DE60029701T2

DE60029701T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation und in Verbindung mit Fällung

Info

Publication number: DE60029701T2
Application number: DE60029701T
Authority: DE
Inventors: c/o Ajinomoto Co. Hiroshi Kawasaki-shi Izui; c/o Ajinomoto Co. Mika Kawasaki-shi Moriya; c/o Ajinomoto Co. Seiko Kawasaki-shi Hirano; c/o Ajinomoto Co. Yoshihiko Kawasaki-shi Hara; c/o Ajinomoto Co. Hisao Kawasaki-shi Ito; Kazuhiko c/o Zao Agri Matsui
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2007-08-09
Also published as: KR20010050133A; BR0003695B1; KR20080083103A; TW200427836A; EP1078989A2; CN100379871C; ATE335081T1; PE20010518A1; US20050227334A1; KR100866479B1; CN1292421A; RU2261272C2; TWI250211B; EP1078989B1; US20070134773A1; CN101230366A; KR20070106959A; EP1078989A3; DE60029701D1; US7015010B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter gleichzeitiger Ausfällung. L-Glutaminsäure wird als Würzmittel und dergleichen weit verbreitet eingesetzt.
L-Glutaminsäure wird hauptsächlich durch Fermentation unter Verwendung sogenannter L-Glutaminsäure produzierender coryneformer Bakterien der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium oder von Mutanten davon hergestellt (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, S. 195–215, 1986). Als Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Verwendung anderer bakterieller Stämme kann ein Verfahren unter Einsatz eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Streptomyces, Penicillium oder dergleichen (U.S. Patent Nr. 3,220,929), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida oder dergleichen (U.S. Patent Nr. 3,563,857), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (derzeit als Enterobacter aerogenes bezeichnet) oder dergleichen (japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 32-9393), ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stammes von Escherichia coli (japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-244970) und dergleichen bekannt. Zusätzlich haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Produzieren von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Klebsiella, Erwinia oder Pantoea vorgeschlagen (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2000-106869).
Außerdem sind verschiedene Techniken zum Verbessern der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Erhöhen der Aktivitäten der L-Glutaminsäurebiosyntheseenzyme durch Einsatz rekombinanter DNA-Techniken offenbart worden. Beispielsweise wurde berichtet, daß die Einführung eines Gens, das für Citratsynthase aus Escherichia coli oder Corynebacterium glutamicum codiert, für die Erhöhung der Fähigkeit zur L-Glutaminsäure produktion in Corynebacterium oder Brevibacterium wirksam ist (japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7-121228). Zudem offenbart die offengelegt japanische Patentanmeldung 61-268185 eine Zelle, die rekombinante DNA trägt, die ein Glutamatdehydrogenasegen aus Corynebacterium enthält. Außerdem offenbart die offengelegt japanische Patentanmeldung Nr. 63-214189 ein Verfahren zur Erhöhung der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Amplifizieren eines Glutamatdehydrogenasegens, eines Isocitratdehydrogenasegens, eines Aconitathydratasegens und eines Citratsynthasegens.
Obwohl die L-Glutaminsäureproduktivität deutlich erhöht worden ist, indem die vorstehend genannten Mikroorganismen gezüchtet wurden oder die Produktionsverfahren verbessert wurden, ist die Entwicklung von Verfahren für eine effizientere Produktion von L-Glutaminsäure bei niedrigen Kosten erforderlich, um den steigenden Bedarf in der Zukunft zu befriedigen.
Es ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Fermentation durchgeführt wird, während die in der Kultur angehäufte L-Aminosäure kristallisiert (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 62-288). In diesem Verfahren wird die L-Aminosäurekonzentration in der Kultur durch Ausfällen der angehäuften L-Aminosäure in der Kultur unter einem bestimmten Wert gehalten. Genauer gesagt wird L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Leucin während der Fermentation durch Einstellen der Temperatur und des pH-Wertes der Kultur oder durch Zugeben eines oberflächenaktiven Mittels zu dem Medium ausgefällt.
Während ein Verfahren zum Durchführen einer Fermentation unter Ausfällung einer L-Aminosäure wie vorstehend beschrieben, bekannt ist, sind die Aminosäuren, die für dieses Verfahren geeignet sind, solche mit relativ geringer Wasserlöslichkeit, wobei kein Beispiel einer Anwendung dieses Verfahrens auch hoch wasserlösliche Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure, bekannt ist. Zudem muß das Medium einen niedrigen pH-Wert haben, um L-Glutaminsäure auszufällen. L-Glutaminsäure produzierende Bakterien, wie die vorstehend genannten, können jedoch unter sauren Bedingungen nicht wachsen, so daß die L-Glutaminsäurefermentation unter neutralen Bedingungen durchgeführt wird (U.S. Patent Nr. 3,220,929 und 3,032,474; K. C. Chao & J. W. Foster, J. Bacteriol., 77, S. 715–725 (1959)). Somit ist die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter gleichzeitiger Ausfällung nicht bekannt. Außerdem ist bekannt, daß das Wachstum der meisten acidophilen Bakterien durch organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure und Bernsteinsäure, inhibiert wird (Yasuro Oshima, Herausgeber, "Extreme Environment Microorganism Handbook", S. 239, Science Forum; R. M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, S. 597–599 (1967) etc.). Deshalb wird angenommen, daß viele Mikroorganismen für L-Glutaminsäure, welche auch eine organische Säure ist, unter sauren Bedingungen zugänglich sind, und es gibt keinen Bericht darüber, daß eine Suche nach Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure unter sauren Bedingungen versucht worden ist.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Unter den vorstehend beschriebenen Umständen ist eine erfindungsgemäße Aufgabe, einen Mikroorganismus, der L-Glutaminsäure bei einem niedrige pH-Wert produziert, zu suchen und zu züchten sowie ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure unter Einsatz eines Mikroorganismus durch Fermentation unter gleichzeitigem Ausfällen von L-Glutaminsäure bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben während der Untersuchungen zur Verbesserung der L-Glutaminsäureproduktivität durch Fermentation gefunden, dass die Hemmung der Produktion durch in einem Medium in hoher Konzentration angehäufte L-Glutaminsäure eines der Hindernisse bei der Verbesserung der Produktivität ist. Beispielsweise haben Zellen ein Ausscheidungssystem und ein Aufnahmesystem für L-Glutaminsäure. Wenn jedoch L-Glutaminsäure, die einmal in das Medium ausgeschieden worden ist, wieder in die Zellen aufgenommen wird, sinkt nicht nur die Produktionseffizienz, es werden auch L-Glutaminsäurebiosynthesereaktionen gehemmt. Um die Hemmung der Produktion durch eine solche Anhäufung von L-Glutaminsäure in hoher Konzentration zu vermeiden, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen gescreent, die unter sauren Bedingungen und in Anwesenheit einer hohen Konzentration von L-Glutaminsäure proliferieren können. Als Ergebnis haben sie erfolgreich Mikroorganismen mit solchen Eigenschaften aus dem Boden isoliert und somit die vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit:

(1) Ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem flüssigen Medium, dessen pH-Wert so eingestellt ist, daß L-Glutaminsäure ausfällt, unter Bildung und Anhäufung von L-Glutaminsäure und Ausfällung von L-Glutaminsäure in dem eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium umfaßt, wobei der pH-Wert 3,0 bis 5,0 ist, wobei der Mikroorganismus eine Kohlenstoffquelle bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und die Kohlenstoffquelle enthält, metabolisieren kann und die Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure in einer Menge anzuhäufen, die die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration in dem flüssigen Medium bei dem pH-Wert entspricht.
(2) Das Verfahren nach (1), wobei der Mikroorganismus mindestens eine der folgenden Eigenschaften hat:
(a) der Mikroorganismus hat eine erhöhte Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert; und
(b) der Mikroorganismus hat eine verringerte oder keine Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion katalysiert, die von einem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure abzweigt und eine andere Verbindung als L-Glutaminsäure herstellt.
(3) Das Verfahren nach (2), wobei das Enzym, das die Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert, mindestens eines ist, das unter Citratsynthase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase und Glutamatdehydrogenase ausgewählt ist.
(4) Das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei das Enzym, das die Reaktion katalysiert, die von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure abzweigt und die andere Verbindung als L-Glutaminsäure herstellt, α-Ketoglutaratdehydrogenase ist.
(5) Das Verfahren nach einem der Punkte (1) bis (4), wobei der Mikroorganismus zur Gattung Enterobacter gehört.
(6) Das Verfahren nach (5), wobei der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans ist.
(7) Das Verfahren nach (6), wobei der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans (AJ13601) FERM BP-7207 ist.
(8) Das Verfahren nach (6), wobei der Mikroorganismus eine Mutation hat, die eine geringere extrazelluläre Sekretion eines viskosen Materials als ein Wildtypstamm verursacht, wenn er in einem Medium kultiviert wird, das ein Saccharid enthält.
(9) Ein Verfahren zum Screenen auf einen Mikroorganismus, welches das Screenen eines Mikroorganismus, der für die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Ausfällung von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium bei pH 3,0–5,0 geeignet ist, umfaßt, welches das Einimpfen einer Probe, die Mikroorganismen enthält, in ein saures Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und eine Kohlenstoffquelle enthält, und das Selektieren eines Stammes umfaßt, der die Kohlenstoffquelle metabolisieren kann.
(10) Das Verfahren nach (9), wobei ein Stamm, der in dem Medium wachsen kann, als der Stamm ausgewählt wird, der die Kohlenstoffquelle metabolisieren kann.
(11) Ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Beginnen der Kultivierung eines Mikroorganismus in einem flüssigen Medium bei einem neutralen pH-Wert und das Beenden der Kultivierung bei einem pH-Wert, bei dem L-Glutaminsäure ausgefällt wird, umfaßt, wobei der Mikroorganismus eine Kohlenstoffquelle bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und die Kohlenstoffquelle enthält, metabolisieren und L-Glutaminäsure in einer Menge anhäufen kann, welche die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration in dem flüssigen Medium bei dem pH-Wert entspricht.
(12) Das Verfahren nach (11), wobei der pH-Wert der Kultur durch Einführen von Ammoniakgas in das Medium kontrolliert wird.
(13) Ein Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-7207.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Ausfällung von L-Glutaminsäure hergestellt werden. Als Ergebnis wird L-Glutaminsäure in dem Medium unter einer bestimmten Konzentration gehalten, und L-Glutaminsäure kann, ohne einer Produkthemmung durch L-Glutaminsäure zu unterliegen, in hoher Konzentration produziert werden.
KURZE ERKLÄRUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Restriktionsenzymkarte eines von Enterobacter agglomerans abgeleiteten DNA-Fragments in pTWVEK101.
2 zeigt den Vergleich einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz eines von Enterobacter agglomerans abgeleiteten sucA-Gens und eines von Escherichia coli abgeleiteten sucA-Gens abgeleitet ist (oben: Enterobacter agglomerans; unten: Escherichia coli; dasselbe gilt im Folgenden).
3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen, die von einer Nucleotidsequenz eines von Enterobacter agglomerans und eines von Escherichia coli abgeleiteten sucB-Gens abgeleitet sind.
4 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen, die von einem von Enterobacter agglomerans und von Escherichia coli abgeleiteten sucC-Gen abgeleitet sind.
5 zeigt den Vergleich von Aminosäuresequenzen, die von Nukleotidsequenzen eines von Enterobacter agglomerans und von Escherichia coli abgeleiteten sdhB-Gens abgeleitet sind.
6 zeigt die Konstruktion des Plasmids pMWCPG, das ein gltA-Gen, ein ppc-Gen und ein gdhA-Gen enthält.
7 zeigt die Konstruktion des Plasmids RSF-Tet, das ein Replikationsursprung des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich und ein Tetracyclin-Resistenzgen enthält.
8 zeigt die Konstruktion des Plasmids RSFCPG, das einen Replikationsursprung des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich, ein Tetracyclin-Resistenzgen, ein gltA-Gen, ein ppc-Gen und ein gdhA-Gen enthält.
9 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSTVCB, welches ein gltA-Gen enthält.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird die Erfindung eingehend beschrieben.
Der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure ist ein Mikroorganismus, der (1) eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure in einer Sättigungskonzentration und die Kohlenstoffquelle enthält, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 metabolisieren kann und (2) die Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure in einer Länge anzuhäufen, welche die Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure in dem flüssigen Medium bei dem vorstehend genannten pH-Wert übersteigt.
Die "Sättigungskonzentration" bedeutet eine Konzentration von L-Glutaminsäure, die in dem flüssigen Medium aufgelöst ist, wenn das flüssige Medium mit L-Glutaminsäure gesättigt ist.
Im folgenden wird ein Verfahren zum Screenen eines Mikroorganismus beschrieben, der eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure in einer Sättigungskonzentration und die Kohlenstoffquelle enthält, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 metabolisieren kann. Eine Mikroorganismen enthaltende Probe wird in ein flüssiges Medium, das L-Glutaminsäure in einer Sättigungskonzentration und eine Kohlenstoffquelle enthält, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 eingeimpft, und der Stamm, der die Kohlenstoffquelle metabolisiert, wird selektiert. Der L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus wird für die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation eingesetzt, wobei gleichzeitig die L-Glutaminsäure ausgefällt wird. Wenn der pH-Wert zu hoch ist, wird es schwierig zu bewirken, daß der Mikroorganismus L-Glutaminsäure in einer für die Ausfällung ausreichenden Menge zu produzieren. Deshalb ist der pH-Wert in dem vorstehend genannten Bereich.
Wenn der pH-Wert einer wäßrigen Lösung, die L-Glutaminsäure enthält, gesenkt wird, fällt die Löslichkeit der L-Glutaminsäure um den pKA-Wert der γ-Carboxygruppe deutlich ab (4,25, 25°C). Die Löslichkeit wird am isoelektrischen Punkt (pH 3,2) am niedrigsten, und L-Glutaminsäure, welche die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration entspricht, wird ausgefällt. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Mediums wird L-Glutaminsäure in einer Menge von 10–20 g/l bei pH 3,2, 30–40 g/l bei pH 4,0 und 50–60 g/l bei pH 4,7 bei etwa 30°C gelöst. Der pH-Wert wird nicht unter 3,0 gesenkt, weil die L-Glutaminsäure ausfällende Wirkung ihre Obergrenze erreicht, wenn der pH-Wert unter einen bestimmten Wert fällt.
Zusätzlich bedeutet der Ausdruck, daß ein Mikroorganismus "eine Kohlenstoffquelle metabolisieren kann", das er proliferieren kann oder eine Kohlenstoffquelle nutzen kann, selbst wenn er nicht proliferieren kann, d.h. daß dies darauf hinweist, daß er eine Kohlenstoffquelle, wir Zucker oder organische Säuren, katabolisiert. Genauer gesagt, kann, wenn beispielsweise ein Mikroorganismus proliferiert, wenn er in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure in einer Sättigungskonzentration enthält, bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt pH 4,0 bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise bei 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, dieser Mikroorganismus die Kohlenstoffquelle in dem Medium metabolisiert. Wenn außerdem beispielsweise ein Mikroorganismus eine Kohlenstoffquelle nutzt, obwohl der Mikroorganismus nicht proliferieren kann, wenn er in einem synthetischen flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration enthält, bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt bei pH 4,0, bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, ist der Mikroorganismus ein Mikroorganismus, der die Kohlenstoffquelle in dem Medium metabolisieren kann.
Der Mikroorganismus, der eine Kohlenstoffquelle metabolisieren kann, umfaßt einen Mikroorganismus, der in dem vorstehend genannten flüssigen Medium wachsen kann.
Außerdem bedeutet der Ausdruck, daß ein Mikroorganismus "wachsen kann", daß er proliferieren kann oder L-Glutaminsäure produzieren kann, selbst wenn er nicht proliferieren kann. Wenn beispielsweise ein Mikroorganismus proliferiert, wenn er in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration enthält, bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt bei pH 4,0, bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, kann dieser Mikroorganismus in dem Medium wachsen. Wenn außerdem beispielsweise ein Mikroorganismus die Menge an L-Glutaminsäure in einem synthetischen flüssigen Medium erhöht, selbst wenn der Mikroorganismus nicht proliferieren kann, wenn der Mikroorganismus in dem synthetischen flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration enthält, bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt bei pH 4,0 bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, ist dieser Mikroorganismus ein Mikroorganismus, der in dem Medium wachsen kann.
Die vorstehend beschriebene Selektion kann zweimal oder mehrere Male unter denselben Bedingungen oder unter Änderung des pH-Werts oder der Konzentration der L-Glutaminsäure wiederholt werden. Eine Selektion auf ein frühes Stadium kann in einem Medium, das Glutaminsäure in einer Konzentration unter der Sättigungskonzentration enthält, durchgeführt werden, und danach kann die anschließende Selektion in einem Medium durchgeführt werden, daß L-Glutaminsäure in einer Sättigungskonzentration enthält. Außerdem können Stämme mit gewünschten Eigenschaften, wie vorteilhafter Proliferationsrate, selektiert werden.
Neben der vorstehend beschriebenen Eigenschaf hat der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus die Fähigkeit, L-Glutaminsäure in einer Menge anzuhäufen, welche die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium entspricht. Der pH-Wert des vorstehend genannten flüssigen Mediums ist vorzugsweise derselbe oder ähnlich wie derjenige des Mediums, das für das Screenen eines Mikroorganismus mit der vorstehend genannten Eigenschaft (1) eingesetzt wird. Üblicherweise wird ein Mikroorganismus für L-Glutaminsäure bei einer hohen Konzentration mit abnehmenden pH-Wert anfälliger. Deshalb ist es bevorzugt, daß der pH-Wert im Hinblick auf die Unempfindlichkeit gegen L-Glutaminsäure nicht niedrig ist, wobei jedoch ein niedriger pH-Wert im Hinblick auf die Produktion von L-Glutaminsäure, die von deren Ausfällung begleitet wird, bevorzugt ist. Um diese Bedingungen zu erfüllen, kann der pH-Wert bereits von 3 bis 5, vorzugsweise 4 bis 5, stärker bevorzugt 4 bis 4,7, noch stärker bevorzugt 4 bis 4,5, insbesondere bevorzugt 4,0 bis 4,3 sein.
Als in der vorliegenden Erfindung eingesetzter Mikroorganismus oder Züchtungsmaterial davon können Mikroorganismen der Gattung Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces oder dergleichen genannt werden. Unter diesen sind Mikroorganismen der Gattung Enterobacter bevorzugt. Im folgenden wird der erfindungsgemäße Mikroorganismus hauptsächlich in bezug auf Mikroorganismen der Gattung Enterobacter beschrieben, die vorliegende Erfindung kann jedoch auch auf Mikroorganismen anderer Gattungen angewandt werden und ist nicht auf Enterobacter beschränkt.
Als Mikroorganismus der Gattung Enterobacter kann Enterobacter agglomerans, vorzugsweise der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355, genannt werden. Dieser Stamm wurde aus der Erde in Iwata-shi, Shizuoka, Japan, als ein Stamm isoliert, der in einem Medium, das L-Glutaminsäure und eine Kohlenstoffquelle enthält, bei niedrigem pH-Wert proliferieren kann.
Die physiologischen Eigenschaften von AJ13355 sind nachstehend genannt:

(1) Gramfärbung: negativ
(2) Verhalten gegen Sauerstoff: fakultativ anaerob
(3) Catalase: positiv
(4) Oxidase: negativ
(5) Fähigkeit zur Nitratreduktion: negativ
(6) Voges-Proskauer-Test: positiv
(7) Methylrottest: negativ
(8) Urease: negativ
(9) Indolherstellung: positiv
(10) Beweglichkeit: beweglich
(11) H₂S-Produktion in TSI-Medium: schwach aktiv
(12) β-Galactosidase: positiv
(13) Saccharid-assimilierende Eigenschaft: Arabinose: positiv Saccharose: positiv Lactose: positiv Xylose: positiv Sorbitol: positiv Inositol: positiv Trehalose: positiv Maltose: positiv Glucose: positiv Adonitol: negativ Raffinose: positiv Salicin: negativ Melibiose: positiv
(14) Glycerose-assimilierende Eigenschaft: positiv
(15) Assimilation von organischen Säuren: Zitronensäure: positiv Weinsäure: negativ Glycolsäure: positiv Essigsäure: positiv Äpfelsäure: negativ
(16) Arginindehydratase: negativ
(17) Ornithindecarboxylase: negativ
(18) Lysindecarboxylase: negativ
(19) Phenylalanindeaminase: negativ
(20) Pigmentbildung: gelb
(21) Fähigkeit zur Verflüssigung von Gelatine: positiv
(22) Wachstums-pH-Wert: Wachstum möglich bei pH 4, gutes Wachstum bei pH 4,5 bis 7
(23) Wachstumstemperatur: gutes Wachstum bei 25°C, gutes Wachstum bei 30°C, gutes Wachstum bei 37°C, Wachstum möglich bei 42°C, Wachstum unmöglich bei 45°C.

Auf der Grundlage dieser bakteriologischen Eigenschaften wurde AJ13355 als Enterobacter agglomerans bestimmt.
Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (derzeit International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) am 19. Februar 1998 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-16644. Er wurde dann unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens am 11. Januar 1999 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-6614.
Der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus kann ein Mikroorganismus mit der ursprünglichen Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure oder mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure sein, die durch Züchtung unter Verwendung einer Mutagenesebehandlung oder einer rekombinanten DNA-Technologie übertragen oder verstärkt worden ist.
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure kann beispielsweise durch Erhöhen der Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert, übertragen oder verstärkt werden. Die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure kann auch durch Verringern oder Ausschalten der Aktivität eines Enzyms, das eine vom Biosyntheseweg für L-Glutaminsäure abzweigende Reaktion katalysiert und eine andere Verbindung als L-Glutaminsäure erzeugt, verstärkt werden.
Als Beispiel für ein Enzym, das eine Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert, kann Glutamatdehydrogenase (im Folgenden auch als "GDH" bezeichnet), Glutaminsynthetase, Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase (im Folgenden auch als "CS" bezeichnet), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (im Folgenden auch als "PEPC" bezeichnet), Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatkinase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogense, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase, Phosphofructokinase und Glucosephosphatisomerase genannt werden. Unter diesen Enzymen sind eines, zwei oder drei unter CS, PEPC und GDH bevorzugt. Außerdem ist es bevorzugt, daß die Aktivitäten aller drei Enzyme, nämlich CS, PEPC und GDH, in dem L-Glutaminsäure anhäufenden Mikroorganismus verstärkt sind. Insbesondere ist CS von Brevibacterium lactofermentum bevorzugt, da es keiner Inhibition durch α-Ketoglutarsäure, L-Glutaminsäure und NADH unterworfen ist.
Um die Aktivität von CS, PEPC oder GDH zu verstärken, kann beispielsweise ein für CS, PEPC oder GDH codierendes Gen auf ein geeignetes Plasmid kloniert werden, und es kann ein Wirtsmikroorganismus mit dem erhaltenen Plasmid transformiert werden. Die Kopienzahl des für CS, PEPC oder GDH codierenden Gens (im Folgenden als "gltA-Gen", "ppc-Gen", bzw. "gdhA-Gen" bezeichnet) in dem transformierten Stamm erhöht sich dadurch, was zu einer Erhöhung der Aktivität von CS, PEPC oder GDH führt.
Die klonierten gltA-, ppc- und gdhA-Gene werden in den vorstehend genannten Ausgangsstamm allein oder in willkürlicher Kombination von zwei oder drei der Gene eingeführt. Wenn zwei oder drei Arten der Gene eingeführt werden, können zwei oder drei Arten der Gene auf ein Plasmid kloniert und in die Wirtszelle eingeführt werden, oder sie können auch zwei oder drei unterschiedliche Plasmide, die koexistieren können, kloniert werden und in die Wirtszelle eingeführt werden.
Zwei oder mehr Arten von Genen, die für dasselbe Enzym codieren, jedoch von unterschiedlichen Mikroorganismen abgeleitet sind, können in dieselbe Wirtszelle eingeführt werden.
Die vorstehend beschriebenen Plasmide sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie in einer Zelle eines Mikroorganismus, der beispielsweise zur Gattung Enterobacter gehört, autonom replizierbar sind. Als Beispiele können pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, mMW218, pACYC177 und pACYC184 genannt werden. Daneben können auch Vektoren von Phagen-DNA eingesetzt werden.
Die Transformation kann beispielsweise durch das Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), durch das Verfahren, bei dem die Durchlässigkeit der Empfängerzellen für DNA durch Behandlung der Zellen mit Calciumchlorid erhöht wird (Mandel M. und Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), oder durch Elektroporation (Miller J. H., "A Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) durchgeführt werden.
Die Aktivität von CS, PEPC oder GDH kann auch dadurch erhöht werden, daß die Anwesenheit mehrerer Kopien des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens auf der chromosomalen DNA des vorstehen genannten Ausgangsstammes, der als Wirt vorgesehen ist, zugelassen wird. Um mehrere Kopien des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens auf die chromosomale DNA eines Mikroorganismus der Gattung Enterobacter einzuführen, kann eine Sequenz, von der mehrere Kopien auf der chromosomalen DNA vorhanden sind, wie repetitive DNA und umgekehrte Wiederholungen, die an einem Ende eines transponierbaren Elements vorhanden sind, eingesetzt werden. Alternativ dazu können mehrere Kopien des Gens in die chromosomale DNA dadurch eingeführt werden, daß der Transfer eines Transposons, welches das gltA-Gen, das ppc-Gen oder das gdhA-Gen enthält, ausgenutzt wird. Als Ergebnis wird die Kopienzahl eines gltA-Gens, ppc-Gens oder gdhA-Gens in einer transformierten Zelle erhöht, so daß die Aktivität von CS, PEPC oder GDH erhöht wird.
Als Organismen, die als Quelle des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens, deren Kopienzahl erhöht werden soll, dienen, können beliebige Organismen eingesetzt werden, solange sie die Aktivität von CS, PEPC oder GDH haben. Unter anderem sind Bakterien, welche Prokaryoten sind, beispielsweise solche der Gattung Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium oder Bacillus bevorzugt. Spezifische Beispiele sind Escherichia coli und Brevibacterium lactofermentum. Das gltA-Gen, das ppc-Gen und das gdhA-Gen können aus der chromosomalen DNA der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen erhalten werden.
Das gltA-Gen, da ppc-Gen und das gdhA-Gen können unter Verwendung eines mutierten Stammes, dem die Aktivität von CS, PEPC oder GDH fehlt, zur Isolierung eines DNA-Fragments, das die Auxotrophie supplementiert, von der chromosomalen DNA des vorstehend genannten Mikroorganismus erhalten werden. Da außerdem die Nucleotidsequenzen dieser Gene aus Escherichia und Corynebacterium bereits bekannt sind (Biochemistry, 22, S. 5243–5249, (1983); J. Biochem., 95, S. 909–916, (1984); Gene, 27, S. 193–199, (1984); Microbiology, 140, S. 1818–1828, (1994); Mol. Gen. Genet., 218, S. 330–339, (1989), Molecular Microbiology, 6, S. 317–326, (1992)), können sie durch PCR unter Einsatz von Primern, die auf der Grundlage jeder Nukleotidsequenz synthetisiert worden sind, und der chromosomalen DNA als Matrize erhalten werden.
Die Aktivität von CS, PEPC oder GDH kann auch durch Verstärken der Expression des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens neben der vorstehend genannten Amplifikation der Gene erhöht werden. Beispielsweise kann die Expression durch Ersetzen eines Promotors für das gltA-Gen, das ppc-Gen oder das gdhA-Gen durch einen stärkeren Promotor verstärkt werden. Beispielsweise sind als stärkere Promotoren der lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor, P_r-Promotor und P_L-Promotor des Phagen lamda bekannt. Das gltA-Gen, das ppc-Gen und das gdhA-Gen, deren Promotor ersetzt wird, werden auf ein Plasmid kloniert und in den Wirtsmikroorganismus eingeführt, oder sie werden in die chromosomale DNA des Wirtsmikroorganismus unter Einsatz repetitiver DNA, umgekehrter Wiederholungen oder Transposons eingeführt.
Die Aktivität von CS, PEPC oder GDH kann auch dadurch erhöht werden, daß der Promotor des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens auf dem Chromoson durch einen stärkeren Promotor ersetzt wird (vergl. WO87/03006 und die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 61-268183), oder das ein stärkerer Promotor stromaufwärts der codierenden Sequenz jedes Gens eingeführt wird (vergl. Gene, 29, S. 231–241 (1984)). Im Speziellen kann die homologe Rekombination zwischen dem gltA-Gen, dem ppc-Gen oder dem gdhA-Gen, deren Promotor durch einen stärkeren Promotor ersetzt ist, oder der DNA, die einen Teil davon enthält, und dem korrespondierenden Gen auf dem Chromosom durchgeführt werden.
Beispiele des Enzyms, das die Reaktion katalysiert, die von dem Bisyntheseweg für L-Glutaminsäure abzweigt und eine andere Verbindung als L-Glutaminsäure erzeugt, umfassen α-Ketoglutaratdehydrogenase (im folgenden auch als "αKGDH"), Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroxysäuresynthase, Acetolactatsynthase, Formatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, Glutamatdecarboxylase und 1-Pyrrolindehydrogenase. Unter diesen ist αKGDH bevorzugt.
Um die Aktivitäten der vorstehend genannten Enzyme in Enterobacter agglomerans zu senken oder zu eliminieren, können Mutationen zum Senken oder Eliminieren der intrazellulären Aktivität der Enzyme in die Gene der vorstehend genannten Enzyme durch übliche Mutageneseverfahren oder gentechnisches Verfahren eingeführt werden.
Beispiele der Mutagenesebehandlung umfassen Verfahren unter Einsatz von Bestrahlung mit Röntgenstrahlung oder UV-Strahlung und Verfahren unter Einsatz der Behandlung mit einem Mutagenesemittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Die Stelle des Gens, an der die Mutation eingeführt wird, kann in der für ein Enzym codierenden Region oder in einer Region für die Regulation der Expression, wie in einem Promotor, eingeführt werden.
Beispiele der gentechnischen Verfahren umfassen Verfahren unter Einsatz der Genrekombination, Transduktion und Zellfusion. Beispielsweise wird ein Arzneimittelresistenzgen in ein kloniertes Zielgen eingeführt, um ein Gen herzustellen, das seine Funktion verloren hat (defektives Gen). Danach wird das defektive Gen in eine Zelle eines Wirtsmikroorganismus eingeführt, und das Zielgen auf dem Chromosom wird durch das vorstehend genannte defektive Gen unter Einsatz der homologen Rekombination ersetzt (Genzerstörung).
Die Senkung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität des Zielenzyms und das Ausmaß der Absenkung der Aktivität können durch Messen der Enzymaktivität eines Zellextrakts oder einer gereinigten Fraktion davon, die von dem Stamm erhalten wird, und Vergleichen mit der Aktivität eines Wildtypstamms bestätigt werden. Beispielsweise kann die αKGDH-Aktivität durch das Verfahren von Reed et al. (Reed L. J. und Mukherjee B. B., Methods in Enzymology, 13, S. 55–61 (1969)) gemessen werden.
In Abhängigkeit von dem Zielenzym kann der mutierte Zielstamm auf der Grundlage des Phänotyps des mutierten Stammes ausgewählt werden. Beispielsweise kann ein mutierter Stamm, in dem die α-KGDH-Aktivität verringert oder ausgeschaltet ist, nicht wachsen oder zeigt unter aeroben Kulturbedingungen eine deutlich verringerte Proliferationsrate in einem Minimalmedium, das Glycose enthält, oder in einem Minimalmedium, das Essigsäure oder L-Glutaminsäure als die einzige Kohlenstoffquelle enthält. Eine normale Proliferation wird jedoch sogar unter denselben Bedingungen ermöglicht, indem Bernsteinsäure oder Lysin, Methionin und Diaminopimelinsäure zu einem Glucose enthaltenden Minimalmedium gegeben werden. Unter Ausnutzung dieser Phänomene als Indikatoren kann ein mutierter Stamm mit verringerter oder ausgeschalteter α-KGDH-Aktivität selektiert werden.
Außerdem werden Verfahren, wie das Klonieren von Genen und das Verdauen und Ligieren von DNA, Transformation und derglei chen, eingehend in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben.
Als spezifisches Beispiel eines mutierten Stammes, dem die αKDGH-Aktivität fehlt oder der eine verringerte αKDGH-Aktivität hat, erhalten wie vorstehend beschrieben, kann Enterobacter agglomerans AJ13356 genannt werden. Enterobacter agglomerans AJ13356 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (derzeit International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) am 19. Februar 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-16645 hinterlegt. Er wurde dann unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens am 11. Januar 1999 in eine internationale Hinterlegung unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6615 hinterlegt. Enterobacter agglomerans AJ13356 hat als Ergebnis der Zerstörung des Gens für die αKGDH-E1-Untereinheit (sucA) keine αKGDH-Aktivität.
Wenn Enterobacter agglomerans, welcher der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismus ist, in einem Medium kultiviert wird, das ein Saccharid enthält, wird Schleim ausgeschieden, der gelegentlich zu einer geringen Kultivierungseffizienz führt. Wenn Enterobacter agglomerans mit einer solchen Eigenschaft eingesetzt wird, ist es daher bevorzugt, einen mutierten Stamm zu verwenden, der im Vergleich zu einem Wildtypstamm weniger Schleim ausscheidet. Beispiele für Mutagenesebehandlungen umfassen Verfahren unter Einsatz der Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen und Verfahren unter Einsatz eines Mutagenesemittels, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Ein mutierter Stamm mit verringerter Ausscheidung von Schleim kann durch Einimpfen von mutagenisierten Bakterienzellen in ein Medium, das ein Saccharid enthält, beispielsweise eine LB-Mediumplatte, die 5 g/l Glucose enthält, Kultivieren der Zellen unter Neigung der Platte um etwa 45 Grad und Auswählen einer Kolonie, die nicht auf dem Schleim nach unten fließt, selektiert werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die Übertragung der Verstärkung der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure und die Übertragung anderer vorteilhafter Eigenschaften, wie eine Mutation zu weniger Schleimausscheidung, in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
Durch Kultivierung des Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium, das auf eine pH-Bedingung eingestellt ist, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure erlaubt, kann L-Glutaminsäure unter gleichzeitiger Ausfällung in das Medium produziert und angehäuft werden. L-Glutaminsäure kann auch dadurch ausgefällt werden, dass die Kultur bei einem neutralen pH begonnen wird, und der pH-Wert dann den Wert bei dem L-Glutaminsäure ausfällt.
Der pH-Wert, bei dem L-Glutaminsäure ausfällt, bedeutet einen Wert, bei dem L-Glutaminsäure ausfällt, wenn der Mikroorganismus L-Glutaminsäure produziert und akkumuliert.
Als Medium für die Kultivierung kann ein übliches Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralsalze und organische Spurenelemente, wie Aminosäuren und Vitamine, nach Bedarf enthält, eingesetzt werden, solange der pH-Wert so eingestellt wird, daß L-Glutaminsäure ausfällt. Es kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquelle und die Stickstoffquelle, die in dem Medium eingesetzt werden, können beliebig sein, solange sie von dem zu kultivierenden Stamm genutzt werden können.
Als Kohlenstoffquelle werden Saccharide, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Glactose, Stärkehydrolysat und Melasse verwendet. Zusätzlich können organische Säuren, wie Essigsäure und Zitronensäure, entweder allein oder in Kombination mit einer anderen Kohlenstoffquelle eingesetzt werden.
Als Stickstoffquelle werden Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Nitrate und dergleichen eingesetzt.
Als organische Spurenelemente werden Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren, Nucleinsäuren, solche, die diese Substanzen enthalten wie Pepton, Casaminosäure, Hefeextrakt und Sojabohnenproteinzersetzungsprodukte verwendet. Wenn ein auxotropher Mutantenstamm, der eine Aminosäure für die Metabolisierung oder das Wachstum benötigt, verwendet wird, muß der erforderliche Mehrstoff supplementiert werden.
Als Mineralsalze werden Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze, Mangansalze oder dergleichen verwendet.
Die Kultivierung wird üblicherweise unter Belüftung bei einer Kultivierungstemperatur von 20 bis 42°C und einem pH-Wert von 3 bis 5, vorzugsweise 4 bis 5, stärker bevorzugt 4 bis 4,7, insbesondere bevorzugt 4 bis 4,5, durchgeführt. Auf diese Weise wird nach etwa 10 Stunden bis etwa 4 Tagen der Kultivierung eine deutliche Menge der L-Glutaminsäure in der Kultur angehäuft. Angehäufte L-Glutaminsäure, welche die Sättigungskonzentration übersteigt, fällt in dem Medium aus.
Nach dem Abschluß der Kultivierung kann die in der Kultur ausgefällte L-Glutaminsäure durch Zentrifugation, Filtration oder dergleichen gewonnen werden. In dem Medium aufgelöste L-Glutaminsäure kann auch durch bekannte Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise kann die L-Glutaminsäure durch Konzentration der Kulturbrühe unter Kristallisation der L-Glutaminsäure oder durch Ionenaustauschchromatographie isoliert werden. Die in der Kulturbrühe ausgefällte L-Glutaminsäure kann zusammen mit L-Glutaminsäure, die in dem Medium nach Kristallisation aufgelöst worden ist, isoliert werden.
Erfindungsgemäß wird die L-Glutaminsäure, die die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration entspricht, ausgefällt, und die Konzentration von in dem Medium aufgelösten L-Glutaminsäure wird bei einem konstanten Wert gehalten. Deshalb kann der Einfluß von L-Glutaminsäure in hoher Konzentration auf Mikroorganismen verringert werden. Dementsprechend wird es möglich, eine Mikroorganismus mit weiter verbesserter Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure zu züchten. Da außerdem L- Glutaminsäure als Kristalle ausgefällt wird, wird die Ansäuerung der Kulturbrühe durch Anhäufung von L-Glutaminsäure unterdrückt, und deshalb kann die Menge der für das Aufrechterhalten des pH-Wertes der Kultur eingesetzten Base deutlich verringert werden.
BEISPIELE
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme der folgenden Beispiele genauer erklärt. In den Beispielen sind die Aminosäuren L-Aminosäuren, wenn nichts anderes angegeben ist.
(1) Screening eines Mikroorganismus mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung
Das Screenen eines Mikroorganismus mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung wurde wie folgt durchgeführt. Jeweils 1 g von etwa 500 Proben, die aus der Natur erhalten wurden, einschließlich aus Erde, Früchten, Pflanzenkörpern, Flusswasser und dergleichen, wurde in 5 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, und 200 ml davon wurden auf 20 ml festes Medium, das mit HCl auf pH 4,0 eingestellt war, gegeben. Die Zusammensetzung des Mediums war wie folgt: 3 g/l Glucose, 1 g/l Ammoniumsulfat, 0,2 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 g/l Natriumchlorid, 0,1 g/l Calciumchloriddihydat, 0,01 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,01 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 50 μg/l Biotin, 50 μm/l Calciumpantothenat, 50 μg/l Folsäure, 50 μg/l Inositol, 50 μg/l Niacin, 50 μg/l p-Aminobenzoesäure, 50 μg/l Pyridoxinhydrochlorid, 50 μg/l Riboflavin, 50 μg/l Thiaminhydrochlorid, 50 mg/l Cycloheximid und 20 g/l Agar.
Die Medien mit den darauf pattierten Proben wurden bei 28°C, 37°C oder 50°C während 2 bis 4 Tagen inkubiert, wobei 378 Kolonie bildende Stämme erhalten wurden.
Danach wurde jeder der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Stämme in ein Teströhrchen von 16,5 cm Länge und 14 mm Durchmesser, das 3 ml flüssiges Medium (eingestellt mit HCl auf pH 4,0) enthielt, welches eine Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure aufwies, eingeimpft und bei 28°C, 37°C oder 50°C während 24 Stunden bis 3 Tage unter Schütteln kultiviert. Dann wurden die gewachsenen Stämme selektiert. Die Zusammensetzung des vorstehend genannten Mediums war wie folgt: 40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Kobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat und 2 g/l Hefeextrakt.
Auf diese Weise wurden 78 Stämme von Mikroorganismen erhalten, die Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung zeigen.
(2) Selektion von Stämmen mit verbesserter Wachstumsrate unter Mikroorganismen mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung
Die verschiedenen Mikroorganismen mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung, die vorstehend erhalten wurden, wurden jeweils in ein Teströhrchen mit einer Länge von 16,5 cm und einem Durchmesser von 14 mm, die 3 ml Medium (eingestellt mit HCl auf pH 4,0), erhalten durch Zugeben von 20 g/l Glutaminsäure und 2 g/l Glucose zu M9 Medium (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) enthielt, eingeimpft und die Trübung des Mediums wurde über die Zeit gemessen, um Stämme mit einer vorteilhaften Wachstumsrate zu selektieren. Als Ergebnis wurde als Stamm mit einem vorteilhaften Wachstum der Stamm AJ13355 aus dem Boden in Iwata-shi, Shizuoka, Japan, erhalten. Dieser Stamm wurde auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen bakteriologischen Eigenschaften als Enterobacter agglomerans bestimmt.
(3) Bereitstellung eines Stammes mit geringerer Schleimausscheidung aus Enterobacter agglomerans AJ13355
Da der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 extrazellulär Schleim ausscheidet, wenn er in einem Medium, das ein Saccharid enthält, kultiviert wird, ist die Kultivierungseffizienz nicht zufriedenstellend. Deshalb wurde ein Stamm mit geringerer Schleimausscheidung durch UV-Bestrahlung erhalten (Miller, J. H. et al., "A Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual", S. 150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.).
Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde 2 Minuten in einem Abstand von 60 cm von einer 60-W UV-Lampe mit UV-Strahlen bestrahlt und über Nacht in LB-Medium kultiviert, um die Mutation zu fixieren. Der mutagenisierte Stamm wurde verdünnt und in LB-Medium, das 5 g/l Glucose und 20 g/l Agar enthielt, eingeimpft, so daß etwa 100 Kolonien pro Platte erscheinen würden, und bei 30°C über Nacht kultiviert, wobei die Platte etwa 45° geneigt wurde, und dann wurden 20 Kolonien selektiert, die auf dem Schleim nicht nach unten geflossen waren.
Als ein Stamm, der die Bedingungen erfüllte, daß, selbst nach fünfmaliger Subkultivierung in LB-Medium, das 5 g/l Glucose und 20 g/l Agar enthielt, keine Revertanten auftraten, und daß ein Wachstum beobachtet werden sollte, das demjenigen des Ausgangsstammes in LB-Medium, 5 g/l Glucose-enthaltendem LB-Medium und M9-Medium (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, USA, 1989), das mit 20 g/l L-Glutaminsäure und 2 g/l Glucose supplementiert und mit HCl auf pH 4,5 eingestellt war, entsprach, wurde der Stamm SC17 aus den vorstehend ausgewählten Stämmen selektiert.
(4) Konstruktion eines Glutaminsäure-produzierenden Bakteriums aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17
(1) Präparation eines αKGDH defizienten Stammes aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17
Ein αKGDH defizienter Stamm mit einem verstärkten L-Glutaminsäurebiosynthesesystem wurde aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17 präpariert.
(i) Klonierung des αKGDH-Gens (im Folgenden als "sucAB" bezeichnet) des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355
Das sucAB-Gen des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde durch Selektieren eines DNA-Fragments, das die fehlende Fähigkeit zur Assimilation von Essigsäure des αKGDH-E1-Untereinheitengen(im Folgenden als "sucA" bezeichnet)-defizienten Stammes von E. coli komplementierte, aus der chromosomalen DNA des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 kloniert.
Die chromosomale DNA des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde durch ein Verfahren isoliert, das üblicherweise zum Extrahieren von chromosomaler DNA aus Escherichia coli eingesetzt wird (Text for Bioengineering Experiments, herausgegeben von der Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 97–98, Baifukan, 1992). Das Plasmid pTWV228 (resistent gegen Ampicillin), das als Vektor eingesetzt wurde, war ein kommerzielles Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd..
Die chromosomale DNA des Stammes AJ13355, die mit EcoT221 verdaut worden war, und pTWV228, das mit PstI verdaut worden war, wurden unter Einsatz von T4-Ligase legiert und eingesetzt, um den sucA-defizienten Stamm Escherichia coli JRG465 zu transformieren (Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Ein Stamm, der in einem Acetatminimalmedium wuchs, wurde unter den Transformantenstämmen, die vorstehend erhalten wurden, selektiert, und es wurde ein Plasmid daraus extrahiert und als pTWVEK101 bezeichnet. Der Stamm Escherichia coli JRG465, der pTWVEK101 enthielt, konnte die Auxotrophie für Bernsteinsäure oder L-Lysin und L-Methionin zusätzlich zur Beseitigung der fehlenden Fähigkeit zur Assimilation von Essigsäure beheben. Dies deutet an, daß pTWVEK101 das sucA-Gen von Enterobacter agglomerans enthielt.
1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte eines von Enterobacter agglomerans abgeleiteten DNA-Fragments in pTWVEK101. In der Nukleotidsequenz des schraffierten Teils in 1 wurden Nukleotidsequenzen, die als zwei vollständige offene Leserahmen angenommen wurden, und zwei Nukleotidsequenzen gefunden, die als Teilsequenzen der offenen Leserahmen angenommen wurden. Als Ergebnis der Homologiesuche für diese Sequenzen zeigte sich, daß die Teile, deren Nukleotidsequenzen bestimmt wurden, eine 3'-Endteilsequenz des Succinatdehydrogenase-Eisenschwefelproteingens (sdhB), vollständiges sucA und α-KGDH-E2-Untereinheitengens (sucB-Gen) und eine 5'-Endteilsequenz des Succinyl-CoA-Synthetase-β-Untereinheitengens (sucC-Gens) enthielt. Die Ergebnisse eines Vergleichs der Aminosäuresequenzen, die von diesen Nucleotidsequenzen abgeleitet sind, mit den Sequenzen, die von Escherichia coli abgeleitet sind (Eur. J. Biochem., 141, S. 351–359 (1984); Eur. J. Biochem. 141, S. 361–374 (1984); Biochemistry, 24, S. 6245–6252 (1985)) sind in den 2 bis 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen zeigten sehr hohe Homologie zueinander. Außerdem wurde gefunden, daß ein Cluster von sdhB-sucA-sucB-sucC auf dem Chromosom von Enterobacter sowie in Escherichia coli vorhanden war (Eur. J. Biochem., 141, S. 351–359 (1984), Eur. J. Biochem., 141, S. 361–374 (1984); Biochemistry, 24, S. 6245–6252 (1985)).
(ii) Bereitstellung eines α-KGDH-defizienten Stammes, der von dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17 abgeleitet ist
Die homologe Rekombination wurde unter Einsatz des sucAB-Gens von Enterobacter agglomerans erhalten, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, wobei ein α-KGDH-defizienter Stamm von Enterobacter agglomerans erhalten wurde.
Nachdem das Plasmid pTWVEK101 mit SphI verdaut worden war, um ein sucA-enthaltendes Fragment auszuschneiden, wurde das Fragment mit dem Klenow-Fragment abgestumpft (Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit pBR322, verdaut mit EcoRI und abgestumpft mit dem Klenow-Fragment, unter Einsatz von T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde an der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms BglII, die in der Nähe des Zentrums von sucA liegt, unter Verwendung dieses Enzyms verdaut, mit Klenow-Fragment abgestumpft und dann erneut unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Es wird angenommen, daß das sucA-Gen seine Funktion verlor, weil eine Leserahmenmutation in sucA des Plasmids, das durch das vorstehende Verfahren neu konstruiert wurde, eingeführt worden war.
Das wie vorstehend beschrieben konstruierte Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym ApaLI verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um ein sucA-enthaltendes DNA-Fragment, in das eine Leserahmenmutation eingeführt worden war, und ein von pBR322 abgeleitetes Tetracyclinresistenzgen zu gewinnen. Das gewonnene DNA-Fragment wurde erneut unter T4-DNA-Ligase ligiert, wobei ein Plasmid zur Ausschaltung des α-KGDH-Gens erhalten wurde.
Das Plasmid zum Ausschalten des α-KGDH-Gens, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, wurde eingesetzt, um den Stamm Enterobacter agglomerans SC17 durch Elektroporation zu transformieren (Miller, J. H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", S. 279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992), und ein Stamm, bei dem das sucA auf dem Chromosom durch eine Mutante des Plasmids durch homologe Rekombination ersetzt worden war, wurde unter Verwendung der Tetracyclinresistenz als Marker erhalten. Der erhaltene Stamm wurde SC17sucA genannt. Um zu bestätigen, daß der Stamm SC17sucA keine αKGDH-Aktivität aufwies, wurde die Enzymaktivität durch das Verfahren von Reed et al. (Reed, L. J. and Mukherjee, B. B., Methods in Enzymology, 13, S. 55–61, (1969)) unter Einsatz von Zellen des Stammes, der im LB-Medium bis zur logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet worden war, gemessen. Es wurde eine α-KGDH-Aktivität von 0,073 (ΔABS/min/mg Protein) für den Stamm SC17 nachgewiesen, während keine α-KGDH-Aktivität für den Stamm SC17sucA nachgewiesen wurde, wodurch bestätigt worden war, daß das sucA-Gen wie vorgesehen ausgeschaltet worden war.
(2) Verstärkung des L-Glutaminsäurebiosynthesesystems des Stammes Enterobacter agglomerans SC17sucA
Danach wurden das Citratsynthasegen, das Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen und das Glutamatdehydrogenasegen, abgeleitet von E. coli in den Stamm SC17sucA eingeführt.
(i) Präparation eines Plasmids mit dem von Escherichia coli abgeleiteten gltA-Gen, ppc-Gen und gdhA-Gen
Die Verfahren zur Präparation eines Plasmids mit dem gltA-Gen, dem ppc-Gen und dem gdhA-Gen werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die 6 und 7 erklärt.
Ein Plasmid mit dem von Escherichia coli abgeleiteten gdhA-Gen, pBRGDH (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 7-203980), wurde mit HindIII und SphI verdaut, beide Enden wurden durch T4-DNA-Polymerasebehandlung abgestumpft, und dann wurde das DNA-Fragment mit dem gdhA-Gen gereinigt und gewonnen. Getrennt davon wurde ein Plasmid mit dem von Escherichia coli abgeleiteten gltA-Gen und ppc-Gen, pMWCP (WO97/08294), mit XbaI verdaut, dann wurden beide Enden unter Einsatz von T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Dieses Fragment wurde dann mit dem vorstehend gereinigten DNA-Fragment mit dem gdhA-Gen gemischt und unter Einsatz von T4-DNA-Ligase ligiert, wobei ein Plasmid pMWCPG erhalten wurde, welches dem Plasmid pMWCP entspricht, das zusätzlich das gdhA-Gen enthält (6).
Gleichzeitig wurde das Plasmid pVIC40 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 8-047397) mit dem Replikationsursprung des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich unter Einsatz von NotI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit PstI verdaut. Das Plasmid pBR322 wurde mit EcoT14I verdaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit PstI verdaut. Beide Produkte wurden gemischt und unter Einsatz von T4-Ligase ligiert, wobei ein Plasmid RSF-Tat mit dem Replikationsursprung von RSF1010 und dem Tetracyclinresistenzgen erhalten wurde (7).
Danach wurde pMWCPG mit EcoRI und PstI verdaut, und ein DNA-Fragment mit dem gltA-Gen, dem ppc-Gen und dem gdhA-Gen wurde gereinigt und gewonnen.
RSF-Tet wurde auf ähnliche Weise mit EcoRI und PstI verdaut, und ein DNA-Fragment mit dem Replikationsursprung von RSF1010 wurde gereinigt und gewonnen. Beide Produkte wurden gemischt und unter Einsatz von T4-Ligase ligiert, wobei ein Plasmid RSFCPG erhalten wurde, welches RSF-Tet entspricht, welches das gltA-Gen, das ppc-Gen und das gdhA-Gen enthält (8). Es wurde bestätigt, daß das erhaltene Plasmid RSFCPG das gltA-Gen, das ppc-Gen und das gdhA-Gen expremierte, indem die Supplementierung der Auxotrophie des von Escherichia coli abgeleiteten gltA-Gen-, ppc-Gen-, oder gdhA-Gen-defizienten Stammes durchgeführt wurde und die jeweilige Enzymaktivität gemessen wurde.
(ii) Präparation eines Plasmids mit dem von Brevibacterium lactofermentum abgeleiteten gltA-Gen
Ein Plasmid mit dem von Brevibacterium lactofermentum abgeleiteten gltA-Gen wurde wie folgt konstruiert. Es wurde unter Verwendung der Primer-DNAs, die auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des gltA-Gens von Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, S. 1817–1828 (1994)) präpariert worden waren, und der chromosomalen DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 als Matrize eine PCR durchgeführt, wobei ein gltA-Genfragment von etwa 3 kb erhalten wurde. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut mit SmaI, unter Bildung des Plasmids pHSGCB eingeführt (9). Danach wurde pHSGCB mit HindIII verdaut, und das ausgeschnittene gltA-Gen-Fragment von etwa 3 kb wurde in das Plasmid pSTV29 (Takara Shuzo Co., Ltd.), verdaut mit HindIII, unter Bildung des Plasmids pSTVCB eingeführt (9). Es wurde bestätigt, daß das erhaltene Plasmid pSTVCB das gltA-Gen expremierte, indem die Enzymaktivität in dem Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 gemessen wurde.
(iii) Einführung von RSFCPG und pSTVCB in den Stamm SC17sucA
Der Stamm Enterobacter agglomerans SC17sucA wurde durch Elektroporation mit RSFCPG transformiert, wobei ein transformierter Stamm JSC17sucA/RSFCPG mit Tetracyclinresistenz erhalten wurde. Außerdem wurde der Stamm SC17sucA/RSFCPG mit pSTVCB durch Elektroporation transformiert, wobei der transformierte Stamm SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB mit Chloramphenicolresistenz erhalten wurde.
(4) Bereitstellung eines Stammes mit verbesserter Resistenz gegen L-Glutaminsäure in einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert
Ein Stamm mit verbesserter Resistenz gegen L-Glutaminsäure bei einer hohen Konzentration in einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert (im Folgenden auch als "Stamm mit Resistenz gegen hohe Glu-Konzentration bei niedrigem pH" bezeichnet) wurde aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB isoliert.
Der Stamm SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB wurde über Nacht bei 30°C in LBG-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 5 g/l Glucose) kultiviert, und die mit Natriumchloridlösung gewaschenen Zellen wurden in geeigneter Weise verdünnt und auf M9-E-Medium platiert (4 g/l Glucose, 17 g/l Na₂HPO₄·12H₂O, 3 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH₄Cl, 10 mM MgSO₄, 10 μM CaCl₂, 50 mg/l L-Lysin, 50 mg/l L-Methionin, 50 mg/l DL-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclin, 25 mg/l Chloramphenicol, 30 g/l L-Glutaminsäure, mit wäßrigem Ammoniak auf pH 4,5 eingestellt). Eine Nachkultivierung bei 32°C während 2 Tagen auftretende Kultur wurde als ein Stamm mit Resistenz gegen eine hohe Glu-Konzentration bei niedrigem pH erhalten.
Für den erhaltenen Stamm wurde das Wachstum in M9-E-Flüssigmedium gemessen, und die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure wurde in einem 50 ml-Teströhrchen, das 5 ml L-Glutaminsäureproduktionstestmedium enthielt (40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 2 g/l Hefeextrakt, 200 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 200 mg/l L-Methionin, 200 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol) enthielt, getestet. Ein Stamm, der das beste Wachstum und dieselbe Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure wie der Ausgangsstamm zeigte, nämlich der Stamm SC17/RSFCPG+pSTVCB, wurde als Enterobacter agglomerans AJ13601 bezeichnet. Der Stamm AJ13601 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (jetzt International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305–8566, Japan) am 18. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-17516 hinterlegt. Er wurde dann am 6. Juli 2000 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-7207.
(5) Kultivierung des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13601 zur Produktion von L-Glutaminsäure (1)
Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 wurde in einen 1-Liter-Rüttelfermenter eingeimpft, der 300 ml Kulturmedium enthielt, das 40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 2 g/l Hefeextrakt, 200 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 200 mg/l L-Methionin, 200 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, und bei 34°C und pH 6,0 während 14 Stunden kultiviert. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Einleiten von Ammoniakgas in das Medium kontrolliert.
Die vorstehend erhaltene Kultur wurde 10 Minuten bei 5000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und die gewonnenen Zellen wurden in eine 1-Liter-Fermenter eingeimpft, der 300 ml Medium enthielt, das 40 g/l Glucose, 5 g/l Ammoniumsulfat, 1,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 6 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 1,5 g/l Natriumchlorid, 0,75 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,06 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,06 g/l Mangansulfattetrahydrat, 2,16 mg/l Zinksulfatdihydrat, 1,92 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 2,16 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 1,2 mg/l Borsäure, 3,6 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 6 g/l Hefeextrakt, 600 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 600 mg/l L-Methionin, 600 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, und bei 34°C und pH 4,5 zur Produktion von L-Glutaminsäure kultiviert. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Einleiten von Ammoniakgas kontrolliert. Nachdem die anfänglich zugegebene Glucose verbraucht worden war, wurden 600 g/l Glucose kontinuierlich zugegeben.
Als Ergebnis der wie vorstehend beschrieben Kultivierung zur Produktion von L-Glutaminsäure während 50 Stunden wurde eine wesentliche Menge on L-Glutaminsäurekristallen in dem Rüttelfermenter ausgefällt. Tabelle 1 zeigt die Konzentration der L-Glutaminsäure, die in der Kulturbrühe zu dem Zeitpunkt gelöst war, und die Konzentration an L-Glutaminsäure, gemessen durch Auflösen der Kristalle in 2 M Kaliumhydroxid. L-Glutaminsäurekristalle wurden aus den Kultur durch Dekantieren gewonnen, nachdem die Kultur stehengelassen wurde.
Tabelle 1
(6) Kultivierung von Enterobacter agglomerans AJ13601 zur Produktion von L-Glutaminsäure (2)
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 selbst in Anwesenheit von L-Glutaminsäurekristallen immer noch die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure hatte.
Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 wurde in einen 1-Liter-Rüttelfermenter eingeimpft, der 300 ml Kulturmedium enthielt, das 40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 2 g/l Hefeextrakt, 200 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 200 mg/l L-Methionin, 200 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, und bei 34°C und pH 6,0 während 14 Stunden kultiviert. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Einblasen von Ammoniakgas in das Medium kontrolliert.
Die vorstehend erhaltene Kultur wurde 10 Minuten bei 5000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und die gewonnenen Zellen wurden in einem Medium kultiviert, in dem L-Glutaminsäure als Kristalle vorhanden war. Das eingesetzte Medium enthielt 40 g/l Glucose, 5 g/l Ammoniumsulfat, 1,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 6 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 1,5 g/l Natriumchlorid, 0,75 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,06 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,06 g/l Mangansulfattetrahydrat, 2,16 mg/l Zinksulfatdihydrat, 1,92 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 2,16 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 1,2 mg/l Borsäure, 3,6 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 6 g/l Hefeextrakt, 600 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 600 mg/l L-Methionin, 600 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol, und 40 g/l L-Glutaminsäurekristalle wurden zugegeben. Die Zellen wurden in einen 1-Liter-Fermenter eingeimpft, der 300 ml dieses Medium enthielt, und bei 34°C und pH 4,3 kultiviert, um die Produktion von L-Glutaminsäure durchzuführen. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Einleiten von Ammoniakgas kontrolliert. Nachdem die anfänglich zugegebene Glucose verbraucht worden war, wurden 600 g/l Glucose kontinuierlich zugegeben. In diesem Medium waren bei pH 4,3 nur 39 g/l der zugegebenen L-Glutaminsäure gelöst, und die verbleibende Menge von 1 g/l war als Kristalle vorhanden.
Als Ergebnis der wie vorstehend beschrieben Kultivierung zur Produktion von L-Glutaminsäure während 53 Stunden wurde eine wesentliche Menge on L-Glutaminsäurekristallen in dem Rüttelfermenter ausgefällt. Tabelle 2 zeigt die Konzentration der L-Glutaminsäure, die in der Kulturbrühe zu dem Zeitpunkt gelöst war, die Menge an L-Glutaminsäure, die als Kristalle vorhanden waren, und die Konzentration an L-Glutaminsäure, gemessen durch Auflösen der Kristalle in 2 M Kaliumhydroxid. L-Glutaminsäurekristalle wurden aus den Kultur durch Dekantieren gewonnen, nachdem die Kultur stehengelassen wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 L-Glutaminsäure anhäufte und dass ausgefällte Kristalle selbst in Anwesenheit von L-Glutaminsäurekristallen vorhanden waren.
Tabelle 2
(7) Kultivierung von Enterobacter agglomerans AJ13601 zur Produktion von L-Glutaminsäure (3)
Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 kann nicht nur bei saurem pH, sondern auch bei neutralem pH wachsen. Deshalb wurde wie folgt bestätigt, dass L-Glutaminsäurekristalle ausgefällt werden konnten auch durch Starten der Kultur bei einem neutralen pH und Erlauben der Produktion von L-Glutaminsäure während der Kultivierung, so dass der pH-Wert der Kultur spontan gesenkt werden sollte.
Zellen der Stammes Enterobacter agglomerans AJ13601 einer Platte (8,5 cm Durchmesser) wurden auf LBG-Agarmedium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 5 g/l Glucose, 15 g/l Agar), das 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, 14 Stunden bei 30°C kultiviert, in einen 1-Liter-Fermenter eingeimpft, der 300 ml Kulturmedium enthielt, das 40 g/l Glucose, 5 g/l Ammoniumsulfat, 1,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 6 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 1,5 g/l Natriumchlorid, 0,75 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,06 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,06 g/l Mangansulfattetrahydrat, 2,16 mg/l Zinksulfatdihydrat, 1,92 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 2,16 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 1,2 mg/l Borsäure, 3,6 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 6 g/l Hefeextrakt, 600 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 600 mg/l L-Methionin, 600 mg/l DL-α,ε- Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, und bei 34°C und pH 7,0 kultiviert. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Einleiten von Ammoniakgas in das Medium kontrolliert. Nachdem die anfängliche Glucose verbraucht worden war, wurden 600 g/l Glucose kontinuierlich zugegeben.
Mit der Anhäufung von L-Glutaminsäure sinkt der pH-Wert spontan. Die Menge des eingeführten Ammoniakgases wurde so eingestellt, dass der pH-Wert während eines Zeitraums von 15 Stunden bis 24 Stunden nach Start der Kultivierung allmählich von 7,0 auf 4,5 und 24 Stunden nach dem Start der Kultivierung 4,5 gesenkt wurde.
Als Ergebnis der vorstehend beschriebenen Kultivierung für die Produktion von L-Glutaminsäure während 36 Stunden wurde eine wesentliche Menge an L-Glutaminsäurekristallen in dem Rüttelfermenter ausgefällt. Tabelle 3 zeigt die Konzentration der L-Glutaminsäure, die in der Kulturbrühe zu dem Zeitpunkt gelöst war, die Menge an L-Glutaminsäure, die als Kristalle vorhanden waren, und die Konzentration an L-Glutaminsäure, gemessen durch Auflösen der Kristalle in 2 M Kaliumhydroxid. L-Glutaminsäurekristalle wurden aus den Kultur durch Dekantieren gewonnen, nachdem die Kultur stehengelassen wurde.
Tabelle 3
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem flüssigen Medium, dessen pH-Wert so eingestellt ist, daß L-Glutaminsäure ausfällt, unter Bildung und Anhäufung von L-Glutaminsäure und Ausfällung von L-Glutaminsäure in dem eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium umfaßt, wobei der pH-Wert 3,0 bis 5,0 ist, wobei der Mikroorganismus eine Kohlenstoffquelle bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und die Kohlenstoffquelle enthält, metabolisieren kann und die Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure in einer Menge anzuhäufen, die die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration in dem flüssigen Medium bei dem pH-Wert entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mindestens eine der folgenden Eigenschaften hat: (a) der Mikroorganismus hat eine erhöhte Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert; und (b) der Mikroorganismus hat eine verringerte oder keine Aktivität eines Enzyms, das eine Reaktion katalysiert, die von einem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure abzweigt und eine andere Verbindung als L-Glutaminsäure herstellt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Enzym, das die Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert, mindestens eines ist, das unter Citratsynthase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase und Glutamatdehydrogenase ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Enzym, das die Reaktion katalysiert, die von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure abzweigt und die andere Verbindung als L-Glutaminsäure herstellt, α-Ketoglutaratdehydrogenase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Enterobacter gehört.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans (AJ13601) FERM BP-7207 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus eine Mutation hat, die eine geringere extrazelluläre Sekretion eines viskosen Materials als ein Wildtypstamm verursacht, wenn er in einem Medium kultiviert wird, das ein Saccharid enthält.
Verfahren zum Screenen auf einen Mikroorganismus, welches das Screenen eines Mikroorganismus, der für die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Ausfällung von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium bei pH 3,0–5,0 geeignet ist, umfaßt, welches das Einimpfen einer Probe, die Mikroorganismen enthält, in ein saures Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und eine Kohlenstoffquelle enthält, und das Selektieren eines Stammes umfaßt, der die Kohlenstoffquelle metabolisieren kann.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei ein Stamm, der in dem Medium wachsen kann, als der Stamm ausgewählt wird, der die Kohlenstoffquelle metabolisieren kann.
Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Beginnen der Kultivierung eines Mikroorganismus in einem flüssigen Medium bei einem neutralen pH-Wert und das Beenden der Kultivierung bei einem pH-Wert, bei dem L-Glutaminsäure ausgefällt wird, umfaßt, wobei der Mikroorganismus eine Kohlenstoffquelle bei einem pH-Wert von 3,0 bis 5,0 in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und die Kohlenstoffquelle enthält, metabolisieren und L-Glutaminäsure in einer Menge anhäufen kann, welche die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration in dem flüssigen Medium bei dem pH-Wert entspricht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der pH-Wert der Kultur durch Einführen von Ammoniakgas in das Medium kontrolliert wird.
Mikroorganismus mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-7207.