JPH0346108B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は発酵法によるＬ−ホモセリンの製造法
に関する。 Ｌ−ホモセリンは生化学的には必須アミノ酸で
あるＬ−スレオニン、Ｌ−メチオニンあるいはＬ
−イソロイシンの重要な生合成前駆物質であり、
医学、栄養学、生化学などの研究試薬として要望
されている。のみならず、近時は発酵法によりＬ
−ホモセリンからＬ−スレオニンを生産する方法
も見出されており、工業薬品としての重要性を有
するに至つている。 ＜従来の技術＞ 従来、発酵法によるＬ−ホモセリンの製造法と
しては、コリネバクテリウム属に属しＬ−スレオ
ニン要求性を付与した変異株を用いる方法が知ら
れている（特開昭46−25710号公報）。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、従来法においてはＬ−ホモセリ
ンの生産能力は低く、工業的に実用化するには不
十分であつた。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ そこで本発明者らは、Ｌ−ホモセリン生産能を
有する微生物を広く検索、研究した結果、プロビ
デンシア属に属する微生物によつて通常の炭素源
を含有する栄養培地にＬ−ホモセリンを著量蓄積
せしめることができることを見出し本発明に到達
した。 すなわち、本発明はプロビデンシア属に属し、
Ｌ−ホモセリン生産能を有する微生物を培養し
て、培地中にＬ−ホモセリンを生成蓄積せしめ、
該培地中からＬ−ホモセリンを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−ホモセリンの製造法で
ある。 プロビデンシア属に属する微生物が著量のＬ−
ホモセリンを生産した事実はまだ知られていな
い。 以下、本発明を具体的に説明する。 本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属
に属し（バージーのマニユアル・オブ・システマ
テイク・バクテリオロジー第１巻（1984、第495
〜496頁に従う）、Ｌ−ホモセリン生産能を有する
微生物であれば特に限定されない。好ましくはプ
ロビデンシア属に属し、Ｌ−ホモセリンに耐性を
有する微生物を用いる。かかる性質を有していれ
ば、他の要求性またはleaky型要求性、他の薬剤
抵抗性の性質をもつものでも本発明の範囲に含ま
れる。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、たとえばプロビデンシア・レトゲリHR17
（FERM Ｐ−9539）、プロビデンシア・レトゲリ
OHR22（FERM Ｐ−9348）が挙げられる。 プロビデンシア・レトゲリHR17は、プロビデ
ンシア・レトゲリTA−１（Ｌ−イソロイシン要
求性、Ｌ−スレオニン要求性）を親株として、ま
た、プロビデンシア・レトゲリOHR22はプロビ
デンシア・レトゲリOTA−１（Ｌ−イソロイシン
要求性、Ｌ−ロイシン要求性、α−アミノ−β−
ハイドロキシ吉草酸耐性、エチオニン耐性、チア
イソロイシン耐性、オキシチアミン耐性、Ｌ−ス
レオニン要求性）を親株として、通常の変異処理
方法によりＬ−ホモセリン耐性変異株として得ら
れたものである。 Ｌ−ホモセリン耐性変異株を得るには、たとえ
ば親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発剤
（たとえばＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で
処理したのちＬ−ホモセリン含有最少培地に塗布
し、生育してきた株を釣菌分離すればよい。 本発明で使用するＬ−ホモセリン耐性株とは、
親株よりＬ−ホモセリンに強い耐性を有する変異
株であり、好ましくは、親株の相対生育度が30％
以下を示すＬ−ホモセリンの濃度範囲において60
％以上の相対生育度を示す変異株のことである。 ここでたとえば生育度は、培養液の660nｍに
おける吸光度を測定し、各菌株のＬ−ホモセリン
を添加していない培養液の吸光度を100％として
表わした場合の相対吸光度で示す。 本発明におけるＬ−ホモセリン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの
ごとき有機酸、グリセロールのごときアルコール
類などを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニ
ウムのごとき有機アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝
酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、ア
ンモニアガス、アンモニア水、尿素などを0.5〜
4.0％、有機微量栄養素としては、Ｌ−イソロイ
シンなどの被要求物質が0.001〜0.4％、または必
要に応じてコーンステイープリカー、ペプトン、
酵母エキスなど０〜４％をそれぞれ適当量含有す
る培地が好適に用いられる。これらの他にリン酸
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄・７水
和物、硫酸マンガン４−６水和物などが微量成分
として少量添加される。 培養は、好気的条件で行う。培養の間、培地の
PHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、48〜
120時間振盪または通気培養すれば好ましい結果
が得られる。 培養液よりＬ−ホモセリンを採取するには、通
常の方法を用いることができる。たとえば、菌体
を除去した培養液をPH２に塩酸で調製したの
ち、強酸性カチオン交換樹脂に通液後、希アンモ
ニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後濃縮
する。これにアルコールを添加し、冷却保存下で
生成した結晶を集め、Ｌ−ホモセリンを得ること
ができる。 また他のアミノ酸が多く混在している時にはた
とえば特公昭38−25の方法にしたがつてＬ−ホモ
セリンを得ることができる。 ＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ Ａ （Ｌ−ホモセリン耐性変異株の分離） プロビデンシア・レトゲリTA−１（Ｌ−イ
ソロイシン要求性、Ｌ−スレオニン要求性）と
プロビデンシア・レトゲリOTA−１（Ｌ−イソ
ロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−ス
レオニン要求性、α−アミノ−β−ハイドロキ
シ吉草酸耐性、チアイソロイシン耐性、オキシ
チアミン耐性）の各菌体を常法によりＮ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処
理したのち、これらの細胞をＬ−ホモセリン
0.05％添加した下記組成の合成寒天培地に塗布
した。 合成寒天培地 グルコース 0.5％ KH₂PO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.7％ （NH₄）₂SO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.01％ Ｌ−イソロイシン 0.005％ Ｌ−スレオニン 0.005％ Ｌ−ロイシン 0.005％ 寒 天 1.5％ 次に37℃で５〜７日培養し、生じたコロニー
を釣菌分離してＬ−ホモセリン耐性株（プロビ
デンシア・レトゲリ）HR17およびプロビデン
シア・レトゲリOHR22）を取得した。 Ｂ （Ｌ−ホモセリン耐性株の耐性度の検定） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地
を用いて30℃で16時間振盪培養し、生育した菌
体を集菌し、生理食塩水で洗浄した。 この菌体懸濁液をＬ−ホモセリン0.33、
0.67、1.0ｇ／の割合で含む最少培地（培地
組成：グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第
１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.01％、Ｌ−イソ
ロイシン0.005％、Ｌ−スレオニン0.005％、Ｌ
−ロイシン0.005％）５mlに植菌して30℃で48
時間培養し各菌株の生育度を調べた。その結果
を第１表に示す。 本発明で使用するＬ−ホモセリンに耐性を有
する変異株（プロビデンシア・レトゲリHR17
およびプロビデンシア・レトゲリOHR22）で
はそれぞれの親株のプロビデンシア・レトゲリ
TA−１およびプロビデンシア・レトゲリ
OTA−１と比較して、高濃度のＬ−ホモセリ
ンによつて生育が阻害されず、強いＬ−ホモセ
リン耐性を獲得していることを示している。

【表】 実施例 ２ （Ｌ−ホモセリン生産菌の培養およびＬ−ホモ
セリンの生産） 下記組成の発酵用培地40mlを１容エーレンマ
イヤーフラスコに入れ、120℃で10分間蒸気殺菌
した。あらかじめ液体ブイヨン培地で30℃、16時
間振盪培養した第２表に示す各菌体の培養液４ml
を移し、30℃、150回転／分、振幅３cmの条件下
88時間培養した。 発酵用培地 グルコース ８％ （NH₄）₂SO₄ 2.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.005％ Ｌ−スレオニン 0.02％ Ｌ−ロイシン 0.06％ CaCO₃（別滅菌） ４％ PH 7.0（KOHで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中のＬ−ホモセリン濃度を自動アミノ酸分析
計（日本電子JLC300）で定量したところ第２表
に示す結果を得た。

【表】 ＜発明の効果＞ 本発明によれば、通常の炭素源を含有する栄養
培地にＬ−ホモセリンを著量蓄積せしめ採取する
ことが可能となり、発酵法によりＬ−ホモセリン
を効率よく製造することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロビデンシア（Providencia）属に属し、
   Ｌ−ホモセリン生産能を有する微生物を培養し
   て、培地中にＬ−ホモセリンを生成蓄積せしめ、
   該培地中よりＬ−ホモセリンを採取することを特
   徴とする発酵法によるＬ−ホモセリンの製造法。 ２ 微生物がＬ−ホモセリンに対する耐性を有す
   るものである特許請求の範囲第１項記載の発酵法
   によるＬ−ホモセリンの製造法。