DE60035243T2 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Histidin durch Aminochinolin-resistente Bakterienstämme der Gattung Escherichia - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Histidin durch Aminochinolin-resistente Bakterienstämme der Gattung Escherichia Download PDFInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Histidin durch Fermentation mit hoher industrieller Effizienz.
- Als eine direktes Fermentationsverfahren zur Herstellung und Anhäufung von L-Aminosäuren direkt aus Zucker, sind Verfahren mit Mutantenstämmen bekannt gewesen, in welchen Mutantenstämme verwendet wurden, die aus Wildtyp-Stämmen von Mikroorganismen abgeleitet wurden, die zum Genus Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Serratia oder Arthrobacter gehören. Zum Beispiel sind die Folgenden als L-Aminosäuren-erzeugende Mutanten bekannt: auxotrophe Mutanten, die Aminosäuren benötigen usw. (Japanische veröffentlichte, geprüfte Patentanmeldung Nummer
10037/1981 134993/1981 44193/1987 31093/1975 134993/1981 273487/1988 48195/1977 330275/1992 - Es ist auch bekannt gewesen, dass die Herstellung einer Aminosäure unter Verwendung von Transformanten verbessert werden kann, die durch Transformation mit rekombinanten DNAs erhalten werden, die Gene tragen, welche an der Biosynthese von Aminosäuren beteiligt sind (Japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldungen Nummern
893/1983 12995/1985 210994/1985 30693/1985 195695/1986 271981/1986 458/1990 42988/1990 42676/1989 11960/1993 26467/1993 - Zur Herstellung von L-Tryptophan, hat es einen Bericht gegeben, dass die Produktivität bzgl. dieser Aminosäure durch die Resistenzverleihung gegenüber Aminochinolinderivaten oder zu Phenothiazin-Derivaten verbessert wurde (Japanische veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nummer
112795/1992 - Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es ein industriell effizientes Verfahren zur Herstellung von L-Histidin welches als Medikament, chemischen Wirkstoff, Nahrungsmaterial oder Futtermittelzusatz nützlich ist bereitzustellen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Aspekte (1) bis (6).
- (1) Ein Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, welches umfasst:
- (a) Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit besitzt L-Histidin herzustellen und Resistenz für ein Aminochinolinderivat in einem Kulturmedium aufweist in einem Medium;
- (b) Herstellen und Anreichern von L-Histidin in der Kultur; und
- (c) Gewinnen von L-Histidin aus der Kultur.
- (2) Das wie vorstehend in (1) beschriebene Verfahren, wobei das Aminochinolinderivat ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Chloroquin, Amodiaquin, Pentaquin, Primaquin und den Alkalimetallsalzen dieser Stoffe.
- (3) Das wie vorstehend in (1) oder (2) beschriebene Verfahren, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli H-9341 (FERM BP-6674) ist.
- (4) Ein Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit zum Herstellen von L-Histidin und Resistenz für ein Aminochinolinderivat aufweist.
- (5) Der vorstehend in (4) beschriebene Mikroorganismus, wobei das Aminochinolinderivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chloroquin, Amodiaquin, Pentaquin, Primaquin und den Alkalimetallsalzen dieser Stoffe.
- (6) Escherichia coli H-9341 (FERM BP-6674).
- Als Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, der zur Gattung Escherichia gehört, solange er eine Fähigkeit besitzt L-Histidin herzustellen und Resistenz für ein Aminochinolinderivat aufweist. Beispiele des Mikroorganismus umfassen Escherichia coli.
- Als das Aminochinolinderivat für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann jeder Stoff verwendet werden, solange er das Aminochinolin-Skelett aufweist. Zum Beispiel, 4-Aminochinolinderivate wie zum Beispiel Chloroquin und Amodiaquin und 8-Aminochinolinderivate wie zum Beispiel Pentaquin und Primaquin, können als das Aminochinolinderivat verwendet werden. Zusätzlich können die Alkalimetallsalze dieser Stoffe als das Aminochinolinderivat verwendet werden. Alle diese Substanzen sind als Anti-Malaria-Medikament bekannt. Hierin können alle Alkalimetallsalze, wie zum Beispiel Natrium und Kalium als die Alkalimetalle verwendet werden.
- Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem ein Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit zur Erzeugung von L-Histidin aufweist, einer herkömmlichen Mutationsbehandlung unterzogen wird, einschließlich ultravioletter Bestrahlung und Behandlung mit einem Mutagen wie zum Beispiel N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), Züchten der resultierenden Mutantenstämme unter gewöhnlichen Bedingungen auf einem Agar-Plattenmedium, das ein Aminochinolinderivat mit einer Konzentration enthält, bei welcher der Elternstamm nicht wachsen kann, oder nur schlecht wächst und Auswählen von Kolonien des Stammes, die schneller als der Elternstamm wachsen oder von Kolonien, die unter den resultierenden Kolonien größer sind als die des Elternstamms.
- Als der Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit zum Herstellen von L-Histidin aufweist, kann ein Mikroorganismus verwendet werden, der die inhärente Fähigkeit besitzt L-Histidin herzustellen; alternativ kann auch ein neu erhaltener Mikroorganismus verwendet werden, indem ein Wildtyp eines Mikroorganismus durch bekannte Verfahren einer Behandlung unterzogen wird, um L-Histidin herzustellen.
- Die bekannten Verfahren umfassen ein Zellfusionsverfahren, Transduktionsverfahren, und andere Genrekombinationstechniken [siehe für alle Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hierin nachstehend abgekürzt als: Molecular Cloning, 2. Ausg.)] zusätzlich zu der vorstehend erwähnten Mutationsbehandlung.
- Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann auch durch Erzeugen eines Mutanten-Mikroorganismus erhalten werden, der durch eine herkömmliche Mutationsbehandlung Resistenz gegenüber einem Aminochinolinderivat aufweist, gefolgt dadurch, dass der resultierende Mikroorganismus dem vorstehend erwähnten Verfahren unterzogen wird, um dem Mikroorganismus die Fähigkeit zu übertragen, L-Histidin herzustellen.
- Spezifische Beispiele des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung umfassen Escherichia coli H-9341 (FERM BP-6674).
- Die Herstellung von L-Histidin durch Verwendung des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann durch ein herkömmliches Verfahren zur Züchtung von Bakterien durchgeführt werden.
- Als für die Herstellung von L-Histidin verwendetes Medium kann jedes synthetische Medium oder natürliches Medium verwendet werden, solange es eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, einen anorganischen Stoff und Spurenmengen an Nährstoffen, die der Stamm benötigt in geeigneter Weise enthält.
- Als die Kohlenstoffquelle können Kohlenhydrate wie zum Beispiel Glucose, Fructose, Lactose, Melasse, Zellulose-Hydrolysate, rohe Zucker-Hydrolysate und Stärke-Hydrolysate; organische Säuren wie zum Beispiel Brenztraubensäure, Essigsäure, Fumarsäure, Apfelsäure und Milchsäure; und Alkohole wie zum Beispiel Glyzerin und Ethanol verwendet werden.
- Als die Stickstoffquelle können Ammoniak; verschiedenste anorganische Salze wie zum Beispiel Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat; Ammoniumsalze von organischen Säuren; Amine, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Casein-Hydrolysate, Sojabohnenkuchen-Hydrolysate, verschiedene fermentierte Zellen und verdautes Material davon, verwendet werden.
- Als die anorganische Substanz kann Kalium-Dihydrogenphosphat, Di-Kalium-Hydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumchlorid und Calciumcarbonat, verwendet werden.
- Der Mikroorganismus wird unter aeroben Bedingungen, wie zum Beispiel Schüttelkultur und belüftete Schüttelkultur bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 20 bis 40°C, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 28 bis 37°C, gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums liegt innerhalb eines Bereiches von 5 bis 9, vorzugsweise um die Neutralität. Der pH-Wert des Mediums wird unter Verwendung von Calciumcarbonat, anorganischen und organischen Säuren, Alkalilösungen, Ammonium und pH-Puffern eingestellt. Im Allgemeinen wird die Aminosäure durch Züchten für 1 bis 7 Tage erzeugt und im Medium angereichert.
- Nach dem Abschluss der Züchtung werden die Präzipitate, wie zum Beispiel Zellen, aus dem Medium entfernt und L-Histidin kann aus dem Medium mittels dem Ionenaustausch-Behandlungsverfahren, Konzentrationsverfahren und Aussalzungsverfahren usw. in Kombination, gewonnen werden.
- Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht so ausgelegt werden sollen, dass sie den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung einschränken.
- Beispiel 1:
- Erzeugung von einem L-Histidin-erzeugenden Mutantenstamm, der Resistenz zu einem Aminochinolinderivat aufweist.
- Der L-Histidin-erzeugende Mutantenstamm H-9340, der Resistenz zu 1,2,4-Triazolalanin aufweist und der vom Methionin-benötigenden Escherichia coli ATCC 21318 abgeleitet wurde, wurde mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) (0,2 mg/ml, 30°C, 30 Minuten) gemäß einem herkömmlichen Verfahren einer Mutationsbehandlung unterzogen und auf ein 150 mg/Liter Primaquin-Di-Natriumsalz enthaltendes Agarplatten-Kulturmedium ausgestrichen [0,2% Glucose, 0,3% Kalium-Di-Hydrogenphosphat, 0,6% Di-Natrium-Hydrogenphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat, 0,05% Natriumchlorid, 0,1% Ammoniumchlorid, 50 mg/Liter benötigter Nährstoff (DL-Methionin) und 1,5% Agar, pH-Wert 7,2].
- Die auf das Agarplattenmedium ausgestrichenen Bakterien wurden für 2 bis 6 Tage bei 30°C gezüchtet und die großen wachsenden Kolonien wurden entnommen und aufgetrennt, um den Stamm H-9341 zu erhalten. Die Stämme H-9340 und H-9341 wurden am 9. März 1999 mit dem National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter dem Budapester Vertrag mit den Zugangsnummern FERM BP-6673 bzw. FERM BP-6674 hinterlegt.
- Beispiel 2:
- Vergleichender Wachstumstest auf Agarplatten-Kulturmedium, das Primaquin enthält.
- Das Wachstum des in Beispiel 1 erhalten Mutantenstammes H-9341 wurde mit dem Wachstum des Elternstammes H-9340 auf einem Agarplatten-Kulturmedium verglichen, welches Primaquin enthielt.
- Jede der Mutantenstämme, die in einem natürlichen Medium für 24 Stunden gezüchtet und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert worden waren, wurden bei einer Zelldichte von 1 bis 10 Zellen/cm2 auf ein Agarplattenmedium ausgestrichen, das Primaquin Di-Natriumsalz bei der gleichen Konzentration enthielt wie jener, zurzeit der Beschaffung jedes Mutantenstammes und wurde bei 33°C für 4 Tage gezüchtet.
- Wachstum oder Nicht-Wachstum der Stämme im vorstehend erwähnten Medium wird in Tabelle 1 gezeigt.
- Der Elternstamm H-9340 ist auf dem Agarplatten-Kulturmedium, das Primaquin enthielt, nicht gewachsen. Tabelle
Bakterienstamm Zusatzstoffe für das Agar-Kulturmedium Kein Zusatz Primaquin D-Natriumsalz H-9340 H-9341 + + - + - Beispiel 3:
- Herstellung von L-Histidin
- Die Herstellung von L-Histidin unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen Mutantenstammes H-9341 und des Elternstammes H-9340 wurde in der folgenden Weise durchgeführt.
- Beide Stämme, H-9340 und H-9341, wurden in 6 ml Saatmedium (2% Glucose, 0,5% Melasse, 1% Maisquellwasser, 1,2% Ammoniumsulfat, 0,3 % Kalium-Di-Hydrogenphosphat, 0,015% Magnesiumsulfat, 600 mg/Liter DL-Methionin, 100 mg/Liter Adenin, 3% Calciumcarbonat, pH-Wert 6,2) in einem großen Proberöhrchen inokuliert und mit Schütteln für 12 Stunden bei 30°C gezüchtet.
- Jede der erhaltenen Saatkulturen (0,1 ml) wurde in 5 ml Produktionsmedium (6% Glucose, 1% Maisquellwasser, 2,4% Ammoniumsulfat, 0,4% Kalium Di-Hydrogenphosphat, 0,015% Magnesiumsulfat, 10 mg/Liter Thiamin-Chloridsalz, 10 mg/Liter Calciumpantothenat, 3% Calciumcarbonat, pH-Wert 6,5) in einem großen Probenröhrchen inokuliert und dann darin unter Schütteln für 48 Stunden bei 30°C gezüchtet.
- Nach dem Züchten wurde die im Medium angereicherte Menge an L-Histidin durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie überprüft.
- Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
- Verglichen mit der L-Histidin-Produktivität des Elternstammes, war, die L-Histidin-Produktivität des Mutantenstammes H-9341 verbessert. Tabelle 2
Bakterienstämme L-Histidin (g/l) H-9340 13,0 H-9341 14,2 - In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann ein Mikroorganismus erhalten werden, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit besitzt L-Histidin herzustellen und Resistenz zu einem Aminochinolinderivat aufweist und durch Züchten des Mikroorganismus in einem Medium kann die Produktivität der Aminosäure erhöht werden, sodass L-Histidin mit industrieller Effizienz hergestellt werden kann.
Claims (6)
- Verfahren zur Herstellung von L-Histidin umfassend: (a) Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit besitzt, L-Histidin herzustellen, und Resistenz für ein Aminochinolinderivat in einem Medium hat; (b) Herstellen und Anreichern des L-Histidins in der Kultur; und (c) Gewinnen des L-Histidins aus der Kultur.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aminochinolinderivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chloroquin, Amodiaquin, Pentaquin, Primaquin und den Alkalimetallsalzen dieser Stoffe.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli H-9341 (FERM BP-6674) ist.
- Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit zum Herstellen von L-Histidin und Resistenz für ein Aminochinolinderivat hat.
- Mikroorganismus nach Anspruch 4, wobei das Aminochinolinderivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chloroquin, Amodiaquin, Pentaquin, Primaquin und den Alkalimetallsalzen dieser Stoffe.
- Escherichia coli H-9341 (FERM BP-6674).
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