DE2016496A1 - Verfahren zur Gewinnung von 1-Histidin - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von 1-HistidinInfo
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Description
2016496 Andrejewski & Honke Patentanwälte
α ι. ι * -sei· η/Cc /-α
Diplom-Ingenieur
Anwalfsakter J* 465/H Dr,-Ing. Manfred Honke
• Essen, den 24. März 197o
Patentanmeldung
KYOWA HAKKO KOGYO KABUSHIKI KAISHA
No.6-1, 1-chome, Ohte-machi^Chlyoaa-ku,
T ok y ö-to (Japan)
Verfahren zur Gewinnung von !-Histidin
Man gewinnt 1-Histidln durch einen Fermentationsprozeß,
indem man ein Gemisch aus einem Mikroorganismus, der imstande ist, 1 - Histidinol zu produzieren und aus einer Hefe, die
imstande ist, 1-Histidinol in 1-Histidln überzuführen, in
einem geeigneten Nährmedium der Züchtung unterwirft.
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung
von 1-Histidin durch Fermentation, im besonderen betrifft
sie ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
maß ein Gemisch aus einem Mikroorganismus, der Imstande ist,
1-Histidinol zu produzieren, Und aus einer Hefe, die imstande
009842/1310
ist, l-llistidinol in 1-Histidin überzuführen, in einem Zuchtmedium,
welches eine C-Quelle, eine N-Quelle, anorganische Substanz
und organische Nährstoffe enthält, der Züchtung unterwirft, eine beträchtliche Menge an 1-IIistidin ansammeln läßt,.
und das angesammelte 1-Histidin aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung 1st, ein verbessertes ™ Verfahren zur Gewinnung von l-flistidin vorzusehen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein technisches Verfahren zur Gewinnung von 1-Histidin vorzusehen,
welches die direkte Ansammlung einer beträchtlichen Menge 1-Histidin in einem Fermentationsmedium enthält.
1-II.istidin, eine der Eiweii3-aufbauenden Aminosäuren, ist für
lebende Körper wichtig, so daß es als Medikament, Zusatz zu Viehfuttermitteln oder auch Zusatz zu Nahrungsmitteln verwendet
worden ist.
) Es ist bereits berichtet worden, daß 1-IIistidin durch Züchten
von Mikroorganismen, wie z.B. den gegen Reagentien beständigen Mutanten von Esoheri»chla ooli und Salmonela typhlmurlum
(Science, 129, 968 -1959 - und Genetics, 50, 611 -ΐυό^- )
angesammelt werden kann. Jedoch ist die in dem Medium angesammelte Menge an 1-IIistidin gering, so daß derartige Verfahren
auf die technische Gewinnung von 1-IIlstidln nicht angewendet
werden können.
Wir haben nun gefunden, daß gewisse Mutanten vom Genus
CorynebaotorLum Imstande sind, eine beträchtliche Menge von
009RA2/1318
Patentanwälte Dr. W. Andrejewski, Dr. M. Honke, 43 Essen, Kettwiger Straße
1-Histidinol in einem Zuchtmedium anzusammeln. Wir haben .
außerdem gefunden, daß in dem Falle, wenn ein Gemisch aus 1-Histidinol-produzierenden Mikroorganismen und aus einer
Hefe, z.B. Torulopsis, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches für die Produktion von 1-Histidinol vorgesehen ist,
eine beträchtliche Menge an 1-Histidin gleichzeitig in dem
Medium angesammelt wird, welche infolge der Anwesenheit einer
kleinen Menge nebenerzeugter anderer Aminosäuren leicht erhalten werden kann.
Als 1-Histidinol-produzierender Mikroorganismus, welcher für
den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden kann, können.z.B.
1-Histidinol-produzierende Stämme von Corynebacterium eingesetzt
werden. Sie sind Im allgemeinen von °1-Histidin benötigender
Natur. Bevorzugte Stämme werden durch Corynebacterium glutamicum M-560 No. 126 (ATCC Nr.21 339) veranschaulicht,
welches für die Öffentlichkeit in unbeschränktem Umfang verfügbar ist, und welches eine Nährstoff-benötigende Mutante ist,
die durch Behandlung von Corynebacterium glutamicum M 560
(ATCC Nr.13 761) mit N-Methyl- N1 -nitro-N-nitrosoguanidin
erhalten wird, und welche sich von dem Original-Stamm mit Rücksicht auf die Forderung nach 1-Histidin und auf die Produktivität
von'1-Histidinol unterscheidet.
Über Corynebacterium glutamicum wurde anfänglich als
Mlcrocoecus glutamicus in der Japan.Patentanmeldung No. 8698/1957 berichtet. Jedoch ist als Ergebnis einer weiteren
Studie durch Kinoshita und Mitarbeiter unter mikrobiologischen
und taxonisohen Gesichtspunkten in "The Journal of ' ineral and
Applied Microbiology", Bd.l8,S.279 bis 301 (I967) unu anderer
009842/131 &
Literatur der Schluß gezogen worden, daß dieser Stamm als Genus Corynebacterium klassifiziert, und als Corynebaoterium
glutamicum bezeichnet werden sollte. Dieser neue Name wird auch in der vorliegenden Beschreibung verwendet.
Andererseits können typische Hefe-Stämme, die imstande sind, 1-Histidinol in 1-Histidin überzuführen, welche für den erfindungsgemäßen
Zweck verwendet werden können, durch Torulopsis No. 942 (ATCC No. 20 200) veranschaulicht werden, welches der
Öffentlichkeit in unbeschränktem Umfang zugänglich ist, und welches aus Melasse durch uns isoliert worden ist.
Der Chemismus der Produzierung von 1-Histidin durch Züchten der oben erwähnten zwei Mikroorganismen ist noch nicht klar.
Jedoch kann er, basierend auf dem Ablauf der Biosynthese von 1-Histidin, billigerweise so angenommen werden, daß 1-Histidinol,
welches durch einen 1-Histidinol-produzierenden Stamm, der zu
\ Corynebacterium gehört, erhalten wird, durch 1-Histidinol-Dehydrase
von Torulopsis in 1-Histidin überführt wird. Die 1-Hlstidinol-Dehydrase ist bekannt, und sie ist durch verschiedene
Mikroorganismen gefunden worden. Wir haben jedoch entdeckt, daß Mikroorganismen, von denen man glaubte, daß sie die
1-Histidinol-Dehydrase hätten, nicht immer imstande sein können,
unter den Bedingungen zum Züchten von 1-Histidinol-produzierenden
Stämmen 1-Histidinol in 1-Histidin zu überführen- mit Ausnahme von Torulopsis, welches- wie in Tabelle 1 gezeigtdie
charakteristischen Merkmale hat.
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Mikroorganismus . ' Ansammlung von Ansammlung von
1-Histidinol 1-Histidin
Brevibaoterium ammoniagenes " + ■+ + +
Serratla marcescens + + +
Aspergillus niger + ■+■ + -
Streptomyces griseus + + + -
Streptomyces ambofaclens +■ 4· +
Streptomyces kelicolor ' + + +
Corynebacterium glutamieum M-560 + + + -
Bacillus subtilis + + +
Saccharomyces cerevisiae + + + .-._.-.
Achromobactßr +■+■+.'
Torulopsis Mo. 942 - ■ + + +
1) Zusammensetzung des Mediums: Glukose-12 g/dl, Ammonsulf.at-1/5
g/dl, Ammonohlorid-0,5 g/dl. Harnstoff-0,5 g/dl, KH2PO^-O,15
g/dl, K2HPO4 -0,5 g/dl, MgSO^-TH2O -0,05 g/dl, FeSO4.7HgO-0,002
g/dl, MnS04'4H20 -0,002 g/dl, Biotin -30/cg/l,
CaCO, -2 g/dl, Pepton -.1 g/dl.u.Fleischextrakt -0,5 g/dl.
Das pH wurde mit Ammoniak auf 7,2 eingestellt.
2) Stamm und Beimpfungszeit: Mit Corynebacterium glutamioum
M-560-Nr.l26 (ATCC Nr.21 399) wurde am Beginn der Züchtung geimpft,
und mit verschiedenen Mikroorganismen, die in Tabelle angeführt sind, wurde nach viertägiger ZUchtung geimpft. Die
Züchtungen wurden, für weitere ? Tage fortgesetzt.
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3) Züchtungsbedingungen: Kolbensohüttelung, Temperatur beim
Züchten 28° C.
Es ist so zu verstehen, daß diese Bedingungen nicht sehr kritisch sind; sie können ganz allgemein vom Fachmann im Rahmen
der folgenden Information abgewandelt werden.
In Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es sehr
wichtig, zwecks besserer Ausbeute an 1-Histidinol ein gutes
Wachstum der selektierten l-flistidinol-produzierenden Mikroorganismen
zu erzielen. Zu diesem Zweck könnte das Medium eine geeignete O-Quelle, N-Quelle, anorganische Substanzen
und organische Nährstoffe enthalten.
Als C-Quelle können Glukose, Pruktose, Galaktose, Saccharose,
Maltose, Mycose, Cellobiose, Arabinose, Alkohole, Essigsäure, Melasse und/oder Stärkehydrolysat u.dgl. mit einer vorzugsweisen
Konzentration von 5 bis PO g/l in dem Medium verwendet werden.
Als N-Quelle kann wenigstens eLne der organischen oder anorganischen
Vorbindungen, wie Ammoniak, Harnstoff, Ammonsulfat, Amtnonohlorid, Ammonacotat, Ammoncitrat u.dgl. verwendet
worden.
Als anorganische Substanzen können salzsaure, schwefelsaure,
salpetersäure und phosphorsaure Salze des Na, K, Mn, Mg, Ca,
Co, Ni, Zn, Cu u.dgl. eingesetzt werden. Ks ist jedooh da
iiie l-HlntldlnoL-produzieronden Mikroorganismen eine
CharakterLatLnoho Anforderung an die Nährstoffe haben -
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notwendig, die erforderlichen organischen Nährstoffe dem
Medium zuzusetzen. Da die Produktions-Ausbeute an 1-Histidinol
und demzufolge auch an 1-Histidin von den Mengen an zugesetzten Nährstoffen abhängen wird, so ist es notwendig, geeignete
Nährstoffmengen zuzusetzen. Es ist z.B. vorzuziehen wenn
die oben erwähnten 1-Histidin-benötigenden Mutanten verwendet werden - 1-Histidin oder 1-Histidin-haltiges Material
in Mengen von 50 bis 3000/ug/ml, berechnet als Histidin zuzusetzen.
Es ist außerdem möglich, dem Medium eine kleine Menge 1-Histidinols oder eines organischen Nährstoffs zuzufügen,
welche auf die Förderung der 1-Hlstidin-Produktion wirksam
ist; jedoch hat ein solcher.Zusatz keine oder nur eine geringe Wirkung auf das Wachstum der Mikroorganismen. Solche organischen
Nährstoffe können im allgemeinen dargestellt werden durch Aminosäuren, Vitamine und auf Nukleinsäure zurückgehende Substanzen,
abgesehen von dem oben erwähnten 1-Histidin. Es ist auch möglich, natürliche organische Materialien, wie Maiswasser,
Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakti ein Hydrolysat von Sojabohnenmehl oder von mikroben Zellen u.dgl. als Nährstoffe
enthaltende Materialien zu verwenden. Diese verschiedenen organischen Nährstoffe können einzeln oder zusammen mit
anderen eingesetzt werden.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen und bei einem
bevorzugten Pu von etwa 5 bis 9 im Laufe der Züchtung (insbesondere
7 "bis 9 nach Beimpfung mit Torulopsis) durchgeführt.
Die Temperatur bei der'Züchtung liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 2j5 bis 4o° C, und die Züchtung wird im allgemeinen
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3 bis 8 Tage fortgesetzt. Erfindungsgemäß kann durch Züchten
eines 1-Histidinol-produzierenden Stammes und einer Hefe, die imstande ist, 1-Histidinol in 1-Histidin zu überführen,
wie z.B. Torulopsis, eine beträchtliche Menge 1-Histidin angesammelt werden, wobei. beide Komponenten von Beginn der
Züchtung an zusammengemischt werden. Es ist jedoch vorzuziehen, nach der Beimpfung mit dem 1-Histidinol-produzierenden
P Stamm eine 2 bis 3-tägige zusätzliche Züchtung durchzuführen.
Das nachfolgende, jedoch nicht begrenzende Beispiel erläutert die Erfindung.
Ein Medium, welches Glukose (4g/dl),KBgPO^(0,15 g/dl),
K2HPO4 (0,05 g/dl), MgSO4.7H2O (0,05 g/dl), Pepton (lg/dl),
Fleischextrakt (l g/dl,) Hefeextrakt (0,5 g /dl) u.NaCl ( 0,5 g/dl) enthielt, wurde mit Ammoniakwasser auf ein pH von
7,2 eingestellt und dann mit Corynebacterium glutamicum M-560 Nr.126 (ATCC Nr.21 339) beimpft. Diese Züchtung wurde
unter Schütteln 24 Stunden fortgesetzt. Ein gleiohes Medium wurde getrennt mit Torulopsis Nr.942 (ATCC Nr.20 200) beimpft,
und es wurde unter Schütteln 24 Stunden gezüchtet. Beide wurden als Saatkulturen verwendet.
Es wurde dann ein Permentationsmedium bereitet durch Zufügen von 1-Histidin, Fleischextrakt, Maiswasser, einem Hydrolysat
aus Sojabohnen oder aus mikroben Zellen der Glutaminsäure-Fermentation
zu einem basischen Medium, das aus Melasse
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(12 g/dl )-als Glukose-,(NH^)2SO4(2 g/dl), KH3PO4 (0,15 g/dl),
K2HPO4(0,05 g /dl), MgSO4-TH2O (0-,05 g/dl) in dem unten gezeigten Umfang und bei einem mit Ammoniakwasser eingestellten p„ von
7,2. Man gab 10 ml des Fermentationsmediums in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben und sterilisierte. Das darin befindliche Medium wurde mit 0,5 ml der Saatkultur von Corynebacterium glutamicum
M-56O Nr. 126 (ATCC Nr., 21 339) beimpft, und man züchtete 4 Tage lang unter Schütteln bei 28°C. Danach wurde mit 1 ml der Saatkultur von Torulopsis Nr.942 (ATCC Nr.20 200) zusammen mit zugesetzter Glukose ( 2 g/dl) und Harnstoff (0,3 g/dl)·geimpft. Die Züchtung unter Schütteln wurde für zusätzliche 3 Tage fortgesetzt, um die nachfolgenden Ergebnisse zu erhalten (Tabelle 2).
K2HPO4(0,05 g /dl), MgSO4-TH2O (0-,05 g/dl) in dem unten gezeigten Umfang und bei einem mit Ammoniakwasser eingestellten p„ von
7,2. Man gab 10 ml des Fermentationsmediums in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben und sterilisierte. Das darin befindliche Medium wurde mit 0,5 ml der Saatkultur von Corynebacterium glutamicum
M-56O Nr. 126 (ATCC Nr., 21 339) beimpft, und man züchtete 4 Tage lang unter Schütteln bei 28°C. Danach wurde mit 1 ml der Saatkultur von Torulopsis Nr.942 (ATCC Nr.20 200) zusammen mit zugesetzter Glukose ( 2 g/dl) und Harnstoff (0,3 g/dl)·geimpft. Die Züchtung unter Schütteln wurde für zusätzliche 3 Tage fortgesetzt, um die nachfolgenden Ergebnisse zu erhalten (Tabelle 2).
Zugesetztes Material und Menge A B
1-Histidin .HCl 350/Ug/ml - 6,4 8,4
Fleischextrakt 0,2 g/dl 9A 0,8
Fleischextrakt 0,2 g/dl + 1-Histidin.HCl 100/Ug/ml 11,3 2,3
Maiswasser 0,5 g/dl 4,8 0,2
Maiswasser 0,5 g/dl +1-Histidin .HCl 150/Ug/ml 12,4 2,4
Sojabohnenhydrolysat 0,5 g/dl 5,2 2,1
hydrolysat 0,5 g/dl +1-Histidin ♦HCl 200,ug/ml 6,5 6,9
+ 1-Histidin . HCl 20OyUgZmI 5/0 9,8
Ael-Histidin-Ansanmjlung in mg/ml (bereohnet als 1-Histidin· HCl )
B-1-Hietidlnol-Ansammlung in mg/ml (bereohnet als 1-Hlstidlnol.HCl).
Ans pril 0 h β ι
009842/1318
Claims (5)
1. Verfahren zur Gewinnung von 1-Histidin durch Fermentation,
dadurch gekennzeichnet, daß ein 1-IIistidinol-produzierender
Mikroorganismus zusammen mit einer Hefe, die imstande ist, 1-Histidinol in 1-IIistidin überzuführen,
in einem Kulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Materialien und organische
Nährstoffe enthält, der Züchtung unterworfen und das angesammelte 1-Histidin gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der
1-HistidinoL-produzierende Mikroorganismus eine Mutante von
Corynebacterium glutamicum ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Hefestamm Torulopsis Nr. 9^2 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der l-Histidlnol-produzierende Mikroorganismus in dem Kulturmedium
gezüchtet wird, ehe die Hefe zugesetzt wird, und daß dann die Züchtung in Gegenwart jenes Mikroorganismus und der Hefe
fortgesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der
Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum M-56O Nr.126 und
die liefe Torulopsis Nr.9^2 sind.
PAe Dr.Androjewnki, Dr.IIonke
SAO ORIGINAL
009842/1318
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