DE112017002181T5

DE112017002181T5 - Bakterienstamm und Verfahren für einen hohen Durchsatz von Zucker bei der mikrobiellen Umwandlung in biosynthetische Produkte

Info

Publication number: DE112017002181T5
Application number: DE112017002181.2T
Authority: DE
Inventors: Annette Michalowski; Martin Siemann-Herzberg; Ralf Takors
Original assignee: Universitaet Stuttgart
Current assignee: Universitaet Stuttgart
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2019-01-03
Also published as: US20190144815A1; WO2017186327A8; WO2017186327A1; EP3239291A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Escherichia coli (E. coli)-Wirtszellen, die in Bezug auf Wildtyp-Zellen mindestens eine Mutation umfassen, die aus der Gruppe, bestehend aus einer Deletion des Gens relA (ΔrelA); Aminosäuresubstitutionen R290E und K292D in dem Protein Guanosin-3',5'-bis-pyrophosphat-3'-pyrophosphohydrolase (bifunktionelle (p)ppGpp-Synthetase II; SpoT) (spoT[R290E;K292D]); und einer Aminosäuresubstitution G267C in dem Protein Pyruvatdehydrogenase-Untereinheit E1 (AceE) (aceE[G267C]), ausgewählt ist. Die rekombinanten Wirtszellen sind durch erhöhte Zuckeraufnahmeraten gekennzeichnet, die zu einer erhöhten Produktivität führen, wenn die Zellen für die Herstellung von biosynthetischen Produkten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner jeweilige Verfahren zur biosynthetischen Herstellung eines interessierenden Produkts unter Verwendung der Wirtszellen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Escherichia coli (E. coli)-Wirtszellen, die in Bezug auf Wildtyp-Zellen mindestens eine Mutation umfassen, die aus der Gruppe, bestehend aus einer Deletion des Gens relA (ΔrelA); Aminosäuresubstitutionen R290E und K292D in dem Protein Guanosin-3',5'-bis-pyrophosphat-3'-pyrophosphohydrolase (bifunktionelle (p)ppGpp-Synthetase II; SpoT) (spoT[R290E;K292D]); und einer Aminosäuresubstitution G267C in dem Protein Pyruvatdehydrogenase-Untereinheit E1 (AceE) (aceE[G267C]), ausgewählt ist. Die rekombinanten Wirtszellen sind durch erhöhte Zuckeraufnahmeraten gekennzeichnet, die zu einer erhöhten Produktivität führen, wenn diese Zellen zur Herstellung von biosynthetischen Produkten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner entsprechende Verfahren zur biosynthetischen Herstellung eines interessierenden Produkts unter Verwendung dieser Wirtszellen.
Aerobe industrielle Herstellungsverfahren in mikrobiellen Systemen unterliegen im Allgemeinen technischen Beschränkungen in Bezug auf Sauerstoffübertragungsraten und ein effizientes Kühlen des Verfahrens. Aus diesem Grund müssen solche Verfahren üblicherweise unter Bedingungen einer verminderten metabolischen Aktivität der Zellen während der Herstellungsphase durchgeführt werden. Auf diese Weise kann das Herstellungsverfahren innerhalb der Grenzen der technischen Beschränkungen aufrechterhalten werden. Die Produktivität des Verfahrens, d.h., die Menge des erzeugten Produkts pro Reaktorvolumen und Zeit, wird jedoch ebenfalls vermindert.
Die Verminderung der metabolischen Aktivität von Zellen wird üblicherweise durch spezifisch eingestellte Substratbeschränkungen erreicht, wie z.B. von Zucker, Stickstoffquellen oder Phosphat, oder durch die Verwendung von suboptimalen Temperaturen oder pH-Werten. Aus diesen Gründen ist die Herstellungsphase üblicherweise durch eine starke Beschränkung des Zellwachstums gekennzeichnet.
Zusätzlich zu einer Beschränkung des Zellwachstums führt die Verminderung der metabolischen Aktivität üblicherweise jedoch auch zu einer Verminderung der Glukoseaufnahmeraten der Zellen. Daher ist gleichzeitig mit einer Verminderung der absoluten Zuckeraufnahme ein größerer Prozentsatz des Zuckermetabolismus für das Aufrechterhalten von essentiellen Zellfunktionen erforderlich. Demgemäß wird nicht nur die Verfahrensproduktivität inhärent vermindert, sondern in vielen Fällen auch die Produktausbeute.
Folglich gibt es einen Bedarf für signifikant erhöhte Zuckeraufnahmeraten bei niedrigen Wachstumsraten. Dies würde den Zuckerumsatz in mikrobiellen Erzeugern erhöhen, so dass der aufgenommene Zucker intrazellulär zu interessierenden biosynthetischen Wegen geführt werden könnte. Dies könnte zu einer signifikanten Zunahme der Verfahrensproduktivität verglichen mit herkömmlichen Verfahren führen. Folglich könnten signifikant erhöhte Stoffwechselraten realisiert werden, während gleichzeitig dieselben technischen Beschränkungen, die vorstehend diskutiert worden sind, eingehalten werden. Dies könnte zu einer neuen mikrobiellen Herstellungsplattform führen, die auf alle Arten von Verfahren für die mikrobielle Herstellung eines breiten Bereichs von interessierenden Produkten angewandt werden könnte.
Daher ist das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem die Bereitstellung von rekombinanten mikrobiellen Wirtszellen, die signifikant erhöhte Zuckeraufnahmeraten bei niedrigen Wachstumsraten aufweisen, sowie von Herstellungsverfahren, bei denen diese verwendet werden.
Die Lösung des vorstehend genannten technischen Problems wird durch die Ausführungsformen erreicht, die in den Patentansprüchen angegeben sind.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine rekombinante Escherichia coli(E. coli)-Wirtszelle, wobei die Zelle mindestens eine der folgenden Mutationen in Bezug auf eine Wildtyp-Zelle umfasst:

(i) Deletion des Gens relA (ΔrelA);
(ii) Aminosäuresubstitutionen R290E und K292D in dem Protein Guanosin-3',5'-bispyrophosphat-3'-pyrophosphohydrolase (bifunktionelle (p)ppGpp-Synthetase II; SpoT) (spoT7[R290E;K292D]); und
(iii) Aminosäuresubstitution G267C in dem Protein Pyruvatdehydrogenase-Untereinheit E1 (AceE) (aceE[G267C]).

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „rekombinante Zelle“ auf eine Zelle, deren Genom verglichen mit einer Wildtyp-Zelle künstlich verändert worden ist.
E. coli-Stämme, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, sind nicht speziell beschränkt und die jeweiligen Stämme sind in dem Fachgebiet bekannt. In bevorzugten Ausführungsformen ist die rekombinante Wirtszelle von dem E. coli-Stamm E. coli K-12 abgeleitet, mehr bevorzugt von dem E. coli-Stamm E. coli K-12-Teilstamm MG1655.
Der Begriff „Mutation“, wie er hier verwendet wird, betrifft jedwede dauerhafte Veränderung der Nukleotidsequenz des Genoms der Wirtszelle. Ferner bezieht sich der Ausdruck „Mutation in Bezug auf eine Wildtyp-Zelle“, wie er hier verwendet wird, auf die Tatsache, dass die Mutation in einer Wildtyp-Zelle nicht vorliegt, jedoch in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung vorliegt.
Die erste Mutation, die in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung vorliegen kann, ist die Deletion des Gens relA (ΔrelA). Der Begriff „Deletion“, wie er hier verwendet wird, betrifft die Entfernung von jedweder Anzahl von Nukleotiden, die zu einer vollständigen Beseitigung der Expression eines funktionell aktiven Proteins führt. Beispielsweise kann die Deletion eines Gens die Entfernung des gesamten Gens oder der gesamten Kodierungssequenz oder die Entfernung von nur wenigen Nukleotiden oder eines einzigen Nukleotids umfassen, die zu einer vollständigen Beseitigung der Expression oder einem vollständigen Verlust der Proteinaktivität führt.
Das Gen relA kodiert das Enzym (p)ppGpp-Synthetase I (auch als GTP-Pyrophosphokinase bekannt). Sequenzinformationen für dieses Gen finden sich unter der EcoGen-Zugangsnummer EG 10835. Sequenzinformationen für das jeweilige Protein finden sich unter der UniProtKB/Swiss-Prot-Zugangsnummer P0AG20. Das Enzym (p)ppGpp-Synthetase I katalysiert die Umwandlung von ATP und GTP in pppGpp durch Hinzufügen des Pyrophosphats von ATP an den 3'-Kohlenstoff der Ribose in GTP, was AMP freisetzt. Folglich ist das Enzym ein Schlüsselmediator der stringenten E. coli-Antwort, die eine Stressantwort als Reaktion auf einen Aminosäuremangel, eine Fettsäurebeschränkung, eine Eisenbeschränkung, einen Wärmeschock und andere Stressbedingungen ist. Die stringente Antwort wird durch das Alarmon (p)ppGpp (Guanosinpenta- oder -tetraphosphat) als Signal angezeigt und moduliert die Transkription bis zu 1/3 aller Gene in der Zelle. Dies wiederum bewirkt, dass die Zelle Ressourcen vom Wachstum und der Teilung und in die Richtung einer Aminosäuresynthese wegführt, so dass das Überleben gefördert wird, bis sich die Nährstoffbedingungen verbessern.
Verfahren zur Gendeletion in E. coli sind nicht speziell beschränkt und sind bekannt.
Die zweite Mutation, die in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung vorliegen kann, ist die Gegenwart der Aminosäuresubstitutionen R290E und K292D in dem Protein Guanosin-3',5'-bis-pyrophosphat-3'-pyrophosphohydrolase (bifunktionelle (p)ppGpp-Synthetase II; SpoT) (spoT[R290E;K292D]). Das Protein wird durch das Gen spoT kodiert. Sequenzinformationen für dieses Gen finden sich unter der EcoGen-Zugangsnummer EG10966. Sequenzinformationen für das jeweilige Protein finden sich unter der UniProtKB/Swiss-Prot-Zugangsnummer P0AG24. Das bifunktionelle Enzym (p)ppGpp-Synthetase II katalysiert die Hydrolyse sowie die Synthese von (p)ppGpp. Folglich ist das Enzym ein wichtiger Regulator der stringenten E. coli-Antwort. Wie hier verwendet, umfasst die Nummerierung von Aminosäuren in der angegebenen SpoT-Mutation das Start-Methionin als Aminosäureposition 1.
Verfahren zur Einführung von Aminosäuresubstitutionen in ein bestimmtes Protein sind nicht speziell beschränkt und bekannt. Sie umfassen jedwede Verfahren zum Verändern der jeweiligen Kodierungssequenz, so dass die substituierte Aminosäure anstelle der Wildtyp-Aminosäure kodiert wird.
Die dritte Mutation, die in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung vorliegen kann, ist die Gegenwart der Aminosäuresubstitution G267C in dem Protein Pyruvatdehydrogenase-Untereinheit E1 (AceE) (aceE[G267C]). Das Protein wird durch das Gen aceEkodiert. Sequenzinformationen für dieses Gen finden sich unter der EcoGen-Zugangsnummer EG10024. Sequenzinformationen für das jeweilige Protein finden sich unter der UniProtKB/Swiss-Prot-Zugangsnummer P0AFG8. Die Pyruvatdehydrogenase-Untereinheit E1 ist ein Teil des E. coli-Pyruvatdehydrogenase-Komplexes (PDC), der ein Komplex aus drei Enzymen ist, die Pyruvat durch eine Pyruvatdecarboxylierung in Acetyl-CoA umwandeln. Acetyl-CoA kann dann im Zitronensäurezyklus zum Durchführen einer Zellatmung verwendet werden, so dass dieser Komplex den Glykolysestoffwechselweg mit dem Zitronensäurezyklus verknüpft. Wie hier verwendet, umfasst die Nummerierung von Aminosäuren in der angegebenen AceE-Mutation das Start-Methionin als Aminosäureposition 1.
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung die vorstehend genannte Mutation (i). In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Wirtszellen mindestens zwei der vorstehend genannten Mutationen (i) bis (iii), vorzugsweise die Mutationen (i) und (ii). In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Wirtszellen alle drei der vorstehend genannten Mutationen (i) bis (iii).
In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung eines interessierenden Produkts (POI), wobei das POI in einer rekombinanten Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wird.
Der Ausdruck „biosynthetische Herstellung“, wie er hier verwendet wird, betrifft die Tatsache, dass das POI mittels einer endogenen Biosynthese in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung oder durch die Unterstützung der Wirtszellen erzeugt wird.
Das POI unterliegt keinen spezifischen Beschränkungen, mit der Maßgabe, dass es in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung biosynthetisch erzeugt werden kann. In speziellen Ausführungsformen ist das POI ein Protein und das Protein wird in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung exprimiert. In weiteren speziellen Ausführungsformen ist das POI ein organisches Molekül und das organische Molekül wird in den Wirtszellen der vorliegenden Erfindung als Metabolit erzeugt. In bevorzugten Ausführungsformen ist das organische Molekül aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvat, Lactat und Acetat, ausgewählt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das organische Molekül ein Molekül, das von einer hohen Vorstufenzuführung von dem zentralen Metabolismus sowie von einer höheren Energiezufuhr in der Form von ATP und Reduktionsäquivalenten, wie z.B. NADH/NADPH, profitiert, und zwar aufgrund der erhöhten katabolischen Aktivitäten in der Wirtszelle.
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „in den Wirtszellen als Metabolit hergestellt“ die Tatsache, dass das POI das Ergebnis eines bestimmten Stoffwechselwegs der Wirtszellen der vorliegenden Erfindung ist. Dieser Stoffwechselweg kann ein endogener Weg sein, der bereits in Wildtyp-Zellen vorliegt, oder ein künstlicher Weg, der transgen implementiert oder modifiziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Ausgangsmaterial für die Erzeugung des Metaboliten ein Zucker, vorzugsweise ein Zucker, der aus der Gruppe, bestehend aus Glukose, Fruktose, Mannose, Xylose, Arabinose und Saccharose, ausgewählt ist, wobei Glukose besonders bevorzugt ist. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das Ausgangsmaterial ein Substrat, das in dem zentralen Metabolismus von E. coli metabolisiert wird, vorzugsweise ein Substrat, das mittels des Phosphotransferasesystems (PTS) in die Zelle transportiert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen einer verminderten Stoffwechselaktivität der Zellen während der Herstellungsphase durchgeführt, um das Herstellungsverfahren innerhalb der Grenzen der vorstehend beschriebenen technischen Beschränkungen aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise wird die metabolische Aktivität durch Beschränken der Menge von verfügbaren Stickstoffquellen vermindert.
Vorzugsweise umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie sie vorstehend festgelegt sind, die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Wirtszelle der vorliegenden Erfindung, wobei die Wirtszelle das POI erzeugen kann,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Erzeugung des POI ermöglichen.

Mittel, die bewirken, dass eine Wirtszelle ein oder mehrere bestimmte(s) POI erzeugen kann, unterliegen keinen spezifischen Beschränkungen und sind bekannt. Ferner sind jeweilige Kulturtechniken und -bedingungen bekannt. Beispielsweise umfassen solche Techniken Chargenverfahren oder Verfahren mit kontinuierlicher Strömung in Bioreaktoren, Fed-batch-Verfahren mit oder ohne Zellretention, immobilisierte oder eingetauchte kultivierte Zellen und E. coli-Biofilme, gegebenenfalls in einem industriellen Maßstab.
In einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer rekombinanten Wirtszelle der vorliegenden Erfindung für die biosynthetische Herstellung eines interessierenden Produkts (POI).
In diesem Aspekt gelten alle relevanten Definitionen und Beschränkungen, die vorstehend für die Wirtszellen und die Verfahren der vorliegenden Erfindung festgelegt worden sind, in einer analogen Weise.
Die Begriffe „umfasst/umfassen“, wie sie hier verwendet werden, sollen ausdrücklich die Begriffe „besteht/besteht im Wesentlichen aus“ und „besteht/besteht aus“ umfassen.
Durch spezifische, zielgerichtete Eingriffe in den Metabolismus und die metabolische Regulation von E. coli erreicht die vorliegende Erfindung in einer vorteilhaften Weise verglichen mit Wildtyp-Zellen eine zwei- bis dreifache Zunahme der Zuckeraufnahmeraten in ruhenden, nicht-wachsenden Zellen. Dies führt zu einer zwei- bis dreifach erhöhten Kohlenstoffquellenströmung in den Zellen, die Prozesse für die Erzeugung eines interessierenden mikrobiellen Produkts versorgen kann. Folglich kann die Verfahrensproduktivität um denselben Faktor erhöht werden.
Die Figuren zeigen:

1: Chargenkultivierung des Escherichia coli MG1655-Wildtyp-Stamms in einem minimalen Medium, das mit 18 g/L Glukose als einzige C-Quelle und 40 mM NH₄ ⁺ als einzige N-Quelle ergänzt ist, bei Startbedingungen. Nach 6 Stunden liegt Glukose nach wie vor im Überschuss vor und die Stickstoffquelle ist bis zu einer minimalen Restkonzentration verbraucht. Das exponentielle Bakterienwachstum stoppt sofort. Datenpunkte und Fehlerbalken werden von drei parallelen Fermentationen n = 3 abgeleitet.
2: Chargenkultivierung des Escherichia coli K-12 MG1655 aceE[G267C]-Stamms in einem minimalen Medium, das mit 30 g/L Glukose als einzige C-Quelle und 40 mM NH₄ ⁺ als einzige N-Quelle ergänzt ist, bei Startbedingungen. Nach 16 Stunden liegt Glukose nach wie vor im Überschuss vor und die Stickstoffquelle ist bis zu einer minimalen Restkonzentration verbraucht. Das exponentielle Bakterienwachstum stoppt sofort. Datenpunkte und Fehlerbalken werden von drei parallelen Fermentationen n = 3 abgeleitet.
3: Chargenkultivierung des Escherichia coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D]-Stamms in einem minimalen Medium, das mit 28 g/L Glukose als einzige C-Quelle und 40 mM NH₄ ⁺ als einzige N-Quelle ergänzt ist, bei Startbedingungen. Nach 5,4 Stunden liegt Glukose nach wie vor im Überschuss vor und die Stickstoffquelle ist bis zu einer minimalen Restkonzentration verbraucht. Das exponentielle Bakterienwachstum stoppt sofort. Datenpunkte und Fehlerbalken werden von drei parallelen Fermentationen n = 3 abgeleitet.
4: Chargenkultivierung des Escherichia coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] aceE[G267C]-Stamms in einem minimalen Medium, das mit 28 g/L Glukose als einzige C-Quelle und 40 mM NH₄ ⁺ als einzige N-Quelle ergänzt ist, bei Startbedingungen. Nach 15 Stunden liegt Glukose nach wie vor im Überschuss vor und die Stickstoffquelle ist bis zu einer minimalen Restkonzentration verbraucht. Das exponentielle Bakterienwachstum stoppt sofort. Datenpunkte und Fehlerbalken werden von drei parallelen Fermentationen n = 3 abgeleitet.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, ohne darauf beschränkt zu sein.
Beispiele
Materialien und Verfahren:
Medien und Lösungen - Minimales Vorkulturmedium

Lösung A: (10× Salze)
NaH₂PO₄ · 2 H₂O	98,44 g/L
K₂HPO₄	46,86 g/L
(NH₄)₂HPO₄	13,21 g/L
(NH₄)₂SO₄	26,80 g/L
Na₂SO4	8,80 g/L

Der pH-Wert wurde mit KOH auf pH 7,0 eingestellt

Lösung B: (1000× Ca²⁺)
CaCl₂ · 2 H₂O		14,70 g/L

Lösung C: (1000× Mg²⁺)
MgSO₄ · 7 H₂O		246,48 g/L

Lösung D: (2000× Spurenelemente-Lösung = TES)
FeCl₃ · 6 H₂O		16,70 g/L
Na₂-EDTA		20,10 g/L
ZnSO₄ · 7H₂O		0,18 g/L
MnSO₄ · H₂O		0,10 g/L
CuSO₄ · 5 H₂O		0,16 g/L
COCl₂ · 6 H₂O		0,18 g/L

Lösung E: (1000x Vitamin)
Thiamin HCl	10,00 g/L

Lösung F: (50 % Glukose Gew./Vol.)
α-D(+)-Glukose · H₂O			500,00 g/L

Medien und Lösungen - minimales Chargenmedium

Lösung A.2: (10x Salze)
NaH₂PO₄ · 2 H₂O		98,44 g/L
K₂HPO₄		46,86 g/L
(NH₄)₂HPO₄		13,21 g/L
(NH₄)₂SO₄		12,68 g/L
Na₂SO₄		8,80 g/L
Der pH-Wert wurde mit KOH auf pH 7,0 eingestellt

Lösung B: (1000× Ca²⁺)
CaCl2 · 2 H₂O		14,70 g/L

Lösung C: (1000× Mg²⁺)
MgSO₄ · 7 H₂O		246,48 g/L

Lösung D: (2000x Spurenelemente-Lösung = TES)
FeCl3 · 6 H₂O		16,70 g/L
Na₂-EDTA		20,10 g/L
ZnSO₄ · 7 H₂O		0,18 g/L
MnSO₄ · H₂O		0,10 g/L
CuSO₄ · 5 H₂O		0,16 g/L
CoCl₂ · 6 H₂O		0,18 g/L

Lösung E: (1000× Vitamin)
Thiamin HCl	10,00 g/L

Lösung F: (50 % Glukose Gew./Vol.)
α-D(+)-Glukose · H₂O			500,00 g/L

Vorkultur-Schüttelkolbenkultivierung
Zur Herstellung des minimalen Vorkulturmediums wurden die vorstehend beschriebenen Lösungen A, B und C getrennt hergestellt und auch für 20 min bei 120 °C getrennt sterilisiert. Die Lösungen D, E und F wurden getrennt hergestellt und bei einer Porengröße von 0,2 µm sterilfiltriert. Für 1 L eines gebrauchsfertigen Vorkulturmediums wurden 100 mL 10x Salze, 1 mL 1000x Ca²⁺-Vorratslösung, 1 mL 1000× Mg²⁺-Vorratslösung, 0,5 mL 2000x TES, 1 mL 1000x Vitamin-Vorratslösung, 10 mL 50 % Gew./Vol. Glukose-Vorratslösung und 886,5 mL steriles Wasser gemischt. Sterile 500 mL-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit Ablenkplatten wurden mit 60 mL des minimalen Vorkulturmediums gefüllt. Für jeden Stamm wurde die Vorkultur parallel mit drei speziell beimpften Schüttelkolben bei 37 °C und konstantem Rühren durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation (4500 × g, 10 min, 4 °C) geerntet und zu einer optischen Dichte von etwa 8,0 in einem Volumen von 5 mL verdünnt. Diese Zellsuspension wurde zum Beimpfen der Bioreaktoren verwendet.
Chargenkultivierung
Zur Herstellung des minimalen Chargenmediums wurden die Lösungen B und C, die vorstehend beschrieben worden sind, getrennt hergestellt und auch für 20 min bei 120 °C getrennt sterilisiert. Die Lösungen D, E und F wurden getrennt hergestellt und bei einer Porengröße von 0,2 µm sterilfiltriert.
Alle Fermentationsverfahren wurden in einem parallelen Kultivierungssystem durchgeführt, das aus drei identischen HWS-Glasbioreaktoren mit einem Arbeitsvolumen von jeweils 250 mL bestanden. Nach dem Zusammenbau des Kultivierungssystems wurde jeder Bioreaktor separat mit 20 mL 10x Salzen (Lösung A.2) und 160 mL Wasser gefüllt. Diese verdünnte Salzlösung wurde in jedem Bioreaktor für 20 min bei 120 °C sterilisiert. Nach der Sterilisation wurde jedem Behälter ein Gesamtvolumen von 15 mL, enthaltend: 7,2 mL 50 % Gew./Vol. Glukose-Vorratslösung (E. coli K-12 MG1655-Wildtyp) oder 11,2 mL 50 % Gew./Vol. Glukose-Vorratslösung (E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D], E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E; K292D] aceE[G267C]) oder 12 mL 50 % Gew./Vol. Glukose-Vorratslösung (E. coli K-12 MG1655 aceE[G267C]), 0,2 mL 1000x Ca²⁺-Vorratslösung, 0,2 mL 1000× Mg²⁺-Vorratslösung, 0,1 mL 2000x TES, 0,2 mL 1000x Vitamin-Vorratslösung und 7,1 mL Wasser oder 3,1 mL Wasser oder 2,3 mL Wasser steril zugesetzt. Jeder Bioreaktor wurde mit 5 mL einer konzentrierten Vorkultur beimpft, die eine optische Ausgangsdichte von 0,2 ergab. Fermentationen wurden bei einer konstanten Temperatur von 37 °C, Rühren und einer guten Sauerstoffversorgung durchgeführt. Die Verfahrensdauer variierte für jeden E. coli K-12 MG1655-Stamm. Individuelle Fermentationszeiten sind für die entsprechenden Stämme in den nachstehenden Beispielen 1 bis 4 genannt.
Stickstoff-beschränkte Chargenkultivierungsphase
Jedes Chargenkultivierungsverfahren begann mit identischen Bedingungen, mit der Ausnahme der Variation der anfänglichen Glukosekonzentrationen für die Verfahren von E. coli K-12 MG1655-Wildtyp/E coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D]) und E. coli K-12 MG1655 aceE[G267C]/E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] aceE[G267C]. Trotz der tatsächlichen Menge von Glukose lag diese einzige C-Quelle zu Beginn jeder Fermentierung stets in einem sehr großen Überschuss vor. Dies gilt auch für alle zusätzlichen Nährstoffe in dem minimalen Chargenmedum, wie sie vorstehend angegeben sind. Für die ersten paar Stunden wuchs jeder E. coli K-12 MG1655-Stamm exponentiell mit dessen sehr spezifischer Wachstumsrate und verbrauchte Glukose mit dessen individueller Biomasse-spezifischer Aufnahmerate unter nicht-beschränkenden Bedingungen. Dieser Zustand wird in den 1, 2, 3 und 4 als „Exponentielles Wachstum“ bezeichnet. Eine festgelegte Stickstoffkonzentration in dem minimalen Medium ermöglicht es den Bakterienzellen, vor dem Eintreten in die Stickstoffmangel-Nährbedingungen eine bestimmte Gesamtbiomasse zu bilden. Die anschließende N-beschränkte Wachstumsphase wird ferner in den 1, 2, 3 und 4 als „Stickstoff-beschränktes Wachstum“ bezeichnet. Während dieser späten Stufe des Fermentationsverfahrens war das Bakterienwachstum aufgrund des Stickstoffmangels stark eingeschränkt. Die Glukosekonzentration blieb jedoch reichlich und die Raten für den Biomasse-spezifischen Glukoseverbrauch bei beschränkten Wachstumsbedingungen konnten berechnet werden.
Beispiel 1:
In diesem Beispiel wurde Escherichia coli K-12 MG1655-Wildtyp bei Vorkultivierungsbedingungen in Schüttelkolben, wie es vorstehend beschrieben worden ist, für 12 Stunden unter konstantem Rühren kultiviert. Diese Bakterienzellen wurden dann unter sterilen Bedingungen in die drei Bioreaktoren überführt, um mit dem Chargenkultivierungsverfahren zu beginnen. Escherichia coli K-12 MG1655-Wildtyp-Zellen wurden für einen Gesamtzeitraum von 9 Stunden mit einer Ausgangskonzentration von Glukose von 18 g/L kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase betrug die maximale Biomasse-spezifische Wachstumsrate 0,718 ± 0,007 Stunde^-1 und Glukose wurde bei einer Biomasse-spezifische Rate von 1,765 ± 0,056 g_Glk/g_Ztg·Stunde (Ztg: Zelltrockengewicht) verbraucht. Wie es aus der 1 ersichtlich ist, wuchsen diese Zellen während der ersten 6 Stunden der Kultivierung, bevor das gesamte NH₄ ⁺ in dem minimalen Medium verbraucht war und die Stickstoff-beschränkte Wachstumsphase erreicht war, exponentiell. Während der folgenden 3 Stunden der Kultivierung zeigten die Bakterienzellen ein beschränktes lineares Wachstumsverhalten und auch ein lineares Fortschreiten des Glukoseverbrauchs. Die Biomasse-spezifische Glukoseaufnahmerate in der Stickstoff-beschränkten Kultivierungsphase von Stunde 6 bis 9 erreichte einen durchschnittlichen Wert von 0,245 ± 0,011g_Glk/g_Ztg·Stunde und die Biomasse-spezifische Wachstumsrate fiel auf einen Wert von 0,043 ± 0,004 Stunde^-1.
Beispiel 2:
In diesem Beispiel wurde Escherichia coli K-12 MG1655 aceE[G267C] bei Vorkultivierungsbedingungen in Schüttelkolben, wie es vorstehend beschrieben worden ist, für 29,5 Stunden unter konstantem Rühren kultiviert. Diese Bakterienzellen wurden dann unter sterilen Bedingungen in die drei Bioreaktoren überführt, um mit dem Chargenkultivierungsverfahren zu beginnen. Escherichia coli K-12 MG1655 aceE[G267C]-Zellen wurden für einen Gesamtzeitraum von 23,5 Stunden mit einer Ausgangskonzentration von Glukose von 30 g/L kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase betrug die maximale Biomasse-spezifische Wachstumsrate 0,201 ± 0,004 Stunde^-1 und Glukose wurde bei einer Biomasse-spezifische Rate von 1,512 ± 0,022 g_Glk/g_Ztg·Stunde verbraucht. Wie es aus der 2 ersichtlich ist, wuchsen diese Zellen während der ersten 16 Stunden der Kultivierung, bevor das gesamte NH₄ ⁺ in dem minimalen Medium verbraucht war und die Stickstoff-beschränkte Wachstumsphase erreicht war, exponentiell. Während der folgenden 7,5 Stunden der Kultivierung zeigten die Bakterienzellen ein beschränktes lineares Wachstumsverhalten und auch ein lineares Fortschreiten des Glukoseverbrauchs. Die Biomasse-spezifische Glukoseaufnahmerate in der Stickstoff-beschränkten Kultivierungsphase von Stunde 16 bis 23,5 erreichte einen durchschnittlichen Wert von 0,314 ± 0,012 g_Glk/g_Ztg·Stunde und die Biomasse-spezifische Wachstumsrate fiel auf einen Wert von 0,008 ± 0,004 Stunde^-1.
Beispiel 3:
In diesem Beispiel wurde Escherichia coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] bei Vorkultivierungsbedingungen in Schüttelkolben, wie es vorstehend beschrieben worden ist, für 11 Stunden unter konstantem Rühren kultiviert. Diese Bakterienzellen wurden dann unter sterilen Bedingungen in die drei Bioreaktoren überführt, um mit dem Chargenkultivierungsverfahren zu beginnen. Escherichia coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D]-Zellen wurden für einen Gesamtzeitraum von 8,4 Stunden mit einer Ausgangskonzentration von Glukose von 28 g/L kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase betrug die maximale Biomasse-spezifische Wachstumsrate 0,715 ± 0,003 Stunde^-1 und Glukose wurde bei einer Biomasse-spezifische Rate von 1,770 ± 0,059 g_Glk/g_Ztg·Stunde verbraucht. Wie es aus der 3 ersichtlich ist, wuchsen diese Zellen während der ersten 5,4 Stunden der Kultivierung, bevor das gesamte NH₄ ⁺ in dem minimalen Medium verbraucht war und die Stickstoff-beschränkte Wachstumsphase erreicht war, exponentiell. Während der folgenden 3 Stunden der Kultivierung zeigten die Bakterienzellen ein beschränktes lineares Wachstumsverhalten und auch ein lineares Fortschreiten des Glukoseverbrauchs. Die Biomasse-spezifische Glukoseaufnahmerate in der Stickstoff-beschränkten Kultivierungsphase von Stunde 5,4 bis 8,4 erreichte einen durchschnittlichen Wert von 0,352 ± 0,016g_Glk/g_Ztg·Stunde und die Biomasse-spezifische Wachstumsrate fiel auf einen Wert von 0,014 ± 0,002 Stunde^-1.
Beispiel 4:
In diesem Beispiel wurde Escherichia coliK-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] aceE[G267C] bei Vorkultivierungsbedingungen in Schüttelkolben, wie es vorstehend beschrieben worden ist, für 29 Stunden unter konstantem Rühren kultiviert. Diese Bakterienzellen wurden dann unter sterilen Bedingungen in die drei Bioreaktoren überführt, um mit dem Chargenkultivierungsverfahren zu beginnen. Escherichia coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] aceE[G267C]-Zellen wurden für einen Gesamtzeitraum von 21,3 Stunden mit einer Ausgangskonzentration von Glukose von 28 g/L kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase betrug die maximale Biomasse-spezifische Wachstumsrate 0,290 ± 0,012 Stunde^-1 und Glukose wurde bei einer Biomasse-spezifische Rate von 1,791 ± 0,059g_Glk/g_Ztg·Stunde verbraucht. Wie es aus der 4 ersichtlich ist, wuchsen diese Zellen während der ersten 15 Stunden der Kultivierung, bevor das gesamte NH₄ ⁺ in dem minimalen Medium verbraucht war und die Stickstoff-beschränkte Wachstumsphase erreicht war, exponentiell. Während der folgenden 6,3 Stunden der Kultivierung zeigten die Bakterienzellen ein beschränktes lineares Wachstumsverhalten und auch ein lineares Fortschreiten des Glukoseverbrauchs. Die Biomasse-spezifische Glukoseaufnahmerate in der Stickstoff-beschränkten Kultivierungsphase von Stunde 15 bis 21,3 erreichte einen durchschnittlichen Wert von 0,596 ± 0,023g_Glk/g_Ztg·Stunde und die Biomasse-spezifische Wachstumsrate fiel auf einen Wert von -0,010 ± 0,004 Stunde^-1.
Beispiel 5:
Der spezifische Glukoseverbrauch, wie er in den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 bestimmt worden ist, ist in den nachstehenden Tabellen zusammengefasst.

Die Tabelle 1 zeigt den Vergleich von Biomasse-spezifischen Raten in verschiedenen Escherichia coli K-12 MG1655-Mutantenstämmen und dem Wildtyp während der Stickstoff-beschränkten Chargenkultivierungsphase. Die Werte werden aus mindestens drei parallelen Fermentationen n ≥ 3 berechnet. Für einen weiteren Vergleich ist der Literaturwert für m_S ^wahr in der letzten Zeile der Tabelle 1 angegeben. Er bezeichnet den „wahren“ Aufrechterhaltungskoeffizienten für Glukose für nicht-wachsende Zellen bei Kohlenstoff-beschränkenden Bedingungen. Tabelle 1

Stamm	Glukoseaufnahme (N-beschränkt)		Wachstum (N-beschränkt)
	q_S [g/g_Ztg·Stunde]		µ[Stunde^-1]
	Ø	σ	Ø	σ
E. coli K-12 MG1655-Wildtyp	0,245	0,011	0,043	0,004
E. coli K-12 MG1655 aceE[G267C]	0,314	0,012	0,008	0,004
E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D]	0,352	0,016	0,014	0,002
E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] aceE[G267C]	0,596	0,023	-0,010	0,004
Escherichia coli m_S ^wahr	0,057	-	0,000	0,000

Die Tabelle 2 zeigt den Vergleich von Biomasse-spezifische Raten in verschiedenen Escherichia coli K-12 MG1655-Mutantenstämmen und dem Wildtyp während der anfänglichen Chargenkultivierungsphase des exponentiellen Wachstums mit allen Nährstoffen im Überschuss. Die Werte werden aus mindestens drei parallelen Fermentationen n ≥ 3 berechnet. Tabelle 2

Stamm	Glukoseaufnahme (Überschuss)		Wachstum (Überschuss)
	q_S [g/g_Ztg·Stunde]		µ [Stunde^-1]
	Ø	σ	Ø	σ
E coli K-12 MG1655-Wildtyp	1,765	0,056	0,718	0,007
E coli K-12 MG1655 aceE[G267C]	1,512	0,022	0,201	0,004
E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D]	1,770	0,059	0,715	0,003
E. coli K-12 MG1655 ΔrelA spoT[R290E;K292D] aceE[G267C]	1,791	0,059	0,290	0,012

Diskussion:
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden erhöhte Zuckeraufnahmeraten in ruhenden Zellen durch spezifische, zielgerichtete Eingriffe in den Metabolismus und die metabolische Regulation von E. coli erreicht.
In Bezug auf die metabolische Regulation ist bekannt, dass die stringente Antwort in E. coli eine zentrale Rolle bei den Bedingungen einer beschränkten Substratverfügbarkeit spielt. In diesem Zusammenhang ist das Alarmon (p)ppGpp (Guanosinpenta- oder -tetraphosphat) ein wichtiges Signal für die Induktion und Vermittlung der regulatorischen Reaktion. Bisherige Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Zunahme der L-Lysin-Erzeugung durch eine Zunahme der (p)ppGpp-Verfügbarkeit nach einer Überexpression von (p)ppGpp-Synthetase I erreicht werden kann, die durch das E. coli-Gen relA kodiert wird. Bezüglich des E. coli-Metabolismus wurde gezeigt, dass die Einführung einer künstlichen ATPase-Aktivität in E. coli zu einer Verminderung der verfügbaren Menge von ATP führt, was zu einer erhöhten Glukoseaufnahme führt.
Folglich sollte eine Zunahme der ppGpp-Synthese, z.B. durch eine Überexpression von relA, für die intrazelluläre Verfügbarkeit von Kohlenstoffquellen vorteilhaft sein. Ferner sollte eine künstliche Verminderung der Verfügbarkeit von ATP zu E. coli-Zuckeraufnahmeraten führen. In der vorliegenden Erfindung wurde jedoch überraschenderweise gefunden, dass die Verminderung der ppGpp-Synthese durch die Deletion von relA, gegebenenfalls in einer Kombination mit einer Verminderung der restlichen ppGpp-Synthetaseaktivität von SpoT durch die Einführung der spoT[R290E;K292D]-Mutation und gegebenenfalls in einer weiteren Kombination mit der Einführung der Mutation aceE[G267C] zu dem gewünschten Phänotyp mit erhöhten Zuckeraufnahmeraten in ruhenden Zellen führt, die verglichen mit Wildtyp-Zellen zwei- bis dreifach höher sind.

Claims

Rekombinante Escherichia coli(E. coli) Wirtszelle, wobei die Zelle die folgenden Mutationen in Bezug auf eine Wildtyp-Zelle umfasst: (iv) Deletion des Gens relA (ΔrelA); (v) Aminosäuresubstitutionen R290E und K292D in dem Protein Guanosin-3',5'-bis-pyrophosphat-3'-pyrophosphohydrolase (bifunktionelle (p)ppGpp-Synthetase II; SpoT) (spoT[R290E;K292D]); und (vi) Aminosäuresubstitution G267C in dem Protein Pyruvatdehydrogenase-Untereinheit E1 (AceE) (aceE[G267C]).
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle vom E. coli-Stamm E. coli K-12 abgeleitet ist.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle vom E. coli-Stamm E. coli K-12 Teilstamm MG1655 abgeleitet ist.
Verfahren zur biosynthetischen Herstellung eines interessierenden Produkts (POI), wobei das POI in einer rekombinanten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das POI ein Protein ist und das Protein in der rekombinanten Wirtszelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das POI ein organisches Molekül ist und das organische Molekül in der rekombinanten Wirtszelle als Metabolit erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das organische Molekül aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvat, Lactat und Acetat, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das Ausgangsmaterial zur Erzeugung des Metaboliten ein Zucker ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Zucker aus der Gruppe, bestehend aus Glukose, Fruktose, Mannose, Xylose, Arabinose und Saccharose, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei die metabolische Aktivität der rekombinanten Wirtszellen durch Beschränken der Menge von verfügbaren Stickstoffquellen vermindert wird.
Verwendung einer rekombinanten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur biosynthetischen Herstellung eines interessierenden Produkts (POI).