MXPA01009508A - Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos no proteinogenos. - Google Patents

Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos no proteinogenos.

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Abstract

Procedimiento para la preparacion de L-aminoacidos no proteinogenos por fermentacion directa de una cepa de microorganismos en si conocida con un metabolismo de cisteina desarreglado de una manera en si conocida, caracterizado porque durante la fermentacion se le añade dosificadamente a la tanda de fermentacion un compuesto nucleofilo en cantidades tales, que esta conduce a la produccion de L-aminoacidos no proteinogenos por la cepa de microorganismos.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN POR FERMENTACIÓN DE L -AMINOÁCIDOS NO PROTEINOGENOS El invento se refiere a un procedimiento para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos (es decir no generadores de proteínas) por fermentación directa de microorganismos, así como a los L-aminoácidos obtenidos según este procedimiento. Los aminoácidos no proteinógenos son aminoácidos que no se utilizan en la naturaleza como eslabones componentes para la biosíntesis de proteínas y por lo tanto se pueden diferenciar manifiestamente de los 20 aminoácidos proteinógenos. Se trata preferiblemente de derivados de L-alanina sustituidos en ß. Los aminoácidos no proteinógenos constituyen compuestos interesantes p.ej. para la preparación de sustancias activas farmacéuticas y agrícolas. Como sustancia activa, o como parte de una sustancia activa, pueden imitar en una especie de mimetismo molecular a la estructura de aminoácidos naturales y con ello pueden producir, por ejemplo en el caso de interacciones con receptores, una modulación de la reacción natural. Además de ello, pueden servir de modo enteramente general como compuestos quirales en el marco del "conjunto quiral = chiral poot' como componentes de síntesis. Los procedimientos actuales de preparación de aminoácidos no proteinógenos en una forma pura en cuanto a los enantiómeros se basan en la mayor parte de los casos en costosas síntesis, que además de ello en su mayor parte solamente permiten el acceso a un determinado compuesto. Sólo pocos procedimientos hacen posible la preparación de diferentes compuestos mediante el simple intercambio de un educto (producto de partida). En la mayor parte de los casos se trata de síntesis químicas, que en su mayor parte a su vez parten ya de componentes quirales o traen consigo un desdoblamiento de racematos. Alternativamente se han descrito también algunos procedimientos enzimáticos. Así, con ayuda de transaminasas procedentes de a-ceto-ácidos se pueden preparar, con L-ácido glutámico como donante de grupos amino, diferentes aminoácidos no proteinógenos. Otro procedimiento utiliza hidantoinasas en combinación con carbamoilasas. Sin embargo los procedimientos enzimáticos presentan asimismo elevados costos, puesto que se deben de poner a disposición las correspondientes enzimas y éstas presentan solamente un limitado tiempo de vida como catalizadores (Rehm y colaboradores Biotechnology 1996; volumen 6, páginas 505 - 560). Por el contrario, resultarían especialmente sencillos y favorables los procedimientos para la preparación de aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de microorganismos. Tales procedimientos albergan sin embargo el peligro de que el aminoácido no proteinógeno producido interfiere con el metabolismo de los aminoácidos naturales y con ello se llega a inhibiciones del crecimiento. Hasta ahora en este campo temático se conoce un procedimiento para la fermentación directa de D-aminoácidos (documento de solicitud de patente internacional WO 98/14602). Esta solicitud describe la preparación de D-aminoácidos mediante microorganismos recombinantes, en los que se habían incorporado un gen de D-amino-transferasa y un gen de L-amino-desaminasa. Además de ello, Saito y colaboradores (Biol. Pharm. Bull. 1997, 20: 47 - 53) describen la producción del aminoácido vegetal, no proteinógeno, L-pirazolil-alanina por expresión de genes vegetales en Escherichia coli. Los rendimientos son, sin embargo, con un valor < 1 g/l, demasiado bajos para la producción comercial y los costos, en el caso del empleo descrito de L-serina como educto, son muy altos. Es misión del presente invento poner a disposición un procedimiento eficiente para la preparación de una serie de L-aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa. El problema planteado por esta misión se resuelve mediante el recurso de que una cepa de microorganismos en sí conocida, con un metabolismo de cisteína desarreglado, se fermenta de una manera en sí conocida, caracterizada porque durante la fermentación se le añade dosificadamente a la tanda de fermentación un compuesto nucleófilo en cantidades tales, que ésta conduce a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos por la cepa de microorganismos. Preferiblemente, al final de la fermentación, los L-aminoácidos no proteinógenos procedentes de la respectiva tanda de fermentación se separan mediante métodos en sí conocidos.
Sorprendentemente, se encontró que al realizar la fermentación de cepas de microorganismos con metabolismo de cisteína desarreglado, en lugar de un sulfuro pasan a tomar parte del metabolismo de aminoácidos muy eficientemente una serie de otros compuestos nucleófilos y se segregan al medio de cultivo los correspondientes productos de reacción. Ventajosamente se puede utilizar en tal caso glucosa como fuente de carbono barata. Mediante la adición dosificada conforme al invento de compuestos nucleófilos durante la fermentación, se forman por consiguiente L-aminoácidos no proteinógenos. Prefepblemente, por lo tanto, se añade durante la fermentación un compuesto nucleófilo que pasa a tomar parte del metabolismo de aminoácidos.
Preferiblemente, se añaden compuestos nucleófilos que comprenden un radical seleccionado entre el conjunto formado por H H H— S — — N— N = — — 0- de modo especialmente preferido se le añade a la tanda de fermentación un compuesto nucleófilo seleccionado entre el siguiente conjunto: un tiol de la fórmula general (1 ): H— S— R? ( 1 ) n la que R1 significa un radical alquilo, alcoxi, arilo o heteroarilo univalente, sustituido o sin sustituir, que tiene como máximo 15 átomos de C; un azol de la fórmula general (2) ó (3): así como sus esteres, éteres o sales, en los que X e Y son iguales o diferentes y significan CR4 ó N, y R4 significa -H, -COOH, -OH, -NH2, -N02", -SH, -S03", -F, -Cl, -Br, -I, alquil C C5-carbonilo o R1, y R1 tiene el significado mencionado para la fórmula (1 ), y en los que R2 y R3 son iguales o diferentes y significan R4, o en que C1 y C2 en la fórmula (3), en lugar de llevar los sustituyentes R2 y R3' están unidos mediante un puente [-CR5R6-]a en el que a es igual a 1 , 2, 3 ó 4, para formar un anillo, en los que R5 y R6 son iguales o diferentes y significan R4, y uno o varios grupos [-CR5R6-] no contiguos pueden estar reemplazados por oxígeno, azufre o por un radical imino eventualmente sustituido con alquilo d- C-5, y dos grupos [-CR5R6-] contiguos pueden estar reemplazados por un grupo [-CR5=CR6-] o por un grupo [-CR5=N-]. - una ¡soxazolinona de la fórmula general (4) ó (5): así como sus esteres, éteres o sales, teniendo X, R1, R2 y R3 los significados ya mencionados, en que C1 y C2 en la fórmula (5), en lugar de llevar los sustituyentes R2 y R3, pueden estar unidos mediante un puente definido como para la fórmula (3), para formar un anillo. Ejemplos de tioles son compuestos seleccionados entre el conjunto constituido por 2-mercapto-etanol, 3-mercapto-propanol, ácido 3-mercapto-propiónico, ácido 3-mercapto-1-propano-sulfónico, ácido mercapto-etano-sulfónico, 2-mercapto-metil-amina, ácido tio-glicólico, ácido tio-láctico, ácido tio-acético, ácido mercapto-succínico, ácido mercapto-pirúvico, ditiotreitol, ditioeritritol, 1-tio-glicerol, tio-fenol, 4-fluoro-tio-fenol, 4-mercapto-fenol, p-tio-cresol, ácido 5-tio-2-nitro-benzoico, 2-mercapto-tiazol, 2-mercapto-tiazolina, 2-mercapto-imidazol, 3-mercapto-1 ,2,4-triazol, 2-tiofeno-tiol, 2-mercapto-piridina, 2-mercapto-pirimidina, 2-tio-citosina, ácido 2-mercapto-nicotínico, 2-mercapto-1-metil-imidazol, 2-mercapto-benzotiazol, 2-mercapto-benzoxazol y 6-mercapto-purina. Ejemplos de azoles son compuestos seleccionados entre el conjunto constituido por 1 ,2-pirazol, 3-metil-pirazol, 4-metil-pirazol, 3,5-dimetil-pirazol, 3-amino-pirazol, 4-amino-pirazol, ácido pirazol-4-carboxílico, ácido pirazol-3,5-dicarboxílico, 1 ,2,3-triazol, 1 ,2,4-triazol, 3-amino-1 ,2,4-triazol, 1 ,2,3,4-tetrazol, indazol, ácido indazol-3-carboxílico, ácido indazol-5-carboxílico, 5-amino-indazol, benzotriazol, ácido benzotriazol-5-carboxílico, 5-amino-benzotriazol, amino-pirazolo-pirimidina, 8-aza-guanina y 8-aza-adenina. Ejemplos de isoxazolinas son compuestos seleccionados entre el conjunto constituido por isoxazolin-2-ona, 4-metil-isoxazolin-2-ona, 5-metil-isoxazolin-2-ona, 4,5-dimetil-isoxazolin-2-ona, 1 ,2,4-oxadiazolidin-3,5-diona. Cepas de microorganismos con metabolismo de cisteína desarreglado, que se pueden emplear en el procedimiento conforme al invento, son conocidas por el estado de la técnica. Éstas se distinguen por una producción endógena, aumentada con respecto a la cepa de tipo salvaje, de O-acetil-L-serina - que es el compuesto precursor biosintético inmediato de la L-cisteína -. En un microorganismo, en la última etapa de la biosíntesis de cisteína, tal como es sabido, la función acetilo de la O-acetil-L-serina se reemplaza por una función de tiol mediante la actividad de las O-acetil-serina-sulfhidrilasas, y con ello se forma L-cisteína. Este tipo de reacción se designa como sustitución en ß, puesto que en el átomo de carbono ß del aminoácido se lleva a cabo un intercambio de un grupo funcional. Preferiblemente, en el procedimiento conforme al invento se emplea una de las siguientes cepas de microorganismos: - cepas con alelos cysE modificados, tal como se describen por ejemplo en el documento WO 97/15673 (incorporado de este modo por su referencia) o en la cita de Nakamori S. y colaboradores, 1998, Appl. Env.
Microbiol. 64: 1.607 - 1.611 (incorporada de este modo por su referencia) o en la cita de Takagi H. y colaboradores 1999, FEBS Lett. 452: 323-327, o - cepas que contienen genes de eflujo, tal como se describen por ejemplo en el documento EP 0885962 A1 (que corresponde a la solicitud de patente en los E.U.A. con el número de serie SN 09/097759 (incorporado de este modo por su referencia)), o - cepas con una actividad de CysB modificada, tal como se describen en la solicitud de patente alemana DE 19949579, o - cepas que se obtienen por empleo de métodos de mutagénesis inespecíficos, combinados con métodos de escrutinio para la sobreproducción de cisteína o para la degradación disminuida de cisteína, tal como se describen por ejemplo en el documento WO 97/15673 o en la cita de Nakamori S. y colaboradores, 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1.607 - 1.611. Tales cepas se distinguen por el hecho de que ellas, en el caso de efectuarse una aportación suficiente de una fuente inorgánica de azufre, tal como p. ej. un sulfato o tiosulfato, segregan dentro del medio de cultivo cantidades importantes de L-cisteína o de un derivado de ésta. Mediante la adición dosificada, conforme al invento, de un compuesto nucleófilo durante la fermentación, este compuesto pasa a tomar parte en la sustitución en ß y conduce con ello a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos. Con cepas de microorganismos, que no poseen ningún metabolismo de cisteína desarreglado (p. ej. los usuales organismos de tipo salvaje) tal modo de proceder conduce a la paralización de la biosíntesis de cisteína y por consiguiente a una inhibición del crecimiento. Como consecuencia de ello, no se forman aminoácidos no proteinógenos de ningún tipo en cantidades significativas. Puesto que las cepas utilizadas conforme al invento presentan sin embargo un metabolismo de cisteína desarreglado y por consiguiente un alto nivel endógeno de O-acetil-L-serina, es posible la producción de los L-amino-ácidos no proteinógenos en grandes cantidades. Al mismo tiempo se garantiza todavía una formación suficiente de L-cisteína, para garantizar el crecimiento celular del microorganismo. Se utilizan preferiblemente cepas de microorganismos del tipo de Escherichia coli, que posee un metabolismo de cisteína desarreglado. Preferiblemente, se trata en tal caso de cepas de Escherichia coli tal como se describen por ejemplo en el documento WO 97/15673 o en el documento EP 0885962 A1 (que corresponde a la solicitud de patente en los E.U.A. con el número de serie SN 09/097759) o bien en el documento DE 19949579. De acuerdo con los procedimientos descritos en estas solicitudes de patente, el metabolismo de cisteína en cualesquiera cepas se puede desarreglar por transformación con un plásmido que lleva p. ej. un alelo cysE resistente a la retroalimentación (feedback) y/o un gen de eflujo. El procedimiento conforme al invento para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos con ayuda de una cepa de microorganismos, se lleva a cabo en un fermentador de una manera en y de por sí conocida, pero mediando adición adicional de un compuesto nucleófilo.
La cultivación de la cepa de microorganismos en el fermentador se efectúa como cultivo continuo, como cultivo en tandas o preferiblemente como cultivo de alimentación en tandas (fed-batch). De modo especialmente preferido, una fuente de C y un compuesto nucleófilo se añaden dosificadamente en régimen continuo durante la fermentación. La adición dosificada del compuesto nucleófilo comienza después de la inoculación o preferiblemente después de una fase de crecimiento. De modo especialmente preferido, la dosificación comienza a las 6-8 horas después del comienzo de la fermentación y dura hasta el final de la fermentación. La cantidad del compuesto nucleófilo añadido depende de su toxicidad para el microorganismo y fluctúa en el margen de 10 a 1.000 mmoles por litro de volumen inicial del medio de fermentación. Es especialmente preferida una adición dosificada de 50 a 500 mmoles por litro de volumen inicial del medio de fermentación. Como fuentes de C para la fermentación sirven preferiblemente azúcares, azúcar-alcoholes o ácidos orgánicos. De modo especialmente preferido, en el procedimiento conforme al invento se emplean glucosa, lactosa o glicerol como fuentes de C. Se prefiere la adición dosificada de glucosa en una forma que garantiza que el contenido en el fermentador se mantenga durante la fermentación en un margen de 0,1 - 50 g/l. Se prefiere especialmente un margen de 0,5 - 10 g/l.
Como fuente de N se utilizan en el procedimiento conforme al invento preferiblemente amoníaco, sales de amonio o materiales hidrolizados de proteínas. Como otras adiciones a los medios se pueden añadir sales de los elementos fósforo, azufre, cloro, sodio, magnesio, nitrógeno, potasio, calcio, hierro y, en cantidades trazas (es decir en concentraciones del orden de los µM (micrómetros)), sales de los elementos molibdeno, boro, cobalto, manganeso, zinc y níquel. Además, se pueden añadir al medio ácidos orgánicos (p. ej. como acetatos, citratos), aminoácidos (p. ej. como isoleucina) y vitaminas (p. ej. las B1 , B6). Como fuentes complejas de materiales nutritivos se pueden pasar a emplear p. ej. un extracto de levadura, agua de maceración de maíz, harina de soja o un extracto de malta. El valor del pH del medio de fermentación está situado en el margen de 4 - 10. Se prefiere un margen de 6 - 8. Se prefiere especialmente un margen de valores del pH de 6,5 a 7,5. La temperatura de incubación es de 15 - 45°C. Se prefiere una temperatura comprendida entre 30 y 37°C. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en condiciones de crecimiento aerobias. La incorporación de oxígeno en el fermentador se efectúa con aire a presión o con oxígeno puro.
Los microorganismos, que se fermentan de acuerdo con el procedimiento descrito, segregan los correspondientes L-aminoácidos no proteinógenos con alta eficiencia en el medio de cultivo, en un período de tiempo de fermentación de 1 a 4 días. En el caso de la aportación de una sustancia nucleófila, los microorganismos con metabolismo de cisteína desarreglado segregan durante la fermentación aminoácidos no proteinógenos de la fórmula general (6) en la configuración L: siendo Z un radical univalente seleccionado entre las fórmulas (7) a (13) sí como sus esteres, éteres o sales, y teniendo R1, R2, R3, R4, X e Y los significados ya mencionados para las fórmulas (1 ) a (5). El procedimiento conforme al invento permite por primera vez preparar compuestos seleccionados entre el conjunto formado por 1 ,2,3,4-tetrazolil-L-alanina y sus derivados así como 1 ,2,3-triazolil-L-alanina y sus derivados. Preferiblemente, en cada caso se trata de las formas isómeras 1 ,2,3,4-tetrazol-1-il-L-alanina (14) y 1 ,2,3,4-tetrazol-2-il-L-alanina (15) y sus derivados, inclusive sus esteres, éteres o sales, así como de 1 ,2,3-triazol-1-il-L-alanina (16) o 1 ,2,3-triazol-2-il-L-alanina (17) y sus derivados, inclusive sus esteres, éteres o sales, teniendo R1, R2, R3 y R4 los significados ya mencionados para las fórmulas (1 ) a (5). El procedimiento conforme al invento hace posible además preparar por primera vez compuestos tomados entre el conjunto formado por S-heteroaril-L-cisteínas. En tales casos de trata cada vez de compuestos de aminoácidos con funcionalidades de aminas y ácidos carboxílicos libres. Como S-heteroaril-L-cisteínas han de entenderse los derivados de cisteína que están caracterizados por la sustitución de un radical R7 en el átomo de S. En tal caso R7 representa un radical heteroarilo que tiene un carácter aromático, es monocíclico o bicíclico y junto a átomos de carbono lleva por lo menos un heteroátomo en un anillo. Ejemplos de heteroátomos son nitrógeno, oxígeno o azufre. El radical heteroarilo puede a su vez estar sustituido con un radical R4, teniendo R4 el significado mencionado para la fórmula (2).
Ejemplos de radicales heteroarilo son pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, tienilo, tiazolilo, oxazolilo, furanilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo o purinilo. El invento se refiere por lo tanto a los compuestos mencionados.
Compuestos especialmente preferidos son: - 1 ,2,3,4-tetrazol-1-il-L-alanina (R4 = H), - 1 ,2,3,4-tetrazol-2-il-L-alanina (R4 = H), - 1 ,2,3-benzotriazol-1-il-L-alanina (R2 y R3 son iguales entre sí y significan [-CR5=CR6-], siendo R5 y R6 iguales a H, y R2 y R3 están unidos para formar un anillo aromático), - 1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina (R2 y R3 son iguales entre sí y significan [-CR5=CR6-], siendo R5 y R6 ¡guales a H, y R2 y R3 están unidos para formar un anillo aromático), - 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-1-il-L-alan¡na (R2 y R3 son diferentes entre sí y significan [-CR5=CR6-], siendo R5 y R6 iguales a H en el caso de R3 y siendo R5 igual a H y R6 igual a -COOH en el caso de R2, y R2 y R3 están unidos para formar un anillo aromático), - 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina (R2 y R3 son diferentes entre sí y significan [-CR5=CR6-], siendo R5 y R6 iguales a H en el caso de R3 y siendo R5 igual a H y R6 igual a -COOH en el caso de R2, y R2 y R3 están unidos para formar un anillo aromático), - 1 ,2,4-triazol-3-il-L-cisteína - tiazol-2-il-L-cisteína - imidazol-2-il-L-cisteína - tien-2-il-L-cisteína - piridin-2-il-L-cisteína - pirimidin-2-il-L-cisteína - benzotiazol-2-il-L-cisteína - benzoxazol-2-il-L-cisteína. Preferiblemente, el producto, después de haber separado la biomasa mediante métodos conocidos (p. ej. de filtración, centrifugación), se aisla a partir del material sobrenadante de cultivo. Tales métodos para el aislamiento de aminoácidos son asimismo conocidos por un experto en la materia. Éstos abarcan p. ej. extracción, adsorción, cromatografía con ¡ntercambiadores de iones, precipitación o cristalización. Los siguientes ejemplos sirven para explicar el invento adicionalmente. La cepa bacteriana Escherichia coli W3110 / pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306, que se utilizó para la realización de los ejemplos, se había depositado en la Colección DSMZ (Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) bajo el número DSM 13495 de acuerdo con el convenio de Budapest.
EJEMPLO 1 Cultivo previo de la cepa de producción Como cultivo previo para la fermentación se inocularon 20 ml del medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de un extracto de levadura, 10 g/l de NaCI), que adicionalmente contenía 15 mg/l de tetraciclina, con la cepa W3110 / pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 (descrita en el documento EP 0885962 A1 y que corresponde a la solicitud de patente en los E.U.A. con el número de serie SN 09/097759 (incorporado de este modo por su referencia)) y se incubó en un aparato sacudidor a 30°C y 150 rpm. Después de siete horas, la tanda total se transfirió a 100 ml del medio SM1 (12 g/l de K2HPO4; 3 g/l de KH2PO4; 5 g/l de (NH4)2SO4; 0,3 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,015 g/l de CaCI2 x 2 H2O; 0,002 g/l de FeSO4 x 7 H2O; 1 g/l de citrato de Na3 x 2 H2O; 0,1 g/l de NaCI; 1 ml/l de una solución de oligoelementos que consta de 0,15 g/l de Na2MoO x 2 H2O; 2,5 g/l de Na3BO3; 0,7 g/l de CoCI2 x 6 H2O; 0,25 g/l de CuSO4 x 5 H2O; 1 ,6 g/l de MnCI2 x 4 H2O; 0,3 g/l de ZnSO4 x 7 H2O), que se había suplementado con 5 g/l de glucosa; 0,5 mg/l de vitamina Bi y 15 mg/l de tetraciclina. La incubación ulterior se efectuó a 30°C durante 17 horas a 150 rpm.
EJEMPLO 2 Preparación por fermentación deS-f2,3-dihidroxi-4-mercapto-butip-L- cisteína Como fermentador sirvió un aparato Biostat M de la entidad Braun Biotech (Melsungen, Alemania) con un volumen máximo de cultivo de 2 I. Con el cultivo previo descrito en el ejemplo 1 (con una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 3), el fermentador se inoculó con 900 ml del medio de fermentación (con 15 g/l de glucosa; 10 g/l de triptona; 5 g/l de un extracto de levadura; 5 g/l de (NH4)2SO4; 1 ,5 g/l de KH2PO4; 0,5 de NaCI; 0,3 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,015 g/l de CaCI2 x 2 H2O; 0,075 g/l de FeSO x 7 H2O; 1 g/l de citrato de Na3 x 2 H2O y 1 ml/l de una solución de oligoelementos (véase el ejemplo anterior), 5 mg/l de vitamina B1 y 15 mg/l de tetraciclina, ajustada a un pH de 7,0 con amoníaco al 25 %). Durante la fermentación se ajustó una temperatura de 32°C y el valor del pH se mantuvo constante en un valor de 7,0 por adición dosificada de amoníaco al 25 %. El cultivo se gaseó con aire a presión desprovisto de gérmenes (esterilizado) a razón de 1 ,5 vol/vol/min y se agitó con un número de revoluciones del agitador de 200 rpm. Después de haber disminuido la saturación con oxígeno a un valor de 50 %, el número de revoluciones se aumentó a través de un aparato de control hasta llegar a un valor de 1.200 rpm, para obtener una saturación con oxígeno de 50 % (determinada con una sonda de pO2, calibrada a una saturación de 100 % a 900 rpm). Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 1 M de ditiotreitol con un caudal de 2 mmoles/h. Se alimentó glucosa procedente de una solución original al 56 %, tan pronto como el contenido del fermentador hubo disminuido desde inicialmente 15 g/l hasta aproximadamente 5 - 10 g/l. La alimentación de glucosa se efectuó con un caudal de 8 - 14 ml/h, siendo mantenida la concentración de glucosa constante entre 0,5 y 10 g/l. La determinación de glucosa se llevó a cabo con el analizador de glucosa de la entidad YSI (Yellow Springs, Ohio, E.U.A.). La duración de la fermentación fue de 48 horas. Después de este período de tiempo, se tomaron muestras y las células se separaron por centrifugación con respecto del medio de cultivo. Los resultantes materiales sobrenadantes de cultivo se separaron mediante una HPLC (cromatografía de líquido de alto rendimiento) de fase inversa en una columna LUNA 5 µ C18(2) (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Como eluyente sirvió un ácido fosfórico diluido (0,1 ml de ácido fosfórico concentrado/l) en un caudal de 0,5 ml/min. La S-mercapto-dihidroxi-butil-L-cisteína se eluye con un tiempo de retención de 86,7 min. El rendimiento fue de 2,5 g/l.
EJEMPLO 3 Preparación por fermentación de S-fenil-L-cisteína Las bacterias se cultivaron tal como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas, se efectuó una adición dosificada de una suspensión 1 M de Na-tio-fenol con un caudal de 2 mmoles/h. La S-fenil-L-cisteína se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 88 min. El rendimiento fue de 2,1 g/l.
EJEMPLO 4 Preparación por fermentación de 1,2-pirazolil-L-alanina Las bacterias se cultivaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 1 M de 1 ,2-pirazol con un caudal de 4 mmoles/h.
La 1 ,2-pirazolil-L-alanina se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 8,4 min. El rendimiento fue de 6,1 g/l.
EJEMPLO 5 Preparación por fermentación de1,2,4-triazolil-L-alanina Las bacterias se cultivaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 1 M de 1 ,2,4-triazol con un caudal de 4 mmoles/h. La 1 ,2,4-triazol-1 -ii-L-alanina se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 5,8 min. El rendimiento fue de 4,6 g/l.
EJEMPLO 6 Preparación por fermentación de 1,2,3,4-tetrazolil-L-alanina Las bacterias se cultivaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 1 M de 1 ,2,3,4-tetrazol con un caudal de 4 mmoles/h. Al realizar la fermentación resultan los dos isómeros 1 ,2,3,4-tetrazol-1-il-L-alanina y 1 ,2,3,4-tetrazol-2-il-L-alanina. Éstos se eluyen con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 5,4 y 5,7 min respectivamente. El rendimiento fue de 3,9 g/l, como suma de los dos isómeros.
EJEMPLO 7 Preparación por fermentación de 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazolil-L-alanina Las bacterias se cultivaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una suspensión de ácido 1 ,2,3-benzotriazol-5-carboxílico 1 M en NaOH 0,5 M con un caudal de 4 mmoles/h. Al realizar la fermentación resultan los tres isómeros 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-1-il-L-alanina, 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina y 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-3-¡l-L-alanina, pero constituyendo el producto principal sin embargo la 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina. Ésta se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 67,5 min. El rendimiento fue de 5,2 g/l.
EJEMPLO 8 Preparación por fermentación de 1,2,4-oxadiazolidin-2,5-dionil-L-alanina (= ácido quisquálico) Las bacterias se cultivaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 2 M de 1 ,2,4-oxadiazolidin-2,5-diona en dimetil-sulfóxido con un caudal de 2 mmoles/h. El ácido quisquálico se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 5,6 min. El rendimiento fue de 2,2 g/l.
EJEMPLO 9 Aislamiento de 1 ,2-pirazolil-L-alanina a partir del caldo de fermentación En primer lugar las células se separaron por centrifugación de 0,6 I de un caldo de fermentación a 5.000 g. El material sobrenadante se mezcló con 10 g de carbón activo para su descoloración, se agitó durante 2 h a la temperatura ambiente y a continuación se filtró. La solución obtenida se ajustó con NaOH 2 M a un valor del pH de 6,0, se aplicó sobre una columna intercambiadora de cationes Amberjet 1200 / H+ (Rohm and Haas S.A., Chauny, Francia; lecho de gel 250 ml) y las sustancias fijadas se eluyeron con NaCI 1 M. Las fracciones de elución se reunieron (500 ml), se ajustaron con NaOH 2 M a un valor del pH de 6,0 y se concentraron a 100 ml. La muestra se almacenó a 4°C durante 16 h. El material cristalizado resultante se obtuvo por filtración, se lavó con 50 ml de etanol y a continuación se secó.
EJEMPLO 10 Preparación por fermentación de S-tiazol-2-il-L-cisteína Las bacterias se cultivaron tal como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 1 M de 2-mercapto-tiazol con un caudal de 2 mmoles/h. La S-tiazol-2-il-L-cisteína se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 33,7 min. El rendimiento fue de 6,1 g/l.
EJEMPLO 11 Preparación por fermentación de S-1,2,4-triazol-3-¡l-L-cisteína Las bacterias se cultivaron como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se efectuó una adición dosificada de una solución 1 M de 3-mercapto-triazol con un caudal de 2 mmoles/h. La S-triazol-2-il-L-cisteína se eluye con el método de HPLC descrito en el ejemplo 2 con un tiempo de retención de 8,2 min. El rendimiento fue de 5,5 g/l.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de una cepa de microorganismos en sí conocida con un metabolismo de cisteína desarreglado de una manera en sí conocida, caracterizado porque durante la fermentación se le añade dosificadamente a la tanda de fermentación un compuesto nucleófilo en cantidades tales, que ésta conduce a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos por la cepa de microorganismos.
2.- Procedimiento según la reivindicación 1 , caracterizado porque al final de la fermentación los L-aminoácidos no proteinógenos se separan con respecto de la tanda de fermentación mediante métodos en sí conocidos.
3.- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se añade dosificadamente un compuesto nucleófilo que comprende un radical seleccionado entre el conjunto formado por H H H-S — — N— N= — N— 0 —
4.- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se añade un compuesto nucleófilo, seleccionado entre el conjunto siguiente:- un tiol de la fórmula general (1 ):
H— S— R, ( 1 ) en la que R1 significa un radical alquilo, alcoxi, arilo o heteroarilo univalente, sustituido o sin sustituir, que tiene como máximo 15 átomos de C; - un azol de la fórmula general (2) ó (3): así como sus esteres, éteres o sales, en los que X e Y son iguales o diferentes y significan CR4 ó N, y R4 significa -H, -COOH, -OH, -NH2, -NO2", -SH, -SO3", -F, -Cl, -Br, -I, alquil C-i-Cs-carbonilo o R1, y R1 tiene el significado mencionado para la fórmula (1 ), y en los que R2 y R3 son iguales o diferentes y significan R4, o en que C1 y C2 en la fórmula (3), en lugar de llevar los sustituyentes R2 y R3, están unidos mediante un puente [-CR5R6-]a en el que a es igual a 1 , 2, 3 ó 4, para formar un anillo, en los que R5 y R6 son iguales o diferentes y significan R4, y uno o varios grupos [-CR5R6-] no contiguos pueden estar reemplazados por oxígeno, azufre o por un radical imino eventualmente sustituido con alquilo C C5, y dos grupos [-CR5R6-] contiguos pueden estar reemplazados por un grupo [-CR5=CR6-] o por un grupo [-CR5=N-]; - una isoxazolinona de la fórmula general (4) ó (5): así como sus esteres, éteres o sales, teniendo X, R1, R2 y R3 los significados ya mencionados, en que C1 y C2 en la fórmula (5), en lugar de llevar los sustituyentes R2 y R3, pueden estar unidos mediante un puente definido como para la fórmula (3), para formar un anillo. 5.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se emplea una cepa de microorganismos seleccionada entre el conjunto de las siguientes cepas en el procedimiento conforme al invento: cepas con alelos cysE modificados; cepas que contiene genes de eflujo; cepas con una actividad de CysB modificada; cepas que se obtienen mediante empleo de métodos de mutagénesis inespecíficos combinados con métodos de escrutinio para la sobreproducción de cisteína o la degradación disminuida de cisteína.
6.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como cepa de microorganismos se emplea una cepa de Escherichia coli.
7.- Procedimiento según las reivindicaciones 1 , 5 ó 6, caracterizado porque la cultivación de la cepa de microorganismos en el fermentador se efectúa como cultivo continuo, como cultivo por tandas o como cultivo de alimentación por tandas {fed-batch).
8.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se añaden dosificadamente de modo continuo durante la fermentación una fuente de C y un compuesto nucleófilo.
9.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la adición dosificada del compuesto nucleófilo comienza 6 - 8 horas después del comienzo de la fermentación y dura hasta el final de la fermentación.
10.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cantidad del compuesto nucleófilo añadido fluctúa en el margen de 10 a 1000 mmoles por litro de volumen inicial del medio de fermentación.
11.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque como fuentes de C se emplean azúcares, azúcar-alcoholes o ácidos orgánicos.
12.- Procedimiento según la reivindicación 11 , caracterizado porque la adición dosificada de la fuente de C se efectúa en una forma que garantiza que el contenido de glucosa en el fermentador se mantenga en un margen de 0,1 - 50 g/l.
13.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque como fuente de N se emplean amoníaco, sales de amonio o materiales hidrolizados de proteínas.
14.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el valor del pH del medio de fermentación se encuentra en el margen de 4 - 10 y la temperatura de incubación asciende a 15 - 45°C.
15.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se lleva a cabo en condiciones de crecimiento aerobias.
16.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el L-aminoácido no proteinógeno, después de haber separado la biomasa a partir de la tanda de fermentación mediante filtración o centrifugación, se aisla a partir del material sobrenadante de cultivo mediante extracción, adsorción, cromatografía con intercambiadores de iones, precipitación o cristalización.
17.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque en el caso del L-aminoácido no proteinógeno se trata de un aminoácido de la fórmula general (6) en la configuración L, siendo Z un radical univalente seleccionado entre las fórmulas (7) a (13) ( 10 ) , así como sus esteres, éteres o sales, y R1, R2, R3, R4, X e Y tienen los significados ya mencionados para las fórmulas (1 ) a (5).
18.- Compuestos seleccionados entre el conjunto formado por 1 ,2,3,4-tetrazolil-L-alanina y sus derivados, 1 ,2,3-triazolil-L-alanina y sus derivados, y S-heteroaril-L-cisteínas.
19.- Compuesto según la reivindicación 18, seleccionado entre el conjunto formado por: 1 ,2,3,4-tetrazol-1-il-L-alanina, 1 ,2,3,4-tetrazol-2-il-L-alanina, 1 ,2,3-benzotriazol-1-il-L-alanina, 1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina, 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-1 -il-L-alanina, 5-carboxi-1 ,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina, 1 ,2,4-triazol-3-il-L-cisteína, tiazol-2-il-L-cisteína, imidazol-2-il-L-cisteína, tien-2-il-L-cisteína, piridin-2-il-L-cisteína, pirimidin-2-il-L-cisteína, benzotiazol-2-il-L-cisteína y benzoxazol-2-il-L-cisteína.
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