WO2018210432A1 - Mikroorganismen-stamm und verfahren zur fermentativen herstellung von himbeerketon - Google Patents

Mikroorganismen-stamm und verfahren zur fermentativen herstellung von himbeerketon Download PDF

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WO2018210432A1
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plasmid
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promoter
raspberry ketone
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PCT/EP2017/062132
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Thomas Schloesser
Fanny Lambert
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Wacker Chemie Ag
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    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the invention relates to a microorganism strain and methods for the fermentative production of raspberry ketone.
  • Raspberry ketone is the lead substance of raspberry flavor. These are 4- (4-hydroxyphenyl) -butan-2-one. Synthetically produced raspberry ketone is already used as a flavoring. The substance is responsible for the typical smell of raspberries and is therefore used for the flavoring of food. The odor threshold for the substance is 0.01 mg / L at 20 ° C in water. Although raspberry ketone can be easily prepared in a chemical synthesis, no naturally produced raspberry ketone is available on the market.
  • natural 1 refers to EU Regulation 1334/2008 of 20 January 2011 on flavorings and certain food ingredients with flavoring properties for use in and on foodstuffs.
  • This Regulation defines a "natural flavoring substance w ", with high requirements as regards:
  • the present application uses the term “natural raspberry ketone” as defined for a "natural flavoring agent” in EU Regulation 1334/2008 of January 20, 2011.
  • synthetic flavorings are increasingly being replaced by natural flavorings in the flavor industry.
  • patent FR2724666B1 discloses an alternative natural process for the production of raspberry ketone.
  • a corresponding product is not available.
  • the patent describes the reaction of rhododendrole, the alcohol of raspberry ketone, with an alcohol dehydrogenase.
  • the representation of a natural raspberry ketone from the precursor rhododendrole is not possible because the precursor must be provided in natural quality.
  • the object of the present invention is to provide a microorganism strain which allows the production of natural 4- (4-hydroxyphenyl) -butan-2- ⁇ without supplementation of the precursor p-coumaric acid in industrially relevant yields.
  • a microorganism strain comprising and expressing at least one TAL gene, a 4-CL gene, a BAS gene and a tyrA gene.
  • the TAL gene is characterized by a DNA sequence coding for a protein which has the function of a tyrosine Has ammonia lyase. Such genes are known. It is preferably SEQ ID NO 1 and variants of this sequence, which are caused by the degenerate genetic code.
  • the 4-CL gene is characterized by a DNA sequence coding for a protein which has the function of a 4-coumarate CoA ligase. Such genes are known. It is preferably SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3 and variants of these sequences, which are caused by the degenerate genetic code.
  • the BAS gene is characterized by a DNA sequence encoding a protein which has the function of a benzalacetone synthase. Such genes are known. It is preferably SEQ ID NO 4 and variants of this sequence, which are caused by the degenerate genetic code.
  • the tyrA gene is characterized by a DNA sequence encoding a protein which has the function of a chorismate mutase.
  • Such genes are known.
  • it is SEQ ID NO 5 and variants of this sequence, which are caused by the degenerate genetic code.
  • variants of this sequence which have a reduced feedback regulation against L-tyrosine.
  • it is a variant with the amino acid exchange A354V.
  • the function of the proteins in a microorganism strain according to the invention can be indirectly characterized by the product raspberry ketone, since microorganisms do not produce raspberry ketone.
  • the HPLC method described in Example 13 can be used as a detection method.
  • the microorganism strain preferably comprises one or more functional copies of the four named genes. Preferably, it comprises one to 700 copies of the four named genes. It particularly preferably comprises one to 20 copies of the four named genes.
  • the genes may be integrated into the chromosome, but they may also be present on one or more plasmids.
  • the production of raspberry ketone is preferably carried out by expressing the TAL gene, the 4-CL gene, the BAS gene and the ty- rA gene on a plasmid in a microorganism strain.
  • the invention therefore also comprises a plasmid containing a TAL gene, a 4-CL gene, a BAS gene, and a tyrA gene under the control of a functional promoter.
  • Production plasmid allows the production of raspberry ketone in a microorganism strain.
  • heterologous refers to the genes characterized by SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4, since the corresponding genes, in contrast to SEQ ID NO 5, do not come from Escherichia coli.
  • Corresponding heterologous promoters are, for example, the promoter of the Escherichia coli gapA gene, the Escherichia coli catB gene promoter, the Escherichia coli tufB gene promoter, the Escherichia coli mppA gene promoter and the proC promoter. Gene from Escherichia coli.
  • the heterologous lac, tac, trc, lambda, ara or tet promoters are known to the person skilled in the art and can be used for heterologous expression of the genes.
  • a plasmid according to the invention therefore preferably comprises the abovementioned promoters, where the promoters are located on the plasmid in such a way that they express the expression of the TAL gene, the 4-CL gene, the BAS gene and the tyrA gene Taxes.
  • the plasmid particularly preferably contains an operon construction in which the TAL gene, the 4-CL gene, the BAS gene and the tyrA gene are under the control of the catB promoter from Escherichia coli.
  • the promoter region for expressing the TAL gene the 4-CL gene, the BAS gene and the tyrA gene, it is also possible to use the natural (homologous) promoter regions of these genes.
  • plasmids in which the TAL gene, the 4-CL gene, the BAS gene and the tyrA gene are introduced, all available and genetically accessible DNA molecules can be used, which are extrachromosomally replicated in microorganisms and a selection marker include.
  • TAL gene As plasmids in which the TAL gene, the 4-CL gene, the BAS gene and the tyrA gene are introduced, it is possible to use preferably all available and genetically accessible DNA molecules which are extrachromosomally replicated in Escherichia coli and include a selection marker.
  • plasmids with a high cellular copy number in Escherichia coli eg, pUC series plasmids, pQE series plasmids, pBluescript series plasmids
  • medium copy number plasmids in Escherichia coli eg, plasmids pBR series, plasmids of the pACYC series
  • plasmids with a low copy number in Escherichia coli eg pSCIOl or pBeloBACII).
  • plasmids with an average copy number in Escherichia coli eg plasmids of the pBR series, plasmids of the pACYC series
  • Escherichia coli eg plasmids of the pBR series, plasmids of the pACYC series
  • a plasmid of the pBR series is used.
  • One possibility for producing a microorganism strain according to the invention is the introduction of a plasmid according to the invention into a starting strain.
  • microorganisms which are accessible to recombinant processes and can be cultivated by fermentation are suitable as starting strains.
  • Such microorganisms may be fungi, yeasts or bacteria.
  • they are bacteria of the phylogenetic group of Eubacteria.
  • Escherichia coli strains which have at least one compared to a wild-type strain by a factor of 2 increased metabolic flux towards chorismate. Chorismate is the starting or branching point for the biosynthesis of L-tyrosine.
  • Escherichia coli strain SV164 The construction of strain SV164 is described in US6180373 BA. The introduction of a plasmid of the invention is done for example by a common transformation method such as electroporation or CaCl a method. Plasmid-carrying clones are then selected via antibiotic resistance.
  • Selection markers known to those skilled in the art are, for example, the chloramphenicol acetyltransferase gene, which confers resistance to chloramphenicol, the neomycin phospholipase gene conferring resistance to kanamycin, the tetracycline efflux gene, the resistance to tetracycline. lin, or the ⁇ -lactamase gene that confers resistance to ampicillin and carbenicillin.
  • the TAL gene, the 4-CL gene, the BAS gene and the tyrA gene can also be integrated into the chromosome of a microorganism strain in addition to a plasmid according to the invention or alone.
  • the integration method used is preferably the systems known to the person skilled in the art with temperate bacteriophages, integrative plasmids or integration via homologous recombination.
  • Another object of the present invention is to provide a process which enables the production of natural raspberry ketone.
  • This object is achieved by a process in which a microorganism strain is cultured in a fermentation medium and 4- (4-hydroxyphenyl) -butan-2-o ⁇ is secemmed into the fermentation medium, characterized in that a microorganism according to the invention is fermented ,
  • the cultivation of a microorganism strain according to the invention in the fermenter is carried out as a continuous culture, as a batch culture or preferably as a fed-batch culture.
  • the carbon source is preferably sugar, sugar alcohols or organic acids. Glucose, lactose, sucrose or glycerol are particularly preferably used as carbon sources in the process according to the invention.
  • the dosage of the carbon source is in a form which ensures that the content of carbon source in the fermenter is maintained within the range of 0.1 g / L to 50 g / L during the fermentation. Particularly preferred is a range of 0.1 g / L to 10 g / L.
  • Ala nitrogen source are used in the process according to the invention preferably ammonia, ammonium salts or protein hydrolysates. When using ammonia as a correction agent for pH control during regular fermentation this nitrogen source is replenished.
  • salts of the elements phosphorus, chlorine, sodium, magnesium, nitrogen, potassium, calcium, iron and trace (i.e., in ⁇ concentrations) salts of the elements molybdenum, boron, cobalt, manganese, zinc, copper and nickel may be added.
  • organic acids e.g., acetate, citrate
  • amino acids e.g., L-isoleucine, L-methionine, L-phenylalanine
  • vitamins e.g., vitamin B1, vitamin B6, vitamin B12
  • Yeast extract e.g. Yeast extract, tryp- ton, corn steep liquor, soy flour or malt extract are used.
  • the incubation temperature for growing a strain according to the invention from the family of Enterobacteriaceae is preferably 28-37 ° C., particularly preferably an incubation temperature of 30-32 ° C.
  • the pH of the fermentation medium during the fermentation is preferably in the pH range from 5.0 to 8.5, particularly preferred is a pH of 7.0.
  • a microorganism strain according to the invention preferably of a strain of the family Enterobacteriaceae, more preferably of an Escherichia coli strain, under aerobic, anaerobic or microaerobic culture conditions over a period of 16 h to 150 h and in the range of the respective strain optimal growth temperature. Particularly preferred are cultivation times between 48 h and 72 h.
  • the fermentation is preferably carried out under aerobic or microaerobic growth conditions.
  • the separation of raspberry ketone from the culture can be carried out by methods known to those skilled in the art, such as centrifugation of the medium to separate the cells with subsequent extraction or distillation of the raspberry ketone from the fermentation supernatant with subsequent purification, concentration and optionally formulation or complexing of the product.
  • the detection and quantification of the raspberry ketone produced in the process according to the invention is carried out, for example, by means of an HPLC method.
  • Figure 1 shows schematically the starting plasmid pTyrA, which contains a tyrA gene from Escherichia coli.
  • Figure 2 shows schematically the precursor plasmid pStS18, which does not yet contain a 4-CL gene.
  • Figure 3 shows schematically a suitable for the preparation of raspberry ketone plasmid pStS24.
  • Figure 4 shows schematically a suitable for the preparation of raspberry ketone plasmid pStS26.
  • Figure 5 shows schematically a suitable for the preparation of raspberry ketone plasmid pStS40.
  • Figure 6 shows schematically a suitable for the preparation of raspberry ketone plasmid pStS41.
  • FIG. 7 shows schematically a plasmid pStS42 suitable for the production of raspberry ketone.
  • Example 1 Construction of precursor plaamide pStS18
  • the starting plasmid for the construction of a raspberry ketone production plasmid was the plasmid pTyrA (see Figure 1).
  • the plasmid pTyrA was deposited on April 24, 2017 with the DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38142 Braunschweig) under the number DSM 32498 in accordance with the Budapest Treaty.
  • the plasmid contains an Eacherichia coli tyrA allele encoding a chorismate mutase.
  • the TAL gene from Rhodobacter aphaeroidea was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion "HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions. which was prepared synthetically and which is characterized by SEQ ID NO 1. As primers were the
  • Oligonucleotides IFC-TAL-for (SEQ ID NO 6) and IPC-TAL-rev (SEQ ID NO 7) were used.
  • the DNA fragment of 1635 base pairs obtained in the PCR was subsequently purified by means of a DNA adsorption column of the QIAprep * Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • the Rubua idaeua BAS gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion * HD cloning kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the template used was DNA which was synthesized and characterized by SEQ ID NO 4.
  • the primers used were the oligonucleotides IFC-BAS-for (SEQ ID NO 8) and IFC-BAS-rev (SEQ ID NO 9).
  • the cloning vector pTyrA was linearized with the restriction endonuclease PstI (New England Biolabs, Frankfurt am Main). Subsequently, the linearized 4024 base pair fragment was passed over an agarose gel using the QIAquick * gel
  • the starting plasmid for the construction of the raspberry ketone production plasmid pStS24 was the plasmid pStS18 from Example 1. a) Amplification of the 4-CL gene:
  • the 4-CL gene from Rhodobacter sphaeroides was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion "HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions Template was DNA prepared synthetically and characterized by SEQ ID NO 2.
  • the primers used were the oligonucleotides IFC-4CL-Rs-for (SEQ ID NO 10) and IFC-4CL-RB-rev (SEQ ID NO 11) ,
  • the cloning vector pStS18 was linearized with the restriction endonuclease HindIII (New England Biolabs, Frankfurt am Main). Subsequently, the linearized 6812 base pair fragment was passed over an agarose gel using the QIAquick * gel
  • the 4-CL gene from Steptomyces coelicolor was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion * HD cloning kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the template used was DNA which was synthesized and characterized by SEQ ID NO 3.
  • the primers used were the oligonucleotides IFC-4CL-Sc-for (SEQ ID NO 12) and IFC-4CL-SC-rev (SEQ ID NO 13).
  • the cloning vector pStS18 was linearized with the restriction endonuclease HindIII (New England Biolabs, Frankfurt am Main). Subsequently, the linearized 6812 base pair fragment was passed over an agarose gel using the QIAquick * gel
  • the cat B promoter from Escherichia coli was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion * HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the template used was DNA which was synthesized and characterized by SEQ ID NO 14.
  • primers the oligonucleotides IFC-catB-for (SEQ ID NO 15) and IFC-catB-rev (SEQ ID NO 16) were used.
  • the 205-base-pair DNA fragment obtained in the PCR was subsequently amplified by means of a DNA Adsorption column of the QIAprep * Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) according to manufacturer's instructions. b) Preparation of the plasmid pStS26 for the in-fusion "HD Clooning
  • the cloning vector pStS26 was digested with the restriction endonucleases EcoRI and Tthllll (New England Biolabs, Frankfurt am Main). Subsequently, the 7981 base pair fragment was purified over an agarose gel using the QIAquick * Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions. c) Cloning by In-Fusion * HD Cloning
  • the starting plasmid for the construction of the raspberry ketone production plasmid pStS41 was the plasmid pStS26 from Example 3. a) Amplification of the tufB promoter:
  • the TufB promoter from Escherichia coli was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the template used was DNA which was synthesized and characterized by SEQ ID NO 17.
  • primers the oligonucleotides IFC-tufB-for (SEQ ID NO 18) and IFC-tufB-rev (SEQ ID NO 19) were used.
  • the 198-base-pair DNA fragment obtained in the PCR was subsequently purified by means of a DNA adsorption column of the QIAprep * Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • the cloning vector pStS26 was digested with the restriction endonucleases EcoRI and Tthllll (New England Biolabs, Frankfurt am Main). The 7981 base pair fragment was then purified on an agarose gel using the QIAquick "Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions.”
  • Production plasmid pStS42 was the plasmid pStS26 from Example 3. a) Amplification of the mppA promoter:
  • Eacherichia coli mppA promoter was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the In-Fusion * HD cloning kit (Clontech Laboratories, Mountain View, California, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the template used was DNA which was synthesized and characterized by SEQ ID NO 20.
  • the primers used were the oligonucleotides IFC-mppA-for (SEQ ID NO 21) and IFC-mppA-rev (SEQ ID NO 22).
  • the DNA fragment obtained in the PCR with a length of 260 base pairs was then purified by means of a DNA adsorption column of the QIAprep * Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • the L-tyrosine production plasmid pTyrA described in Example 1 was used by electroporation method (Dower et al., Nucleic Acids Res. 1988, 6: 6127-6145) to transform the electrocompetent Escherichia coli strain W3110 (ATCC 27325).
  • the electroporation was performed with an Eporator * (Eppendorf, Hamburg) in the program PI (1700 V) with a 1 mm
  • Electroporation cuvette # 5510 (Molecular BioProducts, San Diego, California, USA). After selection on LB agar plates with 50 mg / L ampicillin, the plasmid was reisolated from one of the transformants, cleaved with restriction endonucleases and checked. This strain is called W3110 / pTyrA. It is suitable for the production of L-Tyrosine.
  • Example 8 Preculture of an L-tyrosine production strain for fermentation
  • L-tyrosine was carried out in a 2 L-Permenter using a Dasgip device from Eppendorf (Hamburg, Germany).
  • 900 mL production medium consisting of 5 g / LD (+) - glucose monohydrate, 0.03 g / L pyridoxine ⁇ HCl, 0.005 g / L thiamine ⁇ HCl, 0.1 g / L ampicillin, 5 g / L ( NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 g / L NaCl, 0.9 g / L L-isoleucine, 0.6 g / LD / L-methionine, 0.225 g / L CaCl 3 ⁇ 2 H 2 O, 0, 6 g / L MgSO 4 ⁇ 7 H 2 O, 0.15 g / L Na 2 M0 4 ⁇ 2 H 2 O, 0.3 g / LH 3 B0 3 , 0.2 g / L CoCl 2 ⁇ 6 H 2 0, 0.25 g / L CuS0 4 x 5 H 2 0, 1.6 g / L MHCl a x 4 H 2 0, 1.35 g
  • the antifoam used was Struktol J673 (Schill + Seilacher, Hamburg) in a dilution of 1:10 in sterile water.
  • the culture was gassed with sterile compressed air at 100 L / h and stirred at a stirrer speed of 450 rpm.
  • the speed was increased via the fermenter control unit to a value of 1450 rpm to obtain 30% oxygen saturation.
  • Oxygen saturation was determined with a pO 2 probe calibrated at 450 rpm to 100 tr saturation.
  • a 56% (w / v) glucose solution was added.
  • the glucose feeding was carried out at a flow rate of 4-6 mL / h, the glucose concentration in the fermenter between 0.1 g / L and 10 g / L was kept constant.
  • the Glu- cose determination was carried out with the YSI 7100 MBS analyzer (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA).
  • Table 1 The results of an L-tyrosine fermentation are summarized in Table 1.
  • Table 1 shows the obtained content of L-tyrosine in the culture supernatant obtained with strain W3110 / pTyrA.
  • the raspberry ketone production plasmids pStS24, pStS26, pStS40, pStS41 and pStS42 described in Examples 2 to 6 were electroporated (Dower et al., Nucleic Acids Res. 1988, 6: 6127-6145) to transform ISecherichia coli strain SV164 used.
  • the electroporations were performed with an Eporator * (Eppendorf, Hamburg) in the PI (1700 V) program with 1 mm # 5510 electroporation cuvettes (Molecular Bioproducts, San Diego, California, USA).
  • the plasmids were reisolated from one of the transformants, cleaved with restriction endonucleases and checked.
  • the production strains were designated SV164 / pStS24, SV164 / pStS26, SV164 / pStS40, SV164 / pStS41 and SV164 / pStS42 and are suitable for the production of raspberry ketone.
  • Example 11 Preculture of a raspberry ketone production strain for fermentation
  • Ampicillin added (final concentration of ampicillin: 0.1 g / L, sterile filtered).
  • Raspberry ketone was produced in a 2 L fermenter with the aid of a Dasgip apparatus from Eppendorf (Hamburg, Germany).
  • 100 mL LB preculture from Example 8 were used to inoculate the 900 mL production medium consisting of 5 g / LD (+) - glucose monohydrate, 0.03 g / L pyridoxine ⁇ HCl, 0.005 g / L thiamine ⁇ HCl, 0 , 1 g / L ampicillin, 5 g / L (NH 4 ) 2 S0 4 /0.5 g / L NaCl, 0.9 g / L L-isoleucine, 0.6 g / LD / L-methionine, 0, 5 g / L L-phenylalanine, 7.5 g / L yeast extract, 7.5 g / L tryptone, 0.225 g / L CaCl a x 2 H 2 0, 0.6 g / L MgSO "x 7 H 2 0, 0.15 g / L Na 2 M0 4 X 2 H 2 O, 0.3 g / LH 3 B0 3 ,
  • the antifoam used was Struktol J673 (Schill + Seilacher, Hamburg) in a dilution of 1:10 in sterile water.
  • the culture was gassed with sterile compressed air at 100 L / h and stirred at a stirrer speed of 450 rpm.
  • the speed was increased via the fermenter control unit to a value of 1450 rpm to obtain 30% oxygen saturation.
  • Oxygen saturation was determined with a pO 2 probe calibrated at 450 rpm to 100% saturation.
  • a 56% (w / v) glucose solution was added.
  • the glucose feeding was carried out at a flow rate of 4-6 mL / h, the glucose concentration in the fermenter between 0.1 g / L and 10 g / L was kept constant.
  • the Glu- cose determination was carried out with the YSI 7100 MBS analyzer (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA).
  • Separation column was a Luzia C18 (2) RP-HPLC column 5 ⁇ (250 mm x 4.6 mm) from Phenomenex (Aillesburg, Germany). The samples were eluted in a gradient procedure (mobile phase A: water with 0.5% (v / v) phosphoric acid, mobile phase B: acetonitrile) at 25 ° C. and a flow rate of 1 ml / min. The analytes were detected with a DV detector at a wavelength of 274 nm.
  • Table 2 shows the obtained contents of raspberry ketone and pre-products in the culture supernatant, which were obtained with the strain SV164 / pStS24.
  • Table 3 shows the achieved contents of raspberry ketone and precursors in the culture supernatant, which were obtained with the strain SV164 / pStS26.
  • Table 4 shows the obtained contents of raspberry ketone and precursors in the culture supernatant obtained with strain SV164 / pStS40.
  • Table 5 shows the obtained contents of raspberry ketone and precursors in the culture supernatant obtained with strain SV164 / pStS41.
  • Table 6 shows the achieved levels of raspberry ketone and precursors in the culture supernatant, with the strain

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der ein TAL-Gen ein 4-CL-Gen, ein BAS-Gen und ein tyrA-Gens exprimiert, und ein Verfahren, bei dem dieser Mikroorganismus in einem Fermen tationsmedium fermentiert wird und dabei Himbeerketon im Kulturüberstand angehäuft wird.

Description

Mikroorganismen-Stamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Himbeerketon
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismen-Stamm und Verfah- ren zur fermentativen Herstellung von Himbeerketon.
Himbeerketon ist die Leitsubstanz des Himbeeraromas. Es handelt sich dabei um 4- (4-Hydroxyphenyl) -butan-2-οη. Synthetisch hergestelltes Himbeerketon wird bereits als Geschmacksstoff eingesetzt. Die Substanz ist für den typischen Geruch von Himbeeren verantwortlich und wird daher zur Aromatisierung von Lebensmitteln eingesetzt. Die Geruchsechwelle für die Substanz liegt bei 0,01 mg/L bei 20 °C in Wasser. Obwohl Himbeerketon in einer chemischen Synthese einfach hergestellt werden kann, ist bisher kein natürlich hergestelltes Himbeerketon am Markt erhältlich. Der Begriff „natürlich"1 bezieht sich auf die EU- Verordnung 1334/2008 vom 20. Januar 2011 über Aromen und bestimmte Lebensmittelzutaten mit Aromaeigenschaften zur Verwendung in und auf Lebensmitteln. In dieser Verordnung wird ein „natürlicher Aromastoffw definiert, wobei hohe Anforderungen bzgl. Herkunft und Herstellung gestellt werden. Die vorliegende Anmeldung verwendet den Begriff „natürliches Himbeerketon" wie für einen „natürlichen Aromastoff* in der EU-Verordnung 1334/2008 vom 20. Januar 2011 definiert. Um dem steigenden Be- wusstsein der Verbraucher und Wunsch nach Natürlichkeit Rechnung zu tragen, werden in der Aromaindustrie immer häufiger, synthetisch hergestellte Aromastoffe durch natürliche Aromastoffe ersetzt. Dies setzt allerdings voraus, daes der entsprechende Aromastoff, entsprechend der oben zitierten Defini- tion, auch natürlich verfügbar ist. Am konkreten Beispiel des Himbeerketons ist dies nicht der Fall. Möchte man mit einem natürlichen Himbeeraroma aromatisieren, muss man auf einen Extrakt aus der Himbeere selbst zurückgreifen. Da Extrakte aus der Frucht sehr teuer sind, kann z.Z. nur auf ein synthetisch hergestelltes Aroma zurückgegriffen werden.
Zwar wird in der Patentschrift FR2724666B1 ein alternatives natürliches Verfahren zur Herstellung, von Himbeerketon be- schrieben, ein entsprechendes Produkt ist jedoch nicht erhältlich. Im Patent ist die Umsetzung von Rhododendrol, dem Alkohol des Himbeerketons, durch eine Alkohol-Dehydrogenase beschrieben. Vermutlich ist die Darstellung eines natürlichen Himbeerketons aus der Vorstufe Rhododendrol nicht möglich, da die Vorstufe auch in natürlicher Qualität bereitgestellt werden muss.
Ein erster Ansatz, Himbeerketon über bakterielle Fermentation herzustellen, ist in der Patentschrift 6B2416770 vom
28.07.2004 beschrieben. Die dazu gehörige Publikation von Beekwilder et al. wurde 2007 veröffentlicht (Biotechnol. J. 2007, 2, 1270-1279) . Lediglich 5 mg/L Himbeerketon konnten mit dem dort beschriebenen Expressionsplasmid pAC-4CL-RiCHS im E- acherichia coli Stamm BL21 produziert werden. Eine weitere relevante Publikation aus dem Jahr 2016 beschreibt eine Weinhefe, mit der maximal 7,5 mg/L Himbeerketon produziert werden konnte (Lee et al., Microb. Cell. Fact. 2016, 15: 49). Allerdings war bei beiden Publikationen die Supplementierung des Mediums mit p-Cumarsäure, einer Vorstufe der Himbeerketon- Biosynthese nötig, um auf diese Ausbeuten zu kommen. Idealerweise sollte der zur Produktion eingesetzte Mikroorganismus jedoch genetisch so ausgestattet sein, dass keine Vorstufen- Fütterung notwendig ist. Weiterhin sind die in der Literatur beschriebenen Ausbeuten bei weitem zu gering, um natürliches Himbeerketon in industriellem Maßstab herstellen zu können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Mikroorganismen-Stammes, welcher die Herstellung von natürlichem 4- (4-Hydroxyphenyl) -butan-2-οη ohne Supplementierung der Vorstufe p-Cumarsäure in industriell relevanten Ausbeuten ermöglicht .
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Mikroorganismen-Stamm, der mindestens ein TAL-Gen, ein 4-CL-Gen, ein BAS-Gen und ein tyrA-Gen umfasst und exprimiert.
Das TAL-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer Tyrosin- Ammoniak-Lyase besitzt. Derartige Gene sind bekannt. Bevorzugt handelt es sich um SEQ ID NO 1 sowie Varianten dieser Sequenz, die durch den degenerierten genetischen Code bedingt sind. Das 4-CL-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer 4-Cumarat- CoA-Ligase besitzt. Derartige Gene sind bekannt. Bevorzugt handelt es sich um SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 3 sowie Varianten dieser Sequenzen, die durch den degenerierten genetischen Code bedingt sind.
Das BAS-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer Benzalace- ton-Synthase besitzt. Derartige Gene sind bekannt. Bevorzugt handelt es sich um SEQ ID NO 4 sowie Varianten dieser Sequenz, die durch den degenerierten genetischen Code bedingt sind.
Das tyrA-Gen ist charakterisiert durch eine DNS-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches die Funktion einer Chorismat- Mutase besitzt. Derartige Gene sind bekannt. Bevorzugt handelt es sich um SEQ ID NO 5 sowie Varianten dieser Sequenz, die durch den degenerierten genetischen Code bedingt sind. Besonders bevorzugt handelt es sich um Varianten dieser Sequenz, die eine verminderte Feedback-Regulation gegenüber L-Tyrosin aufweisen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um eine Variante mit dem Aminosäureaustausch A354V.
Die Funktion der Proteine in einem erfindungsgemäßen Mikroorganismen-Stamm kann indirekt über das Produkt Himbeerketon charakterisiert werden, da Mikroorganismen kein Himbeerketon produzieren. Als Nachweismethode kann die in Beispiel 13 beschriebene HPLC-Methode verwendet werden.
Unter „industriell relevanten Ausbeuten* ist vorzugsweise eine Verbesserung der Ausbeute an Himbeerketon um den Faktor 100 - 1000 im Vergleich zum Stand der Technik zu verstehen. Der Mikroorganismen-Stamm umfasst vorzugsweise eine oder mehrere funktionelle Kopien der vier benannten Gene. Bevorzugt umfasst er eine bis 700 Kopien der vier benannten Gene. Besonders bevorzugt umfasst er eine bis 20 Kopien der vier benann- ten Gene. Die Gene können in das Chromosom integriert sein, sie können jedoch auch auf einem oder mehreren Plasmiden vorliegen.
Vorzugsweise erfolgt zur Herstellung von Himbeerketon die Ex- pression des TAL-Gens, des 4-CL-Gens, des BAS-Gens und des ty- rA-Gens auf einem Plasmid in einem Mikroorganismen-Stamm.
Die Erfindung umfasst daher ebenfalls ein Plasmid enthaltend ein TAL-Gen, ein 4-CL-Gen, ein BAS-Gen, und ein tyrA-Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors. Ein derartiges
Produktionsplasmid ermöglicht die Herstellung von Himbeerketon in einem Mikroorganismen-Stamm.
Die Expression dieser Gene wird durch homologe oder heterologe Promotoren erreicht. Der Begriff heterolog bezieht sich auf die Gene charakterisiert durch die SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 und SEQ ID NO 4, da die entsprechenden Gene, im Gegensatz zu SEQ ID NO 5, nicht aus Escherichia coli kommen. Entsprechende heterologe Promotoren sind beispielsweise der Promotor des gapA-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des catB-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des tufB-Gens aus Escherichia coli, der Promotor des mppA-Gens aus Escherichia coli und der Promotor des proC-Gens aus Escherichia coli. Weiterhin sind die heterologen lac-, tac-, trc-, lambda-, ara- oder tet-Promotoren dem Fachmann bekannt und können zur heterologen Expression der Gene verwendet werden.
Bevorzugt wird die Expression des TAL-Gene, des 4-CL-Gens, des 4-CL-Gens, des BAS-Gens und des tyrA-Gens auf einem Plasmid in einem Mikroorganismus durch den Promotor des gapA-Gens, durch den Promotor des catB-Gens, durch den Promotor des tufB-Gens, durch den Promotor des mppA-Gens oder durch den Promotor des proC-Gens aus Escherichia coli erreicht. Besonders bevorzugt wird die Expression des TAL-Gens, des 4- CL-Gens, des 4-CL-Gens, des BAS-Gens und des tyrA-Gens auf einem Plasmid in Escherichia coli durch den Promotor des catB- Gens oder durch den Promotor des gapA-Gens aus Escherichia. coli erreicht.
Ein erfindungsgemäßes Plasmid umfasst daher vorzugsweise die oben genannten Promotoren, wobei die Promotoren sich derart auf dem Plasmid befinden, dass sie die Expression die Expres- sion des TAL-Gens, des 4-CL-Gens, des BAS-Gens und des tyrA- Gens steuern.
Besonders bevorzugt enthalt das Plasmid eine Operon- Konstruktion, bei dem das TAL-Gen, das 4-CL-Gen, das BAS-Gen und das tyrA-Gens unter Kontrolle des catB-Promotors aus E- acherichia coli stehen.
Als Promotorregion zur Expression des TAL-Gens, des 4-CL-Gens, des BAS-Gens und des tyrA-Gens können jedoch auch die natürli- chen (homologen) Promotorregionen dieser Gene dienen.
Als Plasmide, in die das TAL-Gen, das 4-CL-Gen, das BAS-Gen und das tyrA-Gen eingebracht werden, können alle verfügbaren und gentechnisch zugänglichen DNS-Moleküle verwendet werden, die extrachromosomal in Mikroorganismen repliziert werden und einen Selektionsmarker umfassen.
Als Plasmide, in die das TAL-Gen, das 4-CL-Gen, das BAS-Gen und das tyrA-Gen eingebracht werden, können bevorzugt alle verfügbaren und gentechnisch zugänglichen DNS-Moleküle verwendet werden, die extrachromosomal in Escherichia coli repliziert werden und einen Selektionsmarker umfassen. So können beispielsweise Plasmide mit einer hohen zellulären Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pQE-Serie, Plasmide der pBluescript-Serie) , Plasmide mit einer mittleren Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. Plasmide der pBR-Serie, Plasmide der pACYC-Serie) oder Plasmide mit ei- ner niedrigen Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. pSCIOl o- der pBeloBACll) eingesetzt werden.
Bevorzugt werden Plasmide mit einer mittleren Kopienzahl in Escherichia coli (z. B. Plasmide der pBR-Serie, Plasmide der pACYC-Serie) verwendet.
Besonders bevorzugt wird ein Plasmid der pBR-Serie verwendet. Eine Möglichkeit zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismen-Stammes ist das Einbringen eines erfindungsgemäßen Plasmids in einen Ausgangsstamm.
Als Ausgangsstämme sind prinzipiell alle Mikroorganismen ge- eignet, die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und durch Fermentation kultivierbar sind. Solche Mikroorganismen können Pilze, Hefen oder Bakterien sein. Bevorzugt handelt es sich um Bakterien der phylogenetischen Gruppe der Eubacteria. Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen der Familie Enterobacter!- aceae und insbesondere der Art Escherichia coli.
Besonders bevorzugt sind Escherichia coli-Stämme, die mindestens einen im Vergleich zu einem Wildtyp Stamm um den Faktor 2 erhöhten metabolischen Fluss in Richtung Chorismat aufweisen. Chorismat ist der Ausgangs- bzw. Verzweigungspunkt für die Biosynthese von L-Tyrosin. Ganz besonders bevorzugt ist der Escherichia coli-Stamm SV164. Die Konstruktion des Stammes SV164 ist in US6180373 BA beschrieben. Das Einbringen eines erfindungsgemäßen Plasmids geschieht beispielsweise durch eine gängige Transformationsmethode wie z.B. Elektroporation oder CaCla-Methode. Plasmid-tragende Klone werden anschließend über eine Antibiotika-Resistenz selektiert. Dem Fachmann bekannte Selektionsmarker sind beispiels- weise das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen, das Resistenz gegenüber Chloramphenicol vermittelt, das Neomycin-Phospho- transferase-Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin vermittelt, das Tetracyclin-Efflux-Gen, das Resistenz gegenüber Tetracyc- lin vermittelt, oder das ß-Lactamase-Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin und Carbenicillin vermittelt.
Alternativ zur Expression von einem erfindungsgemäßen Plasmid können das TAL-Gen, das 4-CL-Gen, das BAS-Gen und das tyrA-Gen auch in das Chromosom eines Mikroorganismen-Stammes zusätzlich zu einem erfindungsgemäßen Plasmid oder alleine integriert werden. Als Integrationsverfahren werden vorzugsweise die dem Fachmann bekannten Systeme mit temperenten Bakteriophagen, in- tegrativen Plasmiden oder die Integration über homologe Rekombination genutzt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches die Herstellung von na- türlichem Himbeerketon ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, bei dem ein Mikroorganismen-Stamm in einem Fermentationsmedium kultiviert wird und 4- (4-Hydroxyphenyl) -butan-2-οη in das Fermentations- medium sezemiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus fermentiert wird.
Die Anzucht eines erfindungsgemäßen Mikroorganismen-Stammes im Fermenter erfolgt als kontinuierliche Kultur, als Batch-Kultur oder vorzugsweise als Fed-Batch-Kultur.
Als Kohlenstoff-Quelle dienen vorzugsweise Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren. Besonders bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Kohlenstoff-Quellen Glucose, Lactose, Saccharose oder Glycerin eingesetzt.
Bevorzugt ist die Dosierung der Kohlenstoff-Quelle in einer Form, die gewährleistet, dass der Gehalt an Kohlenstoff-Quelle im Fermenter während der Fermentation in einem Bereich von 0,1 g/L bis 50 g/L gehalten wird. Besonders bevorzugt ist ein Bereich von 0,1 g/L bis 10 g/L. Ala Stickstoff-Quelle werden im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Ammoniak, Ammoniumsalze oder Proteinhydrolysate verwendet. Bei Verwendung von Ammoniak als Korrekturmittel zur pH-Kontrolle wird während der Fermentation regelmäßig diese Stickstoff-Quelle nachdosiert.
Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d.h. in μΜ Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zugesetzt werden.
Des Weiteren können organische Säuren (z.B. Acetat, Citrat) , Aminosäuren (z.B. L-Isoleucin, L-Methionin, L-Phenylalanin) und Vitamine (z.B. Vitamin Bl, Vitamin B6, Vitamin B12) dem Medium zugesetzt werden.
Als komplexe Nährstoffquellen können z.B. Hefeextrakt, Tryp- ton, Maisquellwasser, Sojamehl oder Malzextrakt zum Einsatz kommen.
Die Inkubationstemperatur zur Anzucht eines erfindungsgemäßen Stammes aus der Familie der Enterobacteriaceae beträgt vorzugsweise 28 - 37 °C, besonders bevorzugt ist eine Inkubati- oristemperatur von 30 - 32 °C.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums liegt während der Fermentation bevorzugt im pH-Bereich von 5,0 bis 8,5, besonders bevorzugt ist ein pH-Wert von 7,0.
Bevorzugt erfolgt die Inkubation eines erfindungsgemäßen Mikroorganismen-Stammes, bevorzugt eines Stammes aus der Familie der Enterobacteriaceae, besonders bevorzugt eines Escherichia coli-Stammes, unter aeroben, anaeroben oder mikroaeroben Kul- tivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 16 h bis 150 h und im Bereich der für den jeweiligen Stamm optimalen Wachstumstemperatur. Besonders bevorzugt sind Kultivierungszeiten zwischen 48 h und 72 h. Die Fermentation wird vorzugsweise unter aeroben oder mikroaeroben Wachstumsbedingungen durchgeführt. Die Abtrennung von Himbeerketon aus der Kultur kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie Zentrifugation des Mediums zur Abtrennung der Zellen mit anschließender Extraktion oder Destillation des Himbeerketons aus dem Fermentationsüberstand mit anschließender Reinigung, Konzentrierung und ggf. Formu- lierung oder Komplexierung des Produktes, erfolgen.
Der Nachweis und die Quantifizierung des im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten Himbeerketons erfolgt beispielsweise mittels einer HPLC-Methode .
Abbildung 1 zeigt schematisch das Ausgangsplasmid pTyrA, das ein tyrA-Gen aus Escherichia coli enthält.
Abbildung 2 zeigt schematisch das Vorläuferplasmid pStS18, das noch kein 4-CL-Gen enthält.
Abbildung 3 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Himbeerketon geeignetes Plasmid pStS24. Abbildung 4 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Himbeerketon geeignetes Plasmid pStS26.
Abbildung 5 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Himbeerketon geeignetes Plasmid pStS40.
Abbildung 6 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Himbeerketon geeignetes Plasmid pStS41.
Abbildung 7 zeigt schematisch ein zur Herstellung von Himbeer- keton geeignetes Plasmid pStS42.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Beispiel 1: Konstruktion des Vorläufer-Plaamids pStS18
Ausgangsplasmid zur Konstruktion eines Himbeerketon- Produktionsplasmids war das Plasmid pTyrA (siehe Abbildung 1) . Das Plasmid pTyrA wurde am 24. April 2017 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D- 38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 32498 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Das Plasmid enthält ein tyrA-Allel aus Eacherichia coli, das für eine Chorismat-Mutase codiert. Uta das Plasmid pStS18 zu erhalten, wurden zunächst das TAL-Gen aus Rhodobacter sphaeroidee und das BAS-Gen aus Rübue idaeua kloniert . a) Amplifizierung des TAL-Gens:
Das TAL-Gen aus Rhodobacter aphaeroidea wurde mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion" HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und die durch SEQ ID NO 1 charakterisiert ist. Als Primer wurden die
Oligonukleotide IFC-TAL-for (SEQ ID NO 6) und IPC-TAL-rev (SEQ ID NO 7) verwendet.
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 1635 Basenpaaren wurde anschließend mittels einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep* Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Amplifizierung des BAS-Gens :
Das BAS-Gen aus Rubua idaeua wurde mittele der Polymerase- Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert . Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und durch SEQ ID NO 4 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleoti- de IFC-BAS-for (SEQ ID NO 8) und IFC-BAS-rev (SEQ ID NO 9) verwendet .
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 1233 Basenpaaren wurde, anschließend mittels einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep* Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. c) Vorbereitung des Plasmids pTyrA für das In-Fusion* HD Clon- ing
Der Klonierungsvektor pTyrA wurde mit der Restriktionsendonu- clease Pstl (New England Biolabs, Frankfurt am Main) lineari- siert. Anschließend wurde das linearisierte 4024 Basenpaar- Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick* Gel
Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt . d) Klonierung mittels In-Fusion* HD Cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) , b) und c) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittele DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des so erhaltenen Vorläuferplasmids pStS18 ist schematisch in Abbildung 2 darge- stellt .
Beispiel 2: Konstruktion des Produktionsplasmids pStS24
Ausgangsplasmid zur Konstruktion des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS24 war das Plasmid pStS18 aus Beispiel 1. a) Amplifizierung des 4-CL-Gens:
Das 4-CL-Gen aus Rhodobacter sphaeroides wurde mittels der Po- lymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion" HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und durch SEQ ID NO 2 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-4CL-Rs-for (SEQ ID NO 10) und IFC-4CL-RB- rev (SEQ ID NO 11) verwendet.
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 1294 Basenpaaren wurde anschließend mittele einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep* Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Vorbereitung des Plasmids pStS18 für das In-Fusion* HD Clo- ning
Der Klonierungsvektor pStS18 wurde mit der Restriktionsendonu- clease HindiII (New England Biolabs, Frankfurt am Main) linea- risiert. Anschließend wurde das linearisierte 6812 Basenpaar- Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick* Gel
Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt . c) Klonierung mittele In-Fusion* HD Cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion" HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS24 ist schematisch in Abbildung 3 dar- gestellt .
Beispiel 3: Konstruktion des Produktionsplasmids pStS26
Ausgangsplasmid zur Konstruktion des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS26 war das Plasmid pStS18 aus Beispiel 1. a) Amplifizierung des 4-CL-Gens:
Das 4-CL-Gen aus Steptomyces coelicolor wurde mittels der Po- lymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und durch SEQ ID NO 3 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-4CL-Sc-for (SEQ ID NO 12) und IFC-4CL-SC- rev (SEQ ID NO 13) verwendet.
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 1627 Basenpaaren wurde anschließend mittels einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep" Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Vorbereitung des Plasmids pStS18 für das In-Fusion* HD Clo- ning
Der Klonierungsvektor pStS18 wurde mit der Restriktionsendonu- clease Hindlll (New England Biolabs, Frankfurt am Main) linea- risiert. Anschließend wurde das linearisierte 6812 Basenpaar- Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick* Gel
Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt . c) Klonierung mittels In-Fusion* HD Cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Seguenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS26 ist schematisch in Abbildung 4 dar- gestellt .
Beispiel 4: Konstruktion des Produktionspiaemide pStS40
Ausgangsplasmid zur Konstruktion des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS40 war das Plasmid pStS26 aus Beispiel 3. a) Amplifizierung des catB-Promotors :
Der catB-Promotor aus Escherichia coli wurde mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert . Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und durch SEQ ID NO 14 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-catB-for (SEQ ID NO 15) und IFC-catB-rev (SEQ ID NO 16) verwendet.
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 205 Basenpaaren wurde anschließend mittels einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep* Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Vorbereitung des Plasmids pStS26 für das In-Fusion" HD Clo- ning
Der Klonierungsvektor pStS26 wurde mit den Restriktionsendonu- cleasen EcoRI und Tthllll (New England Biolabs, Frankfurt am Main) verdaut. Anschließend wurde das 7981 Basenpaar-Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick* Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt. c) Klonierung mittels In-Fusion* HD Cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laborato- ries, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS40 ist schematisch in Abbildung 5 dargestellt .
Beispiel 5: Konstruktion des Produktionsplaemids pStS41
Ausgangsplasmid zur Konstruktion des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS41 war das Plasmid pStS26 aus Beispiel 3. a) Amplifizierung des tufB-Promotors :
Der tufB-Promotor aus Escherichia coli wurde mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kali- fornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und durch SEQ ID NO 17 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-tufB-for (SEQ ID NO 18) und IFC-tufB-rev (SEQ ID NO 19) verwendet.
Das bei der PCR erhaltene DNS-Fragment mit einer Länge von 198 Basenpaaren wurde anschließend mittele einer DNS- Adsorptionssäule des QIAprep* Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Vorbereitung des Plasmids pStS26 für das In-Fusion* HD Clo- ning
Der Klonierungsvektor pStS26 wurde mit den Restriktionsendonu- cleasen EcoRI und Tthllll (New England Biolabs, Frankfurt am Main) verdaut. Anschließend wurde das 7981 Basenpaar-Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick" Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt. c) Klonierung mittels In-Fusion* HD Cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS41 ist schematisch in Abbildung 6 dargestellt.
Beispiel 6: Konstruktion des Produktionsplasmide pStS42
Ausgangsplasmid zur Konstruktion des Himbeerketon-
Produktionsplasmids pStS42 war das Plasmid pStS26 aus Beispiel 3. a) Amplifizierung des mppA-Promotors :
Der mppA-Promotor aus Eacherichia coli wurde mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits (Clontech Laboratories, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Als Matrize diente DNS, die synthetisch hergestellt wurde und durch SEQ ID NO 20 charakterisiert ist. Als Primer wurden die Oligonukleotide IFC-mppA-for (SEQ ID NO 21) und IFC-mppA-rev (SEQ ID NO 22) verwendet. Das bei der PCR erhaltene DNS- Fragment mit einer Länge von 260 Basenpaaren wurde anschließend mittels einer DNS-Adsorptionssäule des QIAprep* Spin Mi- niprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt. b) Vorbereitung des Plasmids pStS26 für das In-Fusion* HD Cloning Der Klonierungsvektor pStS26 wurde mit den Restriktionsendonu- cleasen EcoRI und Tthllll (New England Biolabs, Prankfurt am Main) verdaut. Anschließend wurde das 7981 Basenpaar-Fragment über ein Agarosegel mit Hilfe des QIAquick* Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers gereinigt. c) Klonierung mittels In-Pusion* HD cloning
Die Klonierung der DNS-Fragmente aus a) und b) erfolgte unter Verwendung des In-Fusion* HD Cloning Kits {Clontech Laborato- ries, Mountain View, Kalifornien, USA) nach Angaben des Herstellers. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels DNS- Sequenzanalyse bestätigt. Eine Vektorkarte des Himbeerketon- Produktionsplasmids pStS42 ist schematisch in Abbildung 7 dargestellt.
Beispiel 7 i Herstellung eines L-Tyrosin-Produktionsstanmes
Das in Beispiel 1 beschriebene L-Tyrosin-Produktionsplasmid pTyrA wurde mittels Elektroporations-Methode (Dower et al., Nucleic Acids Res. 1988, 6: 6127-6145) zur Transformation des elektrokompetenten Escherichia coli-Stammes W3110 (ATCC 27325) eingesetzt. Die Elektroporation wurde mit einem Eporator* (Eppendorf, Hamburg) im Programm PI (1700 V) mit einer 1 mm
Elektroporationsküvette # 5510 (Molecular BioProducts, San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt. Nach Selektion auf LB- Agarplatten mit 50 mg/L Ampicillin wurde das Plasmid aus einer der Transformanten reisoliert, mit Restriktionsendonucleasen gespalten und überprüft. Dieser Stamm wird als W3110/pTyrA bezeichnet. Er ist für die Produktion von L-Tyrosin geeignet. Beispiel 8: Vorkultur eines L-Tyrosin-Produktionsstammes für die Fermentation
100 mL LB-Medium mit Glucose (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 5 g/L D(+) -Glucose Monohydrat; autokla- viert) wurden in einem sterilen 500 mL Erlenmeyerkolben mit Ampicillin versetzt (Endkonzentration von Ampicillin: 0,1 g/L, sterilfiltriert) .
Mit einer Impföse wurden so viele Zellen des ProduktionsStammes W3110/pTyrA von der Agarplatte abgenommen, bis maximal ei- ne schwache Trübung erkennbar wurde. Die Vorkultur wurde für 5 h bei 30°C und 130 rpm auf einem Inkubations-Schüttler CERTOMAT* IS (Sartorius Stedium Biotech, Göttingen, Deutschland) kultiviert .
Beispiel 9: Fermentative Herstellung von L-Tyrosin
Die Herstellung von L-Tyrosin erfolgte in einem 2 L-Permenter mit Hilfe eines Dasgip-Geräts der Firma Eppendorf (Hamburg, Deutschland) .
100 mit LB-Vorkultur aus Beispiel 8 dienten zum Animpfen der
900 mL Produktionsmedium, bestehend aus 5 g/L D(+)-Glucose Mo- nohydrat, 0,03 g/L Pyridoxin x HCl, 0,005 g/L Thiamin x HCl, 0,1 g/L Ampicillin, 5 g/L (NH4)2S04, 0,5 g/L NaCl, 0,9 g/L L- Isoleucin, 0,6 g/L D/L-Methionin, 0,225 g/L CaCl3 x 2 H20, 0,6 g/L MgS04 x 7 H20, 0,15 g/L Na2M04 x 2 H20, 0,3 g/L H3B03, 0,2 g/L CoCl2 x 6 H20, 0,25 g/L CuS04 x 5 H20, 1,6 g/L MhCla x 4 H20, 1,35 g/L ZnS04 x 7 H20, 0,075 g/L FeSO* x 7 H20, 1 g/L Na3- Citrat x 2 H30 und 1,71 g/L KH2P04. Die Medienbestandteile wurden steril in einem 2 L-Fermenter vorgelegt und mit sterilen Korrekturmitteln (25 % Ammoniak & 6,8 N H3P04) auf pH = 7,0 eingestellt. Während der Kultivierung für 67 h wurden die Temperatur auf 30 °C sowie der pH-Wert bei 7,0 durch das Korrekturmittel (25 % Ammoniak) konstant gehalten. Als Antischaum- mittel wurde Struktol J673 (Schill + Seilacher, Hamburg) in einer Verdünnung von 1:10 in sterilem Wasser verwendet. Die Kultur wurde mit keimfreier Druckluft mit 100 L/h begast und mit einer Rührerdrehzahl von 450 rpm gerührt. Nach Absinken der SauerstoffSättigung auf einen Wert von 30 % wurde die Drehzahl über die Steuerungseinheit des Fermenters bis zu ei- nem Wert von 1450 rpm erhöht, um 30 % SauerstoffSättigung zu erhalten. Die SauerstoffSättigung wurde mit einer p02-Sonde bestimmt, die bei 450 rpm auf 100 tr Sättigung kalibriert wurde. Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter auf ca. 1-2 g/L abgesunken war, erfolgte die Zudosierung einer 56 % (w/v) Glu- coselösung. Die Glucose-Fütterung erfolgte mit einer Flussrate von 4-6 mL/h, wobei die Glucose-Konzentration im Fermenter zwischen 0,1 g/L und 10 g/L konstant gehalten wurde. Die Glu- cose-Bestimmung wurde mit dem Analysator YSI 7100 MBS (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt.
Die Ergebnisse einer L-Tyrosin-Fermentation sind in der Tabelle 1 zusammengefasst . Die Tabelle zeigt den erzielten Gehalt an L-Tyrosin im Kulturüberstand, der mit dem Stamm W3110/pTyrA erhalten wurde.
Tabelle 1:
Figure imgf000019_0001
Beispiel 10: Herstellung von Himbeerketon-ProduktionsStämmen
Die in Beispiel 2 bis 6 beschriebenen Himbeerketon- Produktionsplasmide pStS24, pStS26, pStS40, pStS41 und pStS42 wurden mittels Elektroporations-Methode (Dower et al., Nucleic Acids Res. 1988, 6: 6127-6145) zur Transformation des ISecherichia coli-Stammes SV164 eingesetzt. Die Elektroporatio- nen wurden mit einem Eporator* (Eppendorf, Hamburg) im Programm PI (1700 V) mit 1 mm Elektroporationsküvetten # 5510 (Molecular Bioproducts, San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt. Nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 50 mg/L Ampicil- lin wurden die Plasmide aus einer der Transformanten reisoliert, mit Restriktionsendonucleasen gespalten und überprüft. Die Produktionsstämme wurden mit SV164/pStS24, SV164/pStS26, SV164/pStS40, SV164/pStS41 und SV164/pStS42 bezeichnet und sind für die Produktion von Himbeerketon geeignet.
Beispiel 11: Vorkultur eines Himbeerketon-Produktionsstammes für die Fermentation
100 mL LB-Medium mit Glucose (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 5 g/L D(+) -Glucose Monohydrat; autokla- viert) wurden in einem sterilen 500 mL Erlenmeyerkolben mit
Ampicillin versetzt (Endkonzentration von Ampicillin: 0,1 g/L, sterilfiltriert) .
Mit einer Impföse wurden so viele Zellen des Produktionsstammes von der Agarplatte abgenommen bis maximal eine schwache Trübung erkennbar wurde. Die Vorkultur wurde für 5 h bei 30°C und 130 rpm auf einem Inkubations-Schüttler CERTQMAT* IS (Sar- torius Stedium Biotech, Göttingen, Deutschland) kultiviert. Beispiel 12: Fermentative Herstellung von Himbeerketon
Die Herstellung von Himbeerketon erfolgte in einem 2 L- Fermenter mit Hilfe eines Dasgip-Geräts der Firma Eppendorf (Hamburg, Deutschland) .
100 mL LB-Vorkultur aus Beispiel 8 dienten zum Animpfen der 900 mL Produktionemedium, bestehend aus 5 g/L D(+)-Glucose Mo- nohydrat, 0,03 g/L Pyridoxin x HCl, 0,005 g/L Thiamin x HCl, 0,1 g/L Ampicillin, 5 g/L (NH4)2S04/ 0,5 g/L NaCl, 0,9 g/L L- Isoleucin, 0,6 g/L D/L-Methionin, 0,5 g/L L-Phenylalanin, 7,5 g/L Hefeextrakt, 7,5 g/L Trypton, 0,225 g/L CaCla x 2 H20, 0,6 g/L MgSO« X 7 H20, 0,15 g/L Na2M04 X 2 H20, 0,3 g/L H3B03, 0,2 g/L CoCla x 6 H20, 0,25 g/L CuS04 x 5 H20, 1,6 g/L MnCl2 x 4 H20, 1,35 g/L ZnS04 x 7 H20, 0,075 g/L FeS04 x 7 H20, 1 g/L Na3- Citrat x 2 H20 und 1,71 g/L KH2P04. Die Medienbestandteile wurden steril in einem 2 L-Fermenter vorgelegt und mit sterilen Korrekturmitteln (25 % Ammoniak & 6,8 N H3P04) auf pH = 7,0 eingestellt. Wahrend der Kultivierung für 67 h wurden die Temperatur auf 30 °C sowie der pH-Wert bei 7,0 durch das Korrekturmittel (25 % Ammoniak) konstant gehalten. Als Antischaum- mittel wurde Struktol J673 (Schill + Seilacher, Hamburg) in einer Verdünnung von 1:10 in sterilem Wasser verwendet. Die Kultur wurde mit keimfreier Druckluft mit 100 L/h begast und mit einer Rührerdrehzahl von 450 rpm gerührt. Nach Absinken der SauerstoffSättigung auf einen Wert von 30 % wurde die Drehzahl über die Steuerungseinheit des Fermenters bis zu ei- nem Wert von 1450 rpm erhöht, um 30 % SauerstoffSättigung zu erhalten. Die SauerstoffSättigung wurde mit einer p02-Sonde bestimmt, die bei 450 rpm auf 100 % Sättigung kalibriert wurde. Sobald der Glucose-Gehalt im Fermenter auf ca. 1-2 g/L abgesunken war, erfolgte die Zudosierung einer 56 % (w/v) Glu- coselösung. Die Glucose-Fütterung erfolgte mit einer Flussrate von 4-6 mL/h, wobei die Glucose-Konzentration im Fermenter zwischen 0,1 g/L und 10 g/L konstant gehalten wurde. Die Glu- cose-Bestimmung wurde mit dem Analysator YSI 7100 MBS (YSI, Yellow Springs, Ohio, USA) durchgeführt.
Die Ergebnisse der Himbeerketon-Fermentationen sind in den Tabellen 2-6 zusammengefasst .
Beispiel 13: Nachweis von Himbeerketon
Die Bestimmung von Himbeerketon und der Vorprodukte Tyrosin, p-Cumarsäure und 4-Hydroxy-benzalaceton erfolgte mittels einer HPLC-Methode. Die Analyse erfolgte an einer HPLC-Anlage 1100 der Firma Agilent Technologies (Waldbronn, Deutschland) . Als
Trennsäule diente eine Luzia C18(2) RP-HPLC-Säule 5 μ (250 mm x 4,6 mm) der Firma Phenomenex (Aschaffenburg, Deutschland). Die Proben wurden in einer Gradientenfahrweise (mobile Phase A: Wasser mit 0,5 % (v/v) Phosphorsäure, mobile Phase B: Aceto- nitril) bei 25 °C und einem Fluss von 1 mL/min eluiert. Die Analyten wurden mit einem DV-Detektor bei einer Wellenlänge von 274 nm detektiert.
Tabelle 2 zeigt die erzielten Gehalte an Himbeerketon und Vor- Produkten im Rulturüberstand, die mit dem Stamm SV164/pStS24 erhalten wurden.
Tabelle 2:
Figure imgf000021_0001
Tabelle 3 zeigt die erzielten Gehalte an Himbeerketon und Vorprodukten im Kulturuberstand, die mit dem Stamm SV164/pStS26 erhalten wurden.
Tabelle 3:
Figure imgf000022_0001
Tabelle 4 zeigt die erzielten Gehalte an Himbeerketon und Vor- produkten im Kulturüberstand, die mit dem Stamm SV164/pStS40 erhalten wurden. e 4:
Figure imgf000022_0002
nicht bestimmt
Tabelle 5 zeigt die erzielten Gehalte an Himbeerketon und Vorprodukten im Kulturüberstand, die mit dem Stamm SV164/pStS41 erhalten wurden.
Tabelle 5:
Figure imgf000023_0001
Die Tabelle 6 zeigt die erzielten Gehalte an Himbeerketon und Vorprodukten im Kulturüberstand, die mit dem Stamm
SV164/pStS42 erhalten wurden.
Tabelle 6 i
Figure imgf000023_0002

Claims

Patentansprüche
1. Mikroorganismen-Stamm, der mindestens ein TAL-Gen, ein 4- CL-Gen, ein BAS-Gen und ein tyrA-Gen umfasst und expri- miert .
2. Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere funktionelle Kopien der vier Gene TAL-Gen, 4-CL-Gen, BAS-Gen und tyrA-Gen umfasst.
3. Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Escherichia coli- Stamm handelt.
4. Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Escherichia coli-Stamm handelt, der einen im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm um mindestens den Faktor 2 erhöhten metabolischen Piuse in Richtung Chorismat aufweist.
5. Plasmid enthaltend ein TAL-Gen, ein 4-CL-Gen, ein BAS-Gen und ein tyrA-Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors .
6. Plasmid gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der funktionelle Promotor der Promotor des gapA-Gens, der Promotor des catB-Gens, der Promotor des tufB-Gens, der Promotor des mppA-Gens oder der Promotor des proC-Gens aus Escherichia coli ist.
7. Verfahren zur Herstellung von 4- (4-Hydroxyphenyl) -butan- 2-on, bei dem ein Mikroorganismen-Stamm in einem Fermentationsmedium kultiviert wird und 4- (4-Hydroxyphenyl) - butan-2-οη in das Fermentationsmedium sezerniert wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismen-Stamm ein Mikroorganismen-Stamm gemäß Anspruch 1 bis 4 ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer Inkubationstemperatur 28 - 37 °C, einem pH-Wert des Fermentationsmediums während der Fermentation im pH-Bereich von 5 , 0 bis 8 , 5 und einer Inkubationsdauer unter aeroben, anaeroben oder mikroaeroben Kultivierungsbedingungen von 16 h bis 150 h erfolgt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass und eine Abtrennung von 4- (4-Hydroxyphenyl) - butan-2-οη aus dem Fermentationsmedium mittels Zentrifu- gation des Mediums zur Abtrennung der Zellen mit anschließender Extraktion oder Destillation des Himbeerke- tons aus dem Fermentationsuberstand erfolgt.
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