予備カ
ラム誘導化（Vorsaeulenderivatisierung）を、オルト
−フタルジアルデヒドを用いて実施した。この方法を用
いて、精製された求核性基質の広範囲なスクリーニング
を実施できた。
ヒドリラーゼＣｙｓＫもしくはＣｙｓＭの触媒作用能力
の試験 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを用い
て非タンパク質アミノ酸を製造するために、他の求核性
化合物をスルフィド又はチオ硫酸塩の代わりに反応中で
使用した。この検出のために、アミノ酸に対する予備カ
ラム誘導化（Vorsaeulenderivatisierung）を、オルト
−フタルジアルデヒドを用いて実施した。この方法を用
いて、精製された求核性基質の広範囲なスクリーニング
を実施できた。
【００７９】このバッチはＯ−アセチル−Ｌ−セリン
（Ｎａスクシネート−緩衝液５００ｍＭ中の株溶液２０
０ｍＭからの添加物、ｐＨ５．５）４ｍＭ、求核試薬２
０ｍＭ、Ｋ−ホスフェート−緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ
７．０、精製された酵素、５μｇ／ｍｌを含有した。こ
の反応を酢酸（９６％ｖ／ｖ）１／１００体積を用いて
停止し、HP Aminoquantカラム（２００ｍｍ×２．１ｍ
ｍ）を用いるＨＰＬＣによりHewlett Packard, Waldbro
nn, D,の製造元の指示に従って分析した。
（Ｎａスクシネート−緩衝液５００ｍＭ中の株溶液２０
０ｍＭからの添加物、ｐＨ５．５）４ｍＭ、求核試薬２
０ｍＭ、Ｋ−ホスフェート−緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ
７．０、精製された酵素、５μｇ／ｍｌを含有した。こ
の反応を酢酸（９６％ｖ／ｖ）１／１００体積を用いて
停止し、HP Aminoquantカラム（２００ｍｍ×２．１ｍ
ｍ）を用いるＨＰＬＣによりHewlett Packard, Waldbro
nn, D,の製造元の指示に従って分析した。
【００８０】生成された生成物を特性決定するために、
ＨＰＬＣ−ＭＳを用いて分子量を検出した。このため
に、移動層としてギ酸（０．１％ｖ／ｖ）を用いるLuna
-C18-カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, D）を用い
た。イオン化を正のエレクトロスプレー法で実施した。
ＨＰＬＣ−ＭＳを用いて分子量を検出した。このため
に、移動層としてギ酸（０．１％ｖ／ｖ）を用いるLuna
-C18-カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, D）を用い
た。イオン化を正のエレクトロスプレー法で実施した。
【００８１】次の表は多様な求核試薬に対する２つの酵
素ＣｙｓＫもしくはＣｙｓＭの反応性及びＨＰＬＣ−Ｍ
Ｓ−分析（ＭＨ＋）での測定量を示した。
素ＣｙｓＫもしくはＣｙｓＭの反応性及びＨＰＬＣ−Ｍ
Ｓ−分析（ＭＨ＋）での測定量を示した。
【００８２】
【表１】
【００８３】＊ ＋＋＋ ３０分後に７０％を越える転
化率、 ＋＋ ３０分後に４０％を越える転化率、 ＋
３０分後に１０％を越える転化率、 − ３０分後に
５％未満の転化率。
化率、 ＋＋ ３０分後に４０％を越える転化率、 ＋
３０分後に１０％を越える転化率、 − ３０分後に
５％未満の転化率。
【００８４】例５：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフ
ヒドリラーゼＣｙｓＭの発酵による製造 発酵のため予備培養として、付加的にアンピシリン１０
０ｍｌ／ｌを含有するＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／
ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）２０
ｍｌに、株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（上記参照）を接種
し、３０℃で１５０ｒｐｍで振盪器中で一晩中インキュ
ベートした。引き続き全体のバッチを、グルコース５ｇ
／ｌ、ビタミンＢ１ ０．５ｍｇ／ｌ及びアンピシリン
１００ｍｇ／ｌを補充したＳＭ１培地（Ｋ２ＨＰＯ４
１２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４ ５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／
ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳ
Ｏ４×７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ／ｌ；Ｎａ３シトレート
×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ；ＮａＣｌ ０．１ｇ／ｌ；Ｎａ
２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ／ｌ；Ｎａ３ＢＯ３
２．５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０．７ｇ／
ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ
２×４Ｈ２Ｏ １．６ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０．３ｇ／ｌからなる微量元素溶液１ｍｌ／ｌ）１００
ｍｌに移した。この予備培養をさらに３０℃で８時間１
５０ｒｐｍでインキュベーションした。
ヒドリラーゼＣｙｓＭの発酵による製造 発酵のため予備培養として、付加的にアンピシリン１０
０ｍｌ／ｌを含有するＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／
ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）２０
ｍｌに、株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（上記参照）を接種
し、３０℃で１５０ｒｐｍで振盪器中で一晩中インキュ
ベートした。引き続き全体のバッチを、グルコース５ｇ
／ｌ、ビタミンＢ１ ０．５ｍｇ／ｌ及びアンピシリン
１００ｍｇ／ｌを補充したＳＭ１培地（Ｋ２ＨＰＯ４
１２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４ ５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ／
ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳ
Ｏ４×７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ／ｌ；Ｎａ３シトレート
×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ；ＮａＣｌ ０．１ｇ／ｌ；Ｎａ
２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０．１５ｇ／ｌ；Ｎａ３ＢＯ３
２．５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０．７ｇ／
ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ
２×４Ｈ２Ｏ １．６ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０．３ｇ／ｌからなる微量元素溶液１ｍｌ／ｌ）１００
ｍｌに移した。この予備培養をさらに３０℃で８時間１
５０ｒｐｍでインキュベーションした。
【００８５】発酵槽として、２リットルの最大培養容量
を有するBraun Biotech (Melsungen, D)社のBiostat M-
装置を用いた。記載した予備培養（６００ｎｍでの約２
の光学密度）を用いて、発酵培地（グルコース１５ｇ／
ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ／ｌ；（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇ／
ｌ；ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０．３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／
ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．０７５ｇ／ｌ；Ｎａ３
シトレート×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ及び前記のような微量
元素溶液１ｍｌ／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ及びア
ンピシリン１００ｍｇ／ｌ、２５％アンモニアを用いて
ｐＨ７．０に調整）９００ｍｌを有する発酵槽に接種し
た。発酵の間に３２℃の温度を調整し、ｐＨ値をアンモ
ニア２５％ｖ／ｖの添加により７．０の値に一定に保持
した。この培養に除塵した圧縮空気を１．５ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ／ｍｉｎで通気し、２００ｒｐｍの撹拌機回転数で
撹拌した。酸素飽和が５０％の値に低下した後、回転数
を制御装置を介して１２００ｒｐｍの値にまで高め、酸
素飽和５０％を維持した（ｐＯ２センサを用いて測定、
９００ｒｐｍで１００％飽和に校正）。発酵槽中のグル
コース含有量が最初１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌに
低下するまで、グルコース溶液５６％ｗ／ｖの添加を行
った。この培養を３〜６ｍｌ／ｈの流動速度で行い、そ
の際、発酵槽中のグルコース濃度を０．５〜１０ｇ／ｌ
の間に維持した。グルコース測定をＹＳＩ社（Yellow S
prings, Ohio, USA）のグルコース分析機を用いて実施
した。光学密度３０に到達した際に酵素生産をテトラサ
イクリン３ｍｇ／ｌの添加により誘導した。誘導時間は
７時間であった。この時間の後に、試料を取り出し、細
胞を培地の遠心分離により分離し、洗浄した。生じた細
胞懸濁液を例３に記載したように分析した。チオ硫酸塩
を用いて測定したＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒ
ドリラーゼ−活性ＡＳ - Ｃｙｓは１２ユニット／ｍｌ
ＯＤであった。
を有するBraun Biotech (Melsungen, D)社のBiostat M-
装置を用いた。記載した予備培養（６００ｎｍでの約２
の光学密度）を用いて、発酵培地（グルコース１５ｇ／
ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ／ｌ；（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇ／
ｌ；ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０．３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／
ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．０７５ｇ／ｌ；Ｎａ３
シトレート×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ及び前記のような微量
元素溶液１ｍｌ／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ及びア
ンピシリン１００ｍｇ／ｌ、２５％アンモニアを用いて
ｐＨ７．０に調整）９００ｍｌを有する発酵槽に接種し
た。発酵の間に３２℃の温度を調整し、ｐＨ値をアンモ
ニア２５％ｖ／ｖの添加により７．０の値に一定に保持
した。この培養に除塵した圧縮空気を１．５ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ／ｍｉｎで通気し、２００ｒｐｍの撹拌機回転数で
撹拌した。酸素飽和が５０％の値に低下した後、回転数
を制御装置を介して１２００ｒｐｍの値にまで高め、酸
素飽和５０％を維持した（ｐＯ２センサを用いて測定、
９００ｒｐｍで１００％飽和に校正）。発酵槽中のグル
コース含有量が最初１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌに
低下するまで、グルコース溶液５６％ｗ／ｖの添加を行
った。この培養を３〜６ｍｌ／ｈの流動速度で行い、そ
の際、発酵槽中のグルコース濃度を０．５〜１０ｇ／ｌ
の間に維持した。グルコース測定をＹＳＩ社（Yellow S
prings, Ohio, USA）のグルコース分析機を用いて実施
した。光学密度３０に到達した際に酵素生産をテトラサ
イクリン３ｍｇ／ｌの添加により誘導した。誘導時間は
７時間であった。この時間の後に、試料を取り出し、細
胞を培地の遠心分離により分離し、洗浄した。生じた細
胞懸濁液を例３に記載したように分析した。チオ硫酸塩
を用いて測定したＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒ
ドリラーゼ−活性ＡＳ - Ｃｙｓは１２ユニット／ｍｌ
ＯＤであった。
【００８６】この細胞を遠心分離により精製し、液体窒
素中で衝撃冷凍し、−２０℃で貯蔵した。
素中で衝撃冷凍し、−２０℃で貯蔵した。
【００８７】例６：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフ
ヒドリラーゼＣｙｓＫの発酵による製造 ＣｙｓＫ−酵素の製造のために原則として例５に記載し
たと同様に行った。もちろんこの場合に株ＢＬＲ２１
（ＤＥ３）／ｐＬＥ４を使用した。装入されたグルコー
ス１５ｇ／ｌの消費後に、６０％（ｖ／ｖ）グリセリン
溶液を用いた培養を行った。流動速度は９．５ｍｌ／ｈ
であった。同時に酵素産生をイソプロパノール−β−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）０．４ｍＭの添加により誘
導した。２１時間の誘導時間の後に試料を取り出し、培
養基の遠心分離により細胞を分離し、洗浄した。得られ
た細胞懸濁液を例３に記載されたと同様に分析した。ス
ルフィドＡＣｙｓを用いて測定した特異的Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性は２ユニット
／ｍｌ ＯＤであった。
ヒドリラーゼＣｙｓＫの発酵による製造 ＣｙｓＫ−酵素の製造のために原則として例５に記載し
たと同様に行った。もちろんこの場合に株ＢＬＲ２１
（ＤＥ３）／ｐＬＥ４を使用した。装入されたグルコー
ス１５ｇ／ｌの消費後に、６０％（ｖ／ｖ）グリセリン
溶液を用いた培養を行った。流動速度は９．５ｍｌ／ｈ
であった。同時に酵素産生をイソプロパノール−β−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）０．４ｍＭの添加により誘
導した。２１時間の誘導時間の後に試料を取り出し、培
養基の遠心分離により細胞を分離し、洗浄した。得られ
た細胞懸濁液を例３に記載されたと同様に分析した。ス
ルフィドＡＣｙｓを用いて測定した特異的Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性は２ユニット
／ｍｌ ＯＤであった。
【００８８】細胞を遠心分離により分離し、液体窒素中
に衝撃冷凍し、−２０℃で貯蔵した。
に衝撃冷凍し、−２０℃で貯蔵した。
【００８９】例７：休止細胞を用いたＳ−フェニル−Ｌ
−システインの酵素による製造 ｐＨセンサ及びｐＨ制御装置を備えた温度調節可能な容
器中に、まずＯ−アセチル−Ｌ−セリン−ヒドロクロリ
ド（Sigma, Deisenhofen, D）を水１００ｍｌに溶か
し、その結果、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２００ｍＭ
（２９．４ｇ／ｌ）の最終濃度が生じた。その後、撹拌
しながらチオフェノール２００ｍＭを添加した。引き続
きこのバッチを５Ｍ ＮａＯＨの滴定により素早く６．
７のｐＨ値にもたらし、すぐにＣｙｓＭ産生株ＤＨ５α
／ｐＦＬ１４５の細胞懸濁液を混入した。この細胞懸濁
液は１２ユニット／ｍｌ ＯＤの特異的活性ＡＳ -
Ｃｙｓを有していた。バッチ中の細胞の光学密度（６０
０ｎｍで測定）は２．０であり、従ってＯ−アセチル−
Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性は２４ユニット
／ｍｌのＡＳ - Ｃｙｓの値であった。反応の間にｐＨ値
を５Ｍ ＮａＯＨの供給によりｐＨ制御システムを用い
て一定に保持した。
−システインの酵素による製造 ｐＨセンサ及びｐＨ制御装置を備えた温度調節可能な容
器中に、まずＯ−アセチル−Ｌ−セリン−ヒドロクロリ
ド（Sigma, Deisenhofen, D）を水１００ｍｌに溶か
し、その結果、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２００ｍＭ
（２９．４ｇ／ｌ）の最終濃度が生じた。その後、撹拌
しながらチオフェノール２００ｍＭを添加した。引き続
きこのバッチを５Ｍ ＮａＯＨの滴定により素早く６．
７のｐＨ値にもたらし、すぐにＣｙｓＭ産生株ＤＨ５α
／ｐＦＬ１４５の細胞懸濁液を混入した。この細胞懸濁
液は１２ユニット／ｍｌ ＯＤの特異的活性ＡＳ -
Ｃｙｓを有していた。バッチ中の細胞の光学密度（６０
０ｎｍで測定）は２．０であり、従ってＯ−アセチル−
Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性は２４ユニット
／ｍｌのＡＳ - Ｃｙｓの値であった。反応の間にｐＨ値
を５Ｍ ＮａＯＨの供給によりｐＨ制御システムを用い
て一定に保持した。
【００９０】反応の間に白色沈殿物の形成が確認され
た。３０分後に試料を取り出し、１％（ｖ／ｖ）酢酸を
添加した。沈殿物を遠心分離により分離し、同じ体積の
２１％（ｖ／ｖ）リン酸中に溶かし、ＨＰＬＣにより分
析した。遠心分離の上澄液を同様にクロマトグラフィー
にかけた。この分析はＬＵＮＡ ５μ Ｃ１８（２）−
カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, D）の逆相ＨＰＬ
Ｃを用いて実施した。溶離剤として、０．５ｍｌ／ｍｉ
ｎの流動速度で希釈したリン酸（０．１ｍｌ濃リン酸／
ｌ）を用いた。
た。３０分後に試料を取り出し、１％（ｖ／ｖ）酢酸を
添加した。沈殿物を遠心分離により分離し、同じ体積の
２１％（ｖ／ｖ）リン酸中に溶かし、ＨＰＬＣにより分
析した。遠心分離の上澄液を同様にクロマトグラフィー
にかけた。この分析はＬＵＮＡ ５μ Ｃ１８（２）−
カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, D）の逆相ＨＰＬ
Ｃを用いて実施した。溶離剤として、０．５ｍｌ／ｍｉ
ｎの流動速度で希釈したリン酸（０．１ｍｌ濃リン酸／
ｌ）を用いた。
【００９１】Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの含有量は
上澄液中で１．６ｇ／ｌ、沈殿物中で２４．８ｇ／ｌで
あった。これはＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対して６７
％の全反応収率に相当した。このバッチをＯ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの使用を１２もしく
は２ユニット／ｍｌに減少させながらも実施した。しか
しながら、これは延長された酵素反応を生じ、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリンの異性化に基づき５２％もしくは１５
％の収率に低下した。
上澄液中で１．６ｇ／ｌ、沈殿物中で２４．８ｇ／ｌで
あった。これはＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対して６７
％の全反応収率に相当した。このバッチをＯ−アセチル
−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの使用を１２もしく
は２ユニット／ｍｌに減少させながらも実施した。しか
しながら、これは延長された酵素反応を生じ、Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリンの異性化に基づき５２％もしくは１５
％の収率に低下した。
【００９２】例８：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の
発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−フェニル−Ｌ−
システインの酵素を用いた製造 純粋物質としてのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの代わり
に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン中
でこの試験を実施した。このブイヨンはＤＥ１０１０７
００２特許出願明細書に記載されたと同様に発酵により
得られた。発酵の完了時に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
の安定化は２１％（ｖ／ｖ）リン酸を用いてｐＨ値４．
０が調整された。この細胞を遠心分離により分離し、発
酵ブイヨンを蒸発によりＯ−アセチル−Ｌ−セリンの濃
度を３０ｇ／ｌにした。引き続きブイヨン１００ｍｌに
チオフェノール２００ｍＭを添加し、ｐＨ６．７に滴定
した後、ＣｙｓＭ−産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５を混
入した。この活性ＡＳ - Ｃｙ ｓは２４ユニット／ｍｌで
あった。その後、例７によるように実施した。Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリンに対する収率は６５％であった。
発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−フェニル−Ｌ−
システインの酵素を用いた製造 純粋物質としてのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの代わり
に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン中
でこの試験を実施した。このブイヨンはＤＥ１０１０７
００２特許出願明細書に記載されたと同様に発酵により
得られた。発酵の完了時に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
の安定化は２１％（ｖ／ｖ）リン酸を用いてｐＨ値４．
０が調整された。この細胞を遠心分離により分離し、発
酵ブイヨンを蒸発によりＯ−アセチル−Ｌ−セリンの濃
度を３０ｇ／ｌにした。引き続きブイヨン１００ｍｌに
チオフェノール２００ｍＭを添加し、ｐＨ６．７に滴定
した後、ＣｙｓＭ−産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５を混
入した。この活性ＡＳ - Ｃｙ ｓは２４ユニット／ｍｌで
あった。その後、例７によるように実施した。Ｏ−アセ
チル−Ｌ−セリンに対する収率は６５％であった。
【００９３】ＣｙｓＫ−産生株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）／
ｐＬＥ４の細胞を有する同様のバッチを供給し、Ａ
Ｃｙｓ ３８ユニット／ｍｌの使用で７２％の収率が得
られた。
ｐＬＥ４の細胞を有する同様のバッチを供給し、Ａ
Ｃｙｓ ３８ユニット／ｍｌの使用で７２％の収率が得
られた。
【００９４】例９：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の
発酵ブイヨン及び休止細胞を有するＳ−フェニル−Ｌ−
システインの連続的な酵素による製造 反応実施の目標は、高価でかつ不安定な原料のＯ−アセ
チル−Ｌ−セリンに対してできる限り高い収率を達成す
ることである。これを保障するために、連続的方法が行
われる。この場合、まず例８に記載されたと同様に実施
し、単にＣｙｓＭ活性ＡＳ - Ｃｙｓに関する使用が４８
ユニット／ｍｌに高められた。２０分の反応時間の後に
供給ユニットを介してＯ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン（３０ｇ／ｌ）、チオフェノール及びＣ
ｙｓＭ産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（６００ｎｍで２
４０ＯＤ、リン酸カリウム緩衝液中でｐＨ７．０）の細
胞懸濁液を添加した。流動速度は１５０、２．５もしく
は３ｍｌ／ｈであった。同時に、連続的に生成物溶液を
反応容器から１５５．５ｍｌ／ｈの流速で取り出すこと
で開始した。この流速は、反応器中の反応体積が一定に
保持され、反応器中の平均滞留時間が３０分であるよう
に選択される。この方法を用いて、バッチ中で一定のＯ
−アセチル−Ｌ−セリン−濃度で１．０ｇ／ｌの流動速
度が生じた。この低い濃度に基づき（この酵素はそのな
お低いＫＭ値に基づきなお極めて良好な活性を有する）
Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンへの異性化が効果的に最小化
することができる。このＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対
する反応収率は８５％である。
発酵ブイヨン及び休止細胞を有するＳ−フェニル−Ｌ−
システインの連続的な酵素による製造 反応実施の目標は、高価でかつ不安定な原料のＯ−アセ
チル−Ｌ−セリンに対してできる限り高い収率を達成す
ることである。これを保障するために、連続的方法が行
われる。この場合、まず例８に記載されたと同様に実施
し、単にＣｙｓＭ活性ＡＳ - Ｃｙｓに関する使用が４８
ユニット／ｍｌに高められた。２０分の反応時間の後に
供給ユニットを介してＯ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン（３０ｇ／ｌ）、チオフェノール及びＣ
ｙｓＭ産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（６００ｎｍで２
４０ＯＤ、リン酸カリウム緩衝液中でｐＨ７．０）の細
胞懸濁液を添加した。流動速度は１５０、２．５もしく
は３ｍｌ／ｈであった。同時に、連続的に生成物溶液を
反応容器から１５５．５ｍｌ／ｈの流速で取り出すこと
で開始した。この流速は、反応器中の反応体積が一定に
保持され、反応器中の平均滞留時間が３０分であるよう
に選択される。この方法を用いて、バッチ中で一定のＯ
−アセチル−Ｌ−セリン−濃度で１．０ｇ／ｌの流動速
度が生じた。この低い濃度に基づき（この酵素はそのな
お低いＫＭ値に基づきなお極めて良好な活性を有する）
Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンへの異性化が効果的に最小化
することができる。このＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対
する反応収率は８５％である。
【００９５】例１０：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたアジ化−Ｌ−アラ
ニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、ア
ジ化ナトリウム２００ｍＭを使用した。バッチ中で７２
ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の
反応時間の後に４５％の転化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたアジ化−Ｌ−アラ
ニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、ア
ジ化ナトリウム２００ｍＭを使用した。バッチ中で７２
ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の
反応時間の後に４５％の転化率が測定された。
【００９６】例１１：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたシアノ−Ｌ−アラ
ニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、シ
アン化カリウム２００ｍＭを使用した。シアン化物の添
加をまず行い、バッチを６．７のｐＨ値に調整した。バ
ッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性の細胞を用いた３０
分の反応時間の後に６５％の転化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたシアノ−Ｌ−アラ
ニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、シ
アン化カリウム２００ｍＭを使用した。シアン化物の添
加をまず行い、バッチを６．７のｐＨ値に調整した。バ
ッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性の細胞を用いた３０
分の反応時間の後に６５％の転化率が測定された。
【００９７】例１２：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−スルホ−Ｌ−
システインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、チ
オ硫酸ナトリウム２００ｍＭを使用した。バッチ中で１
６ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分
の反応時間の後に９１％の転化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−スルホ−Ｌ−
システインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、チ
オ硫酸ナトリウム２００ｍＭを使用した。バッチ中で１
６ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分
の反応時間の後に９１％の転化率が測定された。
【００９８】例１３：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−チアゾール−
２−イル−Ｌ−システインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、２
−メルカプトチアゾール２００ｍＭを使用した。バッチ
中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた
３０分の反応時間の後に６２％の転化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−チアゾール−
２−イル−Ｌ−システインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、２
−メルカプトチアゾール２００ｍＭを使用した。バッチ
中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた
３０分の反応時間の後に６２％の転化率が測定された。
【００９９】例１４：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−１，２，４−
チアゾール−３−イル−Ｌ−システインの酵素による製
造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、３
−メルカプト−１，２，４−チアゾール２００ｍＭを使
用した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当す
る細胞を用いた３０分の反応時間の後に７４％の転化率
が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−１，２，４−
チアゾール−３−イル−Ｌ−システインの酵素による製
造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、３
−メルカプト−１，２，４−チアゾール２００ｍＭを使
用した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当す
る細胞を用いた３０分の反応時間の後に７４％の転化率
が測定された。
【０１００】例１５：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたセレノ−Ｌ−シス
テインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、セ
レン化ナトリウム２００ｍＭを使用した。セレン化ナト
リウムはホウ水素化ナトリウムを用いる亜セレン酸ナト
リウムの還元により製造した。バッチ中で７２ユニット
／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間
の後に７５％の転化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたセレノ−Ｌ−シス
テインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、セ
レン化ナトリウム２００ｍＭを使用した。セレン化ナト
リウムはホウ水素化ナトリウムを用いる亜セレン酸ナト
リウムの還元により製造した。バッチ中で７２ユニット
／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間
の後に７５％の転化率が測定された。
【０１０１】例１６：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたフェニル−セレノ
−Ｌ−システインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、フ
ェニルセレノール２００ｍＭを使用した。バッチ中で７
２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分
の反応時間の後に６２％の転化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたフェニル−セレノ
−Ｌ−システインの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含
有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、フ
ェニルセレノール２００ｍＭを使用した。バッチ中で７
２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分
の反応時間の後に６２％の転化率が測定された。
【０１０２】例１７：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた１，２，４−チア
ゾール−１−イル−Ｌ−アラニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様に実施した。チ
オフェノールに代わり、１，２，４−チアゾール２００
ｍＭを使用した。この反応のために細胞を１０％（ｖ／
ｖ）クロロホルムを用いた処理により易透化した。バッ
チ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用い
た３０分の反応時間の後に４８％の転化率が測定され
た。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた１，２，４−チア
ゾール−１−イル−Ｌ−アラニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様に実施した。チ
オフェノールに代わり、１，２，４−チアゾール２００
ｍＭを使用した。この反応のために細胞を１０％（ｖ／
ｖ）クロロホルムを用いた処理により易透化した。バッ
チ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用い
た３０分の反応時間の後に４８％の転化率が測定され
た。
【０１０３】例１８：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた５−カルボキシ−
１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラ
ニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様に実施した。チ
オフェノールに代わり、１，２，４−オキサジアゾリジ
ン−２，５−ジオン２００ｍＭを使用した。この反応の
ために細胞を１０％のクロロホルムを用いた処理により
易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相
当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に１１％の転
化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた５−カルボキシ−
１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラ
ニンの酵素による製造 この例において、原則として例８と同様に実施した。チ
オフェノールに代わり、１，２，４−オキサジアゾリジ
ン−２，５−ジオン２００ｍＭを使用した。この反応の
ために細胞を１０％のクロロホルムを用いた処理により
易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相
当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に１１％の転
化率が測定された。
【０１０４】例１９：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた１，２，４−オキ
サジアゾリジン−３，５−ジオニル−Ｌ−アラニン（キ
スカル酸）の酵素による製造 この例において、原則として例８と同様に実施した。チ
オフェノールに代わり、５−カルボキシ−１，２，３−
ベンゾトリアゾール２００ｍＭを使用した。この反応の
ために細胞を１０％のクロロホルムを用いた処理により
易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相
当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に５４％の転
化率が測定された。
の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた１，２，４−オキ
サジアゾリジン−３，５−ジオニル−Ｌ−アラニン（キ
スカル酸）の酵素による製造 この例において、原則として例８と同様に実施した。チ
オフェノールに代わり、５−カルボキシ−１，２，３−
ベンゾトリアゾール２００ｍＭを使用した。この反応の
ために細胞を１０％のクロロホルムを用いた処理により
易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相
当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に５４％の転
化率が測定された。
【０１０５】
【０１０６】
【外２】
【０１０７】
【外３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス マイアー ドイツ連邦共和国 ダッハウ ヨーゼフ− シャイドゥル−シュトラーセ 21ベー (72)発明者 カールステン ゲーベルト ドイツ連邦共和国 ミュンヘン シュヴァ ネックシュトラーセ ６ Ｆターム(参考） 4B064 AE03 CA21 CB24 CC07 CD30 CE08 CE09 CE11 CE15 DA01
Claims (18)
- 【請求項１】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合
物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの
触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にす
る酵素による生体内変換を用いて非タンパク質Ｌ−アミ
ノ酸を製造する方法において、前記の方法をｐＨ５．０
〜７．４の範囲内のｐＨ値で実施することを特徴とす
る、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２】 ｐＨ６．０〜７．１の範囲内のｐＨ値で
実施する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ｐＨ６．０〜６．９９の範囲内のｐＨ値
で実施する、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合
物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの
触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にす
る非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、Ｏ−
アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼとしてＣｙ
ｓＭを使用することを特徴とする、非タンパク質Ｌ−ア
ミノ酸の製造方法。 - 【請求項５】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒド
リラーゼがバッチ中で少なくとも２ユニット／ｍｌの体
積活性ＡＣｙｓを有する、請求項１から４までのいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項６】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合
物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの
触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にす
る非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、持続
的にＯ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リン−スルフヒドリラーゼ及び求核性化合物を供給し、
同時に非タンパク質Ｌ−アミノ酸を含有する溶液を取り
出すことを特徴とする、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製
造方法。 - 【請求項７】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒド
リラーゼを精製された形で使用する、請求項１から６ま
でのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒド
リラーゼを担体に固定化した後に使用する請求項１から
４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合
物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの
触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にす
る非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、Ｏ−
アセチル−Ｌ−セリンとしてＯ−アセチル−Ｌ−セリン
−含有発酵ブイヨンを使用することを特徴とする、非タ
ンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１０】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒ
ドリラーゼを、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒド
リラーゼ活性を有する休止微生物細胞の形で使用する、
請求項１から６までのいずれか１項又は請求項９記載の
非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１１】 求核性化合物が、 【化１】 のグループから選択される基を有する、請求項１から１
０までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】 求核性化合物が、チオ硫酸塩、一般式
（１） Ｈ−Ｓ−Ｒ１ （１） ［式中、Ｒ１は置換又は非置換の一価の、１〜１５個の
Ｃ原子を有するアルキル基、アルコキシ基、アリール基
又はヘテロアリール基を表す］のチオール、セレニド、
一般式（２） Ｈ−Ｓｅ−Ｒ１ （２） ［式中、Ｒ１は式（１）について挙げられた意味を表
す］のセレノール、アジ化物、シアン化物、一般式
（３）又は（４） 【化２】 ［式中、Ｘ及びＹは同じ又は異なり、ＣＲ４又はＮを表
し、Ｒ４は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−Ｎ
Ｏ２ -、−ＳＨ、−ＳＯ３ -、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−
Ｉ、Ｃ１〜Ｃ５−アルキルカルボニル−並びにそのエス
テル、アミド又は塩又はＲ１を表し、Ｒ１は式（１）に
ついて挙げられた意味を表し、Ｒ２及びＲ３は同じ又は
異なり、Ｒ４を表すか、又は式（４）中のＣ１及びＣ２
はＲ２又はＲ３の置換基の代わりに架橋［−ＣＲ５Ｒ６
−］ａによって環を形成するように結合しており、その
際、ａは１、２、３又は４を表し、Ｒ５及びＲ６は同じ
又は異なり、Ｒ４を表し、１個又は数個の隣接しない基
［−ＣＲ５Ｒ６−］は酸素、硫黄又は場合によりＣ１〜
Ｃ５アルキル置換されたイミノ基により置換されていて
もよくかつ２個の隣接する基［−ＣＲ５Ｒ６−］は基
［−ＣＲ５＝ＣＲ６−］又は基［−ＣＲ５＝Ｎ−］によ
り置き換えられていてもよい］のアゾール、一般式
（５）又は（６） 【化３】 ［式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はすでに記載した意味
を表し、式（６）中のＣ １及びＣ２は置換基Ｒ２及びＲ
３の代わりに式（４）について定義された架橋を用いて
１つの環を形成するように結合していてもよい］のイソ
キサゾリンノンのグループから選択される、請求項１１
記載の方法。 - 【請求項１３】 求核性化合物が、２−メルカプトエタ
ノール、３−メルカプトプロパノール、３−メルカプト
プロピオン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン
酸、メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチ
ルアミン、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオ酢酸、メ
ルカプトコハク酸、メルカプトピルビン酸、ジチオトレ
イトール、ジチオエリトリトール、１−チオグリセリ
ン、チオフェノール、４−フルオロチオフェノール、４
−クロロチオフェノール、４−メルカプトフェノール、
ｐ−チオクレゾール、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、
２−メルカプトチアゾール、２−メルカプトチアゾリ
ン、２−メルカプトイミダゾール、３−メルカプト−
１，２，４−トリアゾール、２−チオフェンチオール、
２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリミジン、
２−チオシトシン、２−メルカプトニコチン酸、２−メ
ルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベ
ンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾオキサゾール、
６−メルカプトプリン、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸
カリウム、チオ硫酸アンモニウム、アジ化ナトリウム、
アジ化カリウム、アジ化アンモニウム、シアン化カリウ
ム、シアン化ナトリウム、シアン化アンモニウム、メチ
ルセレノール、エチルセレノール、プロピルセレノー
ル、フェニルセレノール、１，２−ピラゾール、３−メ
チルピラゾール、４−メチルピラゾール、３，５−ジメ
チルピラゾール、３−アミノピラゾール、４−アミノピ
ラゾール、ピラゾール−４−カルボン酸、ピラゾール−
３，５−ジカルボン酸、１，２，３−トリアゾール、
１，２，４−トリアゾール、３−アミノ−１，２，４−
トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、インダ
ゾール、インダゾール−３−カルボン酸、インダゾール
−５−カルボン酸、５−アミノインダゾール、ベンゾト
リアゾール、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、５
−アミノベンゾトリアゾール、アミノピラゾロピリミジ
ン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、イソオキサ
ゾリン−５−オン、３−メチルイソオキサゾリン−５−
オン、４−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４，５
−ジメチルイソオキサゾリン−２−オン、１，２，４−
オキサジアゾリジン−３，５−ジオンのグループから選
択される、請求項１１又は１２記載の方法。 - 【請求項１４】 求核性化合物の濃度が、Ｏ−アセチル
−Ｌ−セリンに対して等モル濃度で存在するように選択
される、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１５】 ５℃〜７０℃の温度で実施する、請求
項１から１４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１６】 非天然のＬ−アミノ酸を、Ｌ−配置の
形の一般式（７） 【化４】 ［式中、Ｚは、式（８）〜（１９） 【化５】 又はそのエステル、エーテル又は塩による一価の基を表
し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ及びＹは式（１）〜
（６）について記載した意味を表す］のアミノ酸のグル
ープから選択される、請求項１から１５までのいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項１７】 非タンパク質Ｌ−アミノ酸をこの方法
の完了後に公知の方法を用いて単離する、請求項１から
１６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 単離を濾過、遠心分離、抽出、吸着、
イオン交換クロマトグラフィー、沈殿又は晶出を用いて
行う、請求項１７記載の方法。
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