SK286163B6 - Spôsob fermentačnej výroby neproteinogénnych L-aminokyselín - Google Patents

Spôsob fermentačnej výroby neproteinogénnych L-aminokyselín Download PDF

Info

Publication number
SK286163B6
SK286163B6 SK1348-2001A SK13482001A SK286163B6 SK 286163 B6 SK286163 B6 SK 286163B6 SK 13482001 A SK13482001 A SK 13482001A SK 286163 B6 SK286163 B6 SK 286163B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
fermentation
amino acids
proteinogenic
alanine
formula
Prior art date
Application number
SK1348-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK13482001A3 (sk
Inventor
Thomas Maier
Original Assignee
Wacker Chemie Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wacker Chemie Ag filed Critical Wacker Chemie Ag
Publication of SK13482001A3 publication Critical patent/SK13482001A3/sk
Publication of SK286163B6 publication Critical patent/SK286163B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D257/04—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/55—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/04—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D233/06—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/08—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms with alkyl radicals, containing more than four carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/12—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms with alkyl radicals, containing more than four carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D233/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/26—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/32—One oxygen, sulfur or nitrogen atom
    • C07D239/38—One sulfur atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/04—1,2,3-Triazoles; Hydrogenated 1,2,3-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/16—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D249/18—Benzotriazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D263/54—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles
    • C07D263/56—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D263/54—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles
    • C07D263/58—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D271/06—1,2,4-Oxadiazoles; Hydrogenated 1,2,4-oxadiazoles
    • C07D271/07—1,2,4-Oxadiazoles; Hydrogenated 1,2,4-oxadiazoles with oxygen, sulfur or nitrogen atoms, directly attached to ring carbon atoms, the nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/30—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/64—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/68—Benzothiazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 2
    • C07D277/70—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/34—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Spôsob výroby neproteinogénnych L-aminokyselín prostredníctvom priamej fermentácie známych kmeňov mikroorganizmov s poruchou regulácie metabolizmu cysteínu, ktorého podstata spočíva v tom, že počas fermentácie sa do fermentačného média pridáva také množstvo nukleofilnej zlúčeniny, ktoré vedie k produkcii neproteinogénnych L-aminokyselín prostredníctvom produkčného kmeňa mikroorganizmov.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu získavania neproteinogénnych (nevytvárajúcich proteíny) L-aminokyselín z mikroorganizmov prostredníctvom priamej fermentácie, ako aj týmto spôsobom získaných L-aminokyselín.
Neproteinogénne aminokyseliny sú aminokyseliny, ktoré sa v prírode nepoužívajú ako stavebné kamene na biosyntézu proteínov a tým sa jasne odlišujú od 20 proteinogénnych aminokyselín. Ide predovšetkým o β-substitučné L-alanin deriváty.
Neproteinogénne aminokyseliny predstavujú zaujímavé zlúčeniny, napr. na výrobu farmaceutický a poľnohospodársky účinných látok. Môžu ako účinná látka alebo ako časť účinnej látky typu molekulovej mimikry imitovať štruktúru prírodných aminokyselín a tým napr. pri interakciách s receptorom modulovať prirodzenú reakciu. Okrem toho môžu vo všeobecnosti ako chirálne zlúčeniny v rámci „chirálneho poolu“, slúžiť ako stavebné kamene biosyntézy.
Doterajší stav techniky
Doterajšie spôsoby výroby neproteinogénnych aminokyselín v čisto enantiomémej forme sa zakladajú najčastejšie na nákladných syntézach, ktoré okrem toho umožňujú väčšinou prístup iba k jednej konkrétnej zlúčenine. Iba málo postupov umožňuje prostredníctvom jednoduchej výmeny pridávanej látky výrobu rozličných zlúčenín.
Vo väčšine prípadov ide o chemickú syntézu, ktorá najčastejšie vychádza z chirálnych stavebných kameňov alebo štiepenia racemátu.
Ako alternatíva sa opisuje aj niekoľko enzymatických postupov. Takto môžu byť z cc-ketokyselín pomocou transamináz, za prítomnosti kyseliny L-glutámovej ako donora amínovej skupiny, vyrobené rozličné neproteinogénne aminokyseliny. Iný spôsob využíva hydantoinázy v kombinácii s karbomoylázami. Enzymatické postupy sú však taktiež finančne nákladné, keďže musia byť vyrobené zodpovedajúce enzýmy a tieto ako katalyzátory majú iba obmedzenú životnosť. (Rehm a kol., Biotechnology 1996; 6: 505-560).
Obzvlášť jednoduché a výhodné oproti tomu by boli postupy na výrobu neproteinogénnych aminokyselín prostredníctvom priamej fermentácie z mikroorganizmov. Takéto postupy skrývajú však nebezpečenstvo, že vyrobená neproteinogénna aminokyselina interferuje s metabolizmom prírodných aminokyselín a tým dôjde k spomaleniu (inhibícii) rastu. Doteraz je v tejto tematickej oblasti známy jeden postup na priamu fermentáciu D-aminokyselín (WO98/14602). Táto prihláška opisuje výrobu D-aminokyselín prostredníctvom rekombinantných mikroorganizmov, do ktorých bol vložený gén pre D-aminotransferázu a gén pre L-aminodeaminázu. Okrem toho Saito a kol. (Biol. Pharm. Bull. 1997, 20: 47-53) opisuje produkciu rastlinnej, neproteinogénnej aminokyseliny L-pyrazolylalanínu prostredníctvom génovej expresie raslinných génov v Escherichia coli. Výťažky menšie ako 1 g/1 sú však na komerčnú výrobu príliš nízke a náklady pri opísanom množstve L-serínu ako východiskovej látky veľmi vysoké.
Podstata vynálezu
Úlohou predloženého vynálezu je vytvoriť účinný spôsob výroby veľkého množstva neproteinogénnych L-aminokyselín prostredníctvom priamej fermentácie.
Riešením tejto úlohy je, že sa štandardne používaný kmeň mikroorganizmov s modifikovanou cys-Ealelou fermentuje obvyklým spôsobom. A to tak, že počas fermentácie sa pridáva do fermentačnej zmesi nukleofilná zlúčenina v množstve, ktoré vedie k produkcii neproteinogénnych L-aminokyselín týmto kmeňom mikroorganizmu.
Na konci fermentácie sa prednostne oddelia neproteinogénne L-aminokyseliny z danej fermentačnej zmesi obvyklými metódami.
Prekvapivo bolo zistené, že pri fermentácii kmeňov mikroorganizmov s poruchou regulácie metabolizmu cysteínu, je možné namiesto sulfidu použiť množstvo iných nukleofilných zlúčenín, ktoré sú veľmi účinné v metabolizme aminokyselín, keď sa do kultúrneho média secemujú zodpovedajúce reakčné produkty. Výhodne môže byť pritom využitá glukóza ako lacný zdroj uhlíka.
Prostredníctvom navrhnutého dávkovania nukleofilných zlúčenín počas fermentácie sa vytvárajú neproteinogénne L-aminokyseliny. Prednostne sa preto počas fermentácie pridávajú nukleofilné zlúčeniny, ktoré vstupujú do metabolizmu aminokyselín.
Uprednostňuje sa pridávanie nukleofilných zlúčenín, ktoré obsahujú zvyšok vybraný z nasledujúcej skupiny:
H H
Η-S-, -N-N=,-N-O-.
Osobitne sa uprednostňuje pridať do fermentačnej zmesi nukleofilnú zlúčeninu vybranú z nasledujúcej skupiny:
- Tiol všeobecého vzorca (1):
H-S-R,(1), kde R1 predstavuje jednomocný substituent alebo nesubstituovaný alkylový, alkoxy, arylový alebo heteroarylový zvyšok s maximálne 15 atómami uhlíka;
- Azol všeobecného vzorca (2) alebo (3):
HH
I ^•(T N11 N
W //cL γ-χ (2»,* m ako aj jeho ester, éter alebo soľ, kde X a Y sú totožné alebo odlišné a predstavujú CR4 alebo N,
R4 predstavuje -H, -COOH, -OH, -NH2, -NO2', -SH, -SO3‘, -F, -Cl, -Br, -I, C|-C5-alkylkarbonyl- alebo R1 a R1 má význam opísaný pri vzorci (1) a kde R2 a R3 sú totožné alebo odlišné a znamenajú R4 alebo kde C1 a C2 vo vzorci (3) sú namiesto substituentov R2 a R3 spojené do kruhu pomocou mostíka [-CR5R6-]a s „a” rovnajúcim sa 1, 2, 3 alebo 4, kde R5 a Rs sú totožné alebo odlišné a zodpovedajú R4 a jedna alebo viaceré nesusediace skupiny [-CR5R6-] môžu byť nahradené kyslíkom, sírou alebo prípadne
C|-C5-alkyl- substitučným imino- zvyškom a dve susediace skupiny [-CR5R6-] môžu byť nahradené skupinou [-CR5=CR6-] alebo skupinou [-CR5=N-].
- Izoxazolinón všeobecného vzorca (4) alebo (5):
ako aj jeho ester, éter alebo soľ, kde X, R1, R2 a R3 majú už uvedený význam a kde C1 a C2 vo vzorci (5) namiesto substituentov R2 a R3 môžu byť spojené do kruhu pomocou mostíka definovanom vo vzorci (3).
Príkladmi tiolov sú zlúčeniny vybrané zo skupiny: 2-merkaptoetanol, 3-merkaptopropanol, kyselina 3-merkaptopropiónová, kyselina 3-merkapto-l-propánsulfónová, kyselina merkaptoetánsulfónová, 2-merkaptoetylamín, kyselina tioglykolová, kyselina tiomliečna, kyselina tiooctová, kyselina merkaptobutándiová (merkaptojantárová), kyselina merkaptopyrohroznová, ditiotreitol, ditioerytritol, 1-tioglycerín, tiofenol, 4-fluórtiofenol, 4-merkaptofenol, p-tiokrezol, kyselina 5-tio-2-nitrobenzoová, 2-merkaptotiazol, 2-merkaptotiazolín, 2-merkaptoimidazol, 3-merkapto-l,2,4-triazol, 2-tioféntiol, 2-merkaptopyridín, 2-merkaptopyrimidín, 2-tiocytozín, kyselina 2-merkaptonikotínová, 2-merkapto-l-metylimidazol, 2-merkaptobenztiazol, 2-merkaptobenzoxazol, 6-merkaptopurín.
Príkladmi azolov sú zlúčeniny vybrané zo skupiny:
1,2-pyrazol, 3-metylpyrazol, 4-metylpyrazol, 3,5-dimetylpyrazol, 3-aminopyrazol, 4-aminopyrazol, kyselina pyrazol-4-karbónová, kyselina pyrazol-3,5-dikarbónová, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, 3-amino-l,2,4-triazol, 1,2,3,4-tetrazol, indazol, kyselina indazol-3-karbónová, kyselina indazol-5-karbónová, 5-aminoindazol, benzotriazol, kyselina benzotriazol-5-karbónová, 5-aminobenzoltriazol, aminopyrazolpyrimidín, 8-azaguanín, 8-azaadenín.
Príkladmi izoxazolinónov sú zlúčeniny vybrané zo skupiny: izoxazolin-2-ón, 4-metylizoxazolin-2-ón, 5-metylizoxazolin-2-ón, 4,5-dimetylizoxazolin-2-ón, l,2,4-oxadiazolidin-3,5-dión.
Zo stavu techniky sú známe kmene mikroorganizmov s poruchou regulácie metabolizmu cysteínu, ktoré môžu byť použité v spôsobe podľa vynálezu. V porovnaní s divokým typom sa vyznačujú zvýšenou endogénnou produkciou O-acetyl-L-serínu - priameho biosyntetického predproduktu L-cysteínu. V mikroorganizme sa v poslednom kroku biosyntézy cysteínu, ako je známe, prostredníctvom aktivity O-acetyl-serínsulfhydrylázy zamení funkčná acetylová skupina O-acetyl-L-serínu za tiolovú funkčnú skupinu a tým sa vytvorí L-cysteín.
Tento typ reakcie sa označuje ako β-substitúcia, pretože sa na β-uhlíkovom atóme aminokyseliny vymení funkčná skupina.
V spôsobe podľa vynálezu sa výhodne použijú nasledujúce kmene mikroorganizmov:
- kmene s modifikovanými cysE-alelami, ako je napríklad opísané vo WO 97/15673 (tu zahrnutej ako odkaz) alebo Nakamori S. a kol., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 (tu zahrnutej ako odkaz) alebo Takagi H. a kol., 1999, FEBS Lett. 452: 323-327, alebo
- kmene, ktoré majú tzv. „efflux”-gény, ako je napríklad opísané v EP 0885962 A1 (zodpovedá US prihláške so sériovým číslom SN 09/097759 (tu zahrnutej ako odkaz)), alebo
- kmene so zmenenou cysB-aktivitou, ako je napríklad opísané v nemeckej patentovej prihláške DE 19949579, alebo
- kmene, ktoré sú získané použitím nešpecifických mutagénnych metód kombinovaných so skríningovými metódami na nadprodukciu cysteínu alebo so zníženým odbúravaním cysteínu, ako je napríklad opísané vo WO 97/15673 alebo v Nakamori S. a kol., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611.
Takéto kmene sa vyznačujú tým, že pri dostatočnom prísune nejakého zdroja anorganickej síry, ako napríklad síranu alebo tiosíranu secemujú do kultivačného média signifikantné množstvá L-cysteínu, alebo jeho derivátu. Prostredníctvom navrhovaného dávkovania nukleofilnej zlúčeniny počas fermentácie, vstupuje táto zlúčenina do β-substitúcie a tým vedie k produkcii neproteinogénnych L-aminokyselín.
S kmeňmi mikroorganizmov, ktoré nemajú poruchu metabolizmu cysteínu (napr. štandardne používané organizmy tzv. divokého typu) vedie takýto postup ku oslabeniu biosyntézy cysteínu a tým ku inhibicii rastu. A v dôsledku toho sa potom nevytvárajú žiadne neproteinogénne aminokyseliny v signifikantných množstvách.
Keďže kmene použité podľa vynálezu vykazujú poruchu regulácie metabolizmu cysteínu a tým vysokú endogénnu hladinu O-acetyl-L-serínu, je produkcia neproteinogénnych L-aminokyselín možná vo veľkom množstve. Súčasne je zaručená aj dostatočná tvorba L-cysteínu, aby bol zabezpečený rast buniek mikroorganizmu.
Uprednostňuje sa používanie kmeňov mikroorganizmov typu Escherichia coli, ktorá má poruchu regulácie metabolizmu cysteínu.
Prednostne pritom ide o kmene Escherichia coli opísané napríklad vo WO 97/15673 alebo EP 0885962 A1 (analogické US prihláške so sériovým číslom SN 09/097759) alebo DE 19949579. Podľa postupov opísaných v týchto patentových prihláškach je možné v ľubovoľných kmeňoch narušiť reguláciu metabolizmu cysteínu prostredníctvom transformácie s plazmidom, ktorý nesie napr. cysE-alelu rezistentnú proti spätnej väzbe-„feedback” a/alebo „efflux” gén.
Spôsob výroby neproteinogénnych L-aminokyselín pomocou kmeňa mikroorganizmov podľa vynálezu sa uskutočňuje vo fermentore známymi metódami, ale za dodatočného pridania nukleofilnej zlúčeniny.
Kmeň mikroorganizmov sa vo fermentore pestuje v procese kontinuálnej kultivácie, ako tzv. „batch” kultúra (kultúra s dávkovaním) alebo prednostne ako „fed-batch” -kultúra (kultúra s dávkovaním výživných látok). Počas fermentácie sa odporúča kontinuálne pridávať zdroj uhlíka a nukleofilnú zlúčeninu.
Pridávanie nukleofilnej zlúčeniny sa začína po naočkovaní kultúry alebo výhodnejšie až po nástupe rastovej fázy. Veľmi výhodné je pridávanie 6-8 hodín od začiatku fermentácie, ktoré trvá do konca fermentácie.
Množstvo pridávanej nukleofilnej zlúčeniny závisí od jej toxicity pre mikroorganizmus a pohybuje sa v rozmedzí od 10 do 1000 mmol na liter počiatočného objemu fermentačného média. Veľmi výhodné je pridávanie v rozmedzí od 50 do 500 mmol na liter počiatočného objemu fermentačného média.
Ako zdroje uhlíka na fermentáciu slúžia predovšetkým: cukor, alkoholový cukor alebo organické kyseliny. V navrhovanom postupe sa ako zdroj uhlíka odporúča použiť glukóza, laktóza alebo glycerín.
Výhodné je dávkovanie glukózy v takej forme, ktorá zabezpečí, že obsah vo fermentore počas fermentácie sa udrží v rozmedzí od 0,1 do 50 g/1. Odporúča sa rozsah od 0,5 do 10 g/1.
Ako zdroj dusíka sa v spôsobe podľa vynálezu používa predovšetkým amoniak, amónna soľ alebo proteínový hydrolyzát.
Ako ďalšie zložky média môžu byť pridané soli prvkov fosfor, síra, chlór, sodík, horčík, dusík, draslík, vápnik, železo a v stopových množstvách (t. j. v μΜ koncentráciách) soli prvkov molybdén, bór, kobalt, mangán, zinok a nikel.
Ďalej môžu byť do média pridané organické kyseliny (napr. acetát, citrát), aminokyseliny (napr. izoleucín) a vitamíny (napr. B1, B6).
Ako komplexné zdroje výživných látok sa môžu použiť napr. kvasnicový extrakt, voda z máčania kukurice, sójová múka alebo sladový extrakt.
Hodnota pH fermentačného média leží v rozmedzí od 4 do 10. Vhodný je rozsah od 6 do 8. Najvhodnejší je rozsah pH od 6,5 do 7,5.
Inkubačná teplota leží v rozmedzí 15 až 45 °C. Vhodná je teplota medzi 30 až 37 °C.
Fermentácia sa uskutočňuje prednostne za aeróbnych rastových podmienok (t. j. za prítomnosti kyslíka). Prívod kyslíka do fermentora je zabezpečený pomocou stlačeného vzduchu alebo čistým kyslíkom.
Mikroorganizmy, fermentované opísaným spôsobom, počas 1 až 4 dni trvajúcej fermentácie veľmi účinne secemujú do média zodpovedajúce neproteinogénne L-aminokyseliny.
Po pridaní nukleofilnej látky secemujú mikroorganizmy s poruchou regulácie metabolizmu cysteínu počas fermentácie, neproteinogénne aminokyseliny, ktoré majú všeobecný vzorec (6) v L-konfigurácii:
COOH
I
H2N—C—H
CH2
I Z (6), kde Z predstavuje jednomocný zvyšok vybraný zo skupiny vzorcov (7) až (13).
(10),
ako aj ich estery, étery alebo soli, a R1, R2, R3, R4, X a Y majú význam opísaný pri vzorcoch (1) až (5).
Spôsob podľa vynálezu umožňuje po prvýkrát výrobu zlúčenín zo skupiny 1,2,3,4-tetrazolyl-L-alanínu a jeho derivátov, ako aj 1,2,3-triazolyl-L-alanínu a jeho derivátov. Ide predovšetkým o izoméme formy 1,2,3,4-tetrazol-l-yl-L-alanín (14), prípadne l,2,3,4-tetrazol-2-yl-L-alanín (15) a ich deriváty vrátane ich esterov, éterov alebo solí, ako aj 1,2,3-triazol-l-yl-L-alanin (16), prípadne l,2,3-triazol-2-yl-L-alanín (17) a ich deri-
váty vrátane esterov, éterov alebo solí.
COOH
COOH I 1 H2N—C—H
Η,Ν—C—H | 1 ch2
ch2 . 1 R\ w // N—N (14) 1 /Νχ IT N w // C—N R (15)
COOH
I
HoN—C—H I
CH2
kde R1, R2, RJ a R4 majú význam uvedený pri vzorcoch (1) až (5).
Spôsob podľa vynálezu okrem toho umožňuje, po prvýkrát výrobu derivátov S-heteroaryl-L-cysteinu. Pritom ide predovšetkým o zlúčeniny aminokyselín s voľnou amino-, prípadne karboxylovou- funkčnou skupinou. Pod pojmom S-heteroaryl-L-cysteiny sa rozumejú deriváty cysteínu, ktoré sú charakteristické substitúciou jedného zvyšku R7 na S-atóme. Pričom R' predstavuje heteroarylový zvyšok, ktorý má aromatický charakter, je mono- alebo bicyklický a okrem uhlíkových atómov nesie minimálne jeden heteroatóm v aromatickom kruhu. Príkladom hcteroatómov sú: dusík, kyslík alebo síra. Heteroarylový zvyšok môže byť nahradený zvyškom R4, kde R4 má už spomenutý význam pri vzorci (2).
h2n—C
COOH —H
CH2
I s
i R7 (18)
Príkladmi heteroarylových zvyškov sú: pyrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, tienyl, tiazolyl, oxazolyl, furanyl, pyridyl, pyrimidyl, pyrazinyl, benzimidazolyl, benzotriazolyl, benzoxazolyl, benzotiazolyl alebo purinyl.
Vynález sa preto týka uvedených zlúčenín.
Veľmi výhodné zlúčeniny sú:
1,2,3,4-tetrazol-l-yl-L-alanín (R4=H),
- l,2,3,4-tetrazol-2-yl-L-alanín (R4=H),
1,2,3-benzotriazol-1 -yl-L-alanín (R2 a R3 sú zhodné a znamenajú [-CR5=CR6-], kde R5 a R6 sa rovnajú H a R2 a R3 sú viazané do aromatického kruhu),
- l,2,3-benzotriazol-2-yl-L-alanin (R2 a R3 sú zhodné a znamenajú [-CR5=CR6-], kde R5 a R6 sa rovnajú H a R2 a R3 sú viazané do aromatického kruhu),
- 5-karboxy-l,2,3-benzotriazol-l-yl-L-alanŕn (R2 a R3 sú odlišné a znamenajú [-CR5=CR6-], kde R5 a R6 v prípade R3 sa rovnajú Hav prípade R2 R5 sa rovnajú H a R6 sa rovná -COOH, a R2 a R3 sú viazané do aromatického kruhu),
- 5-karboxy-l,2,3-benzotriazol-2-yl-alanín (R2 a R3 sú odlišné a znamenajú [-CR5-CR6-], kde R5 a R6 v prípade R3 sa rovnajú Hav prípade R2 R5 sa rovnajú H a R6 sa rovná -COOH, a R* a R3 sú viazané do aromatického kruhu),
- l,2,4-triazol-3-yl-L-cysteín,
- tiazol-2-yl-L-cysteín,
- imidazol-2-yl-l-cysteín,
- tien-2-yl-L-cysteín,
- pyridín-2-yl-L-cysteín,
- pyrimidin-2-yl-L-cysteín,
- benzotiazol-2-yl-L-cysteín,
- benzoxazol-2-yl-L-cysteín.
Je výhodné, ak sa produkt po odstránení biomasy pomocou štandardne používanej metódy (napr. filtrácia, centrifugácia) izoluje zo zvyšku kultúry. Takéto metódy na izoláciu aminokyselín sú odborníkovi dobre známe. Patria k nim napr. extrakcia, adsorbcia, ionomeničová chromatografia, precipitácia, kryštalizácia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady slúžia na ďalšie objasnenie postupu. Bakteriálny kmeň Escherichia coli W3110/ /pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306, ktorý bol použitý na realizáciu jednotlivých príkladov, bol uložený v DSMZ (Nemecká zbierka mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH, D-38142 Braunschweig) pod číslom DSM 13495 podľa Budapeštianskej dohody.
Príklad 1: Laboratórna kultúra produkčných kmeňov
Ako laboratórna kultúra na fermentáciu sa použilo 20 ml LB-média (10 g/1 trypton, 5 g/1 kvasnicový extrakt, 10 g/1 NaCl), dodatočne sa pridalo 15 mg/1 tetracyklínu, médium sa zaočkovalo kmeňom W3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 (opísaný v EP 0885962 Al, zodpovedá US prihláške so sériovým číslom SN 09/097759 (tuná zahrnutej ako odkaz) a inkubovalo pri teplote 30 °C a pri 150 rpm v trepačke. Po siedmich hodinách sa celá dávka preniesla do 100 ml SMI média (10 g/1 K2HPO4; 3 g/1 KH2PO4; 5 g/1 (NH4)2SO4; 0,3 g/1 MgSO4 x 7 H2O; 0,015 g/1 CaCl2 x 2 H2O; 0,002 g/1 FeSO4 x 7 H2O; 1 g/1 Na3 citrátu x 2 H2O; 0,1 g/1 NaCl; 1 ml/1 roztoku stopových prvkov, ktorý pozostával z: 0,15 g/1 Na2MoO4 x 2 H2O; 2,5 g/1 Na3BO3; 0,7 g/1 CoCL x 6 H2O; 0,25 g/1 CuSO4 x 5 H2O; 1,6 g/1 MnCl2 x 4 H2O; 0,3 g/1 ZnSO4 x 7 H2O), suplementovanom 5 g/1 glukózy, 0,5 mg/1 vitamínu BI a 15mg/l tetracyklínu. Nasledovala ďalšia inkubácia pri 30 °C v trvaní 17 hodín pri 150 rpm.
Príklad 2: Fermentačná výroba S-[2,3-dixydroxy-4-merkaptobutyl]-L-cysteínu
Ako fermentor slúžil prístroj Biostat M firmy Braun Biotech (Melsungen, D) s maximálnym objemom kultúry 2 1. Fermentor s 900 ml fermentačného média (15 g/1 glukózy; 10 g/1 tryptonu; 5 g/1 kvasnicového extraktu; 5 g/1 (NH4)2SO4; 1,5 g/1 KH2PO4; 0,5 g/1 NaCl; 0,3 g/1 MgSO4 x 7 H2O; 0,015 g/1 CaCl2 x 2 H2O; 0,075 g/1 FeSO4 x 7 H2O; 1 g/1 Na3citrátu x 2 H2O; 1 ml/1 roztoku stopových prvkov, 5 mg/1 vitamínu BI a 15mg/l tetracyklínu, nastaveného na pH 7,0 s 25 % amoniakom bol naočkovaný laboratórnou kultúrou (optická hustota pri 600 nm cca. 3) opísanou v príklade 1. Počas fermentácie bola nastavená teplota 32 °C a hodnota pH bola udržovaná na konštantnej hodnote 7,0 prostredníctvom pridávania 25 % amoniaku. Kultúra bola okysličovaná sterilným stlačeným vzduchom pri 1,5 vol/voVmin. a premiešavaná miešadlom pri otáčkach 200 rpm. Po poklesnutí saturácie kyslíkom na hodnotu 50 % bol počet otáčok prostredníctvom kontrolného prístroja zvýšený až na hodnotu 1200 rpm tak, aby sa udržala 50 % saturácia kyslíkom (stanovená s pO2 sondou, kalibrovaná na 100 % saturáciu pri 900 rpm). Po 8 hodinách bol pridaný 1 M roztok ditiotreitolu rýchlosťou 2 mmol/hod. Glukóza bola pridaná z 56 % zásobného roztoku, len čo obsah vo fermentore klesol z počiatočných 15 g/1 na cca. 5 až 10 g/1. Glukóza bola pridávaná prietokovou rýchlosťou 8 až 14 ml/h, keď bola koncentrácia glukózy udržovaná konštantné medzi 0,5 až 10 g/1. Stanovenie glukózy bolo realizované na glukózovom analyzátore firmy YSI (Yellow Springs, Ohio, USA). Fermcntácia trvala 48 hodín. Po tomto čase boli odobraté vzorky a bunky boli oddelené od kultúrneho média centrifúgáciou. Výsledné zvyšky kultúry boli odseparované prostredníctvom reverznej fázy HPLC na LUNA 5 μ C18 (2) kolóne (Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland). Ako elučný roztok slúžila zriedená kyselina fosforečná (0,1 ml koncentrovanej kyseliny fosforečnej /1) pri prietokovej rýchlosti 0,5 ml/min. S-merkaptodihydroxybutyl-L-cysteín bol vymytý v elučnom čase 86,7 min. Výťažok predstavoval 2,5 g/1.
Príklad 3: Fermentačná výroba S-fenyl-L-cysteínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príklade 1 a 2. Po 8 hodinách bola pridaná IM suspenzia Na-tiofenolu rýchlosťou 2 mmol/h.
S-fenyl-L-cysteín bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 88 min. Výťažok predstavoval 2,1 g/1.
Príklad 4: Fermentačná výroba 1,2-Pyrazolyl-L-alanínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príklade 1 a 2. Po 8 hodinách bol pridaný IM roztok 1,2-pyrazolu rýchlosťou 4 mmol/h.
1,2-pyrazolyl-L-alanín bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 8,4 min. Výťažok predstavoval 6,1 g/1.
Príklad 5: Fermentačná výroba 1,2,4-triazolyl-L-alanínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Po 8 hodinách bol pridaný IM roztok
1,2,4-triazolu rýchlosťou 4 mmol/h.
1,2,4-Triazol-l-yl-L-alanín bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 5,8 min. Výťažok predstavoval 4,6 g/1.
Príklad 6: Fermentačná výroba 1,2,3,4-tetrazolyl-L-alanínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Po 8 hodinách bol pridaný IM roztok
1.2.3.4- tetrazolu rýchlosťou 4 mmol/h.
Pri fermentácii vznikajú oba izoméry 1,2,3,4-tetrazol-l-yl-L-alanín a l,2,3,4,-tetrazol-2-yl-L-alanín. Tieto boli vyeluované HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 5,4, respektíve 5,7 min. Výťažok predstavoval ako suma oboch izomérov 3,9 g/1.
Príklad 7: Fermentačná výroba 5-karboxy-l,2,3-benzotriazolyl-L-alanínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Po 8 hodinách bola pridaná IM suspenzia kyseliny l,2,3-benzotriazol-5-karboxylovej v 0,5 M NaOH rýchlosťou 4 mmol/h.
Pri fermentácii vznikajú všetky tri izoméry 5-karboxy-l,2,3-benzotiazol-l-yl-L-alanin, 5-karboxy-1,2,3-benzotiazol-2-yl-L-alanín a 5-karboxy-l,2,3-benzotiazol-3-yl-L-alanín, pričom je ale hlavným produktom 5-karboxy-l,2,3-benzotiazol-2-yl-L-alanín. Tento bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 67,5 min. Výťažok predstavoval 5,2 g/1.
Príklad 8: Fermentačná výroba l,2,4-oxadiazolidín-2,5-dionyl-L-alanínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Po 8 hodinách bol pridaný 2M roztok
1.2.4- oxadiazolidín-2,5-dionu v dimetylsulfoxide rýchlosťou 2 mmol/h.
l,2,4-Oxadiazolidin-2,5-dion bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 5,6 min. Výťažok predstavoval 2,2 g/1.
Príklad 9: Izolácia 1,2-pyrazolyl-L-alanínu z fermentačnej zmesy
Najprv boli prostredníctvom centrifugácie pri 5000g z 0,6 1 fermentačného roztoku oddelené bunky. Zvyšok bol zmiešaný z 10 g aktívneho uhlia kvôli odfarbeniu, 2 hodiny bol miešaný pri izbovej teplote a nakoniec prefiltrovaný. Získaný roztok bol pomocou 2M NaOH nastavený na hodnotu pH 6,0, nanesený na kationexovú kolónu Amberjet 1200 / H+ (Rohm and Haas S.A., Chauny, France; 250 ml Gelbett) a naviazané substancie boli vyeluované s IM roztokom NaCl. Elučné frakcie boli spojené dohromady (500 ml), s 2 M roztokom NaOH nastavené na hodnotu pH 6,0 a následne rozdelené na 100 ml frakcie. Vzorka bola uskladnená na 16 hodín pri teplote 4 °C. Výsledný kryštalizát bol získaný prostredníctvom filtrácie, premytý 50 ml etanolu a nakoniec vysušený.
Príklad 10: Fermentačná výroba S-tiazol-2-yl-L-cysteínu
Baktére boli kultivované spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Po 8 hodinách bol pridaný IM roztok 2-merkaptotiazolu rýchlosťou 2 mmol/h.
S-tiazol-2-yl-L-cystein bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 33,7 min. Výťažok predstavoval 6,1 g/1.
Príklad 11: Fermentačná výroba S-l,2,4-triazol-3-yl-L-cysteínu
Baktérie boli kultivované spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Po 8 hodinách bol pridaný IM roztok 3-merkaptotriazolu rýchlosťou 2 mmol/h.
S-triazol-3-yl-Ľ-cysteín bol vyeluovaný HPLC metódou opísanou v príklade 2 v elučnom čase 8,2 min. Výťažok predstavoval 5,5 g/1.

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob výroby neproteinogénnych L-aminokyselín priamou fermentáciou kmeňa mikroorganizmu s modifikovanou cys-E-alelou, vyznačujúci sa tým, že sa počas fermentácie do fermentačnej várky pridáva nukleofilná zlúčenina v takom množstve, ktoré vedie k produkcii neproteinogénnych L-aminokyselín týmto kmeňom mikroorganizmu.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že po skončení fermentácie sa neproteinogénne L-aminokyseliny oddelia od fermentačnej zmesi pomocou známych metód.
  3. 3. Spôsob podľa nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa pridáva nukleofilná zlúčenina, ktorá obsahuje zvyšok vybratý zo skupiny:
    H H
    Η-S-, - N-N=, -N-O-.
  4. 4. Spôsob podľa nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa pridáva nukleofilná zlúčenina vybraná z nasledujúcej skupiny:
    - tiol vo všeobecnom tvare (1):
    H-S-R,, kde R1 predstavuje monovalentný substitučný alebo nesubstítuentný alkylový, alkoxy, arylový alebo heteroarylový zvyšok s maximálne 15 atómami C;
    - azol všeobecného vzorca (2) alebo (3):
    (3), ako aj ich estery, étery alebo soli, kde X a Y sú zhodné alebo odlišné a znamenajú CR4 alebo N a R4 znamená -H, -COOH, -OH, -NH2, -NO2’, -SH, -SO3', -F, -Cl, -Br, -I, Ci-C5-alkylkarbonyl- alebo R1 a
    R1 má význam už opísaný pri vzorci (1) a kde R2 a R3 sú zhodné alebo odlišné a znamenajú R4 alebo kde C1 a C2 vo vzorci (3) sú namiesto substituentov R2 a R3 spojené do kruhu pomocou mostíka [-CR5R6-]a s „a” rovnajúcim sa 1,2, 3 alebo 4, kde R5 a R6 sú zhodné alebo odlišné a znamenajú R4 a jedna alebo viaceré nesusediace skupiny [-CR5R6-] môžu byť nahradené kyslíkom, sírou alebo prípadne CrC5-alkyl-substituovaným iminovým zvyškom a dve susediace skupiny [-CR5R6-] môžu byť nahradené skupinou [-CRS=CR6-] alebo skupinou [-CR5-N-J, - izoxazolinon všeobecného vzorca (4) alebo (5):
    ako aj ich estery, étery alebo soli, kde X, R1, R2 a R3 majú už menovaný význam a kde C1 a C2 vo vzorci (5) môžu byť namiesto substituentov R2 a R3 spojené do kruhu pomocou mostíka definovanom vo vzorci (3).
  5. 5. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa používa kmeň mikroorganizmov vybraný z nasledujúcej skupiny kmeňov: kmene s modifikovanými cysE alelami; kmene obsahujúce efflux gény; kmene so zmenenou cysB aktivitou; kmene získavané použitím nešpecifických mutagénnych metód kombinovaných so skriningovými metódami na nadprodukciu cysteínu alebo znížené odbúravanie cysteínu.
  6. 6. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa používa kmeň mikroorganizmov - Escherichia coli.
  7. 7. Spôsob podľa nárokov 1, 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že v prípade kultivácie kmeňa mikroorganizmov vo fermentore ide o kontinuálnu kultúru, „batch“-kultúru, (kultúra s dávkovaním) alebo „fed-batch“ kultúru, (kultúra s dávkovaním výživných látok).
  8. 8. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že zdroj uhlíka a nukleofilná zlúčenina sa pridávajú počas fermentácie kontinuálne.
  9. 9. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že pridávanie nukleofilnej zlúčeniny začína 6-8 hodín od začiatku fermentácie a trvá až dokonca fermentácie.
  10. 10. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že množstvo pridanej nukleofilnej zlúčeniny sa pohybuje v rozsahu od 10 do 1000 mmol na liter počiatočného objemu fermentačného média.
  11. 11. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že ako zdroj uhlíka sa používajú cukor, alkoholový cukor alebo organické kyseliny.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že pridávanie zdroja uhlíka sa uskutočňuje v takej forme, ktorá umožňuje, udržiavanie obsahu glukózy vo fermentore v rozsahu od 0,1 do 50 g/1.
  13. 13. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že ako zdroj dusíka sa používa amoniak, amónna soľ alebo proteínový hydrolyzát.
  14. 14. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že hodnota pH fermentačného média leží v rozsahu od 4 do 10 a inkubačná teplota medzi 15 až 45 °C.
  15. 15. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 14, vyznačujúci sa tým, že metóda sa realizuje za aeróbnych rastových podmienok.
    5
  16. 16. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 15, v y z n a č u j ú c i sa tým, že neproteinogénne L-aminokyseliny sa izolujú po oddelení biomasy z fermentačného média pomocou filtrácie alebo centrifugácie a zo zvyšku kultúry pomocou extrakcie, adsorbcie, inomeničovej chromatografie, precipitácie alebo kryštalizácie.
  17. 17. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že sa v prípade ncpro-
    10 teinogénnej aminokyseliny ide o aminokyselinu v L-konfigurácii vo všeobecnom tvare (6):
    Ĺ (6) , kde Z zodpovedá jednomocnému zvyšku zo skupiny (7) až (13) (12) , ako aj ich esterov, éterov alebo solí,
    15 a R1, R2, R3, R4, X a Y majú význam definovaný pri vzorcoch (1) až (5).
  18. 18. Zlúčenina zvolená zo skupiny 1,2,3,4-terazol-l-yl-L-alanínu (14), l,2,3,4-terazol-2-yl-L-alanínu (15),
    1,2,3-triazol-l-yl-L-alanínu (16), l,2,3-triazol-2-yl-L-alanínu (17) a ich esterov, éterov alebo solí, K (16) pričom R1, R2, R3 a R4 majú význam uvedený v nároku 4.
  19. 19. Derivát S-heteroaryl-L-cysteínu vzorca
    COOH
    S
    R7 (18), pričom R7 má nasledujúce významy:
    pyrolylový, pyrazolylový, tetrazolylový, tiazolylový, oxazolylový, furanylový, pyridinylový, pyrazinylový, 5 benzimidazolylový, benztriazolylový a purinylový zvyšok.
SK1348-2001A 2000-09-21 2001-09-21 Spôsob fermentačnej výroby neproteinogénnych L-aminokyselín SK286163B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10046934A DE10046934A1 (de) 2000-09-21 2000-09-21 Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK13482001A3 SK13482001A3 (sk) 2002-04-04
SK286163B6 true SK286163B6 (sk) 2008-04-07

Family

ID=7657192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1348-2001A SK286163B6 (sk) 2000-09-21 2001-09-21 Spôsob fermentačnej výroby neproteinogénnych L-aminokyselín

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6756216B2 (sk)
EP (1) EP1191106B1 (sk)
JP (1) JP4240864B2 (sk)
KR (1) KR100475985B1 (sk)
CN (1) CN1250735C (sk)
AT (1) ATE265541T1 (sk)
AU (1) AU758402B2 (sk)
BR (1) BR0104188A (sk)
CA (1) CA2357469A1 (sk)
DE (2) DE10046934A1 (sk)
DK (1) DK1191106T3 (sk)
ES (1) ES2220639T3 (sk)
HU (1) HUP0103764A2 (sk)
MX (1) MXPA01009508A (sk)
PL (1) PL349759A1 (sk)
RU (1) RU2226550C2 (sk)
SK (1) SK286163B6 (sk)
TW (1) TWI258507B (sk)
ZA (1) ZA200107763B (sk)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6579705B2 (en) 2001-04-04 2003-06-17 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids
WO2004041274A1 (en) * 2002-11-05 2004-05-21 Arena Pharmaceuticals, Inc. Benzotriazoles and methods of prophylaxis or treatment of metabolic-related disorders thereof
DE10331291A1 (de) * 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
WO2011143430A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Abbott Laboratories Indazole inhibitors of kinase
US8889730B2 (en) 2012-04-10 2014-11-18 Pfizer Inc. Indole and indazole compounds that activate AMPK
US9394285B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Pfizer Inc. Indole and indazole compounds that activate AMPK
CN103614428B (zh) * 2013-06-26 2017-08-04 山东鲁抗医药股份有限公司 一种发酵生产l‑色氨酸的方法
DE102013219016A1 (de) 2013-09-20 2015-03-26 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids
US10773049B2 (en) 2016-06-21 2020-09-15 Ventec Life Systems, Inc. Cough-assist systems with humidifier bypass
EP4441237A1 (de) 2021-11-29 2024-10-09 Wacker Chemie AG Verfahren zur herstellung von taurin
KR20240108559A (ko) 2021-11-29 2024-07-09 와커 헤미 아게 L-시스테인산의 제조 방법

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE23331T1 (de) * 1979-11-30 1986-11-15 Fujisawa Pharmaceutical Co 5-thio-tetrazolverbindungen und ihre herstellung.
EP0095029B1 (en) * 1979-11-30 1986-11-05 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. 5-thio-tetrazol compounds and their preparation
US4420477A (en) * 1979-11-30 1983-12-13 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Cephem compounds
JPS57120421A (en) * 1981-01-16 1982-07-27 Tokai Kasei Kogyo Kk Manufacture of foamed product lined with core material
CA1292200C (en) * 1987-04-24 1991-11-19 Tatsuo Miyazawa Method for producing protein containing nonprotein amino acids
KR0130196B1 (ko) * 1990-02-15 1998-04-03 도바 다다스 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 발효법
US5646167A (en) * 1993-01-06 1997-07-08 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamix acids
DE19539952A1 (de) * 1995-10-26 1997-04-30 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten
US5728555A (en) * 1996-09-30 1998-03-17 Monsanto Company Preparation of d-amino acids by direct fermentative means
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
DE19726083A1 (de) 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
JP3966583B2 (ja) * 1997-06-23 2007-08-29 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JPH11106398A (ja) * 1997-10-01 1999-04-20 Morinaga Milk Ind Co Ltd ペプチド誘導体および抗真菌剤
US6191168B1 (en) * 1998-06-02 2001-02-20 Edward Rubenstein Methods for the use of nonprotein amino acids as therapeutic agents
DE19849625A1 (de) * 1998-10-28 2000-05-04 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren
DE19949579C1 (de) * 1999-10-14 2000-11-16 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten

Also Published As

Publication number Publication date
RU2226550C2 (ru) 2004-04-10
US6939967B2 (en) 2005-09-06
BR0104188A (pt) 2002-05-07
EP1191106B1 (de) 2004-04-28
DE50102109D1 (de) 2004-06-03
TWI258507B (en) 2006-07-21
SK13482001A3 (sk) 2002-04-04
EP1191106A1 (de) 2002-03-27
US20050222426A1 (en) 2005-10-06
AU7556201A (en) 2002-03-28
US20040197879A1 (en) 2004-10-07
ATE265541T1 (de) 2004-05-15
AU758402B2 (en) 2003-03-20
JP4240864B2 (ja) 2009-03-18
ES2220639T3 (es) 2004-12-16
CN1250735C (zh) 2006-04-12
US7015331B2 (en) 2006-03-21
HUP0103764A2 (en) 2006-01-30
DK1191106T3 (da) 2004-08-16
JP2002165598A (ja) 2002-06-11
US20020039767A1 (en) 2002-04-04
CA2357469A1 (en) 2002-03-21
MXPA01009508A (es) 2003-05-19
KR20020023130A (ko) 2002-03-28
US6756216B2 (en) 2004-06-29
PL349759A1 (en) 2002-03-25
DE10046934A1 (de) 2002-04-18
CN1344801A (zh) 2002-04-17
ZA200107763B (en) 2002-05-16
KR100475985B1 (ko) 2005-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7015331B2 (en) Non-proteinogenic L-amino acids
Maier Semisynthetic production of unnatural L-α-amino acids by metabolic engineering of the cysteine-biosynthetic pathway
JP2006325607A (ja) 非タンパク質ｌ−アミノ酸の製造方法
EP1382684B1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie
US5981239A (en) Synthesis of optically active phenylalanine analogs using Rhodotorula graminis
US20120136159A1 (en) The method of synthesizing ergothioneine and analogs
SK286164B6 (sk) Spôsob fermentačnej výroby O-acetyl-L-serínu
JPS61242589A (ja) Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法
DE10116881A1 (de) Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
DE10121515A1 (de) Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
JPH0272891A (ja) Ｓ−カルボキシメチル−ｌ−システイン誘導体の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20180921