JPH0494692A - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるＬ−スレオニン（以下スレオニン
と略記）の製造法に関する。スレオニンは飼料用、医薬
品用に利用される重要なアミノ酸である。

〔従来の技術〕

従来、発酵法によるスレオニンの製造法としては、ブレ
ビバクテリウム属細菌に属しスレオニンアナログである
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（以下ＡＨＶと略記
）に耐性を有する変異株を使用する方法（Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、３４（３）　４４８４５６
（１９７０）　、特公昭４５−２６７０８号公報）が知
られている。

ＡＨＶ耐性変異株にはスレオニンによるフィードバック
阻害の解除されたホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下Ｈ
Ｄと略記）を持つ株（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

６８、８５９−８６６（１９７０））とＬ−リジン（以
下リジンと略記）生合成経路の第一酵素であるジヒドロ
ジピコリン酸シンターゼ（以下ＤＰＳと略記）の欠失変
異株等（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　５
４．１５０５（１９９０）。

特公昭０ｆ−１８７０９３号公報）がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

ブレビバクテリウム属に属するスレオニン生産変異株に
よりスレオニンの生産収率を更に高めることを目的とし
ている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上述の課題を解決するために種々検討の
結果、ブレビバクテリウム属の従来知られているスレオ
ニン生産菌に更にα−ケト酪酸に対する耐性を付与せし
めたところ、従来のスレオニン生産菌より更に大量にス
レオニンを生産することを見い出した。本発明は、この
知見に基づいて完成されたものである。

本発明のスレオニン製造法において用いられる微生物は
、ブレビバクテリウム属に属し、α−ケト酪酸に耐性を
有し、かつスレオニン生産能を有する微生物である。ス
レオニン生産能は例えば、ＤＰＳ欠失もしくは低下また
は、ＨＤのフィードバック阻害解除によって付与するこ
とができる。

これらの性質の他にＬ−メチオニン要求性、Ｌ−イソロ
イシン要求性、エチオニン耐性、リジンアｌレ ナログ耐性、ビ〃ビン酸キナーゼ欠失又は低下などを付
与するとスレオニン生産能を更に向上させることができ
る。

本発明の親株はいわゆるＬ−グルタミン酸生産菌として
知られているブレビバクテリウム属の微生物である。例
えば、 ・フラバム　　　　八ＴＣＣ１４０６７等がある。本発
明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株として変異
操作を施し、α−ケト酪酸耐性やスレオニン生産能を付
与することによって得られる。なお、変異操作は紫外線
照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（以下ＮＧと略記）、亜硝酸等の変異誘起剤による
処理等の通常の変異処理法で行うことができる。

以下に、例として本発明の使用菌株ブレビバクテリウム
・フラバムＡＪ１２５３５（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５９６
）、ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２５３６（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１１５９７）とブレビバクテリウム・フラ
バム＾Ｊ１２５３７（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１５９８）の具
体的な変異誘導・分離方法の実験例を示す。

ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２５３４　（ＦＥ
ＲＭＰ−１１５９５）を親株として使用する。この菌株
はブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７よ
り誘導された変異株でフィードバック阻害の解除された
ＨＤを持ち、ＤＰＳ低下、ピルビン酸キナーゼ欠失、ク
エン酸合成酵素活性低下、及びフィードバック阻害の部
分解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼを付与されている（Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　５４．１５０５−１５１１
（１９９０））　。ＡＪ１２５３４株を１０００ｇ／ｄ
のＮＧで３０°Ｃ１１０分間処理した（生残率１３．９
％）のち、第１表の合成培地に親株がほとんど生育でき
ない濃度である４■／戚のα−ケト酪酸を添加して作成
した平板培地に塗布する。３０°Ｃ１７日間の培養後、
培地上にコロニーとして生育する菌株、即ちα−ケト酪
酸耐性株を採取し、これよりスレオニン生産能のすくれ
た変異株ＡＪ１２５３５．　ＡＪ１２５３６．　ＡＪ１
２５３７株が選択される。

次に、これらＡＪ１２５３５．　ＡＪ１２５３６．　Ａ
Ｊ１２５３７株のα−ケト酪酸に対する耐性の度合は第
２表に示される通りである。すなわち、耐性のチエツク
は第１表の合成培地より寒天を除いた組成の培地（５ｄ
ずつ試験管に分注）で３０゛Ｃ１１６時間培養したＡＪ
１２５３４．　ＡＪ１２５３５．　ＡＪ１２５３６．へ
Ｊ１２５３７株を第１表の合成培地にα−ケト酪酸を各
０■／ｄ！、　　５■／ｄの濃度になるように溶解して
作成した平板培地（直径８．５　ｃｍ　）にそれぞれ第
２表に示した菌量で接種した後、３０°Ｃ，４日間培養
し、それぞれの菌株の生育の状態を調べることにより行
なうことができる。これにより、ＡＪ１２５３５．　Ａ
Ｊ１２５３６゜ＡＪ１２５３７株は上記培養条件におい
て、α−ケト酪酸を５■／ｄ含む上記培地に約１０７個
接種した場合、３０°Ｃ，４日間の培養後、中程度以上
の生育を示した。尚、本発明で言うα−ケト酪酸の耐性
を有する菌とは上述の条件下で中程度以上の生育を示す
性質の菌をさす。

第１表 合成培 地 組 成 グルコース 硫酸アンモニウム リン酸１カリウム 硫酸マグ名シウム・７水塩 硫酸第１鉄・７水塩 硫酸マンガン・４水塩 α−ビオチン ビタミンＢ１・ＨＣｆ ２０　　　ｇ／ｊ！ １０　　　ｇ７１ １　　　ｇ／１ ０．４　　ｇ／１ １０　　　ｍｇ／Ｉ！。

８　　　ｍｇ／ｌ。

３００　　μｇ／４２ １００　　μｇ／ｌ ジアミノピメリン酸 ｇ／ｌ （苛性ソーダでｐＨ７，０に中和） スレオニン生産用の培養培地は特に制限するところはな
く、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量栄
養素を含有する通常の培地である。

炭素源としては、炭水化物（グルコース、フラクトース
或いはデンプン、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）
、有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコール（グリセリ
ン、エタノール等）、或いは炭化水素（ノルマルパラフ
ィン等）が使用できる。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アン
モニアガス等を、無機塩としてはリン酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、鉄塩。

マンガン塩、その他微量金属塩等を必要に応じて使用す
る。有機微量栄養素としては、栄養要求性のある場合に
は該当するアミノ酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物
質等を適量添加し、必要に応じて更に生育促進物質とし
てアミノ酸、ビタミン。

味液（登録商標、大豆加水分解物）、酵母エキス。

ペプトン、カザミノ酸等が使用できる。特にＤＰＳ欠失
あるいは低下株の場合は、ジアミノピメリン酸（以下Ｄ
ＡＰと略記）やＤＡＰとリジンの添加によって生育が促
進され、良好な結果が得られることが多い。

培養条件は通常の方法でｐＨ５〜９、温度は２０〜４０
°Ｃで好気的条件下に２４〜７２時間培養すれば良い。

培養中にｐ）ｌが下がる場合には炭酸カルシウムを別殺
菌して加えるか又はアンモニア水。

アンモニアガス等のアルカリで中和する。又、有機酸を
炭素源とする場合はｐＨの上昇を鉱酸又は有機酸で中和
する。

スレオニンの単離精製は常法によって行うことができる
。得られたものは薄層クロマトグラムのＲｔ値及び微生
物定量法による生物活性値により、スレオニン標品のそ
れらと一致することを確めスレオニンと同定した。スレ
オニンの定量はロイコノストックメセンテロイデス（八
ＴＣＣ８０４２）を用いる微生物定量法に従って行った
。

以下実施例にて具体的に説明する。

〔実施例〕

実施例１ 第３表に示した組成のスレオニン生産用培地３戚を試験
管（内径１５ｘ１６５ｍｍ）に分注し、加熱滅菌した。

これにあらかじめＤＡＰ２ｇ／ｆｆを添加した第４表の
完全寒天平板培地で３０°Ｃ１２４時間培養したＡＪ１
２５３５．　ＡＪ１２５３６．　ＡＪ１２５３７株およ
びそれらの親株ＡＪ１２５３４の菌体を１白金耳接種し
、３０°Ｃで７２時間振盪培養した。それぞれの培養液
中のスレオニン生産量は、第５表の如くであり、最高は
親株の３６．５％増であった。

第３表 成　　　分 グルコース 硫酸アンモニウム リン酸１カリウム 硫酸マグネシウム・ 硫酸第１鉄・７水塩 硫酸マンガン・４水塩 α−ビオチン ビタミンＢ、・ＨＣｆ 味　　　液” ジアミノピメリン酸 （苛性カリでｐＦＩ７．２に中和） ＊登録商標、大豆加水分解物 ７水塩 スレオニン生産用培地 濃度 １００　ｇ／ｆ ３０　ｇ／Ｉ！。

１．５　ｇ＃！ ０．４ｇ／１ １０　ｍｇ／／！ ８．１ｍｇ／ｆ ２００μｇ／１ ３００μｇ／１ ５　ｄ＃２ ７　ｇ＃！ 第４表 成　　　分 ポリペプトン 酵母エキス ａＣ１ グルコース グルタミン酸す 完全寒天平板培地 濃度 １０ｇ／ｆ １０ｇ／１ ５ｇ／／２ ５ｇ／！ トリウム　　　　　１０ｇ＃２ 第５表　　し−スレオニ 菌　株　　α−ケト酪酸耐性 ＡＪ１２５３４　（親株）　　　なし ＡＪ１２５３５　　　　　　　あり ＡＪ１２５３６　　　　　　　あり ＡＪ１２５３７　　　　　　　あり ン生成量 Ｌ−スレオニン生成量（ｇ／　１　） １３．７ １７．０ １８．７ １７．５ ［発明の効果］ 本発明のα−ケト酪酸に耐性を有するスレオニン生産菌
を使用すれば、従来にないスレオニン生成量が得られる
ことから、工業レベルでの実用化が期待されるものであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム属に属し、α−ケト酪酸に耐性を有
   しかつＬ−スレオニンを生産する能力を有する微生物を
   培養し、生成蓄積したＬ−スレオニンを採取することを
   特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法