DE102011088151B4

DE102011088151B4 - Mikroorganismus mit erhöhter L-Valin Produktivität und Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung desselben

Info

Publication number: DE102011088151B4
Application number: DE102011088151A
Authority: DE
Inventors: Hye Won Kim; Ji-Hye Lee; Soo Youn Hwang; Jong Hyun Kim
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-06-20
Anticipated expiration: 2031-12-10
Also published as: GB201121073D0; ES2399578B1; GB2493999B; JP2014521363A; MY171029A; US20130045511A1; CN102517239B; JP5852738B2; DK2559753T3; EP2559753A1; PL2559753T3; GB2493999A; US8465962B2; BR112014003469B1; KR101117022B1; GB201116206D0; BR112014003469A2; CN102517239A; EP2559753B1; WO2013024947A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität und ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung desselben. Stärker bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung einen Corynebacterium glutamicum Mutantenstamm, der eine Resistenz gegenüber L-Valin und Derivaten davon aufweist, um eine erhöhte L-Valin-Produktivität aufzuweisen, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung desselben.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität und ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung desselben.
2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets
L-Aminosäuren werden in der Humanmedizin verwendet, insbesondere in der Pharmaindustrie, Lebensmittelindustrie und Tierernährung oder dergleichen. Verzweigt-kettige Aminosäuren beziehen sich insbesondere auf drei Aminosäuren unter neun essentiellen Aminosäuren: L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin. Im Gegensatz zu anderen Aminosäuren, die hauptsächlich in der Leber metabolisiert werden, werden verzweigt-kettige Aminosäuren hauptsächlich im Muskelgewebe metabolisiert und dienen als eine Energiequelle während Bewegung. Da verzweigt-kettige Aminosäuren bekannt dafür sind, eine wichtige Rolle bei Muskelerhaltung und -wachstum während Bewegung zu spielen, wächst ihre Verwendung. Besonders L-Valin wurde als ein Futterbestandteil verwendet, weil berichtet wurde, dass L-Valin hohe Reduktionskräfte aufweist und dazu dient, die Laktationsleistung von Säuen zu verbessern. L-Valin wurde auch in Infusionslösungen und Aminosäure-Komplexen für medizinische Zwecke und in Gesundheits-Ergänzungsmitteln und Getränkezusatzstoffen verwendet.
Ein Mikroorganismus, der für die Herstellung von L-Aminosäuren verwendet wird, wird durch coryneforme Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum repräsentiert. Aufgrund der hohen Bedeutung von coryneformen Bakterien in der industriellen Herstellung, erfahren die Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung der Mikroorganismen kontinuierlich Verbesserung. Verbesserungen werden zum Beispiel vorgenommen, um das Verfahren, das Rühren und Einführen von Sauerstoff oder Zusammensetzungen der Kulturmedien wie zum Beispiel Zuckerkonzentration während der Fermentation betrifft, zu verbessern. Um die L-Aminosäure-Produktivität dieser Mikroorganismen zu verbessern, werden Selektions- und Mutantenselektions-Verfahren weithin eingesetzt. Es gibt zum Beispiel ein Verfahren zur Selektion und Verwendung von Mikroorganismen, die resistent gegenüber Antimetaboliten sind, wie zum Beispiel ein Isoleucin-Derivat, Isoleucin-Hydroxamat (Kisumi M et al., (1972) Journal of Bacteriology 110: 761–763), ein L-Valin-Derivat, 2-Thiazolalanin (Tsuchida T et al., (1975) Agricultural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319–1322) oder ein Leucin-Derivat, α-Aminobutyrat (Ambe-Ono Y et al., (1996) Bioscience Biotechnology Biochemistry 60: 1386–1387), oder auxotroph für Metaboliten, die regulatorische Relevanz haben und L-Aminosäuren herstellen (Eva Radmacher et al., (2002) Applied and Environmental Microbiology, Bd. 68 S. 2246–2250).
Inzwischen wurde eine der verzweigt-kettigen Aminosäuren, L-Valin in einem Mikroorganismus biosynthetisiert, ausgehend von Brenztraubensäure über Acetomilchsäure, Dihydroxyisovaleriansäure und Ketoisovaleriansäure. Diese Zwischen-Metabolite werden durch katalytische Aktivitäten von Acetohydroxysäure-Synthase, Acetohydroxysäure-Isomeroreduktase, Dihydroxysäure-Dehydratase und Transaminase B hergestellt. Diese Enzyme sind jedoch auch an der L-Isoleucin-Biosynthese ausgehend von Ketobuttersäure und Brenztraubensäure beteiligt und L-Leucin wird auch aus dem Zwischen-Metabolit, Ketoisovaleriansäure über 2-Isopropyläpfelsäure, 3-Isopropyläpfelsäure und Ketoisocapronsäure biosynthetisiert. Da die Enzyme, die in den Biosynthesewegen der verzweigt-kettigen Aminosäuren, nämlich L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin verwendet werden, identisch sind, ist es daher schwierig, nur eine der verzweigt-kettigen Aminosäuren durch industrielle Fermentation herzustellen. Zusätzlich tritt eine Feedback-Inhibition durch das Endprodukt L-Valin oder Derivate davon auf, was es schwierig für eine industrielle Massenherstellung von L-Valin macht.
Um diese Probleme zu lösen, wurden viele Studien vorgenommen, um L-Valin-herstellende Mikroorganismen mit einer Resistenz gegenüber L-Valin oder Derivaten davon für die Herstellung von L-Valin zu entwickeln und sie werden durch ein Verfahren zur Verwendung eines Mikroorganismus mit einer Resistenz gegenüber D, L-Aminobuttersäure ( Japanische Patentanmeldung Nr. JP 63160592 A ), ein Verfahren zur Verwendung eines Mikroorganismus, der gegenüber Thiazolalanin resistent und auxotroph für Leucin, Isoleucin oder Threonin ist ( Japanische geprüfte Patentanmeldung Nr. JP 52000116 B4 ), ein Verfahren zur Verwendung eines Mikroorganismus mit einer Resistenz gegenüber Aminoethylcystein ( B4 ), ein Verfahren zur Verwendung eines Mikroorganismus mit einer Resistenz gegenüber L-Valin in einem mit Essigsäure angereicherten Medium und mit einer Empfindlichkeit gegenüber Brenztraubensäure in einem mit Glucose angereicherten Medium (US Patent Nr. US 5 521 074 A , koreanisches Patent Nr. KR 101995005133 B1 ), ein Verfahren zur Verwendung eines Mikroorganismus mit einer Resistenz gegenüber Polyketid (koreanisches Patent Nr. KR 101996016871 B1 ) oder dergleichen veranschaulicht.
Derzeit entwickelte L-Valin-herstellende Mikroorganismen sind jedoch nur gegenüber einem einzelnen Material oder einem begrenzten Material von L-Valin oder Derivaten davon resistent und folglich gibt es immer noch einen Bedarf, L-Valin-herstellende Mikroorganismen mit einer Resistenz gegenüber verschiedenen Materialien, die an der Feedback-Kontrolle der L-Valin-Biosynthese beteiligt sind, zu entwickeln.
Aus diesen Gründen haben die vorliegenden Erfinder viele Anstrengungen unternommen, um Mikroorganismen zu entwickeln, die fähig sind, L-Valin in einer höheren Ausbeute als andere konventionelle Stämme herzustellen. Als ein Ergebnis haben sie gefunden, dass ein Mutantenstamm, der aus einem Glutaminsäure-herstellenden Mikroorganismus erhalten wurde, L-Valin in einer hohen Ausbeute herstellt und eine Resistenz gegenüber zahlreichen L-Isoleucin-Derivaten und L-Valin-Derivaten, insbesondere α-Aminobuttersäure (ABA), α-Hydroxyvalin (AHV), Thiazolalanin (TA) und Norvalin (NV) aufweist, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen L-Valin-herstellenden Corynebacterium glutamicum Mutantenstamm KCCM11201P bereitzustellen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung des Mutantenstamms bereitzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Biosyntheseweg von L-Valin als das Endprodukt der vorliegenden Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen L-Valin-herstellenden Corynebacterium glutamicum Mutantenstamm KCCM11201P bereit.
Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff ”L-Valin” eine L-Aminosäure mit einer chemischen Formel von (CH₃)₂CHCH(NH₂)COOH, die eine der essentiellen Aminosäuren ist und strukturell zu den verzweigt-kettigen Aminosäuren gehört, zusammen mit L-Leucin und L-Isoleucin.
Mittlerweile ist die L-Valin-Biosynthese in einem Mikroorganismus wie in 1 gezeigt, worin L-Valin ausgehend von Brenztraubensäure über Acetomilchsäure, Dihydroxyisovaleriansäure und Ketoisovaleriansäure biosynthetisiert wird. Zusätzlich wird der Biosyntheseweg durch Enzyme wie zum Beispiel Acetohydroxysäure-Synthase, Acetohydroxysäure-Isomeroreduktase, Dihydroxysäure-Dehydratase und Transaminase B katalysiert. Diese Enzyme werden jedoch in den Biosynthesewegen der verzweigt-kettigen Aminosäuren, nämlich L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin, identisch verwendet und folglich ist es schwierig nur eine der verzweigtkettigen Aminosäuren durch industrielle Fermentation herzustellen. Insbesondere tritt eine Feedback-Inhibition durch das Endprodukt L-Valin oder Derivaten davon auf, was es schwierig macht, eine Massenherstellung von L-Valin durchzuführen. Bei Lösen des Problems ist der Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung ein neuer Mikroorganismus, der eine Resistenz gegenüber L-Valin oder Derivaten davon aufweist, um die Feedback-Inhibition zu entfernen, wodurch eine erhöhte L-Valin-Produktivität gezeigt wird.
Bevorzugt kann der Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung eine Resistenz gegenüber Valin oder Derivaten davon, Isoleucin oder Derivaten davon aufweisen.
Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff ”Derivat” die bekannten Verbindungen, die die Feedback-Inhibition bezüglich der Biosynthese des Endprodukts L-Valin induzieren, um die Herstellung von L-Valin in dem Mikroorganismus zu reduzieren, und ein Beispiel von L-Isoleucin-Derivaten kann α-Aminobuttersäure und von L-Valin-Derivaten, alpha-Hydroxyvalin, Thiazolalanin und Norvalin oder dergleichen sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugt kann der Mutantenstamm eine Resistenz gegenüber einer oder mehreren Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Valin, α-Aminobuttersäure, alpha-Hydroxyvalin, Thiazolalanin und Norvalin aufweisen. Am stärksten bevorzugt kann er eine Resistenz gegenüber allen von Valin, α-Aminobuttersäure, alpha-Hydroxyvalin, Thiazolalanin und Norvalin aufweisen.
Allgemein ist bekannt, dass die L-Valin-Biosynthese inhibiert wird, wenn L-Valin zu einem bestimmten Level in einer Zelle angesammelt ist. Der Stamm mit einer Resistenz gegenüber den Derivaten entlastet daher die Inhibition aus L-Valin und kann folglich sogar bei einer hohen Konzentration herstellen. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzten die vorliegenden Erfinder ein Verfahren zur Selektion von Mikroorganismen ein, die fähig sind, ein hohes Level an L-Valin durch Verwendung der Derivate herzustellen. Da L-Isoleucin eine Aminosäure ist, die durch einen Biosyntheseweg hergestellt wird, der identisch zum L-Valin-Biosyntheseweg ist, können die Stämme, die fähig sind, ein hohes Level an L-Valin herzustellen, weiterhin auch durch Analyse, ob die Stämme eine Resistenz gegenüber den Isoleucin-Derivaten erwerben, selektiert werden. Die Isoleucin-Derivate werden folglich auch verwendet, um die Stämme, die fähig sind ein hohes Level an L-Valin herzustellen, zu selektieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Mutantenstamm mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität aus den parentalen Stämmen durch Mutation selektiert. In diesem Zusammenhang können die Mutationen in dem Mikroorganismus durch eine Vielzahl an Techniken, die weithin im Fachgebiet bekannt sind, induziert werden und ein beliebiger von physikalischen und chemischen mutagenen Faktoren kann verwendet werden. Beispiele des chemischen mutagenen Faktors, der für die vorliegende Erfindung geeignet ist, schließen N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), Diepoxybutan, Ethyl-methansulfonat, Senf-Verbindungen, Hydrazin und salpetrige Säure ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich können Beispiele des physikalischen mutagenen Faktors Ultraviolett- und Gamma-Strahlung einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Nach der Induktion von Mutationen wird der parentale Stamm durch einen mutagenen Faktor mit einer Intensität beeinträchtigt, die ausreicht, eine bestimmte Größe an überlebenden Populationen zurück zu lassen. Diese Größe variiert abhängig von der Art der mutagenen Faktoren und hängt von der Menge an Mutationen, die in den überlebenden Populationen bei einer gegebenen Abtötungsrate induziert werden, ab. Die gewünschte Abtötungsrate für NTG zum Beispiel sollte ungefähr 10%–50% der Ausgangspopulation zurücklassen. Salpetrige Säure-Mutagenese sollte ungefähr 0,01% bis 0,1% der Ausgangspopulation zurücklassen und Ultraviolett-Mutagenese sollte ungefähr 1,0% zurücklassen. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird NTG verwendet, um Mutationen im parentalen Stamm zu induzieren, um einen Mutantenstamm mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität herzustellen.
In einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wurde ein L-Glutaminsäure-herstellendes Corynebacterum glutamicum KFCC10661 (koreanische Patentanmeldung Nr. KR 1019880016543 ; koreanisches Patent Nr. KR 101990007948 B1 ) als ein parentaler Stamm verwendet, um den Mutantenstamm mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität herzustellen, die der Fähigkeit zugeschrieben wird, 1 Molekül Glutaminsäure während der L-Valin-Biosynthese zu benötigen. Zufällige Mutagenese wurde daher im Glutaminsäure-herstellenden Corynebacterium glutamicum KFCC10661 als ein parentaler Stamm durchgeführt und der Mikroorganismus wurde auf einem Minimalmedium, angereichert mit dem Isoleucin-Derivat α-Aminobuttersäure (ABA) und den Valin-Derivaten alpha-Hydroxyvalin (AHV), Thiazolalanin (TA) und Norvalin (NV), verteilt. Anschließend wurde ein Mutantenstamm mit einer üblichen Resistenz gegenüber den Derivaten bei jeder Konzentration von 20 mM, 20 mM, 40 mM und 50 mM selektiert und als Corynebacterium glutamicum CA08-0072 bezeichnet. Es wurde weiterhin bestätigt, dass die L-Valin-Herstellung des Mutantenstamms mit einer üblichen Resistenz 4 mal oder höher als die des parentalen Stamms erhöht war (siehe Tabelle 1). Der Corynebacterum glutamicum Mutantenstamm CA08-0072 wurde am 13. Juli 2011 bei der internationalen Hinterlegungsbehörde Korean Culture Center of Mikroorganisms hinterlegt, die in 361-221, Hongje-1-dong, Seodaemon-gu, Seoul, Korea ansässig ist und die Zugangsnummer KCCM11201P zugewiesen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin bereit, einschließlich dem Schritt Kultivieren des Mutantenstamms in einem Kulturmedium.
Bevorzugt kann das Verfahren zur Herstellung von L-Valin weiterhin den Schritt Rückgewinnen von L-Valin aus dem Kulturmedium des Mutantenstamms einschließen.
Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff ”Kultivieren”, einen Mikroorganismus unter künstlich kontrollierten Bedingungen zu ziehen. In der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Kultivieren des Corynebacterium glutamicum CA08-0072 Mutantenstamms (KCCM11201P) für die Herstellung von L-Valin unter Verwendung eines Kultivierungsverfahrens von Corynebacterium glutamicum, das weithin im Fachgebiet bekannt ist, ausgeführt werden. Insbesondere schließen Beispiele für das Kultivierungsverfahren Batch-Kultur, kontinuierliche Kultur und Fed-Batch-Kultur ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Diese unterschiedlichen Verfahren sind zum Beispiel in ”Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, S. 138–176, 1991) oder dergleichen offenbart.
Das Medium, das für die Kultur verwendet wird, muss den Anforderungen für die Kultur eines bestimmten Stamms entsprechen. Die Kulturmedien für den Corynebacterium-Stamm sind beschrieben (z. B. Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D. C., USA, 1981). Mögliche Kohlenstoffquellen können Zucker und Kohlenhydrate wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie zum Beispiel Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussfett, Fettsäuren wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäure einschließen. Diese Substanzen können einzeln oder als Mischungen verwendet werden. Mögliche Stickstoffquellen können Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat einschließen. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischungen verwendet werden. Mögliche Phosphorquellen können Kalium-dihydrogenphosphat oder Dikalium-hydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-enthaltenden Salze einschließen. Das Kulturmedium muss weiterhin Metallsalze wie zum Beispiel Magnesiumsulfat und Eisensulfat einschließen, die für das Wachstum nötig sind. Zusätzlich zu den obigen Substanzen können essentielle Wachstumssubstanzen wie zum Beispiel Aminosäuren und Vitame eingeschlossen sein. Geeignete Vorläufer können auch zu den Kulturmedien gegeben werden. Die oben angegebenen Substanzen können geeigneterweise zum Kulturmedium in Batch-Kultur oder in kontinuierlicher Kultur während der Kultivierung gegeben werden.
Der pH-Wert der Kultur kann geeigneterweise durch die Zugabe von basischen Verbindungen wie zum Beispiel Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniak oder sauren Verbindungen wie zum Beispiel Phosphorsäure und Schwefelsäure eingestellt werden. Die Erzeugung von Luftbläschen kann durch die Verwendung eines Antischaummittels wie zum Beispiel Fettsäure-polyglycolester inhibiert werden. Um aerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten können Sauerstoff oder ein Sauerstoff-enthaltendes Gas (z. B. Luft) in die Kultur injiziert werden. Im Allgemeinen ist die Temperatur des Kulturmediums 20 bis 45°C. Die Kultivierung kann fortgesetzt werden, bis die Herstellung von L-Valin ein gewünschtes Level erreicht. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht. L-Valin kann in das Kulturmedium freigesetzt oder innerhalb der Zellen eingeschlossen werden.
Das Verfahren zur Herstellung von L-Valin der vorliegenden Erfindung schließt den Schritt Rückgewinnen von L-Valin aus den Zellen oder dem Kulturmedium ein. Das Verfahren zur Rückgewinnung von L-Valin aus den Zellen oder dem Kulturmedium kann durch ein konventionelles Verfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, durchgeführt werden, zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Anionenaustauschchromatographie, Kristallisation und HPLC, ist aber nicht darauf beschränkt. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Überstand, der durch Zentrifugation des Kulturmediums bei geringer Geschwindikeit und Entfernen von Biomasse erhalten wird, durch Ionenaustauschchromatographie abgetrennt.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen jedoch lediglich dem Zweck der Veranschaulichung und die Erfindung soll nicht durch diese Beispiele beschränkt sein.
Beispiel 1: Selektion des Mutantenstamms durch künstliche Mutagenese
Um Mutantenstämme mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität zu erhalten wurde eine Mutation eines Mikroorganismus unter Verwendung des folgenden Verfahrens induziert.
Insbesondere wurde ein parentaler Stamm, Glutaminsäure-herstellendes Corynebacterium glutamicum KFCC-10661 ( koreanisches Patent Nr. 101990007948 B1 ), der kürzlich durch Kultivierung auf einem Aktivierungsmedium für 16 Stunden aktiviert worden war, für 14 Stunden auf einem Sähmedium, das bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert wurde, kultiviert. Dann wurden 5 ml des Kulturmediums gesammelt und mit 100 mM Citratpuffer gewaschen. NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) wurde mit einer Endkonzentration von 200 mg/l dazu gegeben. Nach 20 Minuten wurde das Medium mit 100 mM Phosphatpuffer gewaschen. Die Stämme, die mit NTG behandelt waren, wurden auf einem Minimalmedium verteilt und die Todesrate wurde gemessen. Als ein Ergebnis war die Todesrate 85%.
Um Mutantenstämme mit einer üblichen Resistenz gegenüber α-Aminobuttersäure (ABA), alpha-Hydroxyvalin (AHV), Thiazolalanin (TA) und Norvalin (NV) zu erhalten, wurden die NTG-behandelten Stämme auf einem Minimalmedium verteilt, das ABA, AHV, TA und NV mit einer Endkonzentration von 20 mM, 20 mM, 40 mM bzw. 50 mM enthielt. Dann wurden die Stämme bei 30°C für 5 Tage kultiviert, um einen Mutantenstamm mit einer üblichen Resistenz gegenüber ABA, AHV, TA und NV zu erhalten.
Der erhaltene Mutantenstamm wurde als Corynebacterium glutamicum CA08-0072 bezeichnet und wurde am 13. Juli 2011 beim Korean Culture Center of Microorganisms hinterlegt und die Zugangsnummer KCCM11201P zugewiesen.
Die in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Medien haben die folgenden Zusammensetzungen.
<Aktivierungsmedium>
Rinderextrakt 1%, Polypepton 1%, Natriumchlorid 0,5%, Hefeextrakt 1%, Agar 2%, pH 7,2
<Sähmedium>
Glucose 5%, Bacto-Pepton 1%, Natriumchlorid 0,25%, Hefeextrakt 1%, Harnstoff 0,4%, pH 7,2
<Minimalmedium>
Glucose 1,0%, Ammoniumsulfat 0,4%, Magnesiumsulfat 0,04%, Kalium-dihydrogenphosphat 0,1%, Harnstoff 0,1%, Thiamin 0,001%, Biotin 200 μg/l, Agar 2%, pH 7,0
Beispiel 2: Untersuchung der L-Valin-Produktivität des L-Valin-herstellenden Mutantenstamms
Das Corynebacterium glutamicum CA08-0072 (KCCM11201P) mit einer üblichen Resistenz gegenüber hohen Konzentrationen von ABA, AHV, TA und NV, das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde durch das folgende Verfahren kultiviert, um seine L-Valin-Produktivität zu untersuchen.
Der parentale Stamm Corynebacterium glutamicum KFCC10661 und der Mutantenstamm wurden in 250 ml-Eck-Schikanekolben, die 25 ml des Sähmediums enthalten, geimpft und bei 30°C für 20 Stunden mit Schütteln bei 200 rpm kultiviert, um Sähkulturmedien zu erhalten. Danach wurde 1 ml jedes der Sähkulturmedien in einen 250 ml-Eck-Schikanekolben, der 24 ml des folgenden Herstellungsmediums enthielt, geimpft und bei 30°C für 72 Stunden mit Schütteln bei 200 rpm kultiviert, um L-Valin herzustellen.
Das im vorliegenden Beispiel 2 verwendete Herstellungsmedium hat die folgende Zusammensetzung.
<Herstellungsmedium>
Glucose 5%, Ammoniumsulfat 2%, Kalium-dihydrogenphosphat 0,1%, Magnesiumsulfat Heptahydrat 0,05%, CSL (Maisquellwasser) 2,0%, Biotin 200 μg/l, pH 7,2
Nachdem die Kultivierung vollständig war wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt, um die Mengen des hergestellten L-Valins zu bestimmen. Die Konzentrationen von L-Valin in den Kulturmedien der experimentellen Stämme sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst. [Tabelle 1] Vergleich der L-Valin-Produktivität von Corynebacterium glutamicum CA08-0072 (KCCM11201P)

Corynebacterium glutamicum KFCC10661 (parentaler Stamm) Corynebacterium glutamicum CA08-0072 (Mutantenstamm)

L-Valin Konzentration (g/l) 0,5 2,1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, stellte der parentale Stamm, Corynebacterium glutamicum KFCC10661 0,5 g/l L-Valin her, aber der Mutantenstamm Corynebacterium glutamicum CA08-0072 gemäß der vorliegenden Erfindung stellte 2,1 g/l L-Valin her, was anzeigt, dass die L-Valin-Produktivität etwa 4 mal oder höher als die des parentalen Stamms ist.
Das obige Ergebnis deutet an, dass der Mutantenstamm mit einer Resistenz gegenüber L-Valin, L-Isoleucin und Derivaten davon nicht durch die Feedback-Inhibition beeinträchtigt ist, wodurch L-Valin in hoher Effizienz und hoher Ausbeute hergestellt wird.
Effekt der Erfindung
Der coryneforme Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung weist eine Resistenz gegenüber L-Valin, L-Isoleucin und Derivaten davon auf und wird folglich nicht durch die Feedback-Inhibition von L-Valin beeinträchtigt, um eine erhöhte L-Valin-Produktivität aufzuweisen. Das Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung wird daher verwendet, um L-Valin in hoher Effizienz und hoher Ausbeute herzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus mit einer erhöhten L-Valin-Produktivität und ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung desselben. Stärker bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung einen Corynebacterium glutamicum Mutantenstamm, der eine Resistenz gegenüber L-Valin und Derivaten davon aufweist, um eine erhöhte L-Valin-Produktivität aufzuweisen, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin unter Verwendung desselben.

Claims

L-Valin-herstellender Corynebacterium glutamicum Mutantenstamm KCCM11201P.
Mutantenstamm KCCM11201P nach Anspruch 1, wobei der Mutantenstamm eine Resistenz gegenüber L-Valin, L-Isoleucin und Derivaten davon aufweist.
Mutantenstamm KCCM11201P nach Anspruch 2, wobei das L-Isoleucin-Derivat α-Aminobuttersäure (ABA) ist und das L-Valin-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus α-Hydroxyvalin (AHV), Thiazolalanin (TA) und Norvalin (NV).
Verfahren zur Herstellung von L-Valin, umfassend Kultivieren von KCCM11201P nach Anspruch 1 in einem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend Rückgewinnen von L-Valin aus dem Kulturmedium von KCCM11201P.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 45°C unter aeroben Bedingungen für 10 bis 160 Stunden durchgeführt wird.