DE60133304T2 - L-glutamine produzierende mikroorganismen und verfahren zur herstellung von l-glutamine unter verwendung derselben - Google Patents

L-glutamine produzierende mikroorganismen und verfahren zur herstellung von l-glutamine unter verwendung derselben Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue L-Glutamin produzierende Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin unter Verwendung derselben. Im besonderen betrifft die Erfindung Brevibacterium lactofermentum CJJA21 (KCCM-10222), resistent gegenüber Natriumazid, und Brevibacterium lactofermentum CJJA22 (KCCM-10223), resistent gegenüber D,L-α-Amino-n-Buttersäure: α-ABA), die beide fähig sind, L-Glutamin mit höherem Ertrag zu produzieren als die bekannten Stämme, sowie Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin unter Verwendung derselben.
  • STAND DER TECHNIK
  • L-Glutamin ist eine Aminosäure, die weit verbreitet ist als Arzneimittel, wie etwa. therapeutische Mittel bei gastroenterologischen Erkrankungen, Verstärker von Leber- und Hirnfunktionen, immunstärkende Mittel und therapeutische Mittel bei Magengeschwür und Alkoholismus, usw., Kosmetika, wie Feuchtigkeitscremes, usw., und Gesundheitskost, wie etwa Sportlernahrung und Nährstoffe für Patienten, usw..
  • Gemäß dem Stand der Technik wurde L-Glutamin aus Sulfaguanidin-resistenten Stämmen, Azaserin-resistenten Stämmen ( Japanese Patent Laid-Open No. Sho55-148094 ), Penicillin-sensitiven Stämmen ( Japanese Patent Laid-Open No. Hei04-088994 ), Tyrosin-Glutaminsäure (tyr-glu)-resistenten Stämmen ( Japanese Patent Laid-Open No. Hei02-186994 ) und ähnlichen gewonnen.
  • JP 56035981 offenbart einen Brevibacterium lactofermentum CJJA21 Stamm, der resistent gegenüber Natriumazid ist und der Glutaminsäure herstellt.
  • EP0379903 offenbart verschiedene Brevibacterium lactofermentum Stämme, die L-Aminosäuren produzieren und eine Resistenz gegenüber Glu oder Asp enthaltenden Peptiden sowie anderen nicht-peptidischen Inhibitoren besitzen, aber keine Resistenz gegenüber alpha-Aminobuttersäure.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder führten umfangreiche Studien durch, um neue Stämme zu entwickeln, die fähig sind, L-Glutamin mit hoher Produktivität zu produzieren. Wir überlegten, dass gegenüber Natriumazid, einem Atmungshemmstoff, oder gegenüber α-Aminobuttersäure, einem Analogon einer Aminosäure, Isoleucin, resistente Stämme eine erhöhte Produktivität von L-Glutamin haben würden. Daher überprüften wir Natriumazid oder α-Aminobuttersäure-resistente Stämme eines Ursprungsstammes, Brevibacterium fermentum KFCC-10680 (Korean Patent Publication No. 91-7818). Als Ergebnis erkannten wir, dass die Natriumazid- oder α-Aminobuttersäure-resistenten Stämme L-Glutamin mit höherem Ertrag herstellen als die bekannten Stämme und realisierten somit die vorliegende Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Mikroorganismen bereit, die L-Glutamin herstellen und Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin unter Verwendung derselben. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind Brevibacterium lactofermentum CJJA21 (KCCM-10222) mit einer Resistenz gegenüber Natriumazid und Brevibacterium lactofermentum CJJA22 (KCCM-10223) mit einer Resistenz gegenüber α-Aminobuttersäure, welche beide L-Glutamin mit hohem Ertrag herstellen. Weiterhin ist das Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin gemäß der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet durch die Aktivierung von Brevibacterium lactofermentum CJJA21 oder Brevibacterium lactofermentum CJJA22 gefolgt von der Kultivierung der aktivierten Stämme.
  • In der vorliegenden Erfindung wurden Mutanten durch die folgenden Methoden induziert: Brevibacterium lactofermentum KFCC-10680 wurde mit N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (NTG), einem gebräuchlichen Mutagen, behandelt und danach auf Minimalmedium (Medium 1) mit 500 mg/l Natriumazid ausplattiert, um Stämme zu erhalten, die eine Resistenz gegenüber 500 mg/l Natriumazid aufweisen.
  • Im besonderen wurde Brevibacterium lactofermentum KFCC-10680, der vorher durch Kultivierung auf einem Aktivierungsmedium (Medium 2) über 16 Stunden aktiviert worden war, für 14 Stunden auf einem Keimmedium [seed medium] (Medium 3) kultiviert, das bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert worden war. Danach wurden 5 ml des Kulturmediums mit 100 mM Citratpuffer gewaschen und dazu wurde NTG mit einer Endkonzentration von 200 mg/l gegeben. Nach 20 Minuten wurde das Medium mit 100 mM Phosphatpuffer gewaschen. Die mit NTG behandelten Stämme wurden auf einem Minimalmedium (Medium 1) ausplattiert, und die Sterberate wurde gemessen. Im Ergebnis war die Sterberate 85%.
  • Um Natriumazid-resistente Stämme zu erhalten, wurden die NTG-behandelten Stämme auf einem Minimalmedium (Medium 1), welches Natriumazid in einer Endkonzentration von 500 mg/l enthielt, ausplattiert und dann bei 30°C für 6 Tage kultiviert, um Natriumazid-resistente Stämme zu erhalten. Die erhaltenen resistenten Mutanten wurden in einem geschüttelten Erlenmeyerkolben mit einem Glutamin-Produktionsmedium (Medium 4) für 72 Stunden kultiviert, um dadurch einen Natriumazid-resistenten Stamm zu selektieren, der L-Glutamin mit 10% oder mehr höherem Ertrag als der Originalstamm, Brevibacterium lactofermentum KFCC-10680 herstellte. Der erhaltene Stamm wurde als CJJA21 bezeichnet. Brevibacterium lactofermentum CJJA21 wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 20. Oktober 2000 beim Korean Culture Center of Microorganisms, dessen Adresse Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul lautet, mit der Eingangsnummer KCCM-10222 hinterlegt.
  • Ferner wurde Brevibacterium lactofermentum KFCC-10680 in der im Wesentlichen selben Weise wie oben beschrieben aktiviert und kultiviert. Es wurde anschließend in der im Wesentlichen selben Weise wie oben beschrieben mit NTG behandelt. Um α-Aminobuttersäure-resistente Mutanten zu erhalten, wurden die NTG-behandelten Stämme auf Minimalmedium (Medium 1) ausplattiert, welches α-Aminobuttersäure in einer Endkonzentration von 15 g/l enthielt, und danach bei 30°C für 6 Tage kultiviert, um α-Aminobuttersäure-resistente Stämme zu erhalten. Die erhaltenen resistenten Mutanten wurden in einem geschüttelten Erlmeyerkolben mit einem Glutaminproduktionsmedium (Medium 4) für 72 Stunden kultiviert, um dadurch einen α-Aminobuttersäure-resistenten Stamm zu selektieren, der L-Glutamin mit 10% oder mehr höherem Ertrag als der Ursprungsstamm, Brevibacterium lactofermentum KFCC-10680 herstellte. Der erhaltene Stamm wurde als CJJA22 bezeichnet. Brevibacterium lactofermentum CJJA22 wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 20. Oktober 2000 beim Korean Culture Center of Micororganisms, dessen Adresse Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul lautet, mit der Eingangsnummer KCCM-10223 hinterlegt.
  • Kulturmedien, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, haben die folgenden Zusammensetzungen:
  • Medium 1: Minimalmedium
    • Glukose 1.0%, Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) 0.4%, Magnesiumsulfat (MgSO4·7H2O) 0.04%, Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) 0.1%, Harnstoff 0.1%, Thiamin-HCl 0.0001%, Biotin 200 μg/l, Agar, pH 7.0
  • Medium 2: Aktivierungsmedium
    • Fleischextrakt 1%, Polypepton 1%, Natriumchlorid (NaCl) 0.5%, Hefeextrakt 0.5%, Agar 2%, pH 7.2
  • Medium 3: Keimmedium [Seed medium]
    • Glukose 5%, Bactopepton 1%, Natriumchlorid (NaCl) 0.25%, Hefeextrakt 1%, Biotin 3 μg/l, Harnstoff 0.4%, pH 7.0
  • Medium 4: Glutaminproduktionsmedium
    • Glukose 4.0%, Ammoniumchlorid (NH4Cl) 3.0%, Sojaprotein Säurehydrolysat 0.3%, Kalziumkarbonat (CaCO3) 5%, Kalziumchlorid (CaCl2) 0.1%, Magnesiumsulfat (MgSO4·7H2O) 0.05%, Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) 0.15%, Kalium-monohydrogenphosphat (K2HPO4) 0.15%, Harnstoff 0.3%, Thiamin-HCl 2 mg/l, Biotin 5 μg/l, Eisensulfat (FeSO4·7H2O) 20 mg/l, Mangansulfat (MnSO4·H2O) 20 mg/l, Zinksulfat (ZnSO4·7H2O) 12 mg/l, pH 6.8
  • Natriumazid-Resistenz von Brevibacterium lactofermentum CJJA21 ist in der folgenden Tabelle 1-1 gezeigt. Tabelle 1-1
    Stamm Natriumazid-Konzentration (mg/l)
    0 100 200 300 500 800
    KFCC-10680 +++ + + - - -
    CJJA21 +++ +++ +++ +++ ++ -
    • +: Wachstum, -: kein Wachstum, Kultivierung bei 30°C für 6 Tage
  • α-Aminobuttersäure-Resistenz von Brevibakterium lactofermentum CJJA22 ist in der folgenden Tabelle 1-2 gezeigt. Tabelle 1-2
    Stamm α-Aminobuttersäure-Konzentration (g/l)
    0 1 5 10 15 20
    KFCC-10680 +++ ++ + - - -
    CJJA22 +++ +++ +++ +++ ++ -
    • +: Wachstum, -: kein Wachstum, Kultivierung bei 30°C für 6 Tage
  • BESTE ART UND WEISE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung wird besser durch die folgenden Beispiele verstanden werden. Der Fachmann wird jedoch bereitwillig anerkennen, dass die beschriebenen spezifischen Materialien und Ergebnisse nur veranschaulichend sind und nicht dazu gedacht sind oder so interpretiert werden sollten, die Erfindung, wie vollständiger in den später folgenden Ansprüchen beschrieben, zu beschränken.
  • Beispiel 1:
    • Stamm: Brevibacterium lactofermentum CJJA21
  • Fermentationsmedium:
    • Glukose 4.0%, Ammoniumchlorid (NH4Cl) 3.0%, Sojaprotein Säurehydrolysat 0.3%, Kalziumkarbonat (CaCO3) 5%, Kalziumchlorid (CaCl2) 0.1%, Magnesiumsulfat (MgSO4·7H2O) 0.05%, Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) 0.15%, Kalium-monohydrogenphosphat (K2HPO4) 0.15%, Harnstoff 0.3%, Thiamin·HCl 2 mg/l, Biotin 5 μg/l, Eisensulfat (FeSO4·7H2O) 20 mg/l, Mangansulfat (MnSO4·H2O) 20 mg/l, Zinksulfat (ZnSO4·7H2O) 12 mg/l, pH 6.8 (identisch zu Medium 4)
  • Fermentationsablauf und Ergebnis:
  • In einen geschüttelten 250 ml Erlenmeyerkolben wurden 20 ml des Fermentationsmediums injiziert. Das Medium wurde bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert. Dazu wurde 1 Impföse voll [1 loopful] der Stämme gegeben, welche durch Kultivierung auf einem Aktivierungsmedium (Medium 2) bei 30°C für 16 Stunden aktiviert worden waren, und anschließend unter Schütteln bei 30°C für 48 Stunden kultiviert. Die Zusammensetzung des fermentierten Mediums war wie folgt. Tabelle 2
    KFCC-10680 (Originalstamm) CJJA (Variante)
    Glutaminkonzentration (g/l) 12.6 14.5
  • Beispiel 2:
    • Stamm: Brevibacterium lactofermentum CJJA21
  • Fermentationsmedium:
    • Glukose 10%, Ammoniumchlorid (NH4Cl) 4.5%, Sojaprotein Säurehydrolysat 0.5%, Kalziumkarbonat (CaCO3) 5%, Kalziumchlorid (CaCl2) 0.1%, Magnesiumsulfat (MgSO4·7H2O) 0.05%, Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) 0.15%, Kalium-monohydrogenphosphat (K2HPO4) 0.15%, Harnstoff 0.3%, Thiamin (Thiamin·HCl) 2 mg/l, Biotin 5 μg/l, Eisensulfat (FeSO4·7 H2O) 20 mg/l, Mangansulfat (MnSO4·H2O) 20 mg/l, Zinksulfat (ZnSO4·7H2O) 12 mg/l, pH 6.8
  • Fermentationsablauf und Ergebnis:
  • In einen geschüttelten 250 ml Erlenmeyerkolben wurden 20 ml des Fermentationsmediums injiziert. Das Medium wurde bei 121°C für 15 Minuten sterilisiert. Dazu wurde 1 Impföse voll [1 loopful] der Stämme gegeben, welche durch Kultivierung auf einem Aktivierungsmedium (Medium 2) bei 30°C für 16 Stunden aktiviert worden waren, und anschließend unter Schütteln bei 30°C für 72 Stunden kultiviert. Die Zusammensetzung des fermentierten Mediums war wie folgt. Tabelle 3
    KFCC-10680 (Originalstamm) CJJA21 (Variante)
    Glutaminkonzentration (g/l) 31.5 37.1
  • Wie in Tabelle 3 gezeigt, produzierte Brevibacterium lactofermentum CJJA21 der vorliegenden Erfindung L-Glutamin mit 10% oder mehr höherem Ertrag als der Originalstamm, Brevibacterium lactofermentum KFCC-10680.
  • Beispiel 3:
  • Brevibacterium lactofermentum CJJA22 wurde gemäß des im wesentlichen selben Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Die Zusammensetzung des fermentierten Mediums war wie folgt. Tabelle 4
    KFCC-10680 (Originalstamm) CJJA (Variante)
    Glutaminkonzentration (g/l) 12.4 14.1
  • Beispiel 4:
  • Brevibacterium lactofermentum CJJA22 wurde gemäß des im wesentlichen selben Verfahrens wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Die Zusammensetzung des fermentierten Mediums war wie folgt. Tabelle 4
    KFCC-10680 (Originalstamm) CJJA (Variante)
    Glutaminkonzentration (g/l) 31.1 36.5
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann L-Glutamin mit höherem Ertrag gewonnen werden als im Stand der Technik. Das gewonnene L-Glutamin ist nützlich als Arzneimittel wie therapeutische Mittel bei gastroenterologischen Erkrankungen, Verstärker von Leber- und Gehirnfunktionen, immunstärkende Mittel, therapeutische Mittel gegen Magengeschwüre und Alkoholismus, usw., Kosmetika so wie Feuchtigkeitscremes, usw., und Gesundheitskost [health food] so wie Sportlernahrung und Nährstoffe für Patienten, usw..

Claims (3)

  1. Brevibacterium lactofermentum CJJA21, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Resistenz gegenüber Natriumazid aufweist und L-Glutamin produziert (Hinterlegungsnummer KCCM-10222).
  2. Brevibacterium lactofermentum CJJA22, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Resistenz gegenüber α-Aminobuttersäure aufweist und L-Glutamin produziert (Hinterlegungsnummer KCCM-10223).
  3. Verfahren zum Erzeugen von L-Glutamin, gekennzeichnet durch die Aktivierung von Brevibacterium lactofermentum CJJA21 gemäß Anspruch 1 oder Brevibacterium lactofermentum CJJA22 gemäß Anspruch 2, gefolgt von der Kultivierung der aktivierten Stämme.
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