BR112014003469B1 - Microrganismo com uma maior produtividade de l-valina e método para a produção de lvalina utilizando o mesmo - Google Patents

Microrganismo com uma maior produtividade de l-valina e método para a produção de lvalina utilizando o mesmo Download PDF

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Abstract

MICRORGANISMO COM UMA MAIOR PRODUTIVIDADE DE L-VALINA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LVALINA UTILIZANDO O MESMO. A presente invenção refere-se a um microrganismo com uma maior produtividade de L-valina e método para a produção de L-valina utilizando o mesmo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum que possui uma resistência à L-valina e respectivos derivados, de forma a apresentar uma maior produtividade de L-valina e a um método para a produção de L-valina utilizando o mesmo.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a um microrganismo com maior produtividade de L-valina e método para a produção de L-valina utilizando o mesmo.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Os L-aminoácidos são utilizados na medicina humana, em particular na indústria farmacêutica, indústria alimentar e nutrição animal ou semelhante. Particularmente, os aminoácidos de cadeia ramificada são três aminoácidos entre os nove essenciais: L-valina, L-leucina e L-isoleucina. Ao contrário de outros aminoácidos, que são metabolizados principalmente no fígado, os aminoácidos de cadeia ramificada são metabolizados principalmente no tecido muscular e servem de fonte de energia durante o exercício. Sabendo-se que os aminoácidos de cadeia ramificada desempenham um importante papel na manutenção muscular e crescimento durante o exercício, a utilização destes está em crescimento. Especificamente, a L-valina tem sido utilizada como componente nutricional, dados os registos do elevado poder redutor e melhor desempenho da lactação em porcas da L-valina. A L-valina tem também sido utilizada em soluções de perfusão e complexos de aminoácidos para fins médicos e em suplementos alimentares e aditivos para bebidas.
[003] Um microrganismo utilizado para a produção de L-aminoácidos é a bactéria corineforme, particularmente a Corynebacterium glutamicum. Devido à elevada importância das bactérias corineformes na produção industrial, estão em constante desenvolvimento métodos de produção dos L-aminoácidos através de microrganismos. Por exemplo, estão a ser introduzidos aperfeiçoamentos para melhorar o método relacionado com a agitação e introdução de oxigénio ou composições do meio de cultura, tal como a concentração de açúcar durante a fermentação. Para melhorar a produtividade de L-aminoácidos destes microrganismos são amplamente utilizados métodos de seleção e seleção de mutantes. Por exemplo, existe um método de seleção e utilização de microrganismos que são resistentes aos antimetabolitos, tais como um derivado de isoleucina, hidroximato de isoleucina (Kisumi M et al., (1972) Journal of Bacteriology 110: 761 -763), um derivado L-valina, 2-tiazol alanina (Tsuchida T et al., (1975) Agricultural and Biological Chemistry, Japão 39: 1319-1322) ou um derivado de leucina, a-aminobutirato (Ambe-Ono Y et al., (1996) Bioscience Biotechnology Biochemistry 60:1386-1387) ou auxotrófico para metabolitos com relevância reguladora e produção de L-aminoácidos (Eva Radmacher et al., (2002) Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68 p.2246-2250).
[004] Entretanto, um dos aminoácidos de cadeia ramificada, L-valina, é biossintetizado num microrganismo a partir de ácido pirúvico, através de ácido acetoláctico, ácido di-hidroxivalérico e ácido cetoisovalérico. Estes metabolitos intermediários são produzidos através de atividades catalíticas de acetohidroxi ácido sintase, acetohidroxi ácido isomerorredutase, dihidroxi ácido desidratase e transaminase B. No entanto, estas enzimas encontram-se também envolvidas na biossíntese da L-isoleucina partindo de ácido cetobutírico e ácido pirúvico e a L-leucina é também biossintetizada a partir do metabolito intermediário, ácido cetoisovalérico através de ácido 2-isopropilmálico, ácido 3-isopropilmálico e ácido cetoisocapróico. Por conseguinte, dado que as enzimas utilizadas nas vias de biossíntese dos aminoácidos ramificados, nomeadamente L-valina, L- isoleucina e L-leucina são idênticos é difícil produzir apenas um dos aminoácidos de cadeia ramificada através de fermentação industrial. Adicionalmente, ocorre uma inibição retroativa no produto final L-valina ou respectivos derivados, o que dificulta a produção à escala industrial da L-valina.
[005] Para resolver estes problemas têm sido executados vários estudos para desenvolver microrganismos produtores de L-valina com resistência à L- valina ou derivados desta para a produção de L-valina, e são exemplificados através de um método de utilização de um microrganismo com resistência a D, ácido L-aminobutírico (patente japonesa em aberto n.Q S63-160592), um método de utilização de um microrganismo que seja resistente a tiazol alanona e auxotrófico à leucina, isoleucina ou treonina (patente japonesa em aberto n.Q S52-116), método de utilização de um microrganismo com resistência a amnioetilcisteína (patente japonesa em aberto n.Q S58-2678), método de utilização de um microrganismo com resistência a L-valina em meio suplementado com ácido acético e com sensibilidade ao ácido pirúvico em meio suplementado com glicose (patente norte-americana n.Q 5,521,074, patente coreana n.Q 1995-0005133), método de utilização de um microrganismo com resistência a policetídeo (patente coreana n.o 1996-0016871) ou semelhantes.
[006] No entanto, os microrganismos produtores de L-valina desenvolvidos atualmente são resistentes apenas a um único material ou um material limitado de L-valina ou derivados desta, subsistindo assim a falta do desenvolvimento de microrganismos produtores de L-valina com resistência a vários materiais envolvidos no controlo retroativo da biossíntese de L-valina.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[007] Os autores da presente invenção esforçaram-se por desenvolver microrganismos capazes de produzir L-valina com um rendimento mais elevado do que as estirpes convencionais. Em resultado, constataram que uma estirpe mutante, obtida de um microrganismo produtor de ácido glutâmico, produz L- valina com um elevado rendimento e é resistente a numerosos derivados de L- isoleucina e de L-valina, especificamente, ácido a-aminobutírico (ABA), a- hidroxivalina (AHV), tiazol alanina (TA) e norvalina (NV), completando assim a presente invenção.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[008] Um objeto da presente invenção consiste em apresentar uma estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum produtora de L-valina, KCCM11201P.
[009] Outro objeto da presente invenção consiste em apresentar um método de preparação de L-valina através da estirpe mutante.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[010] O microrganismo corineforme da presente invenção tem uma resistência à L-valina, L-isoleucina e derivados destes, não sendo assim afetado pela inibição retroativa da L-valina, de forma a apresentar uma produtividade de L-valina intensificada. Por conseguinte, o método de produção da L-valina com o microrganismo da presente invenção é empregue para produzir L-valina com alta eficiência e elevado rendimento.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[011] A FIG. 1 mostra uma via de biossíntese de L-valina como produto final da presente invenção.
MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO
[012] Numa realização, a presente invenção apresenta uma estirpe mutante de Corynebacterium glutamicumprodutora de L-valina, KCCM11201P.
[013] Tal como presentemente utilizado, o termo “L-valina? significa um L- aminoácido com uma fórmula química (CH3)2CHCH(NH2)COOH, que é um dos aminoácidos essenciais e pertence estruturalmente aos aminoácidos de cadeia ramificada, conjuntamente com a L-leucina e L-isoleucina.
[014] Entretanto, a biossíntese da L-valina num microrganismo encontra-se apresentada na FIG. 1, na qual a L-valina é biossintetizada a partir de ácido pirúvico através de ácido acetoláctico, ácido di-hidroxivalérico e ácido cetoisovalérico. Além disso, a via de biossíntese é catalizada por enzimas, tais como acetohidroxi ácido sintase, acetohidroxi ácido isomeroredutase, dihidroxi ácido dehidratase e transaminase B. No entnato, estas enzimas são utilizadas de forma idêntica nas vias de biossíntese dos aminoácidos ramificados, nomeadamente L-valina, L-isoleucina e L-leucina, sendo assim difícil produzir apenas um dos aminoácidos de cadeia ramificada através de fermentação industrial. Em particular, ocorre a inibição retroativa no produto final L-valina ou respectivos derivados, o que dificulta a produção à escala industrial da L-valina. Ao resolver este problema, a estirpe mutante da presente invenção é um novo microrganismo que apresenta resistência à L-valina ou derivados desta de forma a remover a inibição retroativa, apresentando assim uma maior produtividade da L-valina.
[015] De preferência, a estirpe mutante da presente invenção pode apresentar resistência à valina ou derivados desta, isoleucina ou derivados desta.
[016] Tal como presentemente utilizado, o termo «derivado» significa os compostos conhecidos que induzem a inibição retroativa no que respeita à biossíntese do produto final L-valina de forma a reduzir a produção de L-valina no microrganismo, e pode-se apontar como derivados de L-isoleucina o ácido a- aminobutírico e derivados da L-valina, alfa-hidroxivalina, tiazol alanina e norvalina ou semelhantes, sem que estes constituam limitação. De preferência, a estirpe mutante pode apresentar resistência a uma ou mais substâncias selecionadas do grupo constituído por valina, ácido a-aminobutírico, alfa- hidroxivalina, tiazol alanina e norvalina. Mais preferencialmente, pode apresentar uma resistência a todos de entre valina, ácido a-aminobutírico, alfa-hidroxivalina, tiazol alanina e norvalina.
[017] E m geral, sabe-se que a biossíntese da L-valina é inibida quando a L- valina é acumulada a um certo nível na célula. Por conseguinte, a estirpe com resistência aos derivados liberta a inibição da L-valina e pode assim produzir mesmo a uma elevada concentração. De acordo com uma realização da presente invenção, os autores da presente invenção empregaram um método de seleção de microrganismos capazes de produzir um elevado nível de L-valina com o derivado. Além disso, dado que a L-isoleucina é um aminoácido que é produzido pela via da biossíntese idêntico à via da biossíntese da L-valina, as estirpes capazes de produzir um elevado nível de L-valina podem também ser selecionadas analisando se as estirpes adquirem resistência aos derivados de isoleucina. Deste modo, os derivados de isoleucina são também utilizados para selecionar as estirpes capazes de produzir um elevado nível de L-valina.
[018] De acordo com a presente invenção, uma estirpe mutante com uma produtividade elevada de L-valina é selecionada de entre estirpes progenitoras através de mutação. Neste aspecto, as mutações no microrganismo podem ser induzidas através de uma variedade de técnicas bem conhecidas e pode ser empregue qualquer um dos fatores mutagênicos físico ou químico. Exemplos do fator mutagênico químico adequado para a presente invenção incluem N-metil- N”-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), diepoxibutano, metanossulfonato de etilo, compostos de mostarda, hidrazina e ácido nitroso, mas não estão limitados a estes. Além disso, exemplos de fatores mutagênicos físicos podem incluir radiação ulltravioleta e gama, mas não estão limitados a estes.
[019] Com a indução das mutações, a estirpe progenitora é afetada por um fator mutagênico a uma intensidade suficiente para deixar um tamanho particular de populações sobreviventes. O tamanho varia dependendo do tipo de fatores mutagênicos e depende da quantidade de mutações induzidas nas populações sobreviventes a uma dada taxa de morte. Por exemplo, a taxa de morte desejada para NTG deve deixar aproximadamente 10% a 50% da população inicial. A mutagênese com ácido nitroso deve deixar aproximadamente 0,01% a 0,1% da população de partida e a mutagênese com ultravioletas deve deixar aproximadamente 1,0%. De acordo com uma realização da presente invenção, é utilizada NTG para induzir mutações na estirpe progenitora, a fim de preparar uma estirpe mutante com uma produtividade elevada de L-valina.
[020] Num exemplo da presente invenção, foi utilizada uma Corynebacterium glutamicum KFCC 10661 produtora de ácido L-glutâmico (pedido de patente coreana n.Q 1988-0016543; publicação n.Q 1990-0007948) como estirpe progenitora a fim de preparar a estirpe mutante com uma produtividade maior de L-valina, a qual é atribuída à propriedade de requerer 1 molécula de ácido glutâmico durante a biossíntese de L-valina. Por conseguinte, foi executada uma mutagênese aleatória na Corynebacterium glutamicum KFCC 10661 produtora de ácido glutâmico como estirpe progenitora e o microrganismo foi disseminado num meio mínimo suplementado com o derivado de isoleucina, ácido a-aminobutírico (ABA) e os derivados de valina, alfa-hidroxivalina (AHV), tiazol alanina (TA) e norvalina (NV). Posteriormente, selecionou-se uma estirpe mutante com uma resistência comum aos derivados a cada concentração de 20 mM, 20 mM, 40 mM e 50 mM, e foi designada Corynebacterium glutamicum CA08-0072. Além disso, foi confirmado que a produção de L-valina da estirpe mutante com uma resistência comum foi aumentada 4 vezes ou mais relativamente à da estirpe progenitorea (ver quadro 1). A estirpe mutante de Corynebacterium glutamicum CA08-0072 foi depositada junto da autoridade depositária internacional, Centro de Cultura de Microrganismos Coreano, localizado em 361-221, Hongje-1-dong, Seodaemon-gu, Seul, Coreia, a 13 de Julho de 2011, à qual foi atribuído o número de acesso KCCM11201P.
[021] E m outra forma de realização, a presente invenção apresenta um método de produção de L-valina, incluindo a fase de cultura da estirpe mutante num meio de cultura.
[022] De preferência, o método de produção de L-valina pode ainda incluir a fase de recuperação da L-valina a partir do meio de cultura da estirpe mutante.
[023] Tal como presentemente utilizado, o termo “cultura” significa o desenvolvimento de um microrganismo em condições controladas artificialmente. Na presente invenção, o método de cultura da estirpe mutante Corynebacterium glutamicum CA08-0072 (KCCM11201P) para a produção de L- valina pode ser conduzido utilizando um método de cultura de Corynebacterium glutamicum bem conhecido na técnica. Especificamente, exemplos de métodos de cultura incluem a cultura descontínua, cultura contínua e cultura semi- descontínua, sem se restringir a estes. Estes vários métodos são apresentados em, por exemplo, "Biochemical Engineering"(James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991) ou semelhantes.
[024] O meio utilizado para a cultura tem de cumprir os requisitos para a cultura de uma estirpe específica. O meio de cultura da estirpe de Corynebacterium descrita (por ex. Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). Possíveis fontes de carbono podem incluir açúcares e hidratos de carbono, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco ácidos gordos tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois tais como glicerol e etanol e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Estas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou misturadas. Fontes possíveis de azoto podem incluir peptona, extrato de levedural extrato de carne, extracto de malte, milhocina, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. As fontes de azoto podem ser utilizadas individualmente ou misturadas. Fontes possíveis de fósforo podem incluir di- hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais de sódio correspondentes. Além disso, o meio de cultura tem de incluir sais metálicos, tais como sulfato de magnésio e sulfato férrico que são necessários ao desenvolvimento. Além das substâncias referidas, podem ser incluídas substâncias de desenvolvimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas. Podem também ser adicionados precursores apropriados ao meio de cultura. As substâncias referidas podem ser adequadamente adicionadas ao meio de cultura por cultura descontínua ou contínua durante a mesma.
[025] O pH da cultura pode ser adequadamente ajustada mediante a adição de compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e amónio ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A formação de bolhas de ar pode ser inibida recorrendo a um agente antiespumante tal como éster poliglicólico de ácido gordo. Para manter as condições aeróbicas, pode ser injetado na cultura oxigénio ou gás contendo oxigénio (por ex. ar). Em geral, a temperatura do meio de cultura varia entre 20 e 45 QC. A cultura pode ser continuada até a produção de L-valina atingir o nível desejado. Este objetivo é normalmente alcançado no espaço de 10 a 160 horas. A L-valina pode ser libertada no meio de cultura ou incluída nas células-
[026] O método de produção de L-valina da presente invenção inclui a fase de recuperação da L-valina a partir das células ou meio de cultura. O método de recuperação de L-valina a partir das células ou meio de cultura pode ser executado através de um método convencional, conhecido da técnica, por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de permuta aniônica, cristalização e HPLC, sem se limitar a estes processos. De acordo com uma realização da presente invenção, um sobrenadante, obtido através de centrifugação do meio de cultura a uma baixa velocidade e remoção da biomassa, é separado por cromatografia de permuta iónica.
MODO PARA A INVENÇÃO
[027] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhe com referência aos exemplos seguintes. No entanto, estes exemplos são meramente ilustrativos e não se pretende limitar a invenção através destes exemplos. Exemplo 1: Seleção da estirpe mutante através de mutagênese artificial
[028] Para obter estirpes mutantes com uma produtividade de L-valina intensificada, foi induzida a mutação de um microrganismo segundo o seguinte método.
[029] Especificamente, foi cultivada uma estirpe progenitora, Corynebacterium glutamicum KFCC 10661 produtora de ácido glutâmico (publicação da patente coreana n.Q 1990-0007948) previamente ativada por meio de cultura num meio de ativação durante 16 horas, durante 14 horas em meio de sementeira previamente esterilizado a 121 -C durante 15 minutos. Depois foram recolhidos 5 mL de meio de cultura e lavados com 100 mM de tampão de citrato. Adicionou-se NTG (N-metil-N”-nitro-N-nitrosoguanidina) a uma concentração final de 200 mg/L. Ao fim de 20 minutos o meio foi lavado com 100 mM de tampão de fosfato. As estirpes tratadas com NTG foram espalhadas em meio mínimo e foi medida a taxa de morte. Em resultado, a taxa de morte foi de 85%.
[030] A fim de obter estirpes mutantes com uma resistência comum ao ácido a-aminobutírico (ABA, alfa-hidroxivalina (AHV), tiazol alanina (TA) e norvalina (NV), as estirpes tratadas com NTG foram espalhadas em meio mínimo contendo ABA, AHV, TA e NV a uma concentração final de 20 mM, 20 mM, 40 mM e 50 mM, respectivamente. Então, as estirpes foram cultivadas a 30 9C durante 5 dias para obter uma estirpe mutante com uma resistência comum a ABA, AHV, TA e NV.
[031] A estirpe mutante obtida foi designada de Corynebacterium glutamicum CA08-0072 e foi depositada junto do Centro de Cultura de Microrganismos Coreano a 13 de Julho de 2011, à qual foi atribuído o número de acesso KCCM11201P.
[032] Os meios utilizados nos exemplos 1 e 2 possuem as seguintes composições.
[033] <Meio de ativação>
[034] Extracto de carne de vaca 1 %, polipeptona 1 %, cloreto de sódio 0,5%, extracto de levedura 1%, agar 2%, pH 7,2
[035] <Meio de sementeira>
[036] Glicose 5%, Bacto peptona 1%, cloreto de sódio 0,25%, extracto de levedura 1%, ureia 0,4%, pH 7,2
[037] <Meio mínimo>
[038] Glicose 1,0%, sulfato de amónio 0,4%, sulfato de magnésio 0,04%, di- hidrogenofosfato de potássio 0,1%, ureia 0,1%, tiamina 0,001%, biotina 200 yg ZL, agar 2%, pH 7,0 Exemplo 2: Análise da produtividade da L-valina da estirpe mutante produtora de L-valina
[039] A Corynebacterium glutamicum CA08-0072 (KCCM11201P) com uma resistência comum a elevadas concentrações de ABA, AHV, TA e NV, obtida no exemplo 1, foi cultivada segundo o método seguinte a fim de analisar a produtividade de L-valina desta.
[040] A estirpe progenitora Corynebacterium glutamicum KFCC 10661 e a estirpe mutante foram ambas inoculadas em balões de Erlenmeyer de 250 ml contendo 25 ml de meio de sementeira e foram cultivadas a 30 -C durante 20 horas com agitação a 200 rpm para se obter o meio de cultura de sementeira. Seguidamente, foi inoculado 1 ml de cada meio de cultura em balões de Erlenmeyer de 250 ml contendo 24 ml do seguinte meio de produção e foram cultivadas a 30 QC durante 72 horas com agitação a 200 rpm para produzir L- valina.
[041] O meio de produção utilizado no presente exemplo 2 possui a seguinte composição.
[042] <Meio de produção>
[043] Glicose 5%, sulfato de amónio 2%, di-hidrogenofosfato de potássio 0,1%, sulfato de magnésio hepta-hidratado 0,05%, milhocina 2,0%, biotina 200 jug/L, pH 7,2
[044] Uma vez concluída a cultura, foi executada cromatografia líquida de alta velocidade para determinar as quantidades de L-valina produzida. As concentrações de L-valina no meio de cultura das estirpes experimentais encontram-se resumidas no quadro 1 seguinte. Quadro 1
[045] Comparação da produtividade de L-valina de Corynebacterium glutamicumCA08-0072 (KCCM11201P)
Figure img0001
[046] Como se mostra no quadro 1, a estirpe progenitora, Corynebacterium glutamicum KFCC 10661 produziu 0,5 g/L de L-valina, mas a estirpe mutante, Corynebacterium glutamicum CA08-0072 de acordo com a presente invenção produziu 2,1 g/L de L-valina, indicando que a sua produtividade de L-valina é cerca de 4 vezes superior à da estirpe progenitora.
[047] O resultado anterior sugere que a estirpe mutante com resistência à L-valina, L-isoleucina e respectivos derivados não é afetada pela inibição retroativa, produzindo assim L-valina com elevada eficiência e elevado rendimento.

Claims (6)

1. Estirpe mutante de Corynebacterium glutamicumcaracterizada por ser produtora de L-valina, KCCM11201P.
2. Estirpe mutante KCCM11201P de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a estirpe mutante apresentar uma resistência à L-valina, L- isoleucina e respectivos derivados.
3. Estirpe mutante KCCM11201P de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o derivado de L-isoleucina ser ácido a-aminobutírico (ABA), e o derivado de L-valina ser a-hidroxivalina (AHV), tiazol alanina (TA) e norvalina (NV).
4. Método de produção de L-valina, caracterizado por compreender a cultura de KCCM11201P tal como definido na reivindicação 1 por um meio de cultura.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por incluir ainda a recuperação da L-valina do meio de cultura de KCCM11201P.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a cultura ser executada em condições aeróbicas, a uma temperatura entre 20 a 45 QC durante 10 a 160 horas.
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