DE102013219016A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ-Glutamylcystein und dessen Derivaten bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin bei dem ein zur γ-Glutamylcystein-Produktion geeigneter prokaryotischer Mikroorganismenstamm in einem Fermentationsmediums kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium zu Beginn der γ-Glutamylcystein-Produktionsphase auf einen pH-Wert größer 5,0 und kleiner 6,5 eingestellt wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ-Glutamylcystein (γGC) und den Derivaten dieses Dipeptids, γ-Glutamylcystin und bis-γ-Glutamylcystin.
• Der Stand der Technik zur fermentativen Herstellung dieser Verbindungen ist in DE 102013209274 ausführlich beschrieben.
• Als prokaryotische Produzenten für γ-Glutamylcystein sind in US 20100203592 A1 verschiedene Escherichia coli-Stämme beschrieben, welche alle eine erhöhte gshA-Expression aufweisen. Darüber hinaus besitzen diese Stämme eine normale oder sogar erhöhte Glutathionsynthetase-Aktivität im Vergleich zum entsprechenden Ausgangsstamm. Die Ausbeuten mit diesen Stämmen liegen bei maximal 262 mg/l.
• Als weitere prokaryotische Produzenten für γ-Glutamylcystein sind in DE 102013209274 verschiedene E. coli-Stämme beschrieben, welche alle eine verminderte Glutathionsynthetase-Aktivität besitzen, und zusätzlich eine höhere γ-Glutamylcystein-Synthetase-Aktivität aufweisen, als ein vergleichbarer Stamm mit einer ebenfalls verminderten Glutathion-Synthetase-Aktivität. Diese Anmeldung beschreibt darüber hinaus, dass durch Fermentation der dort offenbarten E. coli-Stämme γ-Glutamylcystein-Titer von 5,7 g/l bis zu 21,8 g/l erzielt werden können (siehe DE102013209274 , Beispiele 3 und 4).
• Aufgrund laufend steigender Rohstoff- und Energiekosten ist es erstrebenswert, die Produkt-Ausbeute eines mikrobiellen Prozesses kontinuierlich zu steigern, um auf diese Weise die Wirtschaftlichkeit des entsprechenden Prozesses zu verbessern. Neben der gentechnischen Veränderung von Mikroorganismen, welche als Basis für die Herstellung eines bestimmten Naturstoffs genutzt werden, spielt auch die Optimierung des entsprechenden Fermentationsverfahrens, d.h. die Art und Weise der Kultivierung der Zellen, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Verbesserung eines Produktionsprozesses.
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ-Glutamylcystein und dessen Derivaten bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin zur Verfügung zu stellen.
• Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass das Fermentationsmedium zu Beginn des Verfahrens einen pH-Wert von pH 6,8 bis pH 7,3 hat und der pH-Wert ab Beginn der Produktionsphase über einen Zeitraum von 0,5 h bis 2,5 h auf einen sauren pH-Wert zwischen 5,0 und 6,5 eingestellt wird.
• Generell ist es bekannt, prokaryotische Mikroorganismen bei unterschiedlichen pH-Werten zu kultivieren. So werden beispielsweise für E. coli pH-Werte des Fermentationsmediums im Bereich von 4 bis 10 angegeben (siehe Absatz [0036] in EP 1191106 B1 ). Laut Stand der Technik wird für die fermentative Herstellung von γ-Glutamycystein oder Glutathion mit einem prokaryotischen Mikroorganismus ein pH-Wert des Mediums im Bereich von 5,0 bis 9,0 genutzt, wobei ein pH Bereich von 6,0 bis 7,5 bevorzugt ist (siehe die Absätze [0173] und [0221] in US 20100203592A1 ). Eine Korrelation zwischen pH-Wert und Produktausbeute (γGC und/oder Glutathion) ist in US 20100203592 A1 jedoch nicht beschrieben. Überraschenderweise wurde aber gefunden, dass die extrazellulären Ausbeuten an Gesamt-γ-Glutamylcystein (γ-Glutamycystein + γ-Glutamycystin + bis-γ-Glutamycystein) dadurch gesteigert werden können, wenn der pH-Wert des Fermentationsmediums, in dem der für die γ-Glutamylcystein-Produktion geeignete, prokaryotische Mikroorganismus kultiviert wird, zu Beginn der Produktionsphase von 7,0 schrittweise auf Werte zwischen 5,0 und 6,5 abgesenkt wird (siehe Tabelle 1). Die höchsten Titer an Gesamt-γ-Glutamylcystein werden dabei bei einem recht sauren pH-Wert von 5,0 erzielt. Dies ist dahingehend ungewöhnlich, da der zur γ-Glutamylcystein-Produktion genutzte Mikroorganismus, E. coli, für ein optimales Wachstum, einen weniger sauren bis leicht basischen pH-Wert im Bereich von 6,4 bis 7,2 benötigt (Manderson et al., 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33: 173–182).
• Für das erfindungsgemäße Verfahren wird daher während der gesamten Produktionsphase ein pH-Wert des Fermentationsmediums im sauren Bereich zwischen 5,0 und 6,5 eingehalten. Bevorzugt ist ein pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 5,5.
• Vorzugsweise wird der pH Wert mit Beginn der Produktionsphase automatisch auf die genannten pH-Werte langsam (vorzugsweise 0,5 pH-Einheiten pro 0,5 h) abgesenkt. Der so erreichte pH-Wert wird anschließend bis zum Fermentationsende gehalten.
• Vorzugsweise werden die Zellen des Mikroorganismenstammes aus dem Fermentationsmedium entfernt und die gewünschten Produkte aus dem Kulturmedium aufgereinigt.
• Für das erfindungsgemäße Verfahren sind alle durch Fermentation kultivierbaren prokaryotischen Mikroorganismenstämme geeignet, die den Biosyntheseweg für γ-Glutamylcystein aufweisen, und die γ-Glutamylcystein und dessen Derivate bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin ins Medium ausschleusen. Beispiele solcher Stämme sind offenbart in US 20100203592 A1 und DE 102013209274 , wobei die in DE 102013209274 genannten Stämme bevorzugt eingesetzt werden.
• Die Kultivierung (Fermentation) der Mikroorganismenstämme erfolgt bevorzugt im technischen Maßstab nach üblichen, dem Fachmann bekannten Fermentationsverfahren.
• Die Fermentation findet dabei vorzugsweise in einem üblichen Bioreaktor, beispielsweise einem Rührkessel, einem Blasensäulen-Fermenter oder einem Airlift-Fermenter statt. Besonders bevorzugt ist ein Rührkessel-Fermenter. Unter technischem Maßstab ist dabei eine Fermentergröße von mindestens 2 l zu verstehen. Bevorzugt sind Fermenter mit einem Volumen mehr als 5 l, besonders bevorzugt Fermenter mit einem Volumen von > 50 l.
• Die Kultivierung der Zellen für eine γ-Glutamylcystein-Produktion wird unter aeroben Wachstumsbedingungen durchgeführt, wobei der Sauerstoff-Gehalt während der Fermentation bei maximal 50 % Sättigung eingestellt wird. Die Regulation der Sauerstoff-Sättigung in der Kultur erfolgt dabei automatisch über die Gaszufuhr und die Rührgeschwindigkeit.
• Als Kohlenstoffquelle dienen vorzugsweise Zucker, Zuckeralkohole, organische Säuren oder zuckerhaltige Pflanzenhydrolysate. Besonders bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Kohlenstoffquelle Glukose, Fruktose, Laktose, Glycerin oder Gemische, die zwei oder mehr dieser Verbindungen enthalten, eingesetzt. Bevorzugt wird die Kohlenstoffquelle der Kultur so zudosiert, dass der Gehalt der Kohlenstoffquelle im Fermenter während der Produktionsphase 10 g/l nicht übersteigt. Bevorzugt ist eine maximale Konzentration von 2 g/l.
• Die Produktionsphase des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens beginnt mit dem Zeitpunkt, ab dem erstmals γ-Glutamylcystein, bis-γ-Glutamylcystin oder γ-Glutamylcystin in der Kulturbrühe nachgewiesen werden kann und dauert bis zum Ende der Kultivierung an. Der Nachweis von γ-Glutamylcystein, bis-γ-Glutamylcystin oder γ-Glutamylcystin in der Kulturbrühe erfolgt dabei wie in Bsp. 2 beschrieben. Typischerweise beginnt diese Phase ca. 8–12 h nach Inokulation des Produktionsfermenters mit einer Vorkultur.
• Als Stickstoff-Quelle werden im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Ammoniak, Ammoniumsalze oder Proteinhydrolysate verwendet. Bei Verwendung von Ammoniak als Korrekturmittel zur pH-Stabilisierung wird während der Fermentation regelmäßig diese Stickstoff-Quelle nachdosiert.
• Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d.h. in µM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink und Nickel zugesetzt werden.
• Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat), Aminosäuren (z.B. L-Glutaminsäure, L-Cystein) und Vitamine (z.B. B1, B6) dem Medium zugesetzt werden. L-Glutaminsäure kann dabei entweder direkt als Säure oder in Form eines ihrer Salze, wie z.B. Kalium- oder Natrium-Glutamat, einzeln oder als Gemisch, eingesetzt werden. Bevorzugt ist der Einsatz in Form von Kalium-Glutamat.
• Als komplexe Nährstoffquellen können z.B. Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojamehl oder Malzextrakt zum Einsatz kommen.
• Die Inkubationstemperatur für mesophile Mikroorganismen wie z.B. E. coli beträgt vorzugsweise 15–45 °C, besonders bevorzugt 30–37 °C.
• Mikroorganismen, die nach dem beschriebenen Verfahren fermentiert werden, sezernieren in einem Batch- oder Fedbatch-Prozess nach einer Anwachsphase in einem Zeitraum von mindestens 48 h Stunden γ-Glutamylcystein und die davon abgeleiteten Verbindungen γ-Glutamylcystin und Bis-γ-Glutamylcystin mit hoher Effizienz in das Fermentationsmedium.
• Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
• Beispiel 1: γGC-Produktion (Fermenter)
• A. Vorkultur 1 (Schüttelkolben):
• 100 ml LB-Medium mit 15 mg/l Tetracyclin wurden in einem 1 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit den in Tabelle 1 aufgelisteten E. coli-Stämmen von einer Agarkultur beimpft und für sieben Stunden auf einem Schüttler bei 130 rpm und 32°C inkubiert. Die Generierung der in Tabelle 1 aufgeführten E. coli-Stämme ist in DE 102013209274 beschrieben (siehe DE102013209274 ; Beispiele 1 bis 7).
• B. Vorkultur 2 (Vorfermenter):
• Ein Teil der jeweiligen Vorkultur 1 wurde in einen mit Fermentationsmedium gefüllten Fermenter des Typs Sixfors (Infors AG, Bottmingen, CH) überimpft, sodass zu Beginn eine optische Dichte von ca. 0,01 im Fermenter vorlag (gemessen bei 600 nm). Der verwendete Fermenter hatte ein Gesamtvolumen von 1 l und ein initiales Arbeitsvolumen von 0,7 l. Das Fermentationsmedium enthielt folgende Bestandteile: 3 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,7 g/l KH₂PO₄, 0,25 g/l NaCl, 0,6 g/l MgSO₄ × 7 H₂O, 0,03 g/l CaCl₂ × 2 H₂O, 0,15 g/l FeSO₄ × 7 H₂O, 1 g/l Na₃Citrat × 2 H₂O, 5 g/l Cornsteep Dry (CSD) und 3 ml/l Spurenelementlösung (bestehend aus 2,5 g/l H₃BO₃, 0,7 g/l CoCl₂ × 6 H₂O, 0,25 g/l CuSO₄ × 5 H₂O, 1,6 g/l MnCl₂ × 4 H₂O, 0,3 g/l ZnSO₄ × 7 H₂O, 0,15 g/l Na₂MoO₄ × 2 H₂O). Nach Sterilisation dieses Grundmediums wurden unter sterilen Bedingungen folgende Bestandteile zudosiert: 40 g/l Glukose, 0,018 g/l Vitamin B1, 0,09 g/l Vitamin B6 und 15 mg/l Tetracyclin. Der pH-Wert im Vorfermenter wurde durch Zugabe einer 25%-igen NH₄OH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische Korrektur mit einer 25%-igen NH₄OH-Lösung auf einem Wert von 7,0 gehalten. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit einer Begasungsrate von 0,7 Volumen pro Volumen pro Minute (vvm) einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll-Wert für die O₂-Sättigung während der Fermentation wurde auf 50% eingestellt. Nach Absinken der O₂-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die O₂-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 1,4 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit auf maximal 1.200 rpm kontinuierlich gesteigert. Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 32 °C so lange durchgeführt, bis eine optische Dichte von 30 bis 40 erreicht wurde (gemessen bei 600 nm). Dies war in der Regel nach ca. 17 h der Fall.
• C. Hauptkultur (Hauptfermenter):
• Die Fermentationen wurden in Fermentern des Typs BIOSTAT B-DCU der Firma Sartorius Stedim GmbH (Göttingen, D) durchgeführt. Es wurde ein Kulturgefäß mit 2 l Gesamtvolumen bei einem initialen Arbeitsvolumen von 1 l verwendet. Das Fermentationsmedium enthält folgende Bestandteile: 3 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,7 g/l KH₂PO₄, 0,25 g/l NaCl, 0,6 g/l MgSO₄ × 7 H₂O, 0,03 g/l CaCl₂ × 2 H₂O, 0,15 g/l FeSO₄ × 7 H₂O, 1 g/l Na₃Citrat × 2 H₂O, 15 g/l Cornsteep Dry (CSD) und 3 ml/l Spurenelementlösung (bestehend aus 2,5 g/l H₃BO₃, 0,7 g/l CoCl₂ × 6 H₂O, 0,25 g/l CuSO₄ × 5 H₂O, 1,6 g/l MnCl₂ × 4 H₂O, 0,3 g/l ZnSO₄ × 7 H₂O, 0,15 g/l Na₂MoO₄ × 2 H₂O). Nach Sterilisation dieses Grundmediums wurden unter sterilen Bedingungen folgende Bestandteile zudosiert: 10 g/l Glukose, 0,018 g/l Vitamin B1, 0,09 g/l Vitamin B6 und 15 mg/l Tetracyclin. Zum Animpfen der Hauptkultur wurden 100 ml der Vorkultur 2 in das Fermentergefäß überführt. Der pH-Wert im Hauptfermenter wurde zu Beginn durch Zugabe einer 25%-igen NH₄OH-Lösung auf 7,0 eingestellt und durch automatische Korrektur mit einer 25%-igen NH₄OH-Lösung auf diesem Wert gehalten. Mit Beginn der Produktionsphase wurde der pH-Wert in einer sogenannten „Rampenfunktion“ automatisch auf Werte zwischen 6,5 und 4,5 langsam abgesenkt (0,5 pH-Einheiten pro 0,5 h). Der so erreichte pH-Wert wurde anschließend bis zum Fermentationsende gehalten. Die Kulturen wurden zu Beginn mit 400 rpm gerührt und mit 2 vvm einer über einen Sterilfilter entkeimten Druckluft begast. Unter diesen Startbedingungen war die Sauerstoff-Sonde vor der Inokulation auf 100% Sättigung kalibriert worden. Der Soll-Wert für die O₂-Sättigung während der Fermentation wurde auf 50% eingestellt. Nach Absinken der O₂-Sättigung unter den Soll-Wert wurde eine Regulationskaskade gestartet, um die O₂-Sättigung wieder an den Soll-Wert heranzuführen. Dabei wurde zunächst die Gaszufuhr kontinuierlich erhöht (auf max. 5 vvm) und anschließend die Rührgeschwindigkeit auf maximal 1.500 rpm kontinuierlich gesteigert. Die Fermentationen wurden bei einer Temperatur von 32 °C durchgeführt. Sobald der Glukose-Gehalt im Fermenter von anfänglich 10 g/l auf ca. 2 g/l abgesunken war, erfolgte eine kontinuierliche Zudosierung einer 60%-igen Glukose-Lösung. Die Fütterungsrate wurde so eingestellt, dass die Glukosekonzentration im Fermenter 2 g/l fortan nicht mehr überstieg. Die Glukose-Bestimmung wurde mit einem Glukose-analysator der Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt. Nach 5 h Fermentationszeit erfolgte die Zufütterung einer Schwefelquelle in Form einer sterilen 1,5 M (NH₄)₂SO₄-Stammlösung (Ammoniumsulfat) mit einer Rate von 8–17 mmol/l pro Stunde (Durchschnitt = 11 mmol/l pro Stunde). Nach 16 h wurde der Hauptkultur zusätzlich Glutamat in Form einer sterilen 2,3 M Kaliumglutamat-Stammlösung mit einer Rate von 7,4 mmol/l pro Stunde zugesetzt. Die Fermentationsdauer betrug 72 Stunden. Nach 24 h, 48 h und 72 h wurden Proben entnommen und nach Reduktion mit Dithiothreitol der Anteil an „Gesamt-γ-Glutamylcystein“ im Kulturüberstand mittels HPLC-Analytik bestimmt. Die Ausbeutesteigerungen durch Absenkung des pH-Wertes im Vergleich zu Fermentationen mit einem durchweg konstanten pH-Wert von 7,0 sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
• Beispiel 2: Analytik von γ-Glutamylcystein und den Derivaten
• Unter dem Begriff „Gesamt-γ-Glutamylcystein“ sind γ-Glutamylcystein und die daraus gebildeten Oxidationsprodukte bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin, die während der Fermentation entstehen und im Kulturüberstand akkumulieren, zusammengefasst. Die Konzentrationen an „Gesamt-γ-Glutamylcystein“ wurden mittels HPLC-Analytik bestimmt.
• A. Vorbehandlung der Proben
• Für die zu vermessenen Fermenterproben wurden zunächst die Mikroorganismen durch einen Zentrifugationsschritt und eine anschließende Sterilfiltration von der Fermentationsbrühe getrennt. Für die exakte Bestimmung der „Gesamt-γ-Glutamylcystein-Konzentration“ wurden die γ-Glutamylcystein-Derivate in der zu overmessenden Probe 1 Stunde bei Raumtemperatur (22 C) mit einem molaren Überschuss an Dithiothreitol (DTT) reduziert. Da die reduzierende Wirkung von DTT nur bei neutralem bis alkalischem pH-Wert vollständig erfolgt, wurde der pH-Wert der Probe, wenn nötig, zuvor mit konzentrierter Kalilauge (KOH) auf einen pH-Wert > 7,0 eingestellt.
• B. HPLC-Analytik
• Nach Ansetzen entsprechender Verdünnungen mit vollentsalztem Wasser erfolgte die HPLC-Analytik mit der Säule Synergi 4µm Hydro-RP 250 × 4,6 mm (Phenomenex Ltd., Aschaffenburg, D) bei 20 °C. Als Fließmittel dienten 0,5% (v/v) Phosphorsäure (A) bzw. Acetonitril (B). Zur Trennung von γ-Glutamylcystein aus einem zellfreien und reduzierten Substanzgemisch wurde folgende Methode für die HPLC genutzt.
• • Flussrate = 0,5 ml/min
• • Detektion bei 200 nm mit Diodenarray-Detektor (DAD)
• • Die Trennung erfolgt isokratisch bei 100 % A. Durch einen Spülschritt bei 100% B wird die Säule nach jedem Lauf gereinigt.
• Als Referenzsubstanz, zur Bestimmung der Retentionszeit von γ-Glutamylcystein und der finalen Konzentration in den zu vermessenen Proben, diente reduziertes γ-Glutamylcystein der Firma Sigma Aldrich GmbH (Steinheim, D). Die Konzentration an „Gesamt-γ-Glutamylcystein“ wurde anhand der Peakflächen im Chromatogramm berechnet (siehe 1). Tabelle 1: Einfluss des pH-Wertes auf die finalen γ-Glutamylcystein-Ausbeuten. Gehalt von „Gesamt-γ-Glutamylcystein“ (γGC) nach Neutralisation der Fermenterbrühe und anschließender Reduktion der Oxidationsprodukte bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin mit Dithiothreitol:

  E. coli W3110ΔgshB mit Plasmid	Gesamt-γ-Glutamylcystein nach 72 h (g/l)
  	pH 7,0	pH 6,5	pH 6,0	pH 5,5	pH 5,0	pH 4,5*
  pgshAp-gshATTG	5,7 ± 0,3	5,8 ± 0,1	6,2 ± 0,2	6,3 ± 0,2	6,5 ± 0,3	4,1 ± 0,2
  ptufBp-gshAATG	14,4 ± 0,3	15,0 ± 0,7	15,7 ± 0,5	16,3 ± 1,0	16,8 + 0,9	7,9 ± 0,3
  ptufBp-gshAATG-serA2040	16,5 ± 1,1	17,5 ± 0,9	18,3 ± 1,7	19,0 + 1,3	19,7 + 2,1	9,5 ± 0,6
  ptufBp-gshAATG-cysE14	17,0 ± 0,9	18,1 ± 0,8	19,3 ± 1,3	20,6 ± 0,9	21,5 + 2,2	10,1 ± 0,9
  ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040	20,1 ± 1,2	21,2 ± 1,2	22,8 ± 1,3	23,9 ± 1,5	24,8 + 2,0	10,9 ± 1,1
  ptufBp-gshAATG-serA2040-orf306	16,9 ± 0,6	17,5 ± 0,6	18,6 ± 0,7	19,4 ± 0,6	20,1 + 1,4	9,9 ± 0,6
  ptufBp-gshAATG-cysE14-orf306	17,5 ± 1,1	23,4 ± 1,7	29,9 ± 1,8	35,8 ± 2,1	39,8 + 2,7	11,5 ± 0,8
  ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040- orf306	22,8 ± 1,0	26,8 ± 1,5	33,3 ± 1,2	38,9 ± 1,0	42,1 + 2,4	11,8 ± 1,0

  *Einbruch der γ-Glutamylcystein-Ausbeuten aufgrund massiver Wachstumsprobleme, der für das erfindungsgemäße Verfahren genutzten Mikroorganismen.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• DE 102013209274 [0002, 0004, 0012, 0012, 0025, 0025]
• US 20100203592 A1 [0003, 0008, 0008, 0012]
• DE 102013209274 B [0004]
• EP 1191106 B1 [0008]
• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• Manderson et al., 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33: 173–182 [0008]

Claims (5)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von γ-Glutamylcystein und dessen Derivaten bis-γ-Glutamylcystin und γ-Glutamylcystin in einer Produktionsphase, bei dem ein zur γ-Glutamylcystein-Produktion geeigneter prokaryotischer Mikroorganismenstamm in einem Fermentationsmediums kultiviert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium zu Beginn des Verfahrens einen pH-Wert von pH 6,8 bis pH 7,3 hat und der pH-Wert ab Beginn der Produktionsphase über einen Zeitraum von 0,5 h bis 2,5 h auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und 6,5 eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium zu Beginn der γ-Glutamylcystein-Produktionsphase auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 eingestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass der pH Wert des Fermentationsmediums mit Beginn der Produktionsphase automatisch auf die genannten pH-Werte um 0,5 pH-Einheiten pro 0,5 h abgesenkt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass der so erreichte pH-Wert anschließend bis zum Fermentationsende gehalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des Mikroorganismenstammes aus dem Fermentationsmedium entfernt und die gewünschten Produkte aus dem Kulturmedium aufgereinigt werden.

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