CN107937323B - 一株具有降解4-氨基喹啉功能的微杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于生物降解处理技术领域的一株对4‑氨基喹啉具有降解功能的菌株。4‑氨基喹啉降解菌经鉴定为微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5，菌种保藏号为CGMCC No.14840。将该菌株制成含菌量为1.25×108CFU/ml的菌悬液，对初始浓度为4.86mg/L的4‑氨基喹啉在5天后的降解去除率为94.3％。

Description

一株具有降解4-氨基喹啉功能的微杆菌
技术领域
本发明属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域，特别涉及一株具有降解4-氨基喹啉功能的微杆菌。
背景技术
喹啉为典型的含氮杂环芳香烃化合物，属于石化废水中常见的污染物，具有较强的毒性，对生物体具有一定的致畸、致癌、致突变作用，对人体以及动植物体有着较大的潜在危害，能够通过食物链在包括人类的较高级生物体中进行积累，含喹啉污染物的大量排放对人类的健康以及自然环境会造成严重的威胁。目前喹啉的应用越来越广泛，用量不断增加，在环境中持久性的存在并不断扩散，已成为土壤环境和水环境中的常见污染物。在常规生物处理系统中难以达到良好的降解去除效果，为了降解废水中的喹啉，避免喹啉对自然环境和人类健康的影响，国内外研究者开展了大量研究工作，寻找喹啉处理的有效途径。对环境中喹啉的治理技术主要有物理法、化学法和生物法，其中生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。然而由于缺少高效的喹啉降解菌，制约了喹啉污染土壤生物修复技术的进一步发展和应用。因此，需要从污染的环境中驯化筛选出对喹啉降解速率较快的微生物菌种，然后再把它们应用于实际喹啉污染环境的生物治理，这对于治理和修复喹啉污染土壤有重要的意义。
发明内容
本发明提供一株具有降解4-氨基喹啉功能的微杆菌。所用菌株经鉴定为微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5,2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.14840。将该菌株制成含菌量为1.25×108CFU/mL的菌悬液，可用于环境中4-氨基喹啉的降解。
从污染土壤中分离纯化所述4-氨基喹啉降解菌的步骤如下：
(1)选取受喹啉污染的土壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4℃冰箱中保存备用；
(2)向体积为1000mL的开口玻璃瓶中加入45mL浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉的丙酮混合溶液，为除去丙酮将玻璃瓶开口放置2天；
(3)向由步骤(2)得到的开口玻璃瓶中加入500～600mL基础培养基，在转速为100r/min的条件下搅拌40～50min后加入由步骤(1)得到的土壤200g；然后置于温度为25～30℃的环境中在转速为100r/min的条件下搅拌富集驯化培养65d，在培养期间定期向玻璃瓶中加入基础培养基以维持玻璃瓶中泥浆系统的水土比例保持不变；其中基础培养基的组成为：NH4Cl:1.5g·L-1，KH2PO4:1.5g·L-1，MgCl2:0.25g·L-1，CaCl2·2H2O:0.10g·L-1；
(4)分别向7个体积为250mL的锥形瓶中加入10mL质量浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉的丙酮混合溶液，在通风橱中放置2天后得到锥形瓶1、锥形瓶2、锥形瓶3、锥形瓶4、锥形瓶5、锥形瓶6、锥形瓶7；
(5)将50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶1中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶1A；其中微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O:35mg·L-1，CuCl2:0.20mg·L-1，H3BO3:6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O:25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O:3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O:2.0mg·L-1，ZnCl2:2.5mg·L-1；
(6)将0.35克由步骤(3)驯化得到的泥浆加入到锥形瓶1A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶1B；
(7)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶2中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶2A；
(8)将1mL锥形瓶1B中的混合液加入到锥形瓶2A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶2B；
(9)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶3中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶3A；
(10)将1mL锥形瓶2B中的混合液加入到锥形瓶3A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶3B；
(11)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶4中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶4A；
(12)将1mL锥形瓶3B中的混合液加入到锥形瓶4A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶4B；
(13)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶5中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶5A；
(14)将1mL锥形瓶4B中的混合液加入到锥形瓶5A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶5B；
(15)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶6中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶6A；
(16)将1mL锥形瓶5B中的混合液加入到锥形瓶6A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶6B；
(17)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶7中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶7A；
(18)将1mL锥形瓶6B中的混合液加入到锥形瓶7A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶7B；
(19)向体积为1000mL的锥形瓶内加入490mL基础培养基、9mL微量金属液、1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液和7.5g琼脂，在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，冷却至65～70℃，然后在超净工作台中将其倒入到7个体积为160mL的培养皿中，将7个培养皿在超净工作台中放置2天后得到培养皿1、培养皿2、培养皿3、培养皿4、培养皿5、培养皿6、培养皿7；
(20)在超净工作台中分别向培养皿1、培养皿2、培养皿3、培养皿4、培养皿5、培养皿6、培养皿7中加入0.5mL质量浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿使4-氨基喹啉的丙酮溶液均匀分布，将7个培养皿在超净工作台中放置2天后得到培养皿1A、培养皿2A、培养皿3A、培养皿4A、培养皿5A、培养皿6A、培养皿7A；
(21)分别向7个体积为250mL的锥形瓶中加入10mL质量浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉的丙酮混合溶液，在通风橱中放置2天后得到锥形瓶1C、锥形瓶2C、锥形瓶3C、锥形瓶4C、锥形瓶5C、锥形瓶6C、锥形瓶7C；
(22)分别向锥形瓶1C、锥形瓶2C、锥形瓶3C、锥形瓶4C、锥形瓶5C、锥形瓶6C、锥形瓶7C中加入50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟后得到锥形瓶1D、锥形瓶2D、锥形瓶3D、锥形瓶4D、锥形瓶5D、锥形瓶6D、锥形瓶7D；；
(23)在超净工作台中将1mL锥形瓶7B中的混合液加入到培养皿1A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿1B；将培养皿1B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿1C；
(25)在超净工作台中挑取培养皿1C中的菌落接种到锥形瓶1D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶1E；
(26)在超净工作台中将1mL锥形瓶1E中的混合液加入到培养皿2A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿2B；将培养皿2B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿2C；
(27)在超净工作台中挑取培养皿2C中的菌落接种到锥形瓶2D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶2E；
(28)在超净工作台中将1mL锥形瓶2E中的混合液加入到培养皿3A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿3B；将培养皿3B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿3C；
(29)在超净工作台中挑取培养皿3C中的菌落接种到锥形瓶3D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶3E；
(30)在超净工作台中将1mL锥形瓶3E中的混合液加入到培养皿4A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿4B；将培养皿4B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿4C；
(31)在超净工作台中挑取培养皿4C中的菌落接种到锥形瓶4D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶4E；
(32)在超净工作台中将1mL锥形瓶4E中的混合液加入到培养皿5A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿5B；将培养皿5B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿5C；
(33)在超净工作台中挑取培养皿5C中的菌落接种到锥形瓶5D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶5E；
(34)在超净工作台中将1mL锥形瓶5E中的混合液加入到培养皿6A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿6B；将培养皿6B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿6C；
(35)在超净工作台中挑取培养皿6C中的菌落接种到锥形瓶6D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶6E；
(36)在超净工作台中将1mL锥形瓶6E中的混合液加入到培养皿7A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿7B；将培养皿7B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿7C；
(37)在超净工作台中挑取培养皿7C中的菌落接种到锥形瓶7D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶7E；锥形瓶7E中的菌液即为高效降解4-氨基喹啉的纯菌种。
具体实施方式
(1)选取受喹啉污染的土壤，将其通过直径为2mm的网筛后立即放置于4℃冰箱中保存备用；
(2)向体积为1000mL的开口玻璃瓶中加入45mL浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉的丙酮混合溶液，为除去丙酮将玻璃瓶开口放置2天；
(3)向由步骤(2)得到的开口玻璃瓶中加入500～600mL基础培养基，在转速为100r/min的条件下搅拌40～50min后加入由步骤(1)得到的土壤200g；然后置于温度为25～30℃的环境中在转速为100r/min的条件下搅拌富集驯化培养65d，在培养期间定期向玻璃瓶中加入基础培养基以维持玻璃瓶中泥浆系统的水土比例保持不变；其中基础培养基的组成为：NH4Cl:1.5g·L-1，KH2PO4:1.5g·L-1，MgCl2:0.25g·L-1，CaCl2·2H2O:0.10g·L-1；
(4)分别向7个体积为250mL的锥形瓶中加入10mL质量浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉的丙酮混合溶液，在通风橱中放置2天后得到锥形瓶1、锥形瓶2、锥形瓶3、锥形瓶4、锥形瓶5、锥形瓶6、锥形瓶7；
(5)将50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶1中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶1A；其中微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O:35mg·L-1，CuCl2:0.20mg·L-1，H3BO3:6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O:25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O:3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O:2.0mg·L-1，ZnCl2:2.5mg·L-1；
(6)将0.35克由步骤(3)驯化得到的泥浆加入到锥形瓶1A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶1B；
(7)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶2中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶2A；
(8)将1mL锥形瓶1B中的混合液加入到锥形瓶2A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶2B；
(9)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶3中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶3A；
(10)将1mL锥形瓶2B中的混合液加入到锥形瓶3A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶3B；
(11)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶4中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶4A；
(12)将1mL锥形瓶3B中的混合液加入到锥形瓶4A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶4B；
(13)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶5中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶5A；
(14)将1mL锥形瓶4B中的混合液加入到锥形瓶5A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶5B；
(15)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶6中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶6A；
(16)将1mL锥形瓶5B中的混合液加入到锥形瓶6A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶6B；
(17)将99mL基础培养基、1.0mL微量金属液和0.2mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液加入到锥形瓶7中，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟得到锥形瓶7A；
(18)将1mL锥形瓶6B中的混合液加入到锥形瓶7A中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶7B；
(19)向体积为1000mL的锥形瓶内加入490mL基础培养基、9mL微量金属液、1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液和7.5g琼脂，在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，冷却至65～70℃，然后在超净工作台中将其倒入到7个体积为160mL的培养皿中，将7个培养皿在超净工作台中放置2天后得到培养皿1、培养皿2、培养皿3、培养皿4、培养皿5、培养皿6、培养皿7；
(20)在超净工作台中分别向培养皿1、培养皿2、培养皿3、培养皿4、培养皿5、培养皿6、培养皿7中加入0.5mL质量浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿使4-氨基喹啉的丙酮溶液均匀分布，将7个培养皿在超净工作台中放置2天后得到培养皿1A、培养皿2A、培养皿3A、培养皿4A、培养皿5A、培养皿6A、培养皿7A；
(21)分别向7个体积为250mL的锥形瓶中加入10mL质量浓度为0.8g/L的4-氨基喹啉的丙酮混合溶液，在通风橱中放置2天后得到锥形瓶1C、锥形瓶2C、锥形瓶3C、锥形瓶4C、锥形瓶5C、锥形瓶6C、锥形瓶7C；
(22)分别向锥形瓶1C、锥形瓶2C、锥形瓶3C、锥形瓶4C、锥形瓶5C、锥形瓶6C、锥形瓶7C中加入50mL基础培养基、0.5mL微量金属液和0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液，在转速为100r/min的振荡器中振荡5分钟后得到锥形瓶1D、锥形瓶2D、锥形瓶3D、锥形瓶4D、锥形瓶5D、锥形瓶6D、锥形瓶7D；；
(23)在超净工作台中将1mL锥形瓶7B中的混合液加入到培养皿1A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿1B；将培养皿1B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿1C；
(25)在超净工作台中挑取培养皿1C中的菌落接种到锥形瓶1D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶1E；
(26)在超净工作台中将1mL锥形瓶1E中的混合液加入到培养皿2A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿2B；将培养皿2B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿2C；
(27)在超净工作台中挑取培养皿2C中的菌落接种到锥形瓶2D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶2E；
(28)在超净工作台中将1mL锥形瓶2E中的混合液加入到培养皿3A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿3B；将培养皿3B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿3C；
(29)在超净工作台中挑取培养皿3C中的菌落接种到锥形瓶3D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶3E；
(30)在超净工作台中将1mL锥形瓶3E中的混合液加入到培养皿4A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿4B；将培养皿4B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿4C；
(31)在超净工作台中挑取培养皿4C中的菌落接种到锥形瓶4D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶4E；
(32)在超净工作台中将1mL锥形瓶4E中的混合液加入到培养皿5A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿5B；将培养皿5B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿5C；
(33)在超净工作台中挑取培养皿5C中的菌落接种到锥形瓶5D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶5E；
(34)在超净工作台中将1mL锥形瓶5E中的混合液加入到培养皿6A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿6B；将培养皿6B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿6C；
(35)在超净工作台中挑取培养皿6C中的菌落接种到锥形瓶6D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶6E；
(36)在超净工作台中将1mL锥形瓶6E中的混合液加入到培养皿7A中，来回倾斜转动培养皿使接种的降解菌液均匀分布，得到培养皿7B；将培养皿7B放入温度为25℃的培养箱中培养10天，得到培养皿7C；
(37)在超净工作台中挑取培养皿7C中的菌落接种到锥形瓶7D中，然后置于温度为25～30℃转速为100r/min的振荡器中培养7天，得到锥形瓶7E；锥形瓶7E中的菌液即为高效降解4-氨基喹啉的纯菌种。
运用分离纯化得到的降解4-氨基喹啉的菌种微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5制成菌悬液，含菌量为1.25×108CFU/mL，进行降解4-氨基喹啉的降解试验。结果表明菌株微杆菌Microbacterium sp.M.CWS5能够对4-氨基喹啉进行有效的降解，当4-氨基喹啉的初始浓度为4.86mg/L时，5天后的降解去除率为94.3％。

Claims (1)

1.一株对4-氨基喹啉具有降解功能的菌株，其特征在于，所述菌株为微杆菌Microbacterium sp.，其菌种保藏号为CGMCC No.14840。
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