BR0003695B1 - processos para produzir ácido l-glutámico por fermentação e, para triar um microorganismo apropriado para produção de ácido l-glutámico por fermentação com precipitação de ácido l-glutámico em um meio lìquido. - Google Patents

processos para produzir ácido l-glutámico por fermentação e, para triar um microorganismo apropriado para produção de ácido l-glutámico por fermentação com precipitação de ácido l-glutámico em um meio lìquido. Download PDF

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Description

"PROCESSOS PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO POfcFERMENTAÇÃO E, PARA TRIAR UM MICROORGANISMOAPROPRIADO PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO PORFERMENTAÇÃO COM PRECIPITAÇÃO DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO EMUM MEIO LÍQUIDO".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo para produzirácido L-glutâmico por fermentação acompanhada por precipitação. O ácidoL-glutâmico é amplamente usado como um material para temperos, e outros.
Acido L-glutâmico é principalmente produzido por processosfermentativos usando as assim chamadas bactérias corineformes produzindoácido L-glutâmico e pertencendo ao gênero Brevibacterium,Corynebacterium ou Mierobacterium ou variantes das mesmas (Amino AcidFermentation, Gakkai Shuppan Center, p. 195-215, 1986). Como processospara produzir ácido L-glutâmico por fermentação por uso de outras cepasbacterianas, conhece-se um processo usando um microorganismospertencendo aos gêneros Baeillus, Streptomyees, Penieillium ou outros(patente US 3 220 929), um processo usando um microorganismopertencendo aos gêneros Pseudomonas, Arthrobaeter, Serrada, Candida ououtros (patente US 3 563 857), um processo usando um microorganismopertencendo aos gêneros Baeillus, pseudomonas, Serrada, Aerobacteraerogenes (atualmente também referido como Enterobaeter aerogenes) ousemelhantes (publicação de patente JP (Kokoku) no. 32-9393), um processousando uma cepa mutante de Eseheriehia eoli (pedido de patente JP acessívelao público no. 5 244970 (Kokai), e assim em diante. Além disso, osinventores da presente invenção apresentam um processo para produzir ácidoL-glutâmico por uso de um microorganismo pertencendo ao gênerosKlebsiella, Erwinia ou Pantoea, (pedido de patente JP acessível ao público no.2000- 106869).Além disso, foram descritas várias técnicas para melhorar acapacidade de produção de ácido L-glutâmico por melhora das atividades deenzimas biossintéticas de ácido L-glutâmico através do uso de técnicas deDNA recombinante. Por exemplo, foi registrado que a introdução de um genecodificando para citrato sintase derivado de Escherichia eoli ouCorynebaeterium glutamicum foi efetivo para melhorar a capacidade deprodução de ácido L-glutâmico em bactérias Corynebaeterium ouBrevibacterium (publicação de patente JP no. 7-121228). Além disso, nopedido de patente JP acessível ao público no. 61-268185 descreve uma célulaabrigando DNA recombinante contendo um gene glutamato desidrogenasederivado de bactérias Corynebaeterium. Além disso, o pedido de patente JPacessível ao público no. 63-214189 descreve uma técnica para melhorar acapacidade de produção de ácido L-glutâmico por amplificação de um geneglutamato desidrogenase, um gene isocitrato desidrogenase, um gene aconitatohidratase, e um gene citrato sintase.
Apesar da produtividade de ácido L-glutâmico ter sidoconsideravelmente aumentada por criação dos microorganismos acimadescritos ou melhora dos processos de produção, o desenvolvimento deprocessos para a produção mais eficiente de ácido L-glutâmico em um menorcusto é requerida para responder a outro aumento da demanda no futuro.
Conhece-se um processo em que a fermentação é realizada porcristalização de ácido L-glutâmico acumulado em cultura (pedido de patente JPacessível ao público no. 62-288). Neste processo, a concentração em L-aminoácido na cultura é mantida abaixo de um certo nível por precipitação doL-aminoácido acumulado na cultura. Especificamente, L-triptofano, L-tirosinaou L-Ieucina é precipitado durante a fermentação por ajuste da temperatura epH da cultura ou adição de um agente tensoativo ao meio.
Apesar de um processo fermentativo com precipitação de L-aminoácido ser conhecido como descrito acima, aminoácidos apropriados paraeste processo são os de solubilidade em água relativamente baixa, e nenhumexemplo de aplicação do processo a aminoácidos altamente solúveis em água,como ácido L-glutâmico, é conhecido. Além disso, o meio deve ter baixo pHpara precipitar ácido L-glutâmico. No entanto, as bactérias produzindo ácidoL-glutâmico como as mencionadas acima, não podem crescer sob condiçõesácidas, e assim a fermentação de ácido L-glutâmico é realizada sob condiçõesneutras (patentes US 3 220 929 e 3 032 474; Chao K.C. & Foster, J.W., J.Bacteriol. 77, p. 715- 725 (1959)). Assim, a produção de ácido L-glutâmicopode fermentação acompanhada por precipitação não é conhecida. Além disso, sabe-se que o crescimento de bactérias mais acidófilas é inibido por ácidosorgânicos como ácido acético, ácido láctico, e ácido succínico (Yasuro OshimaEd. "Extreme Environment Microorganism Handbook", p. 231, ScienceFórum, Borichewski R.M. J. Bacteriol. 93, pag. 597-599 (1967), etc). Assim,considera-se que muitos microorganismos são suscetíveis a ácido L-glutâmico,que é também um ácido orgânico, sob condições ácidas, e não se tem registroque a pesquisa por microorganismos mostrando capacidade de produção deácido L-glutâmico sob condições ácidas foi tentada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Na situação corrente, acima mencionada, um objeto da presenteinvenção é pesquisar e criar um microorganismo que produz ácido L-glutâmicosob condições de pH baixo e para prover um processo para produzir ácido L-glutâmico usando um microorganismo obtido por fermentação comprecipitação de ácido L-glutâmico.
Os inventores da presente invenção consideraram durante oestudo para melhora de produtividade de ácido L-glutâmico por fermentaçãoque a inibição da produção por ácido L-glutâmico acumulado em um meio auma alta concentração foi uma das obstruções à melhora da produtividade. Porexemplo, células tem um sistema excretório e um sistema de absorção paraácido L-glutâmico. No entanto, se ácido L-glutâmico uma vez excretado nomeio for incorporado nas células novamente, não somente a eficácia deprodução cai, mas também as reações biossintéticas de ácido L-glutâmico sãoinibidas como um resultado. A fim de evitar a inibição de produção por esteacúmulo de ácido L-glutâmico em alta concentração, os inventores da presenteinvenção triaram microorganismos que podem proliferar sob condições ácidase na presença de uma alta concentração de ácido L-glutâmico. Como resultado,eles isolaram com sucesso microorganismos tendo estas propriedades de solo eassim alcançaram a presente invenção.
Assim, a presente invenção provê o seguinte.
(1) Um microorganismo que pode metabolizar uma fonte decarbono em um pH específico em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e a fonte de carbono, e temcapacidade de acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade excedendo aquantidade correspondente à concentração de saturação no meio líquido no pH.
(2) O microorganismo de acordo com (1), que pode crescer nomeio líquido.
(3) O microorganismo de acordo com (1) ou (2), em que o pHnão é maior que 5,0.
(4) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a
(3), que tem pelo menos uma das seguintes características:
(a) o microorganismo é melhorado enj atividade de uma enzimaque catalisa uma reação para biossíntese de ácido L-glutâmico; e,
(b) o microorganismo é diminuído em ou deficiente ematividade de uma enzima' que catalisa uma reação se ramificando de uma viabiossintética de ácido L-glutâmico e produz um composto diferente de ácido L-glutâmico.
(5) O microorganismo de acordo com (4) em que a enzima quecatalisa a reação para biossíntese de ácido L-glutâmico é pelo menos umselecionado dentre citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase e glutamatodesidrogenase.
(6) O microorganismo de acordo com (4) ou (5), em que aenzima que catalisa a ramificação de reação de via biossintética de ácido L-glutâmico e produz um composto diferente de ácido L-glutâmico écetoglutarato desidrogenase.
(7) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a(6), em que o microorganismo pertence ao gênero Enterobacter.
(8) O microorganismo de acordo com (7), que é Enterobacteragglomerans.
(9) O microorganismo de acordo com (8), que tem umamutação que causa secreção extracelular de um material viscoso comparadocom uma cepa selvagem quando cultivado em um meio contendo umsacarídeo.
(10) Um processo para produzir ácido L-glutâmico porfermentação, que compreende cultivar um microorganismo como definido emqualquer um dentre (1) a (9) em\im meio líquido, cujo pH é ajustado a um pHem que ácido L-glutâmico é precipitado, para produzir e acumular ácido L-glutâmico e precipitar ácido L-glutâmico no meio.
(11) Um processo para triar um microorganismo apropriadopara produzir ácido L-glutâmico por fermentação com precipitação de ácido L-glutâmico em um meio líquido, que compreende inocular uma amostracontendo microorganismos em um meio ácido contendo ácido L-glutâmico auma concentração de saturação e uma fonte de carbono, e selecionar uma cepaque pode metabolizar a fonte de carbono.
(12) O processo de acordo com (11) em que uma cepa que podecrescer no meio é selecionada como a cepa que pode metabolizar a fonte decarbono.
(13) O processo de acordo com (11) ou (12), em que um pH domeio não é maior que 5,0.De acordo com o processo da presente invenção, ácido L-glutâmico pode ser produzido por fermentação com precipitação de ácido L-glutâmico. Como resultado, ácido L-glutâmico no meio é mantido abaixo deuma certa concentração, e ácido L-glutâmico pode ser produzido sem sofrer dainibição de produto por ácido L-glutâmico em uma alta concentração.
BREVE EXPLICAÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra um mapa de restrição de um fragmento deDNA derivado de Enterobacter agglomerans pTWVEKlOl.
A figura 2 mostra comparação da seqüência de aminoácidosdeduzida da seqüência de nucleotídeos de gene sucA derivado de Enterobacteragglomerans e o derivado de Eseheriehia eoli. Seqüência superior:Enterobaeter agglomerans, seqüência inferior, Eseheriehia eoli (o mesmodeve se aplicar à descrição abaixo).
A figura 3 mostra comparação da seqüência de aminoácidosdeduzida da seqüência de nucleotídeos de gene sueB derivado de Enterobaeteragglomerans e o derivado de Escherichia eoli.
A figura 4 mostra comparação da seqüência de aminoácidosdeduzida da seqüência de nucleotídeos de gene sdhB derivado de Enterobaeteragglomerans e o derivado de Escherichia eoli.
A figura 5 mostra comparação da seqüência de aminoácidosdeduzida da seqüência de nucleotídeos de gene sueC derivado de Enterobaeteragglomerans e o derivado de Eseheriehia eoli.
A figura 6 mostra construção de plasmídeo pMWCPG tendoum gene gltA, um gene ppe e um gene gdhA.
A figura 7 mostra construção de plasmídeo RSF-Tet tendo aorigem de replicação de plasmídeos de espectro de hospedeiro amplo RSF1010e um gene de resistência a tetraciclina.
A figura 8 mostra construção de plasmídeos RSFCPG tendo aorigem de replicação de plasmídeo de espectro de hospedeiro amplo RSF1010,um gene de resistência a tetraciclina, um gene gltA, um gene ppc e um genegdhA.
A figura 9 mostra construção de plasmídeo pSTVCB tendo umgene GltA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.
O microorganismo da presente invenção é um microorganismoque (1) pode metabolizar uma fonte de carbono em um pH específico em ummeio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e afonte de carbono e (2) tem capacidade de acumular ácido L-glutâmico em umaquantidade excedendo a quantidade correspondendo à concentração desaturação no meio líquido no pH.
O termo "concentração de saturação" significa umaconcentração de ácido L-glutâmico dissolvido em meio líquido quando o meiolíquido é saturado com ácido L-glutâmico.
A seguir, um processo para triar um microorganismo que podemetabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e a fonte de carbono em um pHespecífico será descrito. Uma amostra contendo microorganismos é inoculadaem um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração desaturação e uma fonte de carbono em um pH específico, e uma cepa que podemetabolizar a fonte de carbono é selecionada. O pH específico não éparticularmente limitado, mas é geralmente mais que cerca de 5,0,preferivelmente não mais que cerca de 4,5, mais preferivelmente não mais quecerca de 4,3. O microorganismo da presente invenção é usado para produzirácido L-glutâmico por fermentação com precipitação de ácido L-glutâmico. Seo pH for muito elevado, se torna difícil permitir ao microorganismo produzirácido L-glutâmico suficiente para precipitação. Assim, o pH estápreferivelmente na faixa acima mencionada.Se pH de uma solução aquosa contendo ácido L-glutâmico forabaixado, a solubilidade de ácido L-glutâmico cai de modo significante emtorno de pKa de grupo -carboxila (4,25, 25 C ). A solubilidade se torna amaior no ponto isoelétrico (pH 3,2) e ácido L-glutâmico excedendo aquantidade correspondendo à concentração de saturação é precipitado. Apesarde depender a composição de meio, ácido L-glutâmico é geralmente dissolvidoem uma quantidade de 10 a 20 g/L a pH 3,2, 30 a 40 g/L a pH 4,0, e 50 a 60g/L a pH 4,7, a cerca de 30 C. Geralmente, o pH não precisa ser feito abaixode 3,0, porque o efeito de precipitação de ácido L-glutâmico entra em umpatamar quando pH cai abaixo de um certo valor. No entanto, o pH pode estarabaixo de 3,0.
Além disso, a expressão que um microorganismo "podemetabolizar a fonte de carbono" significa que pode proliferar ou pode consumira fonte de carbono, mesmo se não puder proliferar, isto é, indica que podecatabolizar fontes de carbono como sacarídeos ou ácidos orgânicos.Especificamente, por exemplo, se um microorganismo proliferar quandocultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentraçãode saturação a pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmentepH 4,3 a 4,0, ainda mais preferivelmente pH 4,0 a uma temperatura apropriada,por exemplo 28 C, 37 C, ou 50 C durante 2 a 4 dias, este microorganismopode metabolizar a fonte de carbono no meio. Além disso, por exemplo,mesmo se um microorganismo não prolifera quando é cultivado em um meiolíquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação a pH 5,0a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, aindamais preferivelmente pH 4,0 a uma temperatura apropriada, por exemplo 28C, 37 C, ou 50 C durante 2 a 4 dias, o microorganismo que aumenta aquantidade de ácido L-glutâmico no meio é o que pode metabolizar a fonte decarbono no meio.
O microorganismo que pode metabolizar a fonte de carbonoinclui um microorganismo que pode crescer no meio líquido.
A expressão de que um microorganismo "pode crescer"significa que ele pode proliferar ou pode produzir ácido L-glutâmico mesmo seele não pode proliferar. Especificamente, por exemplo, se um microorganismoprolifera quando cultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico auma concentração de saturação a pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0,mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, ainda mais preferivelmente pH 4,0 a umatemperatura apropriada, por exemplo 28 C, 37 C, ou 50 C, durante 2 a 4dias, este microorganismo pode crescer no meio. Ainda mais, por exemplo,mesmo se um microorganismo não prolifera quando é cultivado em um meiosintético líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturaçãoa pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a4,0, ainda mais preferivelmente pH 4,0 a uma temperatura apropriada, porexemplo 28 C, 37 C ou 50 C durante 2 a 4 dias, o microorganismo queaumenta a quantidade de ácido L-glutâmico no meio é o que pode crescer nomeio.
A seleção descrita acima pode ser repetida duas ou mais vezessob as mesmas condições ou com mudança de pH ou concentração de ácido L-glutâmico. Uma seleção inicial pode se realizada em um meio contendo ácidoL-glutâmico a uma concentração menor do que a concentração de saturação, ea seguir uma seleção subsequente pode ser realizada em um meio contendoácido L-glutâmico a uma concentração de saturação. Além disso, cepas compropriedades favoráveis como taxa de proliferação superior podem serselecionadas.
Além da propriedade descrita acima, o microorganismo dapresente invenção tem a capacidade de acumular ácido L-glutâmico em umaquantidade excedendo a quantidade correspondendo à concentração desaturação de ácido L-glutâmico em um meio líquido. O pH do meio líquidoacima mencionada é preferivelmente igual ou próximo do meio usado paratriar um microorganismo tendo a propriedade acima mencionada (1).Geralmente, um microorganismo se torna suscetível a ácido L-glutâmico a umaalta concentração como o pH se torna menor. Assim, prefere-se que o pH não ébaixo do ponto de vista de resistência a ácido L-glutâmico, mas pH baixo épreferido do ponto de vista de produção de ácido L-glutâmico comprecipitação do mesmo. Para atender a estas condições, pH pode estar na faixade 3 a 5, preferivelmente 4 a 5, mais preferivelmente 4,0 a 4,7 ainda maispreferivelmente 4,0 a 4,5, particularmente preferivelmente 4,0 a 4,3.
Como o microorganismo da presente invenção ou materiais decriação para o mesmo, pode-se mencionar, por exemplo microorganismospertencendo aos gêneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia,Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Baeillus, Saccharomyees.Dentre estes, os microorganismos pertencendo aos gêneros Enterobacter sãopreferidos. A seguir, o microorganismo da presente invenção será explicadoprincipalmente para microorganismos pertencendo ao gênero Enterobacter,mas a presente invenção pode ser aplicada a microorganismo pertencendo aoutros gêneros e não limitada ao gênero Enterobacter.
Como microorganismo pertencendo a Enterobacter, pode-seespecificamente mencionar Enterobacter agglomerans, preferivelmente oEnterobacter agglomerans cepa AJl 3355. Esta cepa foi isolada de um soloem Iwata-Shi, Shizuoka, Japão, como uma cepa que pode proliferar em ummeio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em um baixo pH.
As propriedades fisiológicas de AJ13355 são como a seguir:
(1) coloração gram : negativa
(2) comportamento contra oxigênio: anaeróbico facultativo
(3) catalase : positiva
(4) oxidase: negativa
(5) capacidade de redução de nitrato: negativa
(6) teste Voges-Proskauer: positivo(7) teste Metil vermelho: negativo
(8) urease: negativo
(9) produção indol: positivo
(10) motilidade: mótil
(11) produção H2S em meio TSI: fracamente ativo
(12) β- galactosidase: positivo
(13) propriedade de assimilação de sacarídeo:arabinose: positivo
sacarose: positivolactose; positivoxilose: positivosorbitol: positivoinositol: positivotrehalose: positivomaltose: positivoglucose: positivoadonitol: negativoraffínose: positivosalicina: negativomelibiose: positivo
(14) Propriedade de assimilação de glicerol: positiva
(15) propriedade de assimilação de ácido orgânico:ácido cítrico: positivo
ácido tartárico: negativoácido glucônico: positivoácido acético: positivoácido malônico: negativo
(16) arginina desidratase: negativo
(17) ornitina decarboxilase: negativo(18) lisina decarboxilase: negativo
(19) fenilalanina deaminase: negativo
(20) formação de pigmento: amarelo
(21) capacidade de liquefação de gelatina: positivo
(22) pH de crescimento: crescimento é possível a pH 4,0, bomcrescimento a pH 4,5 a 7
(23) temperatura de crescimento: bom crescimento a 25 C,bom crescimento a 30 C, bom crescimento a 37 C, crescimento é possível a42 C, crescimento não é possível a 45 C.
Com base nas propriedades bacteriológicas, AJl3355 foideterminado como Enterobacter agglomerans.
O Enterobaeter agglomerans AJ13355 foi depositado noNational Institute of Bioscience and Human Technology da Agency ofIndustrial Science and Technology do Ministério da Indústria e ComércioInternacional (código postal 305, 1-3- Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki,Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERMP-16644. Ele foi então transferido para um depósito internacional sob asprovisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu onúmero de acesso FERM BP-6614.
O microorganismo da presente invenção pode ser ummicroorganismo originalmente tendo capacidade de produção de ácido L-glutâmico ou um tendo capacidade de produção de ácido L-glutâmicoconferida ou melhorada por criação através do uso de tratamento de mutação,técnicas de DNA recombinante ou semelhantes.
A capacidade de produção de ácido L-glutâmico pode serconferida ou melhorada por, por exemplo, aumentando a atividade de umaenzima que catalisa uma reação para biossíntese de ácido L-glutâmico. Acapacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser melhorada pordiminuição da atividade de uma enzima que catalisa uma reação seramificando de via biossintética de ácido L-glutâmico e produzindo umcomposto diferente de ácido L-glutâmico, ou tornando a atividade deficiente.
Como enzimas que catalisam uma reação para biossíntese deácido L-glutâmico, pode-se mencionar glutamato desidrogenase, (a seguirtambém referido como "GDH"), glutamina sintetase, glutamato sintase,isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (a seguir tambémreferido como "CS"), fosfoenolpiruvato carboxilase (a seguir também referidocomo "PEPC"), piruvato desidrogenase, piruvato quinase, enolase,fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase, gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase, triosefosfato isomerase, fructose bisfosfato aldolase,fosfofructoquinase, glucose fosfato isomerase e assim em diante. Dentre estasenzimas uma, duas ou três dentre CS, PEPC, e GDH são preferidas. Alémdisso, prefere-se que as atividades de todas as três enzimas, CS, PEPC e GDH,são melhoradas pelo microorganismo da presente invenção. Em particular, CSde Brevibacterium lactofermentum é preferido, porque não sofre da inibição deácido -cetoglutárico, ácido L-glutâmico e NADH.
A fim de melhorar a atividade de CS, PEPC ou GDH, porexemplo, um gene codificando para CS, PEPC ou GDH pode ser clonado emum plasmídeo apropriado e um microorganismo hospedeiro pode sertransformado com o plasmídeo obtido. O número de cópia do gene codificandopara CS, PEPC ou GDH ((a seguir abreviado como "gene gltA", "gene ppc", egene gdhA, respectivamente), na célula de cepa transformada aumenta,resultando no aumento da atividade de CS, PEPC ou GDH.
O gene gltA clonado, gene ppc e gene gdhA são introduzidos nacepa parental de partida acima mencionada sozinho ou em combinação de doisou três tipos arbitrários dos mesmos. Quando dois ou mais tipos dos genes sãointroduzidos, dois ou três tipos dos genes podem ser clonados em um tipo deplasmídeo e introduzido no hospedeiro, ou separadamente clonado em dois outrês tipos de plasmídeos que podem co-existir e introduzidos no hospedeiro.Dois ou mais tipos de genes codificando para enzimas domesmo tipo, mas derivados de diferentes microorganismos podem serintroduzidos no mesmo hospedeiro.
Os plasmídeos descritos acima não são particularmentelimitados desde que sejam autonomamente replicáveis em células de ummicroorganismo pertencendo a, por exemplo, o gênero Enterobacter ou outro,mas por exemplo pode-se mencionar pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299,pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219,pMW218, pACYC177, pACYC184 e assim em diante. Além destes vetores deDNA de fago também podem ser usados.
A transformação pode ser realizada por por exemplo o processode D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979), o processo emque a permeabilidade de DNA é aumentada por tratamento de células debactéria recipientes com cloreto de cálcio (Mandei M. e Higa A. J. Mol. Biol.53, 159 (1970)), a eletroporação (Miller, J.H. "A Short Course in BacterialGenetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992), ou outro.
A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentadaao permitir cópias múltipla de um gene gltA, um gene ppc ou um gene gdhA, aestar presente em DNA cromossômico da cepa parental de partida acimamencionada para ser um hospedeiro. A fim de introduzir cópias múltiplas degene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA em DNA cromossômico de ummicroorganismo pertencendo ao gênero Enterobacter ou semelhante, do qualmúltiplas cópias de uma seqüência estão presentes no DNA cromossômico,como DNA repetitivo e repetições invertidas presentes nos términos de umelemento transposável, podem ser usados. Alternativamente, cópias múltiplasdos genes podem ser introduzidas sobre o DNA cromossômico por uso detransferência de um transposon contendo o gene gltA, o gene ppc ou o genegdhA. Como resultado, o número de cópias do gene gltA, do gene ppc ou dogene gdhA em uma célula de cepa transformada é aumentado, e assim aatividade de CS, PEPC ou GDH é aumentada.
Como organismos para serem uma fonte do gene gltA, o geneppc ou o gene gdhA dos quais o número de cópia é aumentado, qualquerorganismo pode ser usado desde que tenha atividade de CS, PEPC ou GDH.Inter alia, bactérias, que são procariotos, por exemplo as pertencendo aosgêneros Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia,Corynebacterium, Brevibacterium e Bacillus são preferidas. Como exemplosespecíficos, pode-se mencionar Escherichia coli, Brevibacteriumlactofermentum e outras. O gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA pode serobtido de DNA cromossômico dos microorganismos descritos acima.
O gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA podem ser obtidosusando uma cepa mutante que é deficiente na atividade de CS, PEPC ou GDH,para isolar um fragmento de DNA que complementa a auxotrofia de DNAcromossômico dos microorganismos acima mencionados. Porque asseqüências de nucleotídeos dos gêneros de bactérias Escherichia eCorynebacterium já foram elucidadas (Biochemistry, 22, p. 5243-5249 (1983),J. Biochem. 95, p. 909-916 (1984), Gene 27, p. 193- 199 (1984),Microbiology, 140, p. 1817-1828 (1994), Mol. Gen. Genet. 218, p. 330-339(1989), Molecular Microbiology, 6, pag. 317- 326 (1992), eles também podemser obtidos por uso PCR de iniciadores sintetizados com base em cadaseqüência de nucleotídeo e DNA cromossômico como um gabarito.
A atividade de CS, PEPC, ou GDH, também pode seraumentada por melhora da expressão de gene gltA, o gene ppc ou o genegdhA além da amplificação acima mencionada dos genes. Por exemplo, aexpressão pode ser melhorada por substituição de um promotor para o genegltA, o gene ppc ou o gene gdhA com outros promotores mas fortes. Porexemplo, o promotor lac, o promotor trpfi promotor trc, o promotor tac, opromotor PR e o promotor Pl do fago lambda e assim em diante são conhecidoscomo promotores fortes. O gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA, do qual opromotor é substituído, são clonados em um plasmídeo e introduzidos nomicroorganismo hospedeiro, ou introduzidos no DNA cromossômico domicroorganismo hospedeiro por uso de DNA repetitivo, repetições invertidas,transposon ou outros.
A atividade de CS, PEPC, ou GDH também pode ser melhoradapor substituição do promotor do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA nocromossomo com outros promotores mais fortes (ver WO 87/03006 e pedidode patente JP acessível ao público no. 61-268183), ou inserido um promotorforte a montante da seqüência de codificação de cada gene (ver Gene, 29, p.231-241 (1984). Especificamente, recombinação homóloga pode ser realizadaentre DNA contendo o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA, do qual opromotor é substituído com um mais forte ou uma parte do mesmo e o genecorrespondente no cromossomo.
Exemplos da enzima que catalisa uma reação ramificando davia biossintética de ácido L-glutâmico e produzindo um composto diferente deácido L-glutâmico incluem -cetoglutarato desidrogenase (a seguir tambémreferido como " KGDH"), isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetatoquinase, acetohidroxi ácido sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato desidrogenase, 1-pirrolinadesidrogenase e assim em diante. Dentre estas enzimas, KGDH é preferida.
A fim de obter diminuição ou deficiência de atividade daenzima acima mencionada em um microorganismo pertencendo ao gêneroEnterobacter ou semelhante, mutação causando diminuição ou deficiência daatividade intracelular da enzima pode ser introduzida no gene da enzima acimamencionada por um processo de engenharia genética ou mutagênese.
Exemplos de processo de mutagêneses incluem, por exemplo,processos usando irradiação com raios X ou raio ultravioleta, processos usandotratamento com um agente mutagênico como N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina, e outros. O sítio onde a mutação é introduzida para o genepode estar em uma região de codificação codificando para uma proteína deenzima, ou uma região para regulagem da expressão como um promotor.
Exemplos de processos de engenharia genética incluem, porexemplo, processos usando recombinação de genes, transdução, fusão decélula e outros. Por exemplo, um gene de resistência a drogas é inserido em umgene de marcação clonado para preparar um gene que perdeu sua função (genedefectivo). Subseqüentemente, este gene defectivo é introduzido em umacélula de um microorganismo hospedeiro, e o gene de marcação nocromossomo é substituído com um gene defectivo acima mencionado por uso de recombinação homóloga (ruptura do gene).
A diminuição ou deficiência de atividade intracelular de enzimade marcação e o grau de diminuição da atividade podem ser determinados pormedida da atividade de enzima de uma extrato de célula ou uma fraçãopurificada da mesma obtida de uma cepa candidato e comparando com uma decepa selvagem. Por exemplo, a atividade KGDH pode ser medida peloprocesso de Reed et al (Reed L.J. e Mukheqee B.B. Methods in Enzymology,13, p. 55-61 (1969).
Dependendo da enzima de marcação, a cepa mutante demarcação pode ser selecionada com base no fenótipo da cepa mutante. Porexemplo, uma cepa mutante que é deficiente em atividade KGDH ou diminuina atividade KGDH não pode proliferar ou mostra uma taxa de proliferaçãomarcadamente reduzida em um meio mínimo contendo glucose ou um meiomínimo contendo ácido acético ou ácido L-glutâmico como uma fonte decarbono exclusiva sob condições aeróbicas. No entanto, a proliferação normalé capacitada mesmo sob a mesma condição por adição de ácido succínico oulisina, metionina e ácido diaminopimélico para um meio mínimo contendoglucose. Ao usar estes fenômenos como indicadores, cepas mutantes comdiminuída atividade KGDH ou deficiente em atividade podem serselecionadas.Um processo para preparar a cepa deficiente em gene KGDHde Brevibacterium lactofermentum por uso de recombinação homóloga édescrito em detalhes em WO 95/ 34672. Processos similares podem seraplicados a outros microorganismos.
Além disso, técnicas como clonagem de genes e clivagem eligação de DNA5 transformação e assim em diante, são descritos em detalhesem Molecular Cloning, 2a, ed, Cold Spring Harbor Press, 1989 e outros.
Como um exemplo específico de cepa mutante deficiente ematividade KGDH ou com diminuída atividade KGDH obtida comomostrado acima, pode-se mencionar Enterobacter agglomerans AJl3356.Enterobacter agglomeransAJl3356 foi depositada no National Institute ofBioscience and Human Technology da Agency of Industrial Science andTechnology do Ministério da Indústria e Comércio Internacional (códigopostal 305, 1-3- Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibarakik, Japão) em 19 defevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16645. Ele foientão transferido para um depósito internacional sob as provisões do Tratadode Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu o número de acesso FERMBP-6615. O Enterobaeter agglomerans AJl3356 é deficiente em atividadeKGDH como resultado de ruptura de gene de subunidade KGDH-El {sueA).
Quando Enterobaeter agglomerans, um exemplo domicroorganismo usado na presente invenção, é cultivado em um meiocontendo um sacarídeo, um material viscoso é extracelularmente secretado,resultando em baixa eficiência de operação. Assim, quando Enterobaeteragglomerans tendo esta propriedade de secreção do material viscoso é usado, épreferível usar uma cepa mutante que secreta menos o material viscosocomparado com a cepa selvagem. Exemplos de processo de mutagênesesincluem, por exemplo, processos usando irradiação com raios X ou raioultravioleta, processos usando tratamento com um agente mutagênico como N-metil-N-nitro-N- nitrosoguanidina, e outros. Uma cepa mutante comdiminuída secreção de material viscoso pode ser selecionada por inoculação decélulas bacterianas mutageneizadas em um meio contendo um sacarídeo, porexemplo meio placa LB contendo 5 g/L de glucose, cultivando com inclinaçãoda placa cerca de 45 graus e selecionando uma colônia que não mostraflutuação de líquido.
Na presente invenção, conferir ou melhorar capacidade deprodução de ácido L-glutâmico e conferir outras propriedades favoráveis comomutação para secreção de material menos viscoso descrito acima podem serrealizados em uma ordem arbitrária.
Por cultivo do microorganismo da presente invenção em ummeio líquido do qual pH é ajustado a um pH em que ácido L-glutâmico éprecipitado, ácido L-glutâmico pode ser produzido e acumulado porprecipitando do mesmo no meio. Ácido L-glutâmico também pode serprecipitado por partida da cultura em um pH neutro e então terminando omesmo em um pH em que o ácido L-glutâmico é precipitado.
O pH em que ácido L-glutâmico é precipitado significa um emque ácido L-glutâmico é precipitado quando o microorganismo produz eacumula ácido L-glutâmico.
Como o meio acima mencionado, um meio nutriente comumcontendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais minerais enutrientes de traço orgânicos, como aminoácidos e vitaminas, como requerido,podem ser usados desde que o pH seja ajustado a um pH em que o ácido L-glutâmico é precipitado. Ou um meio sintético ou um meio natural podem serusados. A fonte de carbono e a fonte de nitrogênio usadas no meio podem serqualquer uma desde que possam ser usadas pela cepa cultivada.
Como a fonte de carbono, sacarídeos como glucose, glicerol,fructose, sacarose, maltose, mannose, galactose, hidrolisado de amido emelaços são usados. Além disso, ácidos orgânicos, como ácido acético e ácidocítrico podem ser usados cada sozinho ou em combinação com outra fonte decarbono.
Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio, comosulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio,e acetato de amônio, nitratos e assim em diante são usados.
Como os nutrientes de traço orgânicos, aminoácidos, vitaminas,ácidos graxos, ácido nucleico, os contendo estas substancias como peptona,ácido casamino, extrato de levedura e produtos da decomposição de proteínade soja são usados. Quando uma cepa mutante auxotrófica que requer umaminoácido e outros para metabolização ou crescimento é usada, o nutrienterequerido deve ser suplementado.
Como sais minerais, fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio,sais de ferro, sais de manganês e outros são usados.
Como para o processo de cultura, cultura de aeração égeralmente realizada com controle da temperatura de fermentação a 20 a 42 C,e pH de 3 a 5, preferivelmente 4 a 5, mais preferivelmente 4 a 4,7,particularmente preferivelmente 4 a 4,5. Assim, após cerca de 10 horas a 4 diasde cultura, uma quantidade substancial de ácido L-glutâmico é acumulada nacultura. O ácido L-glutâmico acumulado excedendo a quantidadecorrespondente para a concentração de saturação é precipitado no meio.
Após completar a cultura, ácido L-glutâmico precipitado nacultura pode ser coletado por centrifugação, filtragem ou outros. O ácido L-glutâmico dissolvido no meio pode ser coletado de acordo com os processosconhecidos. Por exemplo, o ácido L-glutâmico pode ser isolado porconcentração do caldo de cultura para cristalizar o mesmo ou isolar porcromatografia de troca de íons ou outro. O ácido L-glutâmico precipitado nocaldo de cultura pode ser isolado junto com ácido L-glutâmico que foidissolvido no meio após ser cristalizado.
De acordo com o processo da presente invenção, ácido L-glutâmico excedendo a quantidade correspondendo à concentração desaturação é precipitado, e a concentração de ácido L-glutâmico dissolvido nomeio é mantida em um nível constante. Assim, influência de ácido L-glutâmicoem uma maior concentração em microorganismos pode ser reduzida.Consequentemente, se torna possível criar um microorganismo tendo outramelhorada capacidade de produção de ácido L-glutâmico. Além disso, porqueácido L-glutâmico é precipitado como cristais, a acidulação do caldo de culturapor acúmulo de ácido L-glutâmico é suprimida, e assim a quantidade de álcaliusada para manter o pH da cultura pode ser reduzida de modo significante.
EXEMPLOS
A seguir, a presente invenção será melhor especificamenteexplicada com referência aos seguintes exemplos.
<1> Triagem de microorganismos tendo resistência a ácido L-glutâmico em meio ácido.
A triagem de um microorganismo tendo resistência a ácido L-glutâmico em um meio ácido foi realizada como a seguir. Cada uma de cercade 500 amostras obtidas a partir da natureza, incluindo solo, furtas, corpos deárvore, água do rio, em uma quantidade de 1 g foi colocada em suspensão em 5mL de água esterilizada, da qual 200 L foram revestidos em 20 mL de meiosólido do qual o pH foi ajustado a 4,0 com HCl. A composição do meio foi aseguinte:
3 g/L of glicose, 1 g/L de (NH4) ZSO4, 0,2 g/L de MgSO4-7H20, 0,5 g/L OfKH2PO4, 0,2 g/L de NaCl, 0,1 g/L de CaCl2-7H20, 0,01 g/Lde FeS04-7H40, 0,01 g/L de MnS04-4H20, 0,72 mg/L de ZnS04-2H20, 0,64mg/L de CuS04-5H20, 0,72 mg/L de CoCl2-6H20, 0,4 mg/L de ácido bórico,1,2 mg/L de Na2Mo04-2H20, 50 g/L de biotina, 50 g/L de pantotenato decálcio, 50 g/L de ácido fólico, 50 g/L de inositol, 50 g/L de niacina, 50g/L de ácido p-aminobenzóico, 50 g/L de cloridrato de piridoxina, 50 g/L deriboflavina, 50 g/L de cloridrato de tiamina, 50 mg/L de cicloheximida, 20g/L de agar.O meio colocado em placas das amostras acima foi incubado a28 C, 37 C, ou 50 C, durante 2 a 4 dias, e 378 cepas cada formando umacolônia, foi obtido.
Subseqüentemente, cada uma das cepas obtida como descritoacima foi inoculada em um tubo de teste de 16,5 cm de comprimento e 14 mmde diâmetro contendo 3 mL de meio líquido (ajustado a pH 4,0 com HCl),contendo uma concentração de saturação de ácido L-glutâmico e cultivado a 28C, 37 C ou 50 C durante 24 h durante 3 dias com agitação. Assim, as cepasde crescimento foram selecionadas. A composição do meio acima mencionadofoi a seguinte: 40 g/L de glucose,
20 g/L de (NH4)2SO4, 0,5 g/L de MgS04-7H20, 2 g/L deKH2PO4, 0,5 g/L de NaCl5 0,25 g/L de CaCl2-7H20, 0,02 g/L de FeSO4-7H20, 0,02 g/L de MnS04-4H20, 0,72 mg/L de ZnS04-2H20, 0,64 mg/L deCuS04-5H20, 0,72 mg/L de CoCl2-6H20, 0,4 mg/L de ácido bórico, 1.2 mg/Lde Na2Mo04-2H20,2 g/L de extrato de levedura.
Assim 78 cepas de microorganismos tendo resistência a ácidoL-glutâmico em um meio ácido foram obtidas com sucesso.
<2> Seleção de cepas com taxa de crescimento superior emmeio ácido a partir de microorganismos tendo resistência a ácido L-glutâmico
Os vários microorganismos tendo resistência a ácido L-glutâmico em meio ácido obtidos como descrito acima foram, cada, inoculadosem um tubo de teste de 16,5 cm de comprimento e 14 mm de diâmetrocontendo 3 mL de meio (ajustado a pH 4,0 com HCl) obtido por adição de 20g/L de ácido glutâmico e 2 g/L de glucose para meio M9 (Sambrook, J. Fritsch,E.F. e Maniatis, Molecular Biology, A laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989), e a turvação do meio foi medida no curso do tempopara selecionar cepas com uma taxa de crescimento favorável. Como resultado,como uma cepa mostrando crescimento favorável, a cepa AJl3355 foi obtidode um solo de Iwata-Shi, Shizuoka, Japão. Esta cepa foi determinada comoEnterobacter agglomerans com base em suas propriedades bacteriológicasdescritas acima.
<3> Aquisição de cepa com secreção de material menosviscoso de Enterobacter agglomerans cepa AJl 3355
Porque Enterobacter agglomerans cepa AJl 3355 secretaextracelularmente um material viscoso quando cultivada em um meio contendoum sacarídeo, a eficácia de operação não é favorável. Assim, uma cepa comsecreção de material menos viscoso foi obtida pelo processo de irradiação deultravioleta (Miller, J.H. et al, "A Short Course in Kacterial GEnetics:Laboratory Manual", p. 150, Cold Spring Harbor LaboratonrPress 1992).
A Enterobacter agglomerans cepa Aj 13355 foi irradiada comultra-violeta durante 2 min na posição 60 cm afastada de uma lâmpadaultravioleta 60 W e cultivada em meio LB durante a noite para fixar mutação.A cepa que sofreu mutação foi diluída e inoculada em meio LB contendo 5 g/Lde glucose e 20 g/L de agar, de modo que cerca de 100 colônias por placa iriamemergir e cultivar a 30 C durante a noite com inclinação da placa cerca de 45graus, e então 20 colônias não mostrando fluxo descendente do materialviscoso foram selecionadas.
Como uma cepa atendendo a condições que nenhum reversoemergiu mesmo após 5 vezes de subcultura em meio LB contendo 5 g/L deglucose e 20 g/L de agar, e que se pode observar crescimento equivalente àcepa parental em meio LB, meio LB contendo 5 g/L de glucose e meio M9,(Sambrook et al, Molecular Biology, 2a.ed, Cold Spring Harbor Press, 1989), àqual 20 g/L de ácido L-glutâmico e 2 g/L de glucose foram adicionados e dasquais o pH foi ajustado a 4,5 com HCl5 cepa SC17 foi selecionada para ascepas selecionadas acima.
<4> Construção de bactéria produzindo ácido L-glutâmico apartir de Enterobacter agglomerans cepa SC17
(1) preparação de cepa deficiente em KGDH de Enterobacteragglomerans cepa SC17
Uma cepa deficiente em KGDH e com sistema biossintéticode ácido L-glutâmico melhorado foi preparada de Enterobacter agglomeranscepa SC17.
(i) Clonagem de gene KGDH (a seguir também referido como"sucAB") de Enterobaeter agglomerans cepa AJl3355
O gene sueAB de Enterobaeter agglomerans cepa AJ13355 foiclonado por seleção de um fragmento de DNA complementando a propriedadenão assimilante de ácido acético de gene de subunidade KlGDH -El (a seguir referido como "sueA" ) cepa deficiente de Eseherichia eoli de DNAcromossômico de Enterobaeter agglomerans cepa AJ13355.
O DNA cromossômico de Enterobaeter agglomerans cepaAJ13355 foi isolado por um processo geralmente empregado quando DNAcromossômico foi extraído de Eseherichia eoli (Text Ibr Bioengineering Experiments, editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão,p. 97-98, Baifukan, 1992). O pTWV228 (resistente a ampicilina) usado comoum vetor foi comercialmente disponível de Takara Shuzo Co., Ltd.
O DNA cromossômico de cepa AJl 3355 digerida comEcoT221 e pTWV228 digerido com PstI foi ligado por uso de ligase T4 e usado para transformar a cepa Eseheriehia eoli JRG465 deficiente em sue A.(Herbert, J. et al, Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Uma cepa crescendoem um meio mínimo de acetato foi selecionada de cepas transformantes acima,e um plasmídeo foi extraído do mesmo e designado como pTWVEK101. Acepa Eseheriehia eoli JRG465 abrigando pTWVEK101 recuperou auxotrofia para ácido succínico ou L-lisina e L-metionina além de; propriedades deassimilação de ácido acético. Isto sugere que pTWYEKl01 contém o genesucA de Enterobaeter agglomerans.
A figura 1 mostra o mapa de restrição de fragmento de DNAderivado de Enterobaeter agglomerans em pTWVEK101. A seqüência denucleotídeo determinada da porção eclodida na figura 1 é mostrada como SEQID NO: 1. Nesta seqüência, as seqüências de nucleotídeos; consideradas comosendo dois ORFs de comprimento completo e duas seqüências de nucleotídeosconsideradas como sendo seqüências parciais de ORFs foram encontradas.
SEQ ID NO: 2 a 5 mostram seqüências de aminoácidos que podem sercodificadas por estes ORFs ou seqüências parciais em uma ordem daextremidade 5'. Como resultado de busca de homologia paia estes, foi reveladoque a porção de seqüências de nucleotídeos foi determinada continha umaextremidade 3' da seqüência parcial de gene de proteína de ferro-enxofresuccinato desidrogenase (sdhB), sucA de comprimento completo e gene desubunidade KGDH -E2 (swcB) e 5'- extremidade seqüência parcial de genesubunidade succinil CoA sintetase. (sucC). Os resultados da comparação deseqüências de aminoácidos deduzidas destas seqüências de nucleotídeos comas derivadas de Escherichia coli (Eur. J. Biochem. 141, p. 351-359 (1984);Eur. J. Biochem. 141, p. 361-374 (1984), Biochemistry, 24, p. 6245- 6252(1985), são mostrados nas figuras 2 a 5. Assim, as seqüências de aminoácidosmostraram cada homologia muito alta. Além disso, verificou-se que umagrupamento de sdhB-sucA-sucB-sueC foi constituído no cromossomo deEnterobacter agglomerans como em Eseheriehia coli (Eur. J. Biochem. 141, p.351-359 (1984), Eur. J. Biochem. 141, p. 361-374 (1984), Biochemistry, 24, p.6245-6252 (1985).
(ii) Aquisição de cepa deficiente em KGDH derivada deEnterobaeter agglomerans cepa SC17
A recombinação homóloga foi realizada usando o gene sueABde Enterobaeter agglomerans obtido como mostrado acima para obter umacepa deficiente em KGDH de Enterobaeter agglomerans.
Após pTWVEKlOl ser digerido com Sph\ para excisar umfragmento contendo sue A, o fragmento foi terminado cego com fragmentoKlenow (Takara Shuzo Co., Ltd.) e ligado com pBR322 digerido com EcoRIqterminado cego com fragmento Klenow usando ligase de DNA T4 (TakaraShuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi digerido no sítio de reconhecimentoBg1II da enzima de restrição posicionado substancialmente no centro de sucApor uso desta enzima, terminado cego com fragmento Klenow, e então ligadonovamente por uso de ligase de DNA T4. Foi considerado que o gene sucA nãofunciona porque uma mutação de armação foi introduzida no sucA doplasmídeo recentemente construído através do procedimento acima.
O plasmídeo construído como descrito acima foi digerido comenzima de restrição ApaLI, e submetido a eletroforese de gel agarose pararecuperar o fragmento de DNA contendo sueA em que a mutação de armaçãofoi introduzida e um gene de resistência a tetraciclina derivado de pBR322. Ofragmento de DNA recuperado foi ligado novamente por uso de ligase DNAT4 para construir um plasmídeo para romper o gene KGDH.
O plasmídeo para romper o gene KGDH obtido como acimamencionado foi usado para transformar o Enterobacter agglomerans cepaSC17 por eletroporação (Miller, J.H. "A Short Course in Bacterial Genetics:Handbook", p. 279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1992), e umacepa em que sucA no cromossomo foi substituída com um tipo mutante porrecombinação homóloga do plasmídeo foi obtida por uso de resistência atetraciclina como um indicador. A cepa obtida foi designada como cepaSC17sucA.
A fim de confirmar que a cepa SC17sucA foi deficiente ematividade KGDH, a atividade de enzima foi medida pelo processo de Reed etal (Reed, LJ. e Mukheijee, B.B. Methods in Enzymology, 13, pag. 55-61,(1969)) por uso de células de cepa cultivada em meio LB até a fase decrescimento logarítmico. Como resultado, a atividade KGDH de 0,073 (ABS/min/mg proteína) foi detectada de cepa SC17, enquanto nenhumaatividade KGDH foi detectada de cepa SC17sucA, e assim foi confirmadoque este sucA era deficiente, como de propósito.(2) Melhora de sistema biossintética de ácido L-glutâmico deEnterobacter agglomerans cepa SC17sucA
Subseqüentemente, um gene citrato sintase, um genefosfoenolpiruvato carboxilase e um gene glutamato desidrogenase derivado deEscherichia eoli foram introduzidos na cepa SC17sucA.
(i) preparação de plasmídeo tendo gene glt.4, gene ppe e genegdhA derivado de Eseheriehia eoli
Os procedimentos para preparar um plasmídeo tendo gene gltA,gene ppe e gene gdhA serão explicados por referência às figuras 6 e 7.
Um plasmídeo tendo um gene gdhA derivado de Escherichiaeoli, pBRGDH (pedido de patente JP acessível ao público no. 7-203980), foidigerido com HindIII e SphI, as extremidades foram terminadas cegas pelotratamento com polimerase DNA T4, e então o fragmento de DNA tendo ogene gdhA foi purificado e recuperado. Separadamente, um plasmídeo tendoum gene gltA e um gene ppe derivado de Eseheriehia eoli, pMWCP (WO97/08294), foi digerido com Xbal, e então ambas as extremidades foramterminadas cegas usando polimerase de DNA T4. Esta foi misturada com ofragmento de DNA acima purificado tendo o gene ghdA e ligado por uso deligase T4 para obter um plasmídeo pMWCPG, que corresponde a pMWCPainda contendo o gene gdhA (figura 6).
Ao mesmo tempo, o plasmídeo pVIC40 (pedido de patente JPacessível ao público no. 8-047397) tendo a origem de replicação de espectro dehospedeiro amplo plasmídeo RSF1010 foi digerido com NotI, tratado compolimerase de DNA T4 e digerido com PstI. PBR322 foi digerido comEcoTX Al, tratado com polimerase de DNA T4 e digerido com Pst\. Ambos osprodutos foram misturados e ligados por uso de ligase T4 para obter umplasmídeos RSF-Tet tendo a origem de replicação e RSFl010 e gene deresistência a tetraciclina (figura 7).
Subseqüentemente, pMWCPG foi digerido com EcoRI e Pstl, eum fragmento de DNA tendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA, foipurificado e recuperado. RSF-Tet foi similarmente digerido com EcoRI e Pstl,e um fragmento de DNA tendo a origem de replicação de RSF1010 foipurificado e recuperado. Ambos os produtos foram misturados e ligados poruso de ligase T4 para obter um plasmídeo RSFCPG, que correspondia a RSF-Tet contendo gene gltA, gene ppc e gene gdhA (figura 8). Foi confirmado que oplasmídeo obtido RSFCPG expresso do gene gltA, gene ppc e gene gdhA, pelacomplementação de auxotrofia de cepa deficiente em gene gltA, ppc e gdhAderivada de Escherichia coli e medida de cada atividade de enzima.(ii) Preparação de plasmídeo tendo gene gltA derivado de
Brevibacterium lactofermentum
Um plasmídeo tendo o gene gltA derivado de Brevibacteriumlactofermentum foi construído como a seguir. PCR foi realizado por uso deDNAs de iniciador tendo as seqüências de nucleotídeos representadas por SEQID NO: 6 e 7, que foram preparadas com base na seqüência de nucleotídeos degene gltA de Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, positivo.1817-1828 (1994)), DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentumATCC13869 como um gabarito para obter um fragmento de gene gltA de cercade 3kb. Este fragmento inserido em um plasmídeo pHSG'r399 (adquirido deTakara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Smal para obter um pl asmídeo pHSGCG(figura 9). Subseqüentemente, pHSGCB foi digerido com HindIII, e ofragmento de gene gltA excisado de cerca de 3 kb foi inserido em umplasmídeo pSTV29 (adquirido de Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido comHindlll para obter um plasmídeo pSTVCB (figura 9). Foi confirmado que oplasmídeo obtido pSTVCB expressou o gene gltA, por medida da atividade deenzima em Enterobacter agglomerans cepa AJ13355.
(iii) Introdução de RSFCPG e pSTVCB em cepa sC17sucAEnterobacter agglomerans cepa SC17sucA foi transformadoem RSFCPG por eletroporação para obter uma cepa SC17sucA/RSFCPGtransformante tendo resistência a tetraciclina. Além disso, a cepaSC17sucA/RSFCPG foi transformada com pSTVCB por eletroporação paraobter uma cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB transformante tendo resistênciaa cloranfenicol.
<4> Aquisição de cepa com melhorada resistência a ácido L-glutâmico em meio de baixo pH
Uma cepa com melhorada resistência a ácido L-glutâmico auma alta concentração de um meio de baixo pH (a seguir também referidocomo "cepa resistente a Glu de alta concentração em baixo pH") foi isolada decepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB de Enterobacter agglomerans.
A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi cultivada durante anoite a 30 C em meio LBG (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10g/L de NaCl, 5 g/L de glucose), e as células lavadas com solução salina foramdiluídas de modo apropriado e colocadas em placa em meio M9-E (4 g/L deglucose, 17 g/L de Na2HPO4.12H20, 3 g/L de KH2PO4, o,5 g/L de NaCl, 1 g/Lde NH4Cl, 10 mM de MgSO4,10 M de CaCl2,50 mg/L de L-lisina, 50 mg/L deL-metionina, 50 mg/L de DL-ácido diaminopimélico, 25 mg/L de tetraciclina, 25mg/L de cloranfenicol, 30 g/L de ácido L-glutâmico, ajustado a pH 4,5 comamônia aquosa). A colônia emergiu após cultura a 32 C durante 2 dias foiobtida como uma cepa resistente a Glu de alta concentração em baixo pH.
Para a cepa obtida, o nível de crescimento em meio líquido M9-E foi medido e a capacidade de produção de ácido L-glutâmico foi testada cmum tubo de teste grande de volume de 50 ml contendo 5 ml cle meio de teste deprodução de ácido L-glutâmico (40 g/L de glucose, 20 g/ L de (NH4)2SO4, 0,5g/L de MgS04.7H20, 2 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 0,25 g/L deCaCl2JH2O, 0,02 g/L de FeS04.7H20, 0,02 g/L de MnS04.4H20, 0,72 mg/Lde ZnS04.2H20, 0,64 mg/L de CuS04.5H20, 0,72 mg/L de CoCl2. 6H20, 0,4mg/L de ácido bórico, 1,2 mg/L de Na2Mo04.2H20, 2 g/L de extrato delevedura, 200 mg/L de cloridrato de L-lisina, 200 mg/L de L-metionina, 200mg/L de ácido DL- , -diaminopimélico, 25 mg/L de cloridrato de tetraciclina,25 mg/L de cloranfenicol). Uma cepa que demonstrou o melhor nível decrescimento e a mesma capacidade de produção de ácido L-glutâmico como ade sua cepa parental, a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, foi designadacomo Enterobacter agglomerans AJ13601. A cepa AJ13601 foi depositadajunto ao National Institute of Bioscience and Human Technology da Agency ofIndustrial Science and Technology do Ministério da Indústria e ComércioInternacional (código postal 305, 1-3- Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki,Japão) em 18 de agosto de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM Ρ-17516. Ele foi então transferido para um depósito internacional sob asprovisões do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e recebeu o númerode acesso FERM BP-7207.
<5> Cultura de Enterobacter agglomerans cepa AJ13601 paraprodução de ácido L-glutâmico (1)
Enterobacter agglomerans cepa AJ13601 foi inoculado em umfermentador de jarra de 1 L contendo 300 ml de meio contendo 40 g/L deglucose, 20 g/ L de (NH4)2SO4,0,5 g/L de MgS04.7H20,2 g/L de KH2PO4,0,5g/L de NaCl, 0,25 g/L de CaCl2.7H20, 0,02 g/L de FeSO4 JH2O, 0,02 g/L deMnS04.4H20, 0,72 mg/L de ZnS04.2H20, 0,64 mg/L de CuS04.5H20, 0,72mg/L de CoCl2. 6H20,0,4 mg/L de ácido bórico, 1,2 mg/L de Na2Mo04.2H20,2 g/L de extrato de levedura, 200 mg/L de cloridrato de L-lisina, 200 mg/L deL-metionina, 200 mg/L de ácido DL- , -diaminopimélico, 25 mg/L decloridrato de tetraciclina, e 25 mg/L de cloranfenicol, e cultivado a 34 C e pH6,0 durante 14 h. O pH da cultura foi controlado por introdução de gás amôniano meio.
A cultura obtida como descrito acima foi centrifugada a 5000rpm durante 10 min, e as células coletadas foram inoculadas em umfermentador de jarra de 1 L contendo 300 ml de meio contendo 40 g/L deglucose, 5 g/ L de (NH4)2SO4, 1,5 g/L de MgSO4JH2O, 6 g/L de KH2PO4, 1,5g/L de NaCl5 0,75 g/L de CaCl2JH2O, 0,06 g/L de FeS04.7H20, 0,06 g/L deMnS04.4H20, 2,16 mg/L de ZnS04.2H20, 1,92 mg/L de CuS04.5H20, 2,16mg/L de CoCl2. 6H20,1,2 mg/L de ácido bórico, 3,6 mg/L, de Na2Mo04.2H20,6 g/L de extrato de levedura, 600 mg/L de cloridrato de L-lisina, 600 mg/L deL-metionina, 600 mg/L de ácido DL-, -diaminopimélico, 25 mg/L decloridrato de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol e cultivados a 34 C e pH4,5 para realizar a cultura para produção de ácido L-glutâmico. O pH da culturafoi controlado por introdução de gás amônia no meio. Como a glucoseinicialmente adicionada foi depletada, 600 g/L de glucose foi continuamenteadicionada.
Como um resultado da cultura para produção de ácido L-glutâmico realizada durante 50 h como descrito acima, uma quantidadesubstancial de cristais de ácido L-glutâmico foi precipitadai no fermentador dejarra. A tabela 1 mostra a concentração de ácido L-glutâmico dissolvido nocaldo de cultura neste momento e a concentração de ácido L-glutâmico medidapor dissolução de cristais em hidróxido de potássio 2M. Os cristais de ácido L-glutâmico foram coletados da cultura por decantação após a cultura ser deixadapermanecer.
Tabela 1
<table>table see original document page 32</column></row><table>
<6> Cultura de Enterobacter agglomerans cepa AJl 3601 paraprodução de ácido L-glutâmico (2)
A seguinte experiência foi realizada a fim de confirmar queEnterobacter agglomerans cepa AJ13601 ainda tinha capacidade de produçãode ácido L-glutâmico mesmo sob a condição que estivessem presentes cristaisde ácido L-glutâmico.
Enterobacter agglomerans cepa AJ13601 foi inoculado comum fermentador de jarra de 1 L contendo 300 ml de meio contendo 40 g/L deglucose, 20 g/ L de (NH4)2SO4,0,5 g/L de MgSO4JH2O,2 g/L de KH2PO4, 0,5g/L de NaCl, 0,25 g/L de CaCl2JH2O, 0,02 g/L de FeSO4JH2O, 0,02 g/L deMnS04.4H20, 0,72 mg/L de ZnS04.2H20, 0,64 mg/L de CuS04.5H20, 0,72mg/L de CoCl2. 6H20, 0,4 mg/L de ácido bórico, 1,2 mg/L de Na2Mo04.2H20,2 g/L de extrato de levedura, 200 mg/L de cloridrato de L-lisina, 200 mg/L deL-metionina, 200 mg/L de ácido DL- , -diaminopimélico, 25 mg/L decloridrato de tetraciclina, e 25 mg/L de cloranfenicol, e cultivado a 34 C a pH6,0 durante 14 h. O pH da cultura foi controlado por borbulhamento do meiocom gás amônia. A cultura obtida como acima foi centrifugada a 5000 rpmdurante 10 min, e então as células coletadas foram cultivadas em um meioonde ácido L-glutâmico estava presente como cristais. O meio usado continha40 g/L de glucose, 5 g/ L de (NH4)2SO4, 1,5 g/L de MgS04.7H20, 6 g/L deKH2PO4, 1,5 g/L de NaCl, 0,75 g/L de CaCl2.7H20, 0,06 g/L de FeSO4JH2O,0,06 g/L de MnS04.4H20, 2,16 mg/L de ZnS04.2H20, 1,92 mg/L deCuS04.5H20, 2,16 mg/L de CoCl2. 6H20, 1,2 mg/L de ácido bórico, 3,6 mg/Lde Na2Mo04.2H20, 6 g/L de extrato de levedura, 600 mg/L de cloridrato de L-lisina, 600 mg/L de L-metionina, 600 mg/L de ácido DL- ,diaminopimélico, 25 mg/L de cloridrato de tetraciclina, e 25 mg/L decloranfenicol e cristais de ácido L-glutâmico foram adicionados a 40 g/L. Ascélulas foram inoculadas em um fermentador de jarra de 1 L contendo 300 mldeste meio e cultivadas a 34 C e pH 4,3 para realizar a cultura para produçãode ácido L-glutâmico. O pH da cultura foi controlado por introdução de gásamônia no meio. Como a glucose inicialmente adicionada foi depletada, 600g/L de glucose foram continuamente adicionados. Neste meio, somente 39 g/Lde ácido L-glutâmico adicionado foram dissolvidos em pH 4,3 e o restante 1g/L estava presente como cristais.
Como resultado da cultura para produção de ácido L-glutâmicorealizada durante 53 horas, como descrito acima, uma quantidade substancialde cristais de ácido L-glutâmico foi preparada no fermentador de jarro. Atabela 2 mostra a concentração de ácido L-glutâmico dissolvido no caldo decultura, a quantidade de ácido L-glutâmico presente como cristais nestemomento e a concentração de ácido L-glutâmico medida por dissolução doscristais em solução 2M KOH. Os cristais de ácido L-glutâir.iico foram coletadosda cultura por decantação após a cultura ser deixada permanecer. Os resultadosmostraram que Enterobacter agglomerans cepa AJ13601 acumulou ácido L-glutâmico e seus cristais precipitados, mesmo sob a condição que cristais deácido L-glutâmico estavam presentes.
Tabela 2
<table>table see original document page 34</column></row><table>
<7> Cultura de Enterobaeter agglomerans cepa AJ13601 paraprodução de ácido L-glutâmico (3)
Enterobaeter agglomerans cepa AJ13601 pode crescer nãosomente em um pH ácido, mas também em um pH neutro. Assim, foiconfirmado, como a seguir, que cristais de ácido L-glutâmico poderiamtambém ser precipitados por início da cultura em um pH neutro e permitindo aprodução de ácido L-glutâmico durante a cultura, de modo que o pH da culturapoder ser espontaneamente abaixo.
Células de uma placa (8,5 cm em diâmetro) de Enterobaeteragglomerans cepa AJl 3601, cultivado em meio agar LBG, (10 g/L triptona, 5g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de glucose, 15 g/L de agar)contendo 25 mg/L de cloridrato de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol a 30C durante 14 h, foram inoculadas em um fermentador de jarra de 1 Lcontendo 300 ml de meio contendo 40 g/L de glucose, 5 g/ L de (NH4)2SO4,1,5 g/L de MgS04.7H20, 6 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de NaCl, 0,75 g/L deCaCl2.7H20, 0,06 g/L de FeS04.7H20, 0,06 g/L de MnS04.4H20, 2,16 mg/Lde ZnS04.2H20, 1,92 mg/L de CuS04.5H20, 2,16 mg/L de CoCl2. 6H20, 1,2mg/L de ácido bórico, 3,6 mg/L de Na2Mo04.2H20, 6 g/L de extrato delevedura, 600 mg/L de cloridrato de L-lisina, 600 mg/L de L-metionina, 600mg/L de ácido DL- , -diaminopimélico, 25 mg/L de cloridrato de tetraciclina,e 25 mg/L de cloranfenicol e a cultura iniciada a 34 C e pH 7,0. O pH dacultura foi controlado por introdução de gás amônia no meio. Como a glucoseinicialmente adicionada foi depletada 600 g/L de glucose foram continuamenteadicionados.
A medida que o ácido L-glutâmico é acumulado, o pH abaixaespontaneamente. A quantidade de gás amônia introduzido foi ajustada demodo que o pH pode ser gradualmente abaixado de 7,0 a 4,5 durante o períodoentre 15 h e 24 h após o início da cultura, e 24 h após o início da cultura, o pHse tornou 4,5. Depois, o cultivo foi continuado durante 12 horas.
Como resultado da cultura para produção de ácido L-glutâmicoconduzida durante 36 h como descrito acima, uma quantidade substancial decristais de ácido L-glutâmico foi precipitada no fermentador de jarra. A tabela3 mostra a concentração de ácido L-glutâmico dissolvido no caldo de cultura, aquantidade de ácido L-glutâmico presente como cristais neste momento e aconcentração de ácido L-glutâmico medida por dissolução dos cristais emsolução KOH 2 M. Os cristais de ácido L-glutâmico foram coletados da culturapor decantação após a cultura ser deixada permanecer.
Tabela 3
<table>table see original document page 35</column></row><table>Listagem da Sequencia
<110> Ajincmoto Co., Ine.
<120> PROCESSO PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO POR FERMENTAÇÃOACOMPANHADA POR PRECIPITAÇÃO
<130>
<150> JP 11-234806<151> 1999-08-20
<150> JP 2000-78πΐ<151> 2000-03-21
<160> 7
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1<211> 4556
<212> ONA
<213> Enterobacter agglcmerans
<220>
<221> CDS
<222> (2)..(121)
<220><221> COS
<222> (322)..(3129)
<220><221> COS
<222> (3145)..(4368)
<220><221> CDS
<222> (4437)..(4556)<400> 1
t gca ttc age gtt ttc cgc tgt cac age ate atg aac tgt gta agt gtt 49Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser [le Met Asn Cys Val Ser Val15 10 15
tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct ate ggc cac att aag tcg 97Cys Pro Iys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His He Iys Ser
20 25 30
atg ctg ctg caa cgc age gcg tagttatacc accgggaacc tcaçgttccc U3Met Leu Leu Gln Arg Ser Alaggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208Qggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324
Met1
cag aac age gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc 372Gln Asn Ser Ala Met Lys Prc Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly 5 10 15 gcg aat cag tet tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat 420Ala Asn Gln 20 Ser Tyr Ile Glu Gln 25 Leu Tyr Glu Asp Phe 30 Leu Thr Asp cct gac tet gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca 468Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu Pro 35 40 45 ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat 516Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr 50 55 60 65 ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tet cgt tac acc tcc tca gtt acc 564Phe Arg Arg Leu Ala 70 Lys Asp Ala Ser Arg 75 Tyr Thr Ser Ser Val 80 Thr gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612Asp Pro Ala Thr 85 Asn Ser Lys Gln Val 90 Lys Val Leu Gln Leu Ile 95 Asn gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc 660Ala Phe Arg 100 Phe Arg Gly His Gln 105 Glu Ala Asn Leu Asp 110 Pro Leu Gly ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat 708Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp 115 120 125 ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa age ttt aac gta ggt tet ttt gcc 75ôLeu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala 130 135 140 145 att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804Ile Gly Lys Glu Thr 150 Met Lys Leu Ala Asp 155 Leu Phe Asp Ala Leu 160 Lys cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca gag tat atg cac ate aat aac 852Gln Thr Tyr Cys 165 Gly Ser Ile Gly Ala 170 Glu Tyr Met His Ile Asn 175 Asn acc gaa gag aaa cgc tgg ate cag cag cgt ate gaa tcc ggt gcg age 9C0Tnr Glu Glu 180 Lys Arg Trp Ile Gln 185 Gln Arg Ile Glu Ser 190 Gly Ala Ser cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu 195 2C0 205 acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly 210 215 220 225 gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg 1044Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu 230 235 240 cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa age ggc aca cgt gaa gtg gta 1092Arg Glu Met Ile 245 Arg His Ala Gly Lys 250 Ser Gly Thr Arg Glu Val 255 Valctg ggg atgLeu Gly Met260
ggt aaa aagGly Lys Lys
275gag cat ctgGlu His Leu290
gat att gaaAsp Ile Glu
ccg tct cacPro Ser His
gca cgt ctcAla Arg Leu340
ate acc attIle Thr Ile
355gaa acc ctgGlu Thr Leu370
gta cgt ateVal Arg Ile
aaa gat gcgLys Asp Ala
ctg gca ccgLeu Ala Pro420
ttt gtt accPhe Val Thr
435gtg ttt ateVal Phe Ile450
gat gag ccaAsp Glu Pro
cat ccg acgHis Pro Thr
gtc gcg tcgVal Ala Ser500
gcg ctc gatAla Leu Asp
515ctg cac tccLsu His Ser530
gcg cac cgtAla His Arg
cca cag gatPro Gln Asp
ggc acc ggtGly Thr Gly295
acc gaa ggtThr Glu Gly
310ctg gaa attLeu Glu Ile325
gat cgt ctgAsp Arg Leu
cac ggt gatHis Gly Asp
aac atg tctAsn Met Ser375
gtc att aacVal Ile Asn
390cgt tca accArg Ser Thr405
att ttc cacIle Phe His
cgc ctg gcgArg Leu Ala
gat ctg gtgAsp Leu Val455
agt gct accSer Ala Thr
470ccg cgt aaaPro Arg Lys485
cag gaa gatGln Glu Asp
gcg ggc gaaAla Gly Glu
ttc acg tggPhe Thr Trp535
ggc cgtGly Arg265ctg ttcLeu Phe280
gat gtgAsp Val
ggt ctgGly Leu
gtc ageVal Ser
gcc gaaAla Glu345gcg gcgAla Ala360
cag gcgGln Ala
aac cagAsn Gln
ccg tacPro Tyr
gtc aatVal Asn425ctg gacLeu Asp440
tgc tatCys Tyr
cag ccgGln Pro
att tacIle Tyr
gcc accAla Thr505tgc gtgCys Val520
tcg cctSer Pro
ctt aacLeu Asn
gac gaaAsp Glu
aag tatLys Tyr
gtg catVal His315ccg gtgPro Val330
ccg gtcPro Val
gtg attVal Ile
cgc ggcArg Gly
gtt ggtVal Gly395tgt actCys Thr410
gct gacAla Asp
tat cgcTyr Arg
cgc cgtArg Arg
ttg atgLeu Met475gcc gatAla Asp490
gag atgGlu Met
gtg ccgVal Pro
tat ctgTyr Leu
gta ctgVal Leu
ttc tccPhe Ser285cac atgHis Met300
ctg gcgLeu Ala
gtc atgVal Met
age aatSer Asn
ggt cagGly Gln365tac gaaTyr Glu380
ttt accPhe Thr
gac ateAsp Ile
gat ccgAsp Pro
aac accAsn Thr445cat ggtHis Gly460
tac cagTyr Gln
cgt ctgArg Leu
gtg aacVal Asn
gaa tggGlu Trp525aac cacAsn His540
att aac gta ctgIle Asn Val Leu270
ggt aaa cac aaaGly Lys His Lys
ggc ttcGly Phe
ctg gcgLeu Ala
gça tcgGly Ser335aaa gtgLys Val350
ggc gtgGly Val
gtg ggcVal Gly
acc tccTnr Ser
ggc aagGly Lys415gaa gcgGlu Ala430
ttc aaaPhe Lys
cac aacHis Asn
aaa ateLys Ile
gaa ggcGlu Gly495ctg tacLeu Tyr510
cgt ccgArg Pro
tct tcgSer Ser305ttt aacPhe Asn320
gta cgtVal Arg
ttg cctLeu Pro
gtt cagVal Gln
ggc acgGly Thr385aac ccgAsn Pro400
atg gtgMet Val
gtg gccVal Ala
cgc gatArg Asp
gag gcgGlu Ala465aaa aagLys Lys480
qaa ggtGlu Gly
cgc gatArg Asp
atg ageMet Ser
gaa tgg gat gagGlu Trp Asp Glu545
114011881236128413321380142814761524157216201663171617641812186019081956cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg 2004Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu 550 555 560 cgt ate age cag gtc cct gag cag att gaa 9tg cag tcg cgc gtg gcc 2052Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala 565 570 575 aag ate tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc 2100Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe 580 585 590 gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa 2148Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu 595 600 605 ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc 2196Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe 610 615 620 625 ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat 2244Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr 630 635 640 acg ccg ctg cac cat att cat aac age cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp 645 650 655 gat tcg gtg ctg tet gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac 2340Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr 660 665 670 gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc ate tgg gaa gcg cag ttt ggt 2388Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly 675 680 685 gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc ate age tet 2436Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser 690 695 700 705 ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Ntet Leu Leu Pro 710 715 720 cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tet gcc cgt ctg gaa 2532His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu 725 730 73:5 cgc tat ctg caa Ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro 740 745 750 tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc 2628Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg 755 760 765 ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc 2676Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg 770 775 780 785 cat cca ctg gcg ate tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc 2724His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe 790 795 800 cag ccg gcc att ggt gag ate gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa 2772Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys 805 810 815 cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag 2820Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln 820 825 830cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc ate gtg cgc ate gaa cag 2868Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln 835 840 845 ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat 2916Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr 850 855 860 865 tct cac gta cag gac ttt ate tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag 2964Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln 870 875 880 ggc gcc tgg tac tgt age cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt 3012Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe 885 890 895 ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc 3060Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala 900 905 910 gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat 3108Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn 915 920 925 gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt age gta gat 3159Asp Ala Leu Asn Val Asn Met Ser Ser Val Asp 930 935 1 5 att ctc gtt CCC gac ctg CCt gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca 3207Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala 10 15 20 acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc age cgc gat gé^a gtc ate 3255Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile 25 30 25 gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc 3303Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala 40 45 50 gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg 3351Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr 55 60 65 tcc cgc cag ate ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa 3399Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys 70 75 80 85 gaa age agt gcc aaa gcg gaa age aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg 90 95 100 cag aca gcg tcg Ctt gaa gaa gag age age gat gcg ctc age ccg gcg 3495Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala 105 110 115 ate cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag ate aaa 3543Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys 120 125 130 ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His 135 140 145 ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt 3639Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly 150 155 160 165 gca gca acg gct cag cag CCt gtt gcc aac cgc age gaa aaa cgt gtt 3687Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val 170 175 180ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala 185 190 195 aag aac age acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa ate aac atg aag 3783Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Tnr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys 200 205 210 ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg 215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tet ttc tac ate aag gcc gtg gtc 3879His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val 230 235 240 245 gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tet ate gat ggc gaa 3927Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu 250 255 260 gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tet acg 3975Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr 265 270 275 cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg age 4023Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser 280 285 290 atg gct gac ate gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg 295 300 305 gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc ate 4119Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile 310 315 320 325 acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tet acg cca ate ate aac 4167Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn 330 335 340 ccg cca cag age gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys Asp Arg Pro 345 350 355 atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg ate ctg cca atg atg tac ctg gct 4263Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala 360 365 370 ctc tcc tac gat cac cgt tta ate gat ggt cgt gaa tet gtc ggc tat 4311Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr 375 380 385 ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg 4359Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu 390 395 400 405
gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415Asp Val
gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag 4466
Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln1 5 10
ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 4514Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr
15 20 25
aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa ate ggt gca 4556
Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala30 35 40<210> 2<211> 39<212> PRT
<213> Enterobacter agglcmerans<400> 2
Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val
15 10 15
Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser
20 25 30
Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala35
<210> 3<211> 935<212> PRT
<213> Enterobacter agglomerans<400> 3
Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala
15 10 15
Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr
20 25 30
Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu
50 55 60
Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val65 70 75 80
Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile
85 90 95
Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu
100 105 110
Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His
115 120 125
Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe
130 135 140
Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu145 150 155 160
Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn
165 170 175
Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala
180 185 190
Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu
195 200 205
Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro
210 215 220
Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Vs.l Pro Met225 230 235 240
Leu Arg Glu Ntet Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val
245 250 255
Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val260 265 270Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp
275 280
Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys
290 295
Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val305 310
Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro325 330
Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro
340 345
Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val
355 360
Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg
370 375
Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val385 390
Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys405 410
Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala
420 425
Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr
435 440
Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg
450 455
Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu465 470
Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala485 490
Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu
500 505
Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val
515 520
Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr
530 535
Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys545 550
Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile565 570
Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met
580 585
Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala
595 600
Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu
610 615
Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn625 630
Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser645 650
TrD Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val
660 665
Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr
675 680
Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val690 695
Glu Phe Ser Gly Lys His285
Tyr His Met Gly Phe Ser300
His Leu Ala Leu Ala Phe315 320
Val Val Met Gly Ser Val335
Val Ser Asn Lys Val Leu350
Ile Gly Gln Gly Val Val365
Gly Tyr Glu Val Gly Gly380
Gly Phe Thr Thr Ser Asn395 400
Thr Asp Ile Gly Lys Met415
Asp Asp Pro Glu Ala Val430
Arg Asn Thr Phe Lys Arg445
Arg His Gly His Asn Glu460
Met Tyr Gln Lys Ile Lys475 480
Asp Arg Leu Glu Gly Glu495
Met Val Asn Leu Tyr Arg510
Pro Glu Trp Arg Pro Met525
Leu Asn His Glu Trp Asp540
Arg Leu Lys Glu Leu Ala555 560
Glu Val Gln Ser Arg Val575
Ala Glu Gly GIu Lys Ala590
Tyr Ala Thr Leu Val Asp605
Asp Ser Gly Arg Gly Thr620
Gln Ala Asn Gly Ser Thr635 640
Gln Gly Glu Phe Lys Val655
Leu Ala Phe Glu Tyr Gly670
Ile Trp Glu Ala Gln Phe685
Ile Asp Gln Phe Ile Ser700Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu705 710 715 720
Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu
725 730 735
Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val
740 745 750
Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu
755 760 765
Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu
770 775 780
Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser785 790 795 800
Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val
805 810 815
Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu
820 825 330
Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu
835 840 845
Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala
850 855 860
Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn865 870 875 880
Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro
885 890 895
Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro
900 905 910
Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val
915 920 925
Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn930 935
<210> 4<211> 407<212> PRT
<213> Enterobacter agglomerans<400> 4
Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala
15 10 15
Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu
35 40 45
Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu
50 55 60
Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly65 70 75 80
Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr
85 90 95
Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp
100 105 110
Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp
115 120 125
Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu130 135 140
Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala145 150 155 150
Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Tnr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu
180 185 190
Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn
195 2C0 205
Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Ass
210 215 220
Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr225 230 235 240
Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser
250 255 270
Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp
275 280 285
Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu
290 295 300
Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Tnr Val Asp Asp Leu Thr Gly305 310 315 320
Gly Asn Phe Thr Ile Tnr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Lau tet Ser
325 320 335
Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala
340 345 350
Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Vai Ile Leu Pro
355 360 365
Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg
370 375 380
Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro385 390 395 4C0
Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val405
<210> 5<211> 40<212> PRT
<213> Entarcbacter agglcmerans<4C0> 5
Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala .Arg Tyr Gly
15 10 15
Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu
20 25 30
Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala35 40
<210> 6<211> 30<212> CNA
<213> <213> SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL<220>
<223> <223> DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL: INICIADOR
<400> 6
gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg
<210> 7<211> 30<212> ONA
<213> <213> SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL
<220>
<223> <223> DESCRIÇÃO DE SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL: INICIADOR
<400> 7
aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt

Claims (7)

1. Processo para produzir ácido L-glutâmico por fermetaçãocaracterizado pelo fato de compreender cultivar um microorganismo em ummeio líquido, cujo pH é ajustado a um pH em que o ácido L-glutâmico éprecipitado, o dito pH não sendo maior que 5,0, para produzir e acumular ácidoL-glutâmico e precipitar ácido L-glutâmico no meio,em que o dito microorganismo pode metabolizar uma fonte decarbono em um pH específico em um meio liquido que contém ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono, e tem ahabilidade de acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que excede aquantidade correspondente à concentração de saturação do meio líquidonaquele pH,em que o dito microorganismo pertence ao gêneroEnterobactery eem que o dito microorganismo tem pelo menos uma dasseguintes características:(a) o microorganismo é melhorado na atividade de uma enzimaque catalisa uma reação para biossíntese de ácido L-glutâmico, quandocomparado com uma cepa selvagem; e(b) o microorganismo é diminuído ou deficiente na atividade deuma enzima que catalisa uma reação que se ramifica de uma via biossintéticado ácido L-glutâmico e produz um composto diferente de ácido L-glutâmico,quando comparado com uma cepa selvagem.
2. Processo para triar um microorganismo apropriado paraproduzir ácido L-glutâmico por fermentação com precipitação de ácido L-glutâmico em um meio líquido, caracterizado pelo fato de que compreendeinocular uma amostra contendo microorganismos em um meio ácido contendoácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e uma fonte de carbono, eselecionar uma cepa que pode metabolizar a fonte de carbono.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que uma cepa que pode crescer no meio é selecionada como a cepa quepode metabolizar a fonte de carbono.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizadopelo fato de que o pH do meio não é maior que 5,0.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a enzima que catalisa a reação de biossíntese de ácido L-glutâmicoé pelo menos uma selecionada dentre citrato sintase, fosfoenolpiruvatocarboxilase e glutamato desidrogenase.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizadopelo fato de que a enzima que catalisa a reação que ramifica da viabiossintética do ácido L-glutâmico e produz um composto diferente do ácidoL-glutâmico é α-cetoglutarato desidrogenase.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado pelofato de o dito microorganismo ser Enterobacter agglomerans.
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