DD269167A1 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von l-lysin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von L-Lysin. L-Lysin ist als essentielle Aminosaeure ein wertvoller Zusatzstoff fuer Futtermittel, bestimmte Lebensmittel und darueber hinaus fuer verschiedene medizinische Praeparate. Bei dem erfindungsgemaessen Verfahren werden Mutanten der Gattung Brevibacterium, die folgende Merkmalskombination aufweisen- Aminosaeure-Prototrophie- Methioninsensibilitaet- Resistenz gegen Lysinanaloga- Resistenz gegen Aspartatanalogazur fermentativen Herstellung von L-Lysin eingesetzt. Bevorzugt werden die Mutanten ZF 1 (ZIMET 11266) und ZF 2 (ZIMET 11267) verwendet. Die Mikroorganismen mit der erfindungsgemaessen Merkmalskombination sind in der Lage, durch ihre geringen Ansprueche an die Versorgung mit komplexen Stickstoffquellen in Medien mit niedrigen Konzentrationen dieser Rohstoffe unter intensiver Nutzung der C-Quelle in relativ kurzer Fermentationszeit hohe Lysinakkumulationen zu erreichen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, das als essjntielle Aminosäure einen wertvollen Zusatzstoff für Futtermittel, bestimmte Lebensmittel und darüber hinaus für verschiedene medizinische Präparate darstellt. Zur Herstellung des L-Lysin werden gegenwärtig überwiegend mikrobiologische Verfahren genutzt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die fermentative Herstellung von L-Lysin erfolgt bei modernen mikrobiologischen Verfahren mittels leistungsmäßig hochgezüchteter Mikroorganismen, die in speziell zusammengesetzten Nährmedien kontaminationsfrei kultiviert werden und dabei eine Kohlenstoffquelle in das gewünschte Zielprodukt umsetzen.

Die bevorzugten L-Lysin-bildenden Produktionsstämme gehören den Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium an.

Eino umfassende Darstellung zur fermentativen L-Lysinbildung ist von TOSAKA u. a.; Trends in Biotechnology 1,70-74 (83) veröffentlicht.

Der auch historisch gesehen erste Typ von L-Lysin-bildenden Mutanten erfordert für sein Wachstum Aminosäuren, die in einem Zusammenhang mit dem Syntheseweg für L-Lysin stehen.

Bevorzugt handelt es sich hierbei um Mutanten, die eine Bedürftigkeit für Homoserin bzw. Methionin und Threonin zeigen.

Diese Art von Mutanten sind in der Lage, L-Lysin in den Größen von 13 bis 34g Lysin/I Kulturlösung anzureichern.

Von wesentlich größerer Bedeutung ist ein weiterer Typ von Produktionsstämmen, der neben einer Bedürftigkeit für eine oder mehrere Aminosäuren zusätzlich sogenannte Regulationsdefekte aufweist.

Bei regulatorischen Mutanten ist die normalen Mikroorganismen eigene Empfindlichkeit von Schlüsselenzymen des Lysinsyntheseweges gegenüber ihren Endprodukten und damit auch gegenüber ihren entsprechenden Analoga aufgehoben, so daß sich Endprodukte über das normale Maß anreichern, weil eine für die Zelle „normale" Regulation des Stoffwechsels nicht mehr erfolgt.

Als ein Beispiel soll hierfür die Resistenz gegen das Lysinanalogon S-(2-amino-ethyl)-L-cystein (AEC) genannt werden.

In der CS-PS 199755 wird eine auxotrophe und zugleich regulatorische L-Lysin-produzierende M-Jtante beschrieben, die Homoserin abhängig und AEC-resistent ist. Dabei handelt es sich um eine Mutante Brevibacterium flavum CCM 251, die nach 96 Stunden Kultivierung eine Lysinanreicherung von 96 g/l Kulturlösung erreicht.

Auxotrophe regulatorische Mutanten von Brevibacterium lactofermentum können 60 bis 70g Lysin/I Kulturlösung anreichern und auxotrophe regulatorische Mutanten von Corynebacteriun glutamicum erreichen 42 bis 68g L-Lysin/I Kulturlösung (TOSAKA u.a., 1983).

Allen diesen Verfahren muß jedoch angelastet werden, daß den verwendeten Mikroorganismen die für ihr Wachstum notwendigen Aminosäuren in einem gewissen Verhältnis aus einer komplexen N-Quelle zugeführt werden müssen.

Die Höhe d«r erreichbaren Biomassekonzentration und die zwangsläufig damit verbundene erreichbare Lysinakkumulation wird durch die Zufuhr der für den jeweiligen Produktionsstrom essentiellen Aminosäure(n) begrenzt.

Für die Bereitstellung der für das Wachstum notwendigen Aminosäuren werden vorzugsweise Hydrolysate komplexer Proteinquellen z.B. Sojaextraktionsschrot, Erdnußmehl, Hefen u. a. genutzt (CS-PS 203769, CS-PS 209684).

Die Bereitstellung einer derartigen N-Quelle bedeutet erheblichen technischen und Kostenaufwand.

Das ist ein Mangel, dem bisher nicht erfolgreich begegnet werden konnte.

Es wurde weiterhin in dritter Typ von Mutanten beschrieben, deren Wachstum durch das Vorliegen einer gewissen Menge an Threonin oder Methionin gehemmt wird.

Diese Eigenschaft kann ebenfalls mit einer Resistenz gegen AEC (DE-OS 2350647) bzw. mit einer Aminosäurebedürftigkeit (FR-PS 1 533&38 und GB-PS 1425648) gekoppelt werden. In der FR-PS 1533688 ist eine Mutante von Corynebacterium beschrieben, deren Wachstum sowohl durch Methionin als auch durch Threonin hemmbar ist, wobei die Wacnstumshemmuiig jeweils durch Zugabe der anderen Aminosäure aufhebbar ist. Die Mutante C.gluiamicum AJ 3400, beschrieben in DE-OS 2350647, wird im Wachstum durch Methionin gehemmt, wobei diese Wachstumshemmung durch Threoninzugabe nicht aufgehoben wird.

I. SHIIO und K, SANO (1969) beschreiben Mutanten von B. flavum mit verminderter Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität, dToii Wachstum sowohl gegen Methionin als auch Threonin sensibel sind und die im synthetischen Medium ?3g L-Lyo · hCI/l Kulturlosung synthetisieren können. (J.tjftn.Mppi.ivücfu'uiui. Ί5, 2ö7 (läüäj;

H. OZAKI und I. SHIIO (1963) beschreiben eine B.flavurr- Mutante mit AEC-Resistenz, Methioninsensibilität und verminderter Pyruvatkinaseaktivität (Agr. Biol.Chem.47,1 569-1 576 [1983]).

Der beschriebene dritte Typ von Produktionsstämmen wäre potentiel in der Lage bei Kopplung der Marker Methionin- oder Threoninsensibilität mit AEC-Resistenz, L-Lysin im synthetischen Medium ohne Zufütterung von Aminosäuren zu bilden. Das angeführte Beispiel von SHIIO u.a. ('969) zeigt jedoch nur eine geringe Lysinakkumulation. Um den erreichten technischen Stand zu charakterisieren, reicht die Angabe der Lysinakkumulation nicht aus. Für die Beurteilung der Leistungsfähigkeit eines Lysinbildners muß ebenso der erreichte Umwandlungsgrad der C-Quelle in Lysin („Konversinnsgrad") und die Fermentationsdauer berücksichtigt werden.

Eine Lysinakkumulation von 55 bis 96g Lysin/I Kulturlösung, ein Konversionsgrad von 0,3 bis 0,5 und Raum-Zeit-Ausbeuten von 1,0 bis 1,5g Lysin/I h stellen gegenwärtige Spitzenverfahren dar (JP-85/166393).

Das Erreichen bzw. Überbieten der vorliegenden Parameter unter Berücksichtigung einer wesentlich ökonomischeren Bereitstellung der komplexen N-Quelle ist ein weiterer Schritt zu einem kostengünstigen Lysinverfahren, wobei zunehmendes Interesse solchen Stämmen gilt, die ausreichend hohe Lysinanreicherungen in relativ kurzer Fermentationszeit erreichen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die aufgezeigten Mangel des Standes der Technik zu beheben. Dabei wird eine wesentliche Verbesserung der Ökonomie des Gesamtprozesses der L-Lysinherstellung angestrebt. Die Verbesserungen sollen in einer weiteren Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute und in einer Reduzierung der Abhängigkeit der Lysinherstellung von komplexen N-Quellen zum Ausdruck kommen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe, die der Erfindung zugrunde liegt, beinhaltet die Erzeugung und Auswahl geeigneter Hochleistungs-Lysinbildner sowie deren produktiven Einsatz im Rahmen eines den mikrowellen Bedingungen entsprechenden technologischen Regimes.

Erfindungsgemäß konnte ein dermaßen geeignetes Stammaterial bei Verwendung von N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) und ultraviolettem Licht als Mutagene unter Einsatz üblicher Methoden der Mutagenese ausgehend vom allgemein zugänglichen Typstamrn Brevibacterium flavum ATCC 14067 erhalten werden.

Dabei wurde zunächst nach Mutagenese mit MNNG eine Homoserin-auxotrophe Mutante isoliert. Nach weiterer Behandlung dieser Mutante mit ultraviolettem Licht konnten Abkömmlinge isoliert werden, die keine Bedürftigkeit für Homoserin mehr zeigen und überraschend eine Resistenz gegen das Lysinanalogon AED aufweisen. Die selektierten prototrophen Stämme sind darüber hinaus Methionin-sensibel. Sie zeigen keine Empfindlichkeit gegenüber Threonin. Ihre Methioninempfindlichkeit ist durch Zugabe von Threonin aufhebbar.

Nach einer erneuten Behandlung mit dem Mutagen MNNG konnten Abkömmlinge mit Resistenz gegen das Aspartatenalogon Cysteinsulfinsäure isoliert werden.

In Kombination dieser Merkmale erweisen sich die isolierten Mutanten als ausgesprochen gute Lysinbildner.

So hergestellte Stämme wurden in der zentralen Stammsammlung der DDR, im ZIMET Jena, unter den Nummern ZIMET 11266 und ZIMET 11267 hinterlegt.

Sie weisen nachfolgende Charakteristika auf:

ZF1: Brevibacterium flavum met^sAECⁿCSSⁿ (ZIMET 11266)

ZF2: Brevibacterium flavum met^sAEC^RCSS^R (ZIMET 11267)

Nachfolgend ist das Ergebnis der Differntialdiagnostik der Mutanten ZF1, ZF2 und des Ausgangsstammes B. flavum ATCC 14067 dargestellt. Da das Erscheinungsbild der Mutanten mit dem Verhalten des Ausgangsstammes B. flavum ATCC 14067 übereinsti-nmt, wurde auf eine gesonderte Darstellung verzichtet.

Ergebnisse der Differentialdiagnostik der Mutanten ZF1, ZF2 und B.flavum ATCC 14067:

Grammverhalten positiv

Beweglichkeit —

Sporenbildung —

Zellform uniforme Kurzstäbchen

Wachstum auf unterschiedlichen Nährböden:

Blutplatte: Nähragar: Riesenkolonie-NA: Wachstum in NaCI-Bouillon

hellgrau, milchig, glänzend, mit glattem Rand, keine ß-Hämolyse runde Kolonie, hellbeige, mattglänzend, gelappter Rand Durchmesser 1 cm, hcllbeige, mattglänzend, gelappter Rand 3% sehr gutes Wachstum 5 % sehr gutes Wachstum 7% gutes Wachstum 10%Wachstum

Nitratreduktion: +

Stärkehydrolyse: -

Caseinhydrolyse: -

Gelatinehydrolyse: -

VPR:

Methylrot: -

Indol:

Simmons-Citra.: -

Urease: +

Katalase: +

Säurebildung aus l-Arabinose: D(+)-Xylose

d-Mannose +

Glukose +

d-Fruktose +

d-Galactose -

Lactose -

Maltese +

Trehalose -

Saccharose +

Raffinose

d-Mannit

d-Sorbit

Dulcit

Aesculin -

Ribose +

Salicin -

Cellobiose -

Assimilation organischer Säuren:

Brenztraubensäure +

Milchsäure +

Essigsäure +

Fumarsäure +

Oxalsäure -

Zitronensäure +

Ameisensäure -

a-Ketoglutarsäure +

Buttersäure -

1-Glutarsäure -

Malonsäure -

Kaninchen-Antiseren der erfindungsgemäßen Mutanten reagieren nur gegen homologe Antigene.

Gegen Vertreter der Gattung Corynebacterium tritt keinerlei serologische Reaktion im Fluoreszenz-Antikörpertest auf.

Technologische Bedingungen, unter denen bei Verwendung der erfindungsgemäßen Stämme ZIMET 11266 und ZiMET 11267 die Lysinbildung erfolgt, werden in den Ausführungsbeispielen erläutert.

Die Bestimmung des Lysins erfolgt mittels AminosJureanalyser.

Bevorzugt erfolgt die Kultivierung der Mutanten der Gattung Brf bacterium, die die erfindungsgemäße Merkmalskombination

— Aminosäure-Prototrophie

— Methioninsensibilität

— Resistenz gegen Lysinanaloga

— Resistenz gegen Aspartatanaloga aufweisen, in einem Medium, das als wesentliche komplexe N-Que!!o lediglich Maisquellwasser in den Konzentrationen von 1 bis 5% enthält.

Die Anfangskonzentration in Saccharose im Medium liegt im Bereich von 1 bis 18%. Die Saccharosezudosierungen erfolgen sowohl kontin zierlich als auch schubweise in Abhängigkeit vom jeweiligen C-Verbrauch, so daß weder eine C-Limitation noch eine durch C-Überschuß hervorgerufene Repression der Lysinsynthese eintritt. Die Statierung des pH-Wertes auf pH 5,0 bis 9,0 erfolgt mittels Ammoniakwasser, daß weder NH₄-Überschuß noch NH₄-Mangel die spezifische Produktbildung beeinträchtigen.

Es ist durch Mutagenese über mehrere Selektionszyklen gelungen, leistungsfähige lysinbildende Mutanten der Gattung Brevibaciei ium bereitzustellen, die die erfindungsgemäße Aufgabenstellung erfüllen.

Die Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium mit der erfindungsgemäßen Merkmalskombination sind in der Lage, in einem Nährmedium mit reduziertem Angebot an komplexen Stickstoffquellen bei hoher Konversion der C-Quelle in relativ kurzer Fermentationszeit hohe Lysinakkumulationen zu erreichen.

A usführungsbeispiele

Die Erfindung soll anhand folgender Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1:

Je ein Ansatz mit Zellmaterial von B.flavum ZF1 (ZIMET 11266) oder B. flavum ZF2 (ZIMET 11267) wird nach 48stündiger Kultivierung bei 30⁰C auf Medium A Schrägagar (1 % Bacto Pepton; 1 % Hefeextrakt; 0,5% NaCI, 2% Agar; pH 7,0) zur Beimpfung einer Vorkultur verwendet.

Die Vorkultur (5% Saccharose; 0,3% Harnstoff; 0,8% Hefuextrakt; 0,C5% KH₂PO₄; 0,05% K₂HPO₄; pH7,0) wird in 500-ml-Schüttelkolben bui einer Befüllungsmenge von 50ml für 18 Stunden bis 3O⁰C und 22OU/min kultiviert.

Als Inokulum für die Hauptkultur (50ml) werden 2 ml der Vorkultur verwendet. Die Hauptkultur hat folgende Zusammensetzung:

Saccharose	14%
Maisquellwasser (40%TS)	1%
(NH4I2SO4	4%
Hefeextrakt	0,1 %
KH2PO4	0,1 %
MgSO4 χ 7 H2O	400 mg/l
FeCI3 x 6 H2O	750mg/l
MnSO4XH2O	6mg/l
CaCO3	5%
Biotin	300pg/l
Thiamin-HCI	200pg/l
pH	7,0

Die Medien werden 20 Minuten bei 121⁰C autoklaviert. Die Sterilisation der Saccharose und des Maisquellwassers erfolgt getrennt von den übrigen Mediumbestandteilen. Die Vitamine werden der Kulturlösung gesondert als steril filterte Lösungen zugesetzt.

Die Hauptkultur wird in Schüttelkolben mit Weithals bei 3O⁰C + 2⁰C und 220 U/min für 120 Stunden kultiviert.

Durch die beschriebene Verfahrensweise kann die Mutante ZF 1 52,6g L-Lys HCI/I Kulturlösung und die Mutante ZF 2 54,9g L-Lys HCI/I Kulturlösung anreichern.

Beispiel 2:

Zellanzucht, Vorkultur und Sterilisation der Medien erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben.

300ml Vorkultur dienen zum beimpfen üiner Hauptkultur folgender Zusammensetzung:

Saccharose	4%
Maisquellwasser (40 %TS)	2,2 %
Hefeextrakt	0,1 %
(NH4I2SO4	4%
KH2PO4	0,1 %
MgSO4 x 7 H2O	400 mg/!
FeCI3 χ 6 H2O	750mg/l
MnSO4 χ H2O	6mg/l
Biotin	300Mg/l
Thiamin-HCI	200Mg/l
Sojaöl	0,1 %

Die Kultivierung erfolgt im LaborfermenterLF2 (Bruttovolumen 5I) 31 Befüllung bei einer Temperatu· von 3O⁰C ± 2⁰C und einer Belüftungsrate von 1 vvm. Die Rührerdretv jhl wird in Abhängigkeit des Gehaltes an Gelöstsauerstoff so eingestellt, daß eine Konzentration an pO₂ a 10% erreicht wird. Die Regulation des pH-Wertes im Bereich pH 5,0 bis 9,0 erfolgt mit 25%igem Ammoniakwasser.

Zur 12. Fermentationsstunde erfolgt eine Nachdosierung an Saccharose von 70g Saccharose/l Kulturlösung. Zwischen der 18.

bis 60. Fermentationsstunds wird Saccharose kontinuierlich zudosiert. Die Gesamtmenge beträgt 77 g Saccrnrose/i Kulturlösung.

Bei einer Konzentration an Biomasse von 25g/l reichert die Mutante ZF1 nach 65 Stunden 70,5g L-Lys · HCI/I Kulturlösung bei einem Konversionsgrad von 0,37 an. Die Raum-Zeit-Ausbeute beträgt 1,1g Lysin · HCI · 1"' · h~\

Beispiel 3:

Zellanzucht, Vorkultur und Sterilisation der Medien erf igen wie in Beispiel 1 beschrieben. 300ml Vorkuitur der Mutante ZF 1 dienen zum Beimpfen einer Hauptkultur folgender Zusammensetzung:

Saccharose 4%

Maisquellwasser (40%TS) 4%

KH₁PO₄ 0,2%

übrige Mediumbestandteile siehe Beispiel 2.

Die Kultivierung erfolgt im Laborfermenter LF2 mit den im Beispiel 2 angegebenen Parametern. Ab 10. Fermentationsstunde erfolgt die Nachdosierung von Saccharose in der Weise, daß die Saccharoso!<onzentration im Medium 4% beträgt. Nach 38 Stunden Kultivierung werden 60g L-Lys HCI/I Kulturlösung bei einem Konversionsgrad von 0,28 gebildet. Die Raum-Zeit-Ausbeute beträgt 1,57g L-Lys · HCI · r' · h~\

Beispiel 4:

Zellanzucht, vorkultur und Sterilisation der Medien erfo.gt wie in Beispiel 1 beschrieben. 300ml Vorkultur der Mutante ZF2 dienen zum Beimpfen einer Hauptkultur folgender Zusammensetzung:

Saccharose 4%

Maisquellwasser (40% TS) 5%

KH₂PO₄ 0,2%

übrige Mediumbestandteile siehe Beispiel 2.

Die Kultivierung erfolgt im Laborfermenter LF2 mit den im Beispiel 2 angegebenen Parametern. Nach Erreichen einer Saccharosekonzentration im Medium von 1% erfolgt die Nachdosierung von 140g Saccharose/l Kulturlösung. Ab

20. Fermentationsstunde erfolgt eine kontinuierliche Saccharosezudosierung.

Die Mutante ZF2 erreicht nach 67 Stunden Kultivierung 83,6g L-Lys · HCI/I Kulturlösung bei einem Konversionsgrad »τ τ 0,29.

Die Raum-Zoit-Ausbeute beträgt 1,25g L-Lys · HCI · Γ¹ · rT¹.

Beispiel 5:

Zellanzucht, Vorkulu ^r und ^erilisation der Medien erfolgen wie in Beisp^;„-i 1 beschrieben. 200ml Vorkultur der Mutante ZF2 dienen zum Beimpfen einer Hauptkultur folgender Zusammensetzung:

Saccharose 14%

Maisquellwasser(40%TS) 1%

KH₂PO₄ 0,05%

übrige mediumbesiänuiuiie siehe Beispiel 2.

Die Kultivierung erfolgt in einem ANKUM-Laborfermenter (Bruttovolumen 3I) mit 2I Befüllung mit den im Beispiel 2 angegebenen Parametern. Nach Erreichen einer Saccharosekonzentration im Medium von 8% erfolgt jeweils die Nachdosierung von 70g Saccharose/l Kulturlösung.

Die Mutante ZF2 reichert nach 60 Stunden Kultivierung 81,7g L-Lys · HCI/I Kulturlösung bei einem Konversionsgrad von 0,29

Die Raum-Zeit-Ausbeute beträgt 1,36g >.ys · HCI · 1"' · h~\

Beispiel 6:

Zellanzucht, Vorkultur und Sterilisation der Medien erfolgen wie Beispiel 1 beschrieben. 200ml Vorkultur der Mutante ZF1 dienen zum Beimpfen einer Hauptkultur folgender Zusammensetzung:

Saccharose 4%

Maisquellwasser(40%TS) 2,2%

KH₂PO₄ 0,2%

übrige Mediumbestandteile siehe Beispiel 2.

Die Kultivierung erfolgt in einem ANKUM-Laborfermonter (Bruttovolumen 3I) mit 21 Befüllung mit dem im Beispiel 2 angegebenen Parametern. Nach Eneichen einer Saccharosekonzentration im Medium von 1 % erfolgt eine schubweise Nachdosierung von Saccharose in 4stündlichen Intervallen, wobei jeweils 24g Saccharose/l Kulturlösung dosiert werden. Die Mutante ZF1 erreicht nach 52 Stunden Kultivierung 73,4g L-Lys HCI · 1"¹ Kulturlösung bei einem Konversionsgi ad von 0,35. Die erreichte Raum-Zeit-Ausbeute beträgt 1,41g L-Lys · HCI 1"¹ · h~\

Claims (5)

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von L-Lysin aus kohlenhydrathaltigen Rohstoffen mittels Mutanten der Gattung Brevibacterium, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mutanten folgende Merkmalskombination aufweisen

— Aminosäure-Prototrophie

— Methioninsensibilität

— Resistenz gegen Lysinanaloga

— Resistenz gegen Aspartatanaloga

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mutanten der Spezies Brevibacterium flavum angehören.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus (ZIMET 11266) bzw. (ZIMET 11267) verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Selektion verwendete Lysinanalogon im Rahmen der erfinderischen Merkmalskomb' -»ation S-(2-amino-ethyl)-L-cystein und das Aspartatanalogon L-Cysteinsulfinsäure ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einem Medium erfolgt, das als wesentliche komplexe N-Quelle lediglich Malsquellwasser in den Konzentrationen von 1 bis 5% enthält, daß die Anfangskonzentration uti Saccharose im Medium im Bereich von 1 bis 18% liegt, daß die Saccharosezudosierungen sowohl kontinuierlich als auch schubweise in Abhängigkeit vom jeweiligen C-Quellenverbrauch erfolgen und weder eine C-Limitation noch eine durch C-Überschu'J hervorgerufene Repression der Lysinsynthese eintritt und daß die Statierung des pH-Wertes im Bereich 5,0 bis 9,0 mittels Ammoniakwasser so erfolgt, daß weder NH₄-Überschuß noch NH₄-Mangel die spezifische Produktbildung beeinträchtigen.