JP7092278B2 - イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体の合成法の確立 - Google Patents
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Description
(i)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したスルホシステインであり、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-Lセリン及び亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体32S、安定同位体34S、放射性同位体33S及び放射性同位体35Sからなる群より選択される;
(ii)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したS-スルホシステインであり、システインシンターゼBの存在下で、O-アセチル-L-セリン及びチオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3)を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体32S、安定同位体34S、放射性同位体33S及び放射性同位体35Sからなる群より選択される;
(iii)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドであり、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリン及び二硫化ナトリウム(Na2S2)を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体32S、安定同位体34S、放射性同位体33S及び放射性同位体35Sからなる群より選択される;
(iv)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドであり、(a)システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させてイオウ原子を同位体標識したシステインを得る工程、ここで当該イオウ原子について同位体標識された基質は硫化水素ナトリウム(NaHS)、又は硫化ナトリウム(Na2S)であり、そしてここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体32S、安定同位体34S、放射性同位体33S及び放射性同位体35Sからなる群より選択される、および(b)工程(a)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインと、二硫化ナトリウムを反応させる工程、を含む;または
(v)システイン誘導体が、セレノシステインであり、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリン及びセレン化ナトリウム(Na2Se)を反応させる工程を含む;
前記方法。
システインシンターゼ;及び
イオウ原子について同位体標識された硫化水素ナトリウム(NaHS)、硫化ナトリウム(Na2S)、亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)、チオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3)、及び二硫化ナトリウム(Na2S2)からなる群より選択される少なくとも一つのイオウを含む基質、ここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体32S、安定同位体34S、放射性同位体33S及び放射性同位体35Sからなる群より選択される、またはセレン化ナトリウム(Na2Se);
を含む、前記キット。
(i)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシスチンポリスルフィドであり、(a)上記[1]または[2]に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、(b)工程(a)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤と反応させる工程、および(c)さらに硫化ナトリウム(Na2S)を添加して反応させる工程、を含む;または
(ii)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したN-アセチルシステインであり、(a)上記[1]または[2]に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、および(b)工程(a)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインをアセチル化剤と反応させる工程、を含む;
前記方法。
(1)システインシンターゼ
システインシンターゼ(EC:2.5.1.47)は、生体内においてはシステインの生合成に関わる酵素であり、以下の化学反応:
セリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.30)は、L-セリンとアセチルCoAを基質としてO-アセチル-L-セリンとCoAを生成する反応を触媒する酵素であり、以下の化学反応:
同位体とは、同一の原子番号を持つものの中性子数が異なる核種の関係をいう。本明細書において「同位体標識された」とは、ある化合物の特定の核種について、天然存在比が最も高い同位体以外の同位体に置換された状態を意味する。また、「同位体標識」は、ある化合物の特定の核種について、置換された天然存在比が最も高い同位体以外の同位体を意味する。同位体標識は、安定同位体であってもよく、放射性同位体であってもよい。ここで、放射性同位体は、崩壊により放射線を出す放射能を有するものであり、安定同位体は崩壊を起こさず安定な同位体である。
システインは、天然アミノ酸の一種であり、特に明記しない限り、L-システインである。
(i)シスチン(Cys-S-S-Cys)であって、当該分子内のイオウ原子の少なくとも1つが同位体標識されている化合物;
(ii)スルホシステイン(Cys-SO3H)、またはS-スルホシステイン(Cys-SSO3H)であって、当該分子内のイオウ原子が同位体標識されている化合物;
(iii)システインパースルフィド(Cys-SSH)であって、当該分子内のイオウ原子の少なくとも1つが同位体標識されている化合物;
(iv)セレノシステイン(Cys-SeH)、ここでセレン原子は同位体標識されていなくてもよく、または同位体標識されていてもよい;
(v)シスチンポリスルフィド(Cys-S-S(1-3)-S-Cys)であって、当該分子内のイオウ原子の少なくとも1つが同位体標識されている化合物;
(vi)N-アセチルシステインであって、当該分子内のイオウ原子が同位体標識されている化合物。
一態様において、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したシステインの合成方法、を提供する。
一態様において、以下の工程:
(i)システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる;
(ii)工程(i)で得られたイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤により酸化させることによりシスチンを得る;
を含む、イオウ原子を同位体標識したシスチンの合成方法を提供する。
一態様において、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリンおよびイオウ原子について同位体標識された亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したスルホシステインの合成方法、を提供する。イオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
一態様において、システインシンターゼBの存在下で、O-アセチル-L-セリンおよびイオウ原子について同位体標識されたチオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3)を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したS-スルホシステインの合成方法、を提供する。イオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
一態様において、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリンおよびイオウ原子について同位体標識された二硫化ナトリウム(Na2S2)を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドの合成方法、を提供する。イオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
一態様において、システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリンおよびセレン化ナトリウム(Na2Se)を反応させる工程を含む、セレノシステインの合成方法、を提供する。セレン化ナトリウムは、同位体標識されていてもよく、同位体標識されていなくてもよい。セレン化ナトリウムが同位体標識されている場合、セレン原子が同位体標識されたセレノシステインが得られる。セレン原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
一態様において、
(i)システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリンおよびイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる;
(ii)工程(i)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤亜硝酸ナトリウム(NaNO2)と反応させる;
(iii)さらに硫化ナトリウム(Na2S)を添加して反応させることにより、シスチンポリスルフィドを得る;を含む、イオウ原子を同位体標識したシスチンポリスルフィドの合成方法を提供する。
一態様において、以下の工程:
(i)システインシンターゼの存在下で、O-アセチル-L-セリンおよびイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる;
(ii)工程(i)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインをアセチル化剤と反応させることにより、N-アセチルシステインを得る;
を含む、イオウ原子を同位体標識したN-アセチルシステインの合成方法を提供する。
上記のシステイン、シスチン、スルホシステイン、S-スルホシステイン、システインパースルフィド、シスチンポリスルフィド、N-アセチルシステインまたはセレノシステインの合成方法において、窒素および/または炭素原子が同位体標識されているO-アセチル-L-セリンを、システインシンターゼによる反応に用いることにより、窒素および/または炭素ならびにイオウが同位体標識された(すなわち、窒素およびイオウが同位体標識された、炭素およびイオウが同位体標識された、窒素、炭素及びイオウが同位体標識された)システイン、シスチン、スルホシステイン、S-スルホシステイン、システインパースルフィド、シスチンポリスルフィド、N-アセチルシステインまたはセレノシステインを得ることができる。
上記の合成方法または上記の反応により得られた、イオウ原子が同位体標識されたシステインまたはシステイン誘導体、あるいは、窒素および/または炭素ならびにイオウが同位体標識されたシステインまたはシステイン誘導体は、クロマトグラフィーなど当業者に公知の手法により回収・精製することができる。
一態様において、イオウ原子を同位体標識したシステインもしくはシスチン、又はシステイン誘導体を合成するためのキットを提供する。当該キットは、システインシンターゼ;及びイオウ原子について同位体標識された基質、又はセレン化ナトリウム(Na2Se)(ここで、セレン化ナトリウムのセレン原子は同位体標識されていてもよく、されていなくてもよい);を含む。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、20mM O-アセチル-L-セリン、20mM 硫化水素ナトリウム(NaH 34S)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysK) 0.05mg/mlを添加し、37℃で1時間反応させた。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、20mM O-アセチル-L-セリン、20mM 硫化水素ナトリウム(NaH 34S)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysK) 0.05mg/mlを添加し、37℃で1時間反応させた。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、1mM 15N標識L-セリン、1mM アセチルCoA、1mM 硫化水素ナトリウム(NaH 34S)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysK) 0.05mg/mlと参考例2の手法で調製したセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(CysE)を添加し、37℃で5分反応させた。システイン生成の確認を容易にする目的で、上記の反応後、反応液中にメタノール及び過剰量のモノブロモビマン(MBB)を添加し、37℃で15分間インキュベートした。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、1mM 15N標識L-セリン、1mM アセチルCoA、1mM 亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysK) 0.05mg/mlと参考例2の手法で調製したセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(CysE)を添加し、37℃で30分反応させた。反応物を質量分析機により分析した(カラム:Imtakt Scherzo SS-C18(2.0 mm×150 mm)(インタクト株式会社);カラム温度:45℃;インジェクション容量:3μl;移動層:A液/0.2%ギ酸、0.2%酢酸、及びB液/100mM酢酸アンモニウム、50%メタノール;グラジエント:0%B液(0分)-0%B液(1分)-2%B液(4分)-45%B液(15分)-0%B液(15.1分)-0%B液(20分);流速0.3ml/分);質量分析条件:プレカーサーイオン168、プロダクトイオン81、フラグメンター電圧90V、コリジョンエナジー21、極性ネガティブ。溶出時間3~4分に目的の生成物(スルホシステイン)のピークが確認できた。また、この生成物のスルホシステインの同位体標識されていない標品についてm/z:168のピークを検出したのに対し、生成物はm/z:169のピークを検出した。このことは、生成物が、15Nで同位体標識された化合物であることを示している。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、1mM 15N標識L-セリン、1mM アセチルCoA、1mM チオ硫酸ナトリウム(Na2S2O3)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysM) 0.05mg/mlと参考例2の手法で調製したセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(CysE)を添加し、37℃で30分反応させた。反応物を質量分析機により分析した(カラム:Imtakt Scherzo SS-C18(2.0 mm×150 mm)(インタクト株式会社);カラム温度:45℃;インジェクション容量:3μl;移動層:A液/0.2%ギ酸、0.2%酢酸、及びB液/100mM酢酸アンモニウム、50%メタノール;グラジエント:0%B液(0分)-0%B液(1分)-2%B液(4分)-45%B液(15分)-0%B液(15.1分)-0%B液(20分);流速0.3ml/分);質量分析条件:プレカーサーイオン201、プロダクトイオン136、フラグメンター電圧90V、コリジョンエナジー9、極性ネガティブ。溶出時間4~5分に目的の生成物(S-スルホシステイン)のピークが確認できた。また、この生成物についてS-スルホシステインの同位体標識されていない標品についてm/z:200のピークを検出したのに対し、生成物はm/z:201のピークを検出した。このことは、生成物が、15Nで同位体標識された化合物であることを示している。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、1mM 15N標識L-セリン、1mM アセチルCoA、1mM セレン化ナトリウム(Na2Se)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysK) 0.05mg/mlと参考例2の手法で調製したセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(CysE)を添加し、37℃で30分反応させた。反応物を質量分析機により分析した(カラム:Imtakt Scherzo SS-C18(2.0 mm×150 mm)(インタクト株式会社);カラム温度:45℃;インジェクション容量:3μl;移動層:A液/0.2%ギ酸、0.2%酢酸、及びB液/100mM酢酸アンモニウム、50%メタノール;グラジエント:0%B液(0分)-0%B液(1分)-2%B液(4分)-45%B液(15分)-0%B液(15.1分)-0%B液(20分);流速0.3ml/分);質量分析条件:プレカーサーイオン336.9、プロダクトイオン247.8、フラグメンター電圧90V、コリジョンエナジー9、極性ポジティブ。なお、セレノシステインはほぼ全てが反応液中で酸化され、分子同士がジスルフィド結合で連結したセレノシスチン(Cys-Se-Se-Cys)を形成するため、セレノシスチンを検出した。溶出時間4~5分に目的の産物の酸化体であるセレノシスチンのピークが確認できた。また、この生成物についてセレノシスチンの同位体標識されていない標品についてm/z:336.9のピークを検出したのに対し、生成物はm/z:338.9のピークを検出した。このことは、生成物が、15Nで同位体標識された化合物であることを示している。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、実施例1の手法で調製した0.1mM 34S標識システインと0.1mM 二硫化ナトリウム(Na2S2)を混合し、37℃で30分反応させた。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、1mM O-アセチル-L-セリン、1mM 34S標識・亜硫酸ナトリウム(Na2 34SO3)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysK) 0.05mg/mlを添加し、37℃で30分反応させた。実施例4に記載したものと同じ条件で、反応物を質量分析機により分析した。溶出時間3~4分に目的の生成物(スルホシステイン)のピークが確認できた。また、この生成物のスルホシステインの同位体標識されていない標品についてm/z:168のピークを検出したのに対し、生成物はm/z:170のピークを検出した。このことは、生成物が、34Sで同位体標識された化合物であることを示している。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、1mM O-アセチル-L-セリン、1mM 34S標識・チオ硫酸ナトリウム(Na2S34SO3)となるように溶解した。この溶液に、参考例1の手法で調製したシステインシンターゼ(CysM) 0.05mg/mlを添加し、37℃で30分反応させた。実施例5に記載したものと同じ条件で、反応物を質量分析機により分析した。溶出時間4~5分に目的の生成物(S-スルホシステイン)のピークが確認できた。また、この生成物についてS-スルホシステインの同位体標識されていない標品についてm/z:200のピークを検出したのに対し、生成物はm/z:202のピークを検出した。このことは、生成物が、34S標識で同位体標識された化合物であることを示している。
5%ギ酸中、5mM 34S標識L-システイン、25mM 亜硝酸ナトリウム(NaNO2)となるように溶解し、37℃で15分反応させた。この溶液に、6mM Na2 34Sを添加し、さらに37℃で15分反応させた。反応物を質量分析機により分析した(カラム:YMC Triat C18 plus(2.1 mm×50 mm)(株式会社ワイエムシィ);カラム温度:45℃;インジェクション容量:3μl;移動層:A液/0.1%ギ酸、及びB液/アセトニトリル;イソクラティック:0.2%B液;流速0.2ml/分;質量分析条件:MS2スキャン(m/z:200-400)、フラグメンター電圧90V、極性ポジティブ。溶出時間2~3分、4~5分、12~13分にそれぞれ目的の生成物(シスチンポリスルフィド:Cys34S-34S(1-3)-34SCys)のピークが確認できた。また、この生成物についてシスチンポリスルフィドの同位体標識されていない標品についてm/z:273.0、305.0、337.0のピークをそれぞれ検出したのに対し、生成物はm/z:278.9、312.9、346.8のピークをそれぞれ検出した。このことは、生成物が、34Sで同位体標識された化合物であることを示している。
100mM リン酸バッファー(pH7.6)中、5mM 34S標識L-システイン、5mM アセチルCoA、となるように溶解し、37℃で30分反応させた。反応物を質量分析機により分析した(カラム:YMC Triat C18 plus(2.1 mm×50 mm)(株式会社ワイエムシィ);カラム温度:45℃;インジェクション容量:3μl;移動層:A液/0.1%ギ酸、及びB液/アセトニトリル;グラジエント:0.2%B液(0分)-10%B液(10分)-0.2%B液(10.1分)-0.2%B液(15分);流速0.2ml/分。質量分析条件:プレカーサーイオン166.2、プロダクトイオン99.5、フラグメンター電圧50V、コリジョンエナジー21、極性ポジティブ。溶出時間2~3分に目的の生成物(N-アセチルシステイン)のピークが確認できた。また、この生成物についてN-アセチルシステインの同位体標識されていない標品についてm/z:164のピークを検出したのに対し、生成物はm/z:166のピークを検出した。このことは、生成物が、34Sで同位体標識された化合物であることを示している。
ネズミチフス菌由来のヒスチジンタグ融合CysKおよびCysMを発現する大腸菌をLB培地にて37℃で振盪培養した。大腸菌の濁度がOD.600=0.5になってから0.5mM IPTGを添加し、さらに30℃で2時間振盪培養した。大腸菌を遠心分離で回収し、リシスバッファー(50mM リン酸バッファー、300mM 塩化ナトリウム、10mM イミダゾール 1mg/ml リゾチーム、0.1μg/ml DNアーゼI pH7.8)で再懸濁した。氷上で30分静置後、超音波破砕機にて大腸菌を破砕し、遠心分離し、上清を回収した。上清をニッケル固相化アガロース充填カラムに通した後、洗浄バッファー(50mM リン酸バッファー、300mM 塩化ナトリウム、20mM イミダゾール pH7.8)にてカラムを2回洗浄した後、溶出バッファー(50mM リン酸バッファー、300mM 塩化ナトリウム、300mM イミダゾール pH7.8)でヒスチジンタグ融合CysKを溶出した。溶出したヒスチジンタグ融合CysKを50mM リン酸バッファー pH7.8で平衡化した脱塩カラムに通し、得られた溶液をシステインシンターゼ(CysK、CysM)として使用した。
ネズミチフス菌由来のヒスチジンタグ融合CysEを発現する大腸菌をLB培地にて37℃で振盪培養した。大腸菌の濁度がOD.600=0.5になってから0.5mM IPTGを添加し、さらに30℃で2時間振盪培養した。大腸菌を遠心分離で回収し、リシスバッファー(50mM リン酸バッファー、300mM 塩化ナトリウム、10mM イミダゾール 1mg/ml リゾチーム、0.1μg/ml DNアーゼI pH7.8)で再懸濁した。氷上で30分静置後、超音波破砕機にて大腸菌を破砕し、遠心分離し、上清を回収した。上清をニッケル固相化アガロース充填カラムに通した後、洗浄バッファー(50mM リン酸バッファー、300mM 塩化ナトリウム、20mM イミダゾール pH7.8)にてカラムを2回洗浄した後、溶出バッファー(50mM リン酸バッファー、300mM 塩化ナトリウム、300mM イミダゾール pH7.8)でヒスチジンタグ融合CysEを溶出した。溶出したヒスチジンタグ融合CysEを50mM リン酸バッファー pH7.8で平衡化した脱塩カラムに通し、得られた溶液をセリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(CysE)として使用した。
Claims (8)
- イオウ原子を同位体標識したシステインの合成方法であって、システインシンターゼ(EC:2.5.1.47)の存在下で、O-アセチル-L-セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる工程を含み、ここで当該イオウ原子について同位体標識された基質は硫化水素ナトリウム(NaHS)であり、そしてここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体32S、安定同位体34S、放射性同位体33S及び放射性同位体35Sからなる群より選択される、前記方法。
- O-アセチル-L-セリンを、以下の工程:
セリン-O-アセチルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.30)の存在下で、窒素および/または炭素原子について同位体標識されたセリンを反応させる;
により得ることをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - システインシンターゼが、システインシンターゼA(CysK)又はシステインシンターゼB(CysM)である、請求項1又は2に記載の方法。
- システインシンターゼAが、サルモネラ属に属する微生物由来である、請求項3に記載の方法。
- システインシンターゼが、ヒスチジンタグを含む組換えタンパク質である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- イオウ原子を同位体標識したシスチンの合成方法であって、請求項1又は2に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成し、当該システインを酸化剤の存在下で酸化することによりシスチンを得る工程を含む、前記方法。
- 酸化剤がヨウ素(I2)である、請求項6に記載の方法。
- システイン誘導体の合成方法であって、
(i)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシスチンポリスルフィドであり、(a)請求項1または2に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、(b)工程(a)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤と反応させる工程、および(c)さらに硫化ナトリウム(Na2S)を添加して反応させる工程、を含む;または
(ii)システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したN-アセチルシステインであり、(a)請求項1または2に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、および(b)工程(a)で得たイオウ原子を同位体標識したシステインをアセチル化剤と反応させる工程、を含む;
前記方法。
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