TWI250211B - Method for producing l-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation - Google Patents

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TWI250211B
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Hiroshi Izui
Mika Moriya
Seiko Hirano
Yoshihiko Hara
Hisao Ito
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Ajinomoto Kk
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1250211 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明背景 本發明係關於一種以醱酵兼倂沈源方式生產L -變胺 酸的方法。L -麩胺酸通常係作爲調味料之用途。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) L -麩胺酸主要係由可生產L -麩胺酸之棒狀桿菌以 及短桿菌屬、棒狀桿菌屬或微桿菌屬、或其突變品系（ Ammo Acid Fermenation, pp . 195-215, Gakkai Shuppan Center, 1986)以醱酵方法生產。其它種用以醱酵生產l — 麩胺酸的細菌品系，有：使用桿菌屬、鏈黴菌屬、青霉屬 等微生物醱酵之方法可參見美國專利第 3 ” 2 2 0，9 2 9號，使用假單胞菌屬、節桿菌屬、沙 雷氏菌屬、假絲酵母等微生物醱酵之方法則可參見美國專 利第3 ’ 5 6 3 ，8 5 7號，使用桿菌屬、假單胞菌、沙 雷氏菌屬、產氣氣桿菌（目前稱爲產氣腸桿菌）等微生物 醱酵之方法可參見日本專利公告（Kokokii)第3 2 — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9 3 9 3號，使用大腸桿菌突變品系醱酵之方法可參見日 本專利申請案Laid-open ( Kokai )第5 — 244970號等 °此外，本發明發明人亦曾提出使用克雷伯氏菌屬、歐文 氏菌或潘氏菌（Pantoea )等微生物醱酵生產L —麩胺酸之 方法（參見日本專利申請案Laid-open No · 2 0 0 0 — 1 0 6 8 6 9 )° 此外，藉由D N A重組技藝來提高L -麩胺酸生合成 的酵素活性，可改善已發表的各種L -麩胺酸之生產技藝 ’例如引進源自大腸桿菌或麩胺酸棒桿菌之檸檬酸酯合成 酶的編碼基因可使棒狀桿菌屬或短桿菌屬細菌（日本專利 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 4 - 1250211 A7 B7 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 公告第7 — 1 2 1 2 2 8號）生產L 一麩胺酸之能力提高 。此外，日本專利申請案LaW-open第61 — 268185 號亦揭示一種細胞內之重組D N A，其內含源自棒狀桿菌 屬細菌之麩胺酸酯去氫酶基因。此外，日本專利申請案 Laid-open第6 3 — 2 1 4 1 8 9號亦揭示一種以放大變胺 酸酯去氫酶基因、異檸檬酸酯去氫酶基因、烏頭酸酯水合 酶基因及檸檬酸酯合成酶基因來提高其生產L -麩胺酸之 能力的技藝。 雖然上述培植微生物或提高生產之方法已大幅增加L -麩胺酸之生產力（生產率），但仍有必要發展在較低價 格下更有效地生產L -麩胺酸之方法以因應未來不斷增加 的需求。 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 目前已知有許多在培養液中使堆積的L -氨基酸結晶 的醱酵方法（日本專利申請案Laid-open No · 6 2 -2 8 8 )。在此類方法中，必須使在培養液中累積的L — 氨基酸沈澱以使L -氨基酸之濃度維持在特定量之下。明 確言之，在醱酵期間必須調整培養物的溫度及酸鹼値或在 培養液中添加表面活性劑以使L -色氨酸、L -酪氨酸或 L 一白氨酸沈澱。 雖然上述L -氨基酸的醱酵沈澱方法爲已知，不過適 用此方法之氨基酸僅限於水溶性較低之氨基酸，且此方法 尙未應用在高水溶性之氨基酸，如：L -麩胺酸。此外， 培養液之酸鹼値必須降低才能使L -麩胺酸沈澱。然而， 生產L 一麩胺酸之上述細菌並不能在酸性條件下生長，因 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -5 - 1250211 A7 B7 五、發明説明（3 ) 此L 一麩胺酸醱酵必須在中性條件下進行（美國專利第 3 ，220，929 以及 3，032，474 號；Chao K. C. & Foster J.W., J. Bacteriol., 7 7，ρρ·7 1 5 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 725(1959))。因此，伴隨著沈澱之醱酵以生產 L 一麩胺酸並非爲已知的技藝。此外，目前已知大部分嗜 酸細菌的生長都會被有機酸，如：乙酸、乳酸以及琥珀酸 戶斤抑制（Yasuro 0 shima Ed·， "Extreme Environment Microorganism Handbook"，p · 2 3 1 ，Science Forum; Borichewski R.M·, J. Bacteriol. ，9 3 ，P P · 5 9 7 — 599 (1967)等）。同時，許多微生物在L —麩胺 酸（其亦爲有機酸）的酸性條件下並不易生長，而且目前 尙無任何有關於尋求在酸性條件下具有L -麩胺酸生產能 力之微生物的報告。 本發明槪要 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在上述的現況下，本發明的目的之一是尋求一種可在 低酸鹼値條件下生產L -麩胺酸的微生物，並提供一種用 尋得的微生物醱酵兼倂使L -麩胺酸沈澱以生產L -麩胺 酸之方法。 經過本發明之發明人硏究如何在醱酵中提高L -麩胺 酸之生產率時，考慮到提高生產率之阻力之一是培養液中 高濃度的L -麩胺酸在累積後會抑制L -麩胺酸生產。例 如，細胞內均有L 一麩胺酸的分泌系統及攝入系統。然而 ，一旦分泌在培養液中的L -麩胺酸再度由細胞攝取時不 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 - 1250211 A7 B7 五、發明説明（4) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 僅會降低生產效率，也會抑制L -麩胺酸生的合成反應。 爲了避免該高濃度下L -麩胺酸累積所生產的抑制作用， 本發明之發明人篩選出可在酸性條件以及在高濃度L -變 胺酸存在下增殖之微生物。結果成功的從土壤中分離出具 有該種性質之微生物，如此達成本發明。 本發明提供如下。 (1 ) 一種微生物，其可在內含飽和濃度L 一麩胺酸 及碳源之特定酸鹼値的培養液中代謝碳源，並能在此酸驗 値之培養液中使L -麩胺酸的累積量超過L -麩胺酸的飽 和濃度。 (2 )如第（1 )項之微生物，其可在培養液中生長 〇 (3 )如第（1 )或（2 )項之微生物，其酸鹼値不 超過5 . 0。 (4 )如第（1 )至（3 )項中任一項之微生物，其 具有至少一種以下之特性： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (a )將微生物催化L -麩胺酸生合成反應的酵 素活性提高；以及 (b )將微生物催化在L -麩胺酸生合成路徑中 生產非L -麩胺酸化合物的分支反應之酵素活性減低或消 除。 (5 )如第（4 )項之微生物，其中催化L 一麩胺酸 生合成反應之酵素至少爲下列中之一種：檸檬酸酯合成酉每 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-7 - 1250211 Α7 Β7 五、發明説明（） 、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶與麩胺酸酯去氫酶。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (6 )如第（4 )或（5 )項之微生物，其中催化在 L 一麩胺酸生合成路徑中生產非L -麩胺酸化合物的副反 應之酵素爲α -酮戊二酸酯去氫酶。 (7 )如第（1 )至（6 )項中任何一項之微生物’ 其中微生物屬於腸桿菌屬。 (8 )如第（7 )項之微生物，其係爲黏聚腸桿菌。 (9 )如第（8 )項之微生物，該微生物帶有一種突 變，使其在含醣類培養液中分泌的細胞外黏性物質較野生 品系少。 (1 0 ) —種以醱酵方式生產L 一麩胺酸之方法，其 包含在將酸鹼値調成可使L -麩胺酸沈澱之酸鹼値的培養 液中培養如第（1 )至（9 )項中任何一項之微生物，生 產及堆積L -麩胺酸並使L -麩胺酸在培養液中沈澱。 (1 1 ) 一種篩選適於在培養液中醱酵沈澱L 一麩胺 酸以生產L -麩胺酸之微生物的方法，其係包含將內含微 生物之樣品接種在內含飽和濃度L -麩胺酸及碳源的酸性 培養液中，並選取可代謝碳源之品系。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1 2 )如第（1 1 )項之方法，其中選取在培養液 中生長之品系作爲可代謝碳源之品系。 (1 3 )如第（1 1 )或（1 2 )項之方法，其中培 養液之酸鹼値不超過5 . 0。 依據本發明之方法，可用醱酵兼倂L -麩胺酸沈澱的 方式生產L -麩胺酸。結果，將培養液中之L -麩胺酸維 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1250211 A7 B7 五、發明説明（） 持在特定濃度以下，且在沒有高濃度L -麩胺酸之產物抑 制下生產L 一鍵胺酸。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖示簡述 圖1爲源自黏聚腸桿菌pTWVEKl 〇 1 DNA 片段之限制酶水解圖。
圖2顯示源自黏聚腸桿菌及源自大腸桿菌s u c A S 因之核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。上方序列：黏 聚腸桿菌，下方序列：大腸桿菌（此後亦同）。 .圖3顯示源自黏聚腸桿菌以及源自大腸桿菌s U c β 基因核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。 圖4顯示源自黏聚腸桿菌以及源自大腸桿菌s u c C： 基因核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。 圖5顯示源自黏聚腸桿菌以及源自大腸桿菌s d h β 基因基因核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。。 圖6顯示構築具有g 1 tA基因、ppc基因及 g dhA基因之質體pMWCPG。
圖7顯示構築具有寬廣寄主範圍質體R S F 1 〇 1 Q 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 之複製起點、以及四環素抗性基因之質體R S F — T e t ο 圖8顯示構築具有寬廣寄主範圍質體R S F 1 ο 1 0 之複製起點、四環素抗性基因、gl tA基因、PPC® 因及gdhA基因之質體RSFCPG。
圖9顯示構築具有g 1 t A基因之質體p STVCB 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 9 1250211 A7 B7 五、發明説明（7 ) 〇 發明之詳細說明 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明將詳細說明如下。 本發明之微生物（1 )可於內含飽和濃度L -麩胺酸 以及碳源且在特定酸鹼値下之培養液中代謝碳源及（2 ) 能在此酸鹼値之培養液中使L -麩胺酸的累積量超過L -麩胺酸的飽和濃度。 本文中之 ''飽和濃度〃指L -麩胺酸在培養液中之飽 和濃度。 以下將說明篩選可在內含飽和濃度L 一麩胺酸和碳源 及特定酸鹼値下之培養液中代謝碳源之微生物的方法。將 內含微生物之樣品接種在特定酸鹼値下內含飽和.濃度L -麩胺酸及碳源之培養液中，並選取可代謝碳源的品系。所 謂特定酸鹼値沒有一定的限制，但通常不超過5 · 0，較 佳者不超過4 · 5，更佳者不超過4 · 3。本發明之微生 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 物使用L -麩胺酸之醱酵兼倂沈澱法生產L -麩胺酸。若 其酸鹼値太高，則難以使微生物生產足夠的L -麩胺酸進 行沈澱。因此較佳的酸驗値是上述範圍。 若內含L 一麩胺酸之水溶液的酸鹼値降低至7 -羧基 之p K a ( 4 · 2 5 ，2 5 °C )附近，則L 一麩胺酸的溶 解度會顯著降低。溶解度在等電點（酸鹼値3 · 2 )時最 低，L -麩胺酸會因超過飽和濃度而沈澱。而此全取決於 培養液組合物，通常在3 0 °C時L -穀氨在酸酸鹼値 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） -- 1250211 A7 B7 五、發明説明（8) 3 · 2下之溶量爲1〇至2〇克/升，在酸鹼値4 · 0下 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲30至40克/升而在酸鹼値4 · 7下爲50至60克 /升。通常酸鹼値不需要低於3 · 0，此乃因爲當酸鹼値 低於特定値時，L -麩胺酸之沈澱效應到達高峰。然而 p Η可低於3 · 0 ◦ 此外’用 ''可代謝碳源〃形容微生物時係指可增殖或 即使不能增殖亦可消耗碳源，即表示可同化碳源，如醣類 或有機酸。尤其是指，例如，若微生物可在內含飽和濃度 L 一麩胺酸的培養液中、酸鹼値5 · 0至4 · 0下（較佳 者酸鹼値爲4 · 5至4 · 0，更佳者酸鹼値爲4 · 3至 4 · 0，最佳者在酸鹼値4 · 0 )，於適當的溫度下（例 如：2 8 °C、3 7 °C或5 0 °C )生長2至4天，即表示此 微生物可在培養液中代謝碳源。此外，例如，即使在內含 飽和濃度L —麩胺酸、酸鹼値5 · 0至4 · 0下（較佳者 酸鹼値爲4 · 5至4 · 0，更佳者酸鹼値爲4 · 3至 4 . 0，最佳者在酸鹼値4 · 0 )於適當溫度（例如： 2 8 °C、3 7 °C或5 0 °C下）的培養液中微生物不能生長 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2至4天，但微生物可在培養液中消耗碳源，亦表示此微 生物可在培養液中代謝碳源。 可代謝碳源之微生物包括可在培養液中生長之微生物 〇 用 ''可生長〃形容微生物時係指可增殖、或雖然不肯g 增殖但可生產L -麩胺酸。尤其是，例如：若微生物可於 酸鹼値爲5·0至4·0 (較佳者酸鹼値爲4.5至 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 11 - 1250211 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（） 4 · 0 ，更佳者酸鹼値爲4 · 3至4 · 0，最佳者酸鹼値 4 · 0 )之內含飽和濃度L -麩胺酸的培養液中、適當溫 度下，例如：2 8 °C、3 7 °C或5 0 °C下生長2至4天， 即表示此微生物可在培養液中生長。此外，例如：即使當 微生物不能在酸鹼値爲5 · 0至4 . 0 (較佳者酸鹼値爲 4 . 5至4 · 0，更佳者酸鹼値爲4 · 3至4 · 0，最佳 者酸鹼値4 . 0 )之內含飽和濃度L -麩胺酸的培養液中 、適當溫度下，例如：2 8 t：、3 7 °C或5 0 t下生長2 至4天，但微生物仍可使培養液中L -麩胺酸之含量增加 ，即表示此微生物可在培養液中生長。 上述之選取步驟可於相同條件下或改變酸鹼値或L -麩胺酸濃度下重覆二次或多次。首次選取時可在L -麩胺 酸濃度低於飽和濃度之培養液中進行，其後的選取步驟可 在內含飽和濃度L -麩胺酸之培養液中進行。以外，可選 取性質優良之品系，如：優越的增生速率。 除上述性質之外，本發明之微生物可使L -麩胺酸之 累積量高於L -麩胺酸在培養液中的飽和濃度。上述培養 液的酸鹼値以與在篩選具有上述性質（1 )之微生物時之 培養液相同或接近較佳。通常若酸鹼値變得太低，微生物 會不耐高濃度的L -麩胺酸。因此，就對L -麩胺酸之抗 性而言，酸鹼値不宜過低，但低酸鹼値卻有利於將L -麩 胺酸沈澱。爲了滿足此類條件，P Η可介於3至5，較佳 者4至5，更佳者4 · 0至4 · 7，最佳者4 · 0至 4.5，特佳者4.0至4.3。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -12- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1250211 Α7 Β7 - 10 - 五、發明説明（） 本發明之微生物或培養物可包含，例如：腸桿菌屬微 生物、克雷伯氏菌、沙雷氏菌屬、潘氏菌（Pantoea)、歐 文氏菌、埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、抗硫桿菌（ Alicyclobacillus)、桿菌、酵母菌等。在此類微生物之中， 以腸桿菌屬微生物較佳。下列本發明微生物之說明主要是 以腸桿菌屬微生物爲主，但本發明可應用至其它屬之微生 物而不限於腸桿菌屬。 腸桿菌屬微生物（尤其是黏聚腸桿菌）中較佳者爲黏 聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系。此品系由
Iwata-shi(Shizuoka，Japan)自土壤中分離出，可在內含L -麩胺酸以及碳源之低酸鹼値培養液中增殖。 A J 1 3 3 5 5的生理性質如下： (1)革蘭氏染色：陰性 (2 )抗氧氣行爲：兼性厭氧性 (3)過氧化氫酶：陽性 (4 )氧化酶：陰性 (5 )還原硝酸鹽能力：陰性 (6 )弗—波氏（Voges-Proskaue r )測試：陽性 (7 )甲基紅測試：陰性 (8)尿素酶：陰性 (9 )吲哚之生產：陽性 (1〇)能動性：可移動 (1 1 ) T S I培養液中Η 2 S生產：微弱的活性 (1 2 ) $ —半乳糖苷酶：陽性 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）-13 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 冒裝. 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250211 A7 B7 11 五、發明説明（） (1 3 )消化吸收糖類之性質： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 樹膠醛醣：陽性 蔗糖：陽性 乳糖：陽性 木糖：陽性 山梨糖醇：陽性 肌醇：陽性 漏蘆糖：陽性 麥芽糖：陽性 葡萄糖：陽性 側金盞花醇：陰性 蜜三糖：陽性 水楊苷：陰性 蜜二糖：陽性 (1 4 )消化吸收甘油之性質：陽性 (15) 消化吸收有機酸之性質： 檸檬酸：陽性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 酒石酸：陰性 葡萄糖酸：陽性 乙酸：陽性 丙二酸：陰性 (16) 精氨酸脫水酶：陰性 (1 7 )鳥胺酸脫羧酶：陰性 (1 8 )離氨酸脫羧酶：陰性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 14 - 1250211 A7 B7 12 五、發明説明（） (19) 苯基丙氨酸脫胺酶：陰性 (20) 色素形成：黃色 (2 1 )液化明膠之能力：陽性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (22)生長之pH:可在酸鹼値4 · 〇下生長’在酸鹼 値4 · 5至7下生長良好 (2 3 )生長之溫度：在2 5 ΐ：下生長良好，在3 0°C下 生長良好，在3 7 °C下生長良好，可4 2 °C下生長，無法 在4 5 °C下生長 基於此類細菌學上的性質，A J 1 3 3 5 5被測定爲 黏聚腸桿菌。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5寄存於National Institute of Bioscience and human-Technology, Agency of Industria 1 S cienceand Technology, ministry of International Trade and Industry (郵遞區號：3 〇 5 — 8566 ，1 — 3 ， Higashi 1-chome，Tsukuba-shi, Ibaraki，Japan )於 1998年2月19日存入，寄存編號爲FERM P -1 6 6 4 4。然後在Budapest Treaty之條件下於1 9 9 9 年1月1 1日轉移至國際寄存中心，寄存編號爲F E R Μ Β Ρ — 6 6 1 4。 本發明之微生物爲原本即具有生產L -麩胺酸能力之 微生物，或爲藉由突變、D Ν Α重組等技藝賦予或提高L -麩胺酸生產能力之微生物。 將催化L 一麩胺酸生合成反應之酵素活性提高可賦予 或提高生產L 一麩胺酸之能力，而將（或去除）催化L - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15 _ 1250211 A7 B7 五、發明説明（） 麩胺酸生合成路徑之分支反應（生產非L -麩胺酸化合物 )之酵素活性降低亦可提高生產L -麩胺酸酸之能力。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 催化L -麩胺酸生合成反應之酵素包括：麩胺酸酯去 氫酶（此後亦稱爲'' G D Η 〃 )、麩胺醯氨酸合成酶、g 胺酸酯合成酶、異檸檬酸酯去氫酶、烏頭酸酯水合酶、檸 檬酸酯合成酶（此後亦稱爲'' C S 〃 ）、磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶（此後亦稱爲'' P E P C 〃 ）、丙酮酸去氫酶、丙 酮酸激酶、烯醇酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸酯磷激 酶、甘油醛- 3 -磷酸酯去氫酶、丙糖磷酸酯異構酶、果 醣二磷酸酯醛縮酶、磷酸果醣磷激酶、葡萄糖磷酸酯異構 酶等。在此類酵素之中較佳者爲CS、PEPC以及 G D Η。此外，以提高本發明微生物所有三個酵素：C S 、P E P C及G D Η之活性較佳。其中以乳酸醱酵短桿菌 之C S較佳，因爲它不會受到α —酮戊二酸、L 一鍵胺酸 及N A D Η抑制。 經濟部智慧財產局工消費合作社印製 例如，爲了提高C S、P E P C或G D Η之活性，可 於適當的質體中選殖C S、P E P C或GDH之編碼基因 並以得到的質體將寄主微生物轉形。增加轉形品系細胞中 C S、PEPC或GDH之編碼基因（以下分別縮寫爲 g 1 t Α基因"、'' p p c基因"以及'' g d h A基因" )套數可提高CS、PEPC或GDH之活性。 將選殖出的g 1 tA基因、ppc基因及gdhA基 因個別地或結合任二種或三種基因引入上述起始原生品系 中。在引入二種或三種基因時，此二種或三種基因可用同 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -16 - 1250211 A7 B7 14 五、發明説明（） 一種選殖質體引入寄主中，或分別的選殖於可共存的二種 或三種質體後再引入寄主中。 亦可將二種或多種源自不同微生物之相同酵素的編碼 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基因引入相同之寄主中。 上述之質體並無特別限制’只要彼可獨立自主地在寄 主微生物（例如：腸桿菌屬）中複製即可’例如 pUC19、pUC18、pBR322、 PHSG299、PHSG298、PHSG399、 pHG3 98 、RSFl〇l〇、 PMW119 、 pMWl 18、PMW219、PMW218、 PACYC177、PACYC184 等。此外，亦可使 用噬菌體DΝΑ之載體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 進行轉形之方法可依例如：D.M. Mornson之方法（ Method in Enzymology，68，326 (1979)); 用氯化鈣處理細菌受體細胞以提高D N A可透性之方法（ Mandel Μ·以及 Higa A. ，J· Mol · Biol.，5 3，1 5 9 (1 9 7 0 ));電穿透作用（Miller J.H·，"A Short Course in Bacterial GeneticsM, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A. 1 9 9 2 )等。 增加上述的起始原生品系寄主染色體D ΝΑ上 g 1 tA基因、ppC基因或gdhA的基因套數亦可提 高C S、P E P C或G D Η之活性。爲了在腸桿菌屬微生 物之染色體DNA上引進數套g 1 t Α基因、p p c基因 或g d h A基因，可採用在染色體上帶有數套DNA的序 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -17 - 1250211 A7 B7 15 五、發明説明（） 列，例如末端有重覆性及重複反轉的D N A之轉位元件。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外，利用內含gl tA基因、ppc基因或gdhA基 因之轉位子的轉移作用可在染色體D N A上引進數套基因 。結果可增加轉形品系細胞中之g 1 t A基因、p p c基 因或gdhA基因的套數，並提高CS、PEPC或 G D Η之活性。 若生物體爲g 1 t Α基因、p pc基因或gdhA基 因（套數增加）之來源，則任何具有C S、P E P C或 G D H活性之生物體均可使用。尤其是原核生物之細菌， 例如.腸桿囷屬、克雷伯氏菌、歐文氏菌、潘氏菌（
Pantoea )、沙雷氏菌屬、埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿 菌屬，以桿菌較佳。特定實施例爲大腸桿菌、乳酸醱酵短 桿菌等。可自上述微生物之染色體DNA中取得g 1 t A 基因、ppc基因及gdhA基因。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用缺乏C S、P E P C或G D Η活性的突變品系可 分離出g 1 t Α基因、ρ p c基因及g dhA基因之 D ΝΑ片段，其可彌補上述微生物染色體DNA的營養缺 陷。由於埃希氏菌屬及棒狀桿菌屬細菌的上述基因之核苷 酸序列已被發表（8丨〇(：11611^匕;^，2 2，？？.5 2 4 3 — 5249 (1983) ; J · Biochem · ， 9 5 ， ρ ρ · 909-916 (1984) ; Gene 、 2 7 ， ρ ρ · 1 9 3 — 1 9 9 ( 1 9 84) ; Microbiology，140， ρρ· 18171828 (1994) ; Mol. Gen. Genet· ，218，pp.330-339 ( 19 8 9); 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -18 - 1250211 Α7 Β7 五、發明説明（16)
Molecular Microbiology，6，P P . 3 1 7 — 3 2 6 ( 1992))，彼亦可以各個核苷酸序列爲基礎合成的引 子及以染色體D N A作爲模板用P C R方法取得。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 除了放大上述基因一途之外，加強g 1 t A基因、 P P c基因或g d hA基因之表現亦可提高C S、 P E P C或G D H之活性。例如，用其它較強的啓動子取 代g 1 tA基因、ppC基因或gdhA基因之啓動子可 增強表現。例如：1 a c啓動子、t r p啓動子、t r c 啓動子、t a c啓動子、P R啓動子及又噬菌體之？1^啓動 子等已知的強啓動子。將g 1 t A基因、p pc基因及 g d h A基因之啓動子取代後可以質體選殖並藉由重複性 D N A、反轉重覆序列、轉位子等引入寄主微生物中，或 引入寄主微生物的染色體DNA中。 經濟部智慧財產局工消費合作社印製 染色體上g 1 t A基因、p p c基因或g dhA基因 之啓動子亦可用其它較強的啓動子取代以提高C S、 PEPC或GDH之活性（參見W〇 87/03006 以及日本專利申請案Laid-open第61 — 268183號） ，或在各編碼基因序列之上游插入強啓動子（參見基因、 29 ^pp. 231-241 ( 1 9 8 4 ))。明確言之 ，內含gl tA基因、ppc基因或gdhA基因的 D N A之間可進行同源重組，其啓動子可被對應於染色體 基因之其他強啓動子或其部分取代。 催化L 一麩胺酸生合成旁枝路徑反應（生產非L -魅 胺酸化合物）的酵素之實施例，包括：α -酮戊二酸酯去 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） _ 19 - 1250211 A7 B7 17 --- 五、發明説明（） 氫酶（以下亦稱爲'' α K G D Η 〃 ）、異檸檬酸酯裂解酶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、磷酸酯乙醯基轉移酶、乙酸酯磷激酶、乙醯羥基酸合成 酶、乙醯乳酸酯合成酶、甲酸酯乙醯基轉移酶、乳酸酯去 氫酶、麩胺酸酯脫羧酶、1 -窬鏈沲去氫酶等。在此類酵 素之中，以α K G D Η較佳。 爲了取得上述酵素活性降低或缺少的腸桿菌屬微生物 ，可用一般的突變或基因工程的方法將因突變造成酵素活 性降低或缺少的上述酵素基因引入細胞內。 突變方法之實施例，包括例如：利用X -射線或紫外 線照射之方法、利用突變劑如：Ν —甲基一 Ν / —硝基一 Ν亞硝基胍處理之方法等。在基因上引入突變的位點可爲 酵素蛋白質之編碼基因的編碼區域或調節表現區域（如啓 動子）。 經濟部智慧財產局M工消費合作社印製 基因工程方法之實施例，包括例如：使用基因重組、 轉導、細胞融合等三種方法。例如將抗藥基因插入選殖出 的目標基因以製備喪失功能之基因（有缺陷的基因）。接 著’將此有缺陷的基因引入寄主微生物細胞中，並利用同 源重組將此染色體上的目標基因用上述的缺陷基因取代（ 破壞基因）。 判定目標酵素在細胞內降低或喪失活性以及活性之降 低程度時，可測量細胞萃取物或自候選品系純化出之片段 的酵素活性，並與野生品系比較而知。例如：α K G D Η 活性可用R e e d e t a 1 ·之方法測量（R e e d L J. a n d Mukherjee B.B.， Method in Enzymology， 1 3 ，p p . 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -20 - 1250211 A7 B7 18 五、發明説明（） 55 - 61 (1969))。 視目標酵素而定，可依據突變品系之表現型選取目標 突變之品系。例如，缺乏α K G D Η活性或α K G D Ή活 性減低之突變品系在內含葡萄糖之基本培養基中或內含乙 酸或L -麩胺酸作爲唯一碳源的基本培養基中、有氧的條 件下，並不能增殖或其增生速率顯著地降低。然而在相同 條件下，在內含葡萄糖之基本培養基中添加琥珀酸或離氨 酸、甲硫氨酸及二氨基庚二酸則可造成一般之增生。利用 此類現象作爲指標，可選取α K G D Η活性減低或缺乏活 性的突變品系。 製備乳酸醱酵短桿菌α K G D Η基因缺乏品系之方法 係利用詳細敘述於W〇 9 5 / 3 4 6 7 2之同源重組方 法。相似的方法可應用至其它的微生物。 此外，基因選殖和切除及聯結D N A、轉化等技藝則 詳細敘述於 Molecular Cloning，2nd Edition, Cold Spring
Harbor Press，1 9 8 9 等。 上述方法得到之α K G D H活性缺乏或α K G D H的 活性減低之突變品系的特定實施例爲黏聚腸桿菌 AJ 1 33 56。黏聚腸桿菌AJ 1 3356寄存於 National Institute of Bioscience and human-Technology, Agency of Industrial Scienceand Technology, ministry of
International Trade and Industry (郵遞區號·· 3 0 5 — 8 5 6 6 ’ 1 — 3 ’ Higashi 1-chome，Tsukuba-shi, Ibaraki ，Japan )於1 9 9 8年二月1 9日存入，寄存編號爲 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公慶） .21 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250211 Α7 Β7 19、 五、發明説明（) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) FERM P — 16645° 然後在 Budapest Treaty 之條 件下於1 9 9 9年1月1 1日轉移至國際寄存中心，寄存 編號爲F E R Μ Β Ρ — 6 6 1 5。黏聚腸桿菌 A J 1 3 3 5 6中因爲破壞aKGDH — Ε 1次單元基因 (s u c A )所以缺乏α K G D Η的活性。 在內含醣類的培養液中培養黏聚腸桿菌（用於本發明 微生物之實施例）時’細胞外會分泌出黏性物質，造成操 作效率低。因此，在使用會分泌該黏性物質的黏聚腸桿菌 時，宜使用分泌黏性物質比野生品系少的突變品系。突變 方法之實施例包括’例如：χ射線或紫外線照射方法、利 用突變劑如Ν —甲基一 Ν I -硝基—Ν -亞硝基胍等處理 之方法。篩選降低分泌黏性物質的突變品系是將突變的細 菌接種在其中內含醣類之培養基’例如其中內含5克/升 葡萄糖之L Β培養板’在培養時將培養板傾斜約4 5度並 選取不會向下流動之菌落。 本發明中，在進行賦予或增強生產L -麩胺酸之能力 和賦予其它有利性質（如以突變降低上述黏性物質的分泌 )時其先後順序可隨意。 經濟部智慧財產局i工消費合作社印製 在培養液中培養本發明之微生物時，將其酸鹼値調至 沈澱L -麩胺酸之酸鹼値可在培養液中生產並沈澱所累積 的L -麩胺酸。亦可先在中性ρ Η下培養，最後再調成使 L 一麩胺酸酸沈澱之酸鹼値以便沈澱L -麩胺酸。 使L -麩胺酸之沈澱酸鹼値是指在微生物生產並累積 L 一麩胺酸時使L -麩胺酸沈澱之酸鹼値。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22 - 201250211 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 上述的培養液爲一般的營養素培養液，其中內含碳源 、氮源、礦物鹽類以及微量有機營養物如氨基酸和維生素 ，視須要可將酸鹼値調至沈澱L -麩胺酸之酸鹼値。其可 爲合成的培養液或天然的培養液。培養液中之碳源和氮源 可爲任何適用於培養品系的碳源以及氮源。 所使用之碳源包含醣類，如：葡萄糖、甘油、果醣、 蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳醣、澱粉水解產物以及糖蜜 。此外有機酸，如：乙酸和檸檬酸可各自單獨或與另一種 碳源合倂使用。 所使用之氮源包含氨水、銨鹽，如：硫酸銨、碳酸銨 、氯化銨、磷酸銨以及乙酸銨、硝酸鹽等。 可使用內含有機微量營養物、氨基酸、維生素、脂肪 酸、核酸之物質，如：蛋白腺、卡氨基酸（casamino acid )、酵母菌萃取物及大豆蛋白質降解產物。在使用須要氨 基酸等代謝或生長之自營性的突變體品系時，須要補充營 養素。 可使用礦物鹽類、磷酸鹽、鎂鹽類、鈣鹽類、鐵鹽類 、錳鹽類等。 至於培養方法’通常是以通氣培養將醱酵溫度控制在 2 0至4 2 °C之間及酸鹼値爲3至5，較佳者爲4至5 ， 更佳者爲4至4 · 7 ’尤佳者爲4至4 · 5。因此，在培 養約1 0小時至4天之後，大量的l -麩胺酸可累積在培 養液中。當培養液中累積的L -麩胺酸超過飽和濃度時即 開始沈澱。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1250211 A7 B7 2] ------—— 五、發明説明（） 於完成培養之後’培養液中沈澱的L -麩胺酸可用離 心、過濾等方法收集。可依據已知的方法收集溶於培養液 中之L -麩胺酸酸。例如將培養液濃縮以結晶分離出L 一 麩胺酸或用離子交換色層分析等方法分離。經過濃縮結晶 後，在培養液中可一倂分離出L -麩胺酸沈澱及溶於培養 基中之L 一麩胺酸。 依據本發明之方法，當L -麩胺酸的含量超過飽和濃 度時即開始沈澱，而溶於培養液中之L -麩胺酸濃度則維 持在固定的水準。因此可減少高濃度L -麩胺酸對微生物 之影響。因此可培育出其它種L -麩胺酸生產能力較佳之 微生物品種。此外，由於L -麩胺酸之沈澱爲結晶，可抑 制由於L -麩胺酸在培養液中累積所造成的酸化現象，因 此可顯著的降低在培養基中維持酸鹼値的鹼用量。 貫施例 本發明將以下列實施例詳細說明。 < 1 >篩選在酸性環境下具有L -麩胺酸抗性之微生 物 篩選在酸性環境下具有L -麩胺酸抗性之微生物，其 進行方法如下。將各約5 0 0個取自土壤、果實、農作物 、河流之天然樣品，每公克懸浮於5毫升之滅菌水，取出 2 0 〇 u 1塗在2 〇毫升之固體培養基（其酸鹼値用 H c 1調至4 · 0 )上。培養液之組成如下：3克/升葡 萄糖，1克/升（NH4) 2S〇4，0 · 2克/升 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-24 - I---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250211 A7 B7 22 五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ g S 〇 4 ~ -7 Η 2 〇， 〇 • 5 克 / 升 Κ Η 2 Ρ < 0 4 ，0 . 2 克 / 升 N a C 1 ， 0 . 1 克/升 CaCl2— 7 Η 2〇’ 〇 • 〇 1 克 /升F e S 0 1 一 7 Η 2 〇，〇 ·〇 1克/升 Μ η S 〇 4 一 -4 Η 2 〇， 〇 • 7 2毫克/升Ζ η S〇4 一 2 Η 2〇 ，0 · 6 4毫克/ / 升 CuS〇.4— 5Η 2〇 ， 0 • 7 2 笔 克/升 C〇 C 1 2 — 6 Η 2 〇，0 · 4 毫克/ 升 硼 酸 ο 1 • 2毫克 /升 N a2Mo〇4~2H2 〇 ，5 0 微 克 / 升 生 物 素，5 0微 :克 /升泛酸鈣，5 0微 克 /升葉 酸 5 0 微 克 /升肌 醇， 5 0微克/升菸鹼酸， 5 0微克 / 升 對 ~ 氨 基 苯甲酸 ，5 0 微克/升吡哆醇氯化 氫 ，5 0 微 克 / 升 核 黃 素，5 〇微 :克 /升硫胺素氯化氫， 5 0毫克 / 升 環 己 醯 亞 胺，2 〇克 /; 升瓊脂。 以 上 述 樣品種 植之 .培 養基在28 t：、37 °C 或5 0 °C 下 培 養 2 至 4天，： 得到 3 7 8個品系菌落。 接 著 將 上述之 品系 接 種於含有3毫升培養 液 (內含 飽 和 濃 度 之 L 一麩胺 酸， 酸1 驗値用H C 1調至4 . .0 )之 1 6 • 5 公 分長、 14 公 厘直徑之測試管內， 在 2 8 1 3 7 °c 或 5 0 °C下 搖動 丨培 養2 4小時至3天。 然 後選取 生 長 的 品 系 〇 上述培 養液 :內 含的組合物如下：4 〇 克/升 葡 萄 糖 > 2 0 克/升 (N Η 4 ) 2 S 〇 4、〇 · 5 克 /升 Μ g S 〇 4 - -7 Η 2 〇、 2 克/升Κ Η 2 Ρ〇4、 0 • 5克 / 升 N a C 1 、0 · 2 5 克 / 升 CaC12 — 7Η2 〇、 〇 • 〇 2 克 /升F e S 〇 4 — 7 Η 2 0 ν 〇 . 〇 2克/升 Μ η S 〇 4 — -4 Η 2 〇、 〇 .72毫克/升Ζη S〇4 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25 - 1250211 A7 B7 23 ' - 五、發明説明（） 2H2〇、〇· 64毫克/升CuS〇4— 5H2〇、 〇· 72¾克/升C〇C1_2— 6H2C)、〇 · 4毫克/升 硼酸、1 · 2毫克/升Na2M〇〇4—2H2〇、2克/ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 升酵母菌萃取物。 如此成功地得到在酸性環境下具有L -麩胺酸抗性之 7 8個微生物品系。 < 2 >在酸性環境下具有L -麩胺酸抗性之微生物中 選取生長速率優良之品系 將上述得到之在酸性環境中具有L -麩胺酸抗性之各 種微生物各自接種於含3毫升培養液（在μ 9培養液中加 入2 0克/升變!女酸以及2克/升葡萄糖（Sambrook，J., Fritsh，E.F.以及 Maniatis，T·，"Molecular cloning'，，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1 9 8 9 )，酸鹼値用 HC1調至4 · 0) 16 · 5公分長、14公厘直徑之測 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 試管內，在一定的時間內測量培養液之濁度以選取生長速 率較佳之品系。結果發現生長速率速率較佳之品系爲 A J 1 3 3 5 5 品系，其係得自土壤（Iwata-shi, Shizuoka， Japan )。此品系經上述細菌學性質測定後證實爲黏聚腸 桿菌。 < 3 >從黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系得到分泌較 少黏性物質的品系 由於黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系在內含醣類之培 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） · 26 · 1250211 A7 B7 24 ------- 五、發明説明（）
養液中培養時會在細胞外分泌出黏性物質，所以操作效率 不佳。因此可用紫外線照射方法（Miller, J.H. et al. ，，A
Short Course in Bacterial Genetics;Laboratory Manual", (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) p.150，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1 9 9 2 )得到黏性物質分泌較少的品系。 將黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系用相距6 0公分以 外的6 0 - W紫外燈以紫外線照射2分鐘，在L B培養液 中培養過夜以固定突變。稀釋突變的品系並接種至內含5 克/升葡萄糖及2 0克/升瓊脂的L B培養液中（大約 1 0 0個菌落/板）並在3 0 °C下培養過夜，培養板傾斜 約4 5度，選取2 0個無黏性物質流下的菌落。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 選取在內含5克/升葡萄糖以及2 0克/升瓊脂的 L B培養液中培養5次之後仍能滿足上述條件而無反突變 現象且在L B培養液之生長情形與原生品系相等之品系， 於內含5克/升葡萄糖的LB培養液中添加2 0克/升L 一麩胺酸及2克/升葡萄糖，酸鹼値用HC1調至4·5 形成的1^9培養液（3811^1.〇〇1^，：1.6131.,分子選殖，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，1 9 8 9 )中培養 ，從以上的品系中篩選出S C 1 7品系。 < 4 >從黏聚腸桿菌S C 1 7品系構築生產變胺酸之 細菌。 (1 )從黏聚腸桿菌S C 1 7品系製備α K G D H缺 乏的品系 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 251250211 A7 B7 五、發明説明（） 從黏聚腸桿菌s C 1 7品系中製備出缺乏α κ G D Η 且L 一麩胺酸生合成系統增強的品系° (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i )選殖黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系的 QKGDH基因（以下稱爲''s u cAB〃 ） 選殖黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系s u c A B基因 的方法是從黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系的染色體 DNA中選取可在aKGDH - E 1次單元基因（以下稱 爲'' s u c A 〃 ）缺乏的大腸桿菌品系中彌補不消化吸收 乙酸性質的D N A片段。 使用萃取大腸桿菌染色體D N A的一般方法（Text for Bioengineering 實驗，Edited by the Society for Bioscience 以及 Bioengineering，Japan，PP· 9 7 — 9 8， Baifukan，1 9 9 2 )分離黏聚腸桿菌A J 1 3 3 .5 5品系 的染色體DNA。用市售之pTWV228 (抗氨比西林 )作爲載體（Takara Shuzo Co.，Ltd·) ° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將經E c ο T 2 2 1水解過之A J 1 3 3 5 5品系的 染色體DNA與經Ps t I水解過之PTWV 2 2 8用 T 4連接酶連結並將缺乏s u c A的大腸桿菌 J R G 4 6 5 品系轉形（Herbert，J· et al· ，Mol· Gen· Genetics，1 〇 5，1 8 2 ( 1 9 6 9 ))。將轉形品系（ 其係選自以上方法得到之轉形品系）於含有乙酸醋之基本 培養基中生長，萃取其質體並稱爲pTWVEKlOl° 大腸桿菌J R G 4 6 5品系帶有p T W V E K 1 0 1後可 恢復除了乙酸消化吸收性質以外之琥珀酸或L 一離氨酸以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28 - 1250211 A7 B7 - ~ 26 ~ ~ 五、發明説明（） 及L 一甲硫氨酸之營養缺陷。此顯示P T W V E K 1〇1 含有黏聚腸桿菌之s u c A基因。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1爲pTWVEK 1 ο 1中源自黏聚腸桿菌DNA 片段之限制酶水解圖。圖1中斜線方框部份的核苷酸序列 如S E Q識別號碼：1所示。在此序列中，有二個完整的 〇R F S核苷酸序列和二個〇R F s之部份核苷酸序列。 由S E Q識別號碼：2至5顯示由此類0 R F s編碼的氨 基酸序列或從5 ’端依序開始的部份序列。此類序列同源 比對的結果顯示其琥珀酸酯去氫酶鐵-硫蛋白質基因（ s d h B ) 3 ’端之部分核苷酸序列、完整s u c A以及 aKGDH — E2次單元基因（sucB)、以及琥拍醯 基C ο A合成酶/3次單元基因（s u c C ) 5 ’端之部份 序列。由此類核苷酸序列推演出之氨基酸序列在與大腸桿 菌（Eur. J. Biochem·，141，PP · 351 — 359 ( 1 9 8 4 ) ; Eur. J. Biochem.，141，ρρ·361 — 374 ( 1 984) (Biochemistry，24 ’ pp · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 2 4 5 — 6 2 5 2 ( 1 9 8 5 ))比較後結果如圖2至 5。各氨基酸序列顯示有非常高的同源相似性。此外，在 黏聚腸桿菌之染色體上亦發現與大腸桿菌上之一串 s dhB— s u cA— s u cB— s u c C 基因相同（Eur. J. Biochem.，141，ΡΡ· 351 — 359 ( 1 984) ;Eui'J· Biochem·，141，ρρ· 36 1 — 3 7 4 ( 1 9 8 4 ) ; Biochemistry ’ 2 4 ’ p p · 6245 — 6252(1985))。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） 1250211 A7 B7 一 _ — 五、發明説明（） (ϋ )自黏聚腸桿菌s C 1 7品系得到缺乏 α K G D Η的品系 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用上述得到之黏聚腸桿菌S u c A B基因進行伺源 重組而得到α K G D Η缺乏的黏聚腸桿菌品系。 將pTWVEKl01用SphI水解之後切出內含 s u c A之片段，片段用Klenow片段（Takara Shuzo Co .，公司）鈍端化後再使用T 4 D Ν Α黏合酵素（
Takara Shuzo Co.，公司）而與經E c 〇 R I水解且 K1 enow片段鈍端化的p B R 3 2 2進行連結。所得到的質 體用限制酵素B g 1 I I水解（辨視位點大體上位於 s u c A中心）、K 1 e η 〇 w片段鈍端化、然後再一次 的使用Τ 4 D Ν Α黏合酵素連結。經由上述步驟可構築 使s u c A基因喪失功能之框架位移突變的質體。 將上述構築之質體用限制酵素A p a L I水解，以及 用瓊脂糖凝膠電泳回收其中內含框架位移突變的s u c A DNA以及源自pBR3 2 2之抗四環素基因片段。回 收的D Ν A片段再一次的使用T 4 D Ν A黏合酵素連結 以構築破壞α K GDH基因之質體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將上述方法得到之破壞α K G D Η基因之質體用電穿 透作用（Miller，J.H., MA Short Course in Bacterial Genetics; Handbook"，p · 2 7 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A·，1 9 9 2 )將黏聚腸桿菌 S C 1 7品系轉形，用四環素抗性作爲指標挑選出已用同 源重組方式將染色體s u c A以質體上突變的s u c A取 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -30 - 1250211 經濟部智慧財產局工消費合作社印製 A7 B7 ---- 五、發明説明（） 代的品系。所得到的品系稱爲S C 1 7 s u c A品系。 爲了 §登貫S C 1 7 s u cA品系中缺乏aKGDH的 活性，用 Reed et al. ( Reed，L.J. and Mukherjee, B.B.， Method in Enzymology，13，ρρ·55 — 61，（ 1 9 6 9 ))的方法測量L B培養液之對數生長相中該品 系細菌之酵素活性。結果在S C 1 7品系中偵測到的 α K G D Η活性爲〇·〇7 3 ( △ A B S / m i η /毫克 蛋白質），而在s C 1 7 s u c A品系則無法偵測到 α K G D Η活性，因此証實s u c A的缺乏。 (2 )增強黏聚腸桿菌S C 1 7 s u cA品系的 麩胺酸生合成系統 接者’將源自大腸桿囷之棒橡酸醋合成酶基因、_ g乡 烯醇丙酮酸羧化酶基因及麩胺酸酯去氫酶基因引入 SC17 sucA品系中。 (i )製備具有源自大腸桿菌g 1 tA基因、Pp e 基因及g d h A基因之質體 製備具有gltA基因、appc基因及gdhAg 因之質體的方法將說明於圖6以及7。 將具有源自大腸桿菌g d hA基因之質體， pBRGDH (曰本專利申請案Laid-open No · 7 — 203980)，用 Hindi II 以及 Sph I 水 解，兩端用T 4 D Ν Α聚合酶鈍端化，然後將具有 g d h A基因之D N A片段純化及回收。同時將具有 g 1 t A基因及源自大腸桿菌p p c基因之質體， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -31 - I——^——一----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1250211 A7 ___ B7 29 -------— 五、發明説明（） P M W C P (WO 97/08294)，用 Xbal 水 里酶鈍端化。將上述具 有g d h A基因的純化之D N A片段與此質體混合，使用 τ 4連接酶連結以得到質體p M W C P G，其爲進一步的 內含gdhA基因之pMWCP質體（圖6)。 同時，將具有大寄主範圍質體r s F 2 〇 1 〇複製起 點之質體p V I C 4 0 (日本專利申請案Laid-open No · 8 — 047397)用 Not I 水解，丁 4 DNA 聚合 酶處理以及用P s t I水解。將p B R 3 2 2用 E c 〇T 1 4 1水解，以T4 DNA聚合酶處理並用 P s t I水解。混合上述之產物並以τ 4連接酶連結而得 到其具有複製起點R S F 1 〇 1 〇及抗四環素基因之質體 RSF — Tet (圖 7)。 接著，將pMWCPG用EcoRI及PS t I水解 ，並純化及回收具有g 1 t A基因、p p c基因及 gdhA基因之DNA片段。同樣地將RSF — Te t用 E c 〇 R I及P s t I水解，純化及回收具有複製起點 R S F 1 〇 1 〇之D N A片段。將此二產物混合及使用 T 4連接酶連結以得到質體R S F C P G，其爲內含 g 1 tA基因、ppc基因及gdhA基因之RSF — Tet (圖8)。証實所得到之質體RSFCPG可表現 g 1 tA基因、ppc基因及gdhA基因、可互補源自 大腸桿菌品系之g 1 t A、p P c或g d h A基因缺乏的 營養缺陷以及測量各酵素活性。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250211 A7 B7 _ - - 五、發明説明（） (ϋ )製備具有源自乳酸醱酵短桿菌g 1 t A基因之 質體 具有源自乳酸醱酵短桿菌g 1 t A基因之質體其構築 方法如下。使用具有代表S E Q識別號碼：6以及7之核 脊酸序列（其製備係基於麩胺酸棒桿菌g 1 t A基因（ Microbiology，14〇，ρρ · 1 8 1 7 - 1 828 ( 1 9 9 4 ))的核苷酸序列）的引子D N A進行P C R ’ 以及用乳酸醱酵短桿菌A T C C 1 3 8 6 9的染色體 D N A作爲模板以得到約3 k b的g 1 t A基因片段。將 此片段插入事先用SmaI水解的質體pHSG399 ( 購自Takara Shuzo Co·公司）以得到質體pHSGCB( 圖9 )。接著將P H S G C B用H i n d I I I水解，切 出約3kb的gltA基因片段，插入事先用 Η 1 n d I I I水解的質體p s T V 2 9 (購自Takara Shuzo Co.，公司）以得到質體pSTVCB (圖9)。 測量黏聚腸桿囷A J 1 3 3 5 5品系中之酵素活性証實得 到質體PSTVCB可表現gitA基因。 (iii)將 RSFCPG 以及 pSTVCB 引入 SC17sucA品系 用電穿透作用將R S F C P G轉形入黏聚腸桿菌 S C 1 7 S U C A品系以得到具有四環素抗性轉形株之 SC 1 7 s u cA/RSFCPG 品系。再將 s C 1 7 S u cA/RSFCPG品系用電穿透作用進一 步的轉形入P S T V C B以得到具有氯黴素抗性之轉形株 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）· 33 - (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) ►装· 訂' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250211 Α7 Β7 五、發明説明（ SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB 品系 < 4 >得到在低酸鹼値環境下改進L 一麩胺酸抗性的品系 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在低酸鹼値環境下改進對高L 一麩胺酸濃度抗性的品 系（以下亦稱爲 ''低酸鹼値下抗高濃度G 1 u品系〃）係 分離自黏聚腸桿菌SC 1 7 s u C.A/RSFCPG + p S T V C B 品系。
將 SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB 品系在3 0 °C下於L B G培養液（1 〇克/升胰腺、5克 /升酵母菌萃取物、1 0克/升Na C 1 、5克/升葡萄 糖）中培養過夜，用生理食鹽水淸洗細胞，經適當稀釋後 種植入M9 — E培養基（4克/升葡萄糖、17克/升 Na2HP〇4—12H2〇、3 克/升 KH2P〇4、 0· 5克/升NaCl 、 1克/升NH4CI 、1〇毫莫耳 濃度之MgS〇4、10微莫耳濃度之CaCl2、50毫 克/升L 一離氨酸、5 0毫克/升L甲硫氨酸、5 0毫克 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 /升DL -一氨基庚一酸、2 5毫克/升四環素、2 5毫 克/升氯黴素、3 0克/升L -麩胺酸，酸鹼値用氨水調 至4 · 5 )。於菌落出現之後在3 2 °C下培養2天得到在 低酸鹼値下抗高濃度G 1 u之品系。 將得到之品系，於Μ 9 — E培養液中生長，在內含5 毫升之L -麩胺酸生產測試培養液（4 〇克/升葡萄糖、 20 克 / 升（ΝΗ4) 2S〇4、〇 · 5 克 / 升 MgS〇4 — 7H2〇、2 克/升 KH2P〇4、〇 · 5 克/升 Na C 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -34- 1250211 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 、〇· 25 克/升 CaC]_2— 7H2〇、〇 · 02 克 / 升 F e s〇—4— 7Hs〇、〇.〇2克/升MnS〇4 —4 Η 2 Ο 1 0 . 72 毫克/升 ZnSOj— 2Η2〇， 0 · 64毫克/升CuS〇4 — 5Η2〇、〇· 72毫克/ 升C〇C12 — 6H2C)、〇 · 4毫克/升硼酸、1 · 2毫 克/升N a 2M0〇4 一 2 H2〇、2克/升酵母菌萃取物 、2 0 0毫克/升L 一離氨酸氯化氫、2 0 0毫克/升L —甲硫氨酸、2 0 0毫克/升01^ — 61：，£—二氨基庚二 酸、2 5毫克/升四環素氯化氫、2 5毫克/升氯黴素） 之5 0 -毫升體積的大測試管中測量L -麩胺酸之生產能 力。將展現最佳生長能力且其L -麩胺酸生產能力與原生 品系（SC17/RSFCPG+pSTVCB品系）相 同之品系稱爲黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1。 AJ 1 360 1品系於1999年8月十八曰寄存於 National Institute of Bioscience and human-Technology， Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (郵遞區號：3 0 5 — 8 5 6 6 ，1 — 3，Higashi 卜chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan )，寄存編號爲FERM P — 17516。然後 於2 0 0 0年七月六日依BudaPest Treaty轉移至國際保存 中心，寄存編號爲FERM BP — 7207。 < 5 >培養黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系生產L 一 S胺 酸（1 ) m —Bn— -I - I - I If·· nn nm«— mu 1 §_11 · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂r Φ f— ^_ϋν— 111- amen In— In» 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35- 1250211 A7 B7 — 五、發明説明（） 將黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系接種至內含3 0 0 —毫1之培養速的L二 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 葡萄糖、20克/升（NH4) 2S〇4、〇 . 5克/升 MgS〇4— 7H2〇、2 克/升 KH2P〇4、0 . 5 克/ 升 NaCl 、0. 25 克 / 升 CaCl2— 7H2〇、 〇.02克/升FeS〇4— 7H2〇、〇·〇2克/升 MnS〇4— 4H2〇、0 · 72 毫克/升 ZnS〇4 — 2H2〇、〇 · 64毫克/升CuS〇4— 5H2〇、 〇· 72毫克/升C〇C12 — 6H2〇、0 · 4毫克/升 硼酸、1 · 2毫克/升Na2Mo〇4— 2H2〇、2克/ 升酵母菌萃取物、2 0 0毫克/升L 一離氨酸氯化氫、 200毫克/升L —甲硫氨酸' 200毫克/升DL — α ，ε -二氨基庚二酸、2 5毫克/升四環素氯化氫以及 25毫克/升氯黴素，在34 °C、酸鹼値6 . 0之下培養 1 4小時。引入氨氣來控制培養液之酸鹼値。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將上述得到之培養物在5 0 0 0 r p m下離心1 0分 鐘，收集細胞接種入內含3 0 0毫升之培養液之1 一 L小 型醱酵槽，其中內含4 0克/升葡萄糖、5克/升（ NH4) 2S〇4、 1 · 5 克/升 MgS〇4— 7H2〇、6 克 / 升 KH2P〇4、1 · 5 克 / 升 NaCl 、〇 . 75 克 /升CaCl2— 7H2〇、〇·〇6克/升FeS〇4 — 7H2〇、〇·〇6克/升MnS〇4— 4H2〇、 2 · 16毫克/升ZnS〇4— 2H2〇、1 · 92毫克/ 升CuS〇4— 5HZ〇、2 · 16毫克/升C〇C12 — 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 1250211 A7 B7 -~34 ~-—- 五、發明説明（） 6H2〇、1 · 2毫克/升硼酸、3 · 6毫克/升 ——N ——a—2 M 0〇4 — 2 Η 2〇、6考乙丑酵母菌萃-物二 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 6 0 0毫克/升L 一離氨酸氯化氫、6 〇 〇毫克/升l 一 甲硫氨酸、6 0 0毫克/升DL — α，ε —二氨基庚二酸 、2 5毫克/升四環素氯化氫以及2 5毫克/升氯黴素， 在3 4 °C、酸鹼値4 · 5之下培養生產L 一麩胺酸。引入 氨氣控制培養液之酸鹼値。當最初加入之葡萄糖耗盡後， 連續地加入6 0 0克/升葡萄糖。 結果在上述之培養液生產L -麩胺酸進行5 0小時後 ’小型醱酵槽有大量的L -麩胺酸結晶沈澱出現。表1顯 示溶於培養液中L -麩胺酸之濃度及用2 Μ氫氧化鉀溶解 結晶後測量之L -麩胺酸濃度。將培養液靜置後倒掉培養 液，收集L 一麩胺酸酸結晶。 表1 溶於培養液中之L -麩胺酸濃度 5 1克/升 結晶沈澱的L -麩胺酸量 6 7克/升 溶解結晶後測量之L -麩胺酸濃度 1 1 1 8克/升 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 < 6 >培養黏聚腸桿菌A J 1 3 6 〇 1品系生產L 一麩胺 酸（2 ) 以下實驗係爲了證實黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系 即使於L -麩胺酸結晶的情況下仍具有生產L 一鍵胺酸之 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1250211 五、發明説明（ 能力。 A 7 B7 ϋ聚腸桿菌a 毫升之培養液的 葡萄糖、 0 1品系接種於內含3 0 0 〜L小型醱酵槽，其中內含4 0克/升 0克/升（N H MgS〇4— 7H2〇、 升N a C 0 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 S〇4、0 · 5克/升 克/升ΚΗ2Ρ〇4、〇·5克/ 7 Η 2 〇、 Γ7H2〇、〇·〇2克/升 0·72毫克/升ZnS〇4— 4笔克/升CuS〇4-5H2〇、 h— 6H2〇、〇 . 4毫克/升 2〇、2克/ 0 0毫克/升L 一離氨酸氯化氫、 甲硫氨酸、2〇〇毫克/升〇1^ — “ 基庚二酸、9 r 一 _ 毫克/升四環素氯化氫以及 2 5毫克/升氯黴素， 在34C、酸鹼値6·0之下培養 1 4小時。引入氨氣切j + &制培養液之酸鹼値。將上述得到之 培養物在5000rDn^ p m下離心1 0分鐘，然後將收集的 細胞在內a L —麩胺酸結晶的培養液中培養。帛養液內含 40克/升葡萄糖、5克/升（NIi4) 2S〇4、1 · 5 克/升MgS〇4— 7h2〇、6克/升KH2p〇4、 1 · 5 克/升 NaC 1 、〇· 75克/升（：3〇12 — 7H2〇、〇·〇6克/升FeS〇4— 7H2〇、 〇 ·〇6克/升MnS〇4— 4H2〇、2 . 16毫克/升 Z π S 0 4 — 2 Η 2 Ο λ 1 · 92 毫克/升 CuS〇4 — 〇 25 克 / 升 CaCl 〇 ·〇2克/升FegQ Μη S〇4 一 4h2〇、 2 Η 2 〇、〇 · 〇.7 2¾克/升c〇c 硼酸、1 · 2毫克/升 7TNa2Mo〇4-2H 升酵母菌萃取物、 2 0 0毫克/升l ，ε —二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-38 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250211 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（36) 5 Η 2 0 > 2 · 16 毫克/升 C〇Cl2— 6Η2〇、 —i—^2—毫克/升硼麗、3 · 6毫克/升Na2Mo〇4 一 2H2〇、6克/升酵母菌萃取物、600毫克/升L 一離 氣酸氯化氫、6 0 0毫克/升L 一甲硫氨酸、6 0 0毫克 /升DL - α，ε —二氨基庚二酸、2 5毫克/升四環素 氯化氫以及2 5毫克/升氯黴素以及添加4 0克/升L 一 變fee酸結晶。將細胞接種入內含3 0 0笔升之此培養液白勺 1 一 L小型醱酵槽，在3 4 °C以及酸鹼値4 . 3下培養生 產L -麩胺酸。引入氨氣控制培養液之酸鹼値。待最初力口 入之葡萄糖耗盡後，連續地加入6 0 0克/升葡萄糖。此 培養液中，於酸鹼値4 · 3下僅溶解3 9克/升加入的L 一麩胺酸，殘留1克/升結晶。 結果當上述之培養生產L -麩胺酸進行5 3小時後， 在小型醱酵槽有大量的L -麩胺酸結晶沈澱。表2顯示溶 於培養液中L -麩胺酸之濃度以及用2 Μ氫氧化鉀溶解結 晶後測量之L -麩胺酸濃度。培養液靜置後倒掉培養液， 收集L -麩胺酸酸結晶。結果顯示黏聚腸桿菌 A J 1 3 6 0 1品系在L —麩胺酸結晶存在下可累積L 一 麩胺酸以及使其沈澱結晶。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 袈. 訂
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39 - 1250211 A7 B7 五、發明説明（） 表2 _令培養液中L -麩胺酸之濃度 3 9克/升 L -麩胺酸沈澱結晶的量 1 1 9克/升 溶解結晶後測量之L -麩胺酸濃度 1 5 8克/升 主要的培養新生產之L -麩胺酸結晶量 1 1 8克/升 < 7 >培養黏聚腸桿菌A J 1 3 6 Ο 1品系生產L 一麩胺 酸（3 ) 黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系不僅可在酸性的p Η 下生長，且亦可在中性的ρ Η下生長。因此以下之實驗証 實L -麩胺酸亦可在中性ρ Η的起始培養液中沈澱結晶並 可於培養期間生產L -麩胺酸而使培養酸鹼値自然的降低 〇 將黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系的細胞在一盤（直 徑8 · 5公分）內含2 5毫克/升四環素氯化氫以及2 5 毫克/升氯黴素的L B G瓊脂培養基（1 〇 g//L胰腺、 5克/升酵母菌萃取物、1 〇克/升Na C 1 、5克/升 葡萄糖、1 5克/升瓊脂）中於3 0 °C下培養1 4小時後 ，再接種至內含3 0 〇毫升之培養液之1 一 l小型醱酵槽 中，其中內含4 0克/升葡萄糖、5克/升 (NH4) 2S〇4、 1 · 5 克/升 MgS〇4— 7H2〇、 6 克 / 升 KH2P〇4、1 · 5 克/升 NaC 1 、0 · 75 克 / 升 CaC12 — 7H2〇、0 · 06 克 / 升 FeS〇4 —71^2〇、0.〇6克/升]\/1118〇4一4112〇、 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -40 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 晶 結 酸 酸 胺 麩 I L 集 收 表 1250211 A7 ___ B7 ~~ Jg-------—--—__... 五、發明説明（） 2 · 16毫克/升ZnS〇4— 2H2〇、1 · 92毫克/ ……^ '2.16 毫 Jg / 升 C 〇 C 1 2 — 6H2〇、1 · 2毫克/升硼酸、3 · Θ毫克/升 Na2Mo〇4-2H2〇 ^ 6克/升酵母菌萃取物、 6 〇 〇毫克/升L 一離氨酸氯化氫、6 〇 〇毫克/升l 一 甲硫氨酸、6 0 0毫克/升Dl — α，ε -二氨基庚二酸 、2 5毫克/升四環素氯化氫以及2 5毫克/升氯黴素， 先在3 4 °C以及酸鹼値7 · 0下培養。引入氨氣控制培養 液之酸鹼値。待最初加入之葡萄糖耗盡後，連續地加入 6 0 0克/升葡萄糖。 當L —麩胺酸累積後，酸鹼値自然的降低。控制引入 的氨氣以便在開始培養後1 5小時至2 4小時內酸鹼値逐 步地從7 · 0降低至4 · 5，再於開始培養2 4小時之後 將酸鹼値變成4 · 5，然後繼續培養1 2小時。 結果在上述之培養生產L -麩胺酸進行3 6小時後， 小型醱酵槽內有大量的L -麩胺酸結晶沈澱。表3顯示溶 於培養液中L -麩胺酸之濃度以及用2 Μ氫氧化鉀溶解結 晶後測量之L -麩胺酸濃度。待培養液靜置後倒掉培_液 L 一麩胺酸溶於培養液中之濃度 4 5克/升 一 結晶沈澱的L -麩胺酸量 3 1克/升 一 溶解結晶測量之L -麩胺酸濃度 7 6克/升 一 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -41 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1250211 A7 B7 五、發明説明（ 序列表 0 > Ajinomoto Co., Inc. 〈1 2 Ο〉伴隨沈澱法之醱酵生產L -麩胺酸的方法 〈13 0〉 (15 0) JP 1 1 - 2 3 4 8 0 6 〈151〉1999- 08 - 2 0 〈15〇〉JP 2000-78771 〈151〉 20 0 〇一03 — 21 (16 0) 7 < 1 7 0 ) Patentln Ver. 2 . 0 I-—, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 o_ -1 C\1 oo IX IX IX IX 2 2 2 2 ο 2 2 2 2 4 D 黏 6 5 5
A N 菌 桿 腸 聚
S D C 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -42 - !25〇211
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 t gca ttc age gtt ttc cgc tgt cac age ate atg aac tgt gta agt gtt 49 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser lie Met Asn Cys Val Ser Val 15 1〇 15 tgt cct aaa ggg eta aac ccg aeg ege get ate ggc cac att aag teg 97
Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala lie My His lie Lys Se「 20 25 30 atg ctg ctg caa ege age geg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148
Met Leu Leu Gin Arg Ser Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -43 - 411250211 A7 B7 五、發明説明（）、 ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208 gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268 aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc-ataacattgc ttaagggatc aca atg 324 ..一 .......... —— Met 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cag aac age geg atg aag ccc tgg Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro T「p 5 geg aat cag tet tac ata gag caa Ala Asn Gin Se「Ty「lie Glu Gin 20 25 cct gac tet gtg gat gca gtg tgg Pro Asp Ser Val Asp Ala Val T「p 35 40 ggc aeg gga gtg aaa cct gag cag Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gin 50 55 ttc cgt ege ctg geg aaa gac gca Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala 70 gat ccg gca acc aac tee aaa caa Asp Pro Ala Th「 Asn Se「 Lys Gin 85 geg ttt cgt ttc ege gga cat cag Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin 100 105 ctg tgg aaa cag gac ege gtt gee Leu Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala 115 120 ctg acc gac gee gat ttt cag gaa Leu Th「 Asp Ala Asp Phe Gin Glu 130 135 att ggc aaa gaa acc atg aag ctg lie Gly Lys Glu Th「Met Lys Leu 150 cag acc tac tgt ggc teg att ggt Gin Thr Tyr Cys Gly Ser lie Gly 165 acc gaa gag aaa ege tgg ate cag Thr Glu Glu Lys Arg Trp lie Gin 180 185 cag aeg tea ttc agt ggc gaa gag Gin Th「 Ser Phe Ser Gly Glu Glu 195 200 acc geg gca gaa ggg ctg gaa aaa Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys 210 215 gca aaa cgt ttc teg ctg gaa ggc Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly 230 ege gag atg att cgt cat geg ggc Arg Glu Met-Ile Arg His Ala Gly 245 ctg gac tee tee tgg ctg gee ggc Leu Asp Ser Ser T「p Leu Ala Gly 10 15 etc tat gag gat ttc ctg acc gat Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp 30· ege teg atg ttc caa cag tta cca Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu Pro 45 ttc cac tee gca act ege gaa tat Phe His Se「 Ala Thr A「g G〕u Ty「 60 65 tet cgt tac acc tee tea gtt acc Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr 75 80 gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac Val Lys Val Leu Gin Leu lie Asn 90 95 gaa gca aat etc gat ccg ett ggc Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly 110 gat etc gat cct gee ttt cac gat Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp 125 age ttt aac gta ggt tet ttt gee Ser Phe Asn Val Gly Se「Phe Ala U0 145 gee gat ctg ttc gac geg ctg aag Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys 155 160 gca gag tat atg cac ate aat aac Ala Glu Ty「Met His lie Asn Asn 170 175 cag cgt ate gaa tee ggt geg age Gin Arg lie Glu Ser Gly Ala Ser 190 aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu 205 tat ctg ggc geg aaa ttc ccg ggt Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly 220 225 99t gat geg ctg gtg ccg atg ctg Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu 235 240 aaa age ggc aca cgt gaa gtg gta Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val 250 255 372 420 468 516 564 612 660 708 756 804 852 900 948 996 1044 1092 I— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-44 - 42 —1250211 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ett aac gta ctg att aac gta ctg 1U0 Leu Asn Val Leu lie Asn Val Leu _ 270 gac gaa ttc'tcc ggt aaa cac aaa 1188 Asp GTu Phe Ser Gyy [ys g· 285 aag tat cac atg ggc ttc tct teg 1236 Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser 300 305 gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac 1284 Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn 315 320 ccg gtg gtc atg gga teg gta cgt 1332 Pro Val Val Met Gly Se「Val A「g 330 335 ccg gtc age aat aaa gtg ttg cct 1380 Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro 350 gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428 Val He Gly Gin Gly Val Val Gin 365 ege ggc tac gaa gtg ggc ggc aeg 1476 Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr 380 385 gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524 Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro 395 400 tgt act gac ate ggc aag atg gtg 1572 Cys Thr Asp He Gly Lys Met Val 410 415 get gac gat ccg gaa gcg gtg gcc 1620 Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala 430 tat ege aac acc ttc aaa ege gat 1668 Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp 445 ege cgt cat ggt cac aac gag gcg 17-)5 Arg Arg His Gly His Asn GTu Ala 460 465 ttg atg tac cag aaa ate aaa aag ]η^ Leu Met Tyr Gin Lys He Lys Lys 475 480 gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt igp Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly 490 495 gag atg gtg aac ctg tac ege gat ΐββ〇 Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp 510 一 gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg age iqq〇 Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser 525 tat ctg aac cac gaa tgg gat gag Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu 540 545 五、發明説明（） ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg 260 265 ———jag cca cag gat ctg ttc
Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe 275 280 gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val 290 295 gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg Asp He Glu Thr Glu Gly Gly Leu 310 ccg tct cac ctg gaa att gtc age
Pro Se「His Leu Glu lie Val Ser 325 gca cgt etc gat cgt ctg gcc gaa
Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu 340 345 ate acc att cac ggt gat gcg gcg lie Thr He His Gly Asp Ala Ala 355 360 gaa acc ctg aac atg tct cag gcg Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala 370 375 gta cgt ate gtc att aac aac cag Val Arg lie Val He Asn Asn Gin 390 aaa gat gcg cgt tea acc ccg tac Lys Asp A〕a Arg Ser Thr Pro Ty「 405 ctg gca ccg att ttc cac gtc aat Leu Ala Pro lie' Phe His Val Asn 420 425 ttt gtt acc ege ctg gcg ctg gac Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp 435 440 gtg ttt ate gat ctg gtg tgc tat Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr 450 455 gat gag cca agt get acc cag ccg Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gin Pro 470 cat ccg aeg ccg cgt aaa att tac His Pro Thr Pro Arg Lys lie Tyr 485 gtc gcg teg cag gaa gat gcc acc Val Ala Ser Gin Glu Asp Ala Thr 500 505 gcg etc gat gcg ggc gaa tgc gtg Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val 515 520 ctg cac tcc ttc aeg tgg teg cct
Leu His^Ser- Phe Thr T卬 Ser Pro 530 535 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-45 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1250211 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/ cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg
Pro Tyr Pro Ala Gin Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu 550 - 555 560 ate .agc..cag gtc. cct. gag^ c cag^iGg cgc gtg gcc ^
Arg He Se「Gin Val P「〇 Glu Gin lie Glu Val Gin Ser A「g Val Ala 565 570 575 aag ate tat aac gat cgc aag ctg atg gec gaa ggc gag aaa geg ttc
Lys lie Ty「Asn Asp A「g Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe 580 585 590 gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg geg tac gcc aeg ctg gtg gat gaa
Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu 595 600 605 ggt att ccg gtt cgc etc teg ggt gaa gac tee ggt cgt gga acc ttc
Gly lie Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Se「Gly A「g Gly Thr Phe 610 615 620 625 ttc cat cgc cac geg gtc gtg cac aac cag get aac ggt tea acc tat
Phe His A「g His Ala Val Val His Asn Gin Ala Asn Gly Se「Thr Ty「 630 635 640 aeg ccg ctg cac cat att cat aac age cag ggc gag ttc aaa gtc tgg
Thr Pro Leu His His lie His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys Val Trp 645 650 655 gat teg gtg ctg tet gaa gaa geg gtg ctg geg ttt gaa tac ggt tac
Asp Se「Val Leu Se「Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Ty「Gly Tyr 660 665 670 gcc aeg get gag ccg cgc gtg ctg acc ate tgg gaa geg cag ttt ggt
Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr lie Trp Glu Ala Gin Phe Gly 675 680 685 gac ttt gcc aac ggt get cag gtg gtg att gac cag ttc ate age tet
Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin Val Val lie Asp Gin Phe He Ser Ser 690 695 700 705 ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg
Gly Glu Gin Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro 710 715 720 cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tee tet gcc cgt ctg gaa
His Gly Tyr Glu y Gin Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu 725 730 735 cgc tat ctg caa ett tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg
Arg Tyr Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Val Pro 740 745 750 teg aeg ccg get cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag geg ctg cgc
Ser 工h「P「〇 Ala Gin Val Tyr His Met Leu Arg Arg G"ln A*1 a Leu Arg 755 760 765
r?9 C9C C9t CC9 ct9 9t9 9tg atg tc9 cc9 aa9 tc9 ct9 C9C
Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg 77〇 ' 775 780 785 cat cca ctg geg ate teg teg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc
His Pro Leu Ala lie Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe 790 795 800 cag ccg gee att ggt gag ate gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa bln Pro Ala He Gly Glu lie Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val Lys .,805 810 815 λ9° v9v-r λ9^-?ΧΪ9 t9c 99^ a39 gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag
Arg VaT Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gin 820 825 830 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46 - 2004 ,2052一 2100 2148 2196 2244 2292 2340 2388 2436 2484 2532 2580 2628 2676 2724 2772 2820 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250211 A7 B7 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ί^Τ 發明説明（） cgt cgt aaa gac gag aaa Arg Arg Lys Asp Glu Lys 835 …-‘ctt taG^ccg 4tG^ c Leu Ty「 Pro Phe Pro His 850 855 tct cac gta cag gac ttt Ser His Val Gin Asp Phe 870 ggc gcc tgg tac tgt age Gly Ala Trp Tyr Cys Ser 885 ggt gcc acc ctg cgt tat Gly Ala Thr Leu Arg Tyr 900 gtg ggt tat atg tcc gta Val Gly Tyr Met Ser Val 915 gac gca ctg aac gtc aat Asp Ala Leu Asn Val Asn 930 935 att etc gtt ccc gac ctg lie Leu Val Pro Asp Leu 10 acc tgg cac aag aaa cca Thr Trp His Lys Lys Pro 25 gtc gaa att gaa act gac Val Glu lie Glu Thr Asp 40 .gat ggc gtg ctg gaa gcc Asp Gly Val Leu Glu Ala 55 tcc ege cag ate ctg ggt Ser Arg Gin lie Leu Gly 75 gaa age agt gcc aaa geg Glu Ser Ser Ala Lys Ala 90 cag aca geg teg ctt gaa Gin Thr Ala Ser Leu Glu 105 ate cgt ege ctg att geg He Arg Arg Leu lie Ala 120 acc gat gtt Thr Asp Val 840 cag 〜gcg〜gta Gin Ala Val gtc tgg tgc Val Trp Cys cag cat cat Gin His His 890 gca ggt ege Ala Gly Arg 905 cac caa caa cag cag His Gin Gin Gin Gin 920 taattaaaag gaaagata ggc acc ggc Gly Thr Gly 135 ctg geg aac Leu Ala Asn 150 9ca aca aeg Ala Ala Thr 9ta ggc gga Val Gly Gly aaa ccg cag Lys Pro Gin 155 get cag cag Ala Gin Gin 170 cct gaa Pro Glu ggc gat Gly Asp aaa gtc Lys Val 45 gtg ctg Val Leu 60 ege ctg Arg Leu gaa age Glu Ser gaa gag Glu Glu gag cat Glu His 125 cgt tta Arg Leu U0 9ct gag Ala Glu cct gtt Pro Val gcc ate Ala lie cag一gaa Gin Glu 860 cag gaa Gin Glu 875 ttc cgt Phe Arg ccg gca Pro Ala gtg ege Val Arg 845 gca .^tts Ala Leu g3g cc*t Glu Pro gat gtc Asp Val teg get Ser Ala 910 teg gtt gca Ser Val Ala 15 gca gtc age Ala Val Ser 30 gtg ctg gaa Val Leu Glu gaa gac gaa Glu Asp Glu aaa gaa ggc Lys Glu Gly 80 aat gac acc Asn Asp Thr 95 age age gat Ser Ser Asp 110 aat ctt gac Asn Leu Asp aeg cgt gaa Thr Arg Glu aaa gcc gcc Lys Ala Ala 160 gcc aac ege Ala Asn Arg 175 caa Gin 925 atg Met 1 gat Asp gac Asp agt Ser gcc Ala ate gaa cag lie Glu Gin aaa gee.,,taL, Lys Ala Tyr 865 ctg aac cag Leu Asn Gin 880 gtg ccg ttt Val Pro Phe 895 tct ccg gcc Ser Pro Ala ctg gtt aat Leu Val Asn age gta gat Se「 Val Asp 5 aca gta gca Thr Val Ala 20 gaa gtc Glu Val 35 gca tct Ala Ser ege gat Arg Asp gtg ccg Val Pro 50 ggg gca Gly Ala 65 aac agt Asn Ser aeg cca Thr Pro 9cg etc Ala Leu get geg Ala Ala 130 9ac gtt Asp Val 145 9cg cca geg geg ggt Ala Pro Ala Ala Gly 0 165 ^9c gaa aaa cgt gtt Glu Lys Arg Val 180 ate lie gcc Ala acc gtt aeg Th「 Val Thr 9cg ggt aaa Ala Gly Lys 85 gee cag cgt Ala Gin Arg 100 age ccg geg Ser.Pro Ala 115 cag ate aaa Gin lie Lys gaa aaa cat Glu Lys His 2868 、2916 2964 3012 3060 3108 3159 3207 3255 3303 3351 3399 3447 3495 3543 3591 3639 3687 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本纸張尺度適用中國’標準（CNS ) M規格（加π7公董） 47 1250211 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735
Pro Met Th「A「g Leu A「g Lys Arg Val AU Glu A「g Leu Leu Glu Ala 185 190 195 aag aac age acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa ate aac atg aag 3783
Lys Asn Ser Thr Ala Mei Leu Th「 Thr Phe Asn Glu lie Asn Met Lys 200 205 210 ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831
Pro He Met Asp Leu Arg Lys Gin Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg 215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tet ttc tac ate aag gcc gtg gtc 3879
His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Se「Phe Tyr He Lys Ala Val Val 230 235 240 245 gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tet ate gat ggc gaa 3927
Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser He Asp Gly Glu 250 255 260 gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tet acg 3975
Asp Val Val Ty「 His Asn Tyr Phe Asp Val Ser lie Ala Val Se「 Th「 265 270 275 cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg age 4023
Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser 280 285 290 atg get gac ate gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071
Met Ala Asp lie Glu Lys Lys lie Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg 295 300 305 gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc ate 4119
Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr GTy Gly Asn Phe Thr lie 310 315 320 325 acc aac ggt ggt gtg ttc ggt teg ctg atg tet acg cca ate ate aac 4167
Th「Asn Gly Gly Λ/al Phe Gly Se「Leu Met Se「Thr Pro lie lie Asn 330 335 340 ccg cca cag age gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215
Pro Pro Gin Ser Ala lie Leu Gly Met His Ala lie Lys Asp Arg Pro 345 350 355 atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg ate ctg cca atg atg tac ctg get 4263
Met Ala Val Asn Gly Gin Val Val lie Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala 360 365 370 etc tcc tac gat cac cgt tta ate gat ggt cgt gaa tet gtc ggc tat 4311
Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu lie Asp Gly Arg Glu Ser Val My Tyr 375 380 385 ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg' ctg ctg 4359
Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu 390 395 400 405 gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415 Asp Val gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag get aa.a cag 4466
Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin 1 5 1〇
ctg ttt gca egg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 45U
Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr 15 20 25 aca cca cgt*gaa gca gaa gaa gcg gca teg aaa ate ggt gca 4556
Thr Fro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys lie Gly Ala 30 35 40 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 48 - 461250211 A7 B7 五、發明説明（ 〈2 1 〇〉2 2 2 2〉P R T 3〉黏聚腸桿菌 4 0 0 )2 Al$ Phe Se「 Val Phe A「g Cys His Se「 lie Met Asn Cys Val Ser Vat 1 5 1〇 15 Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala lie Gly His He Lvs Ser 20 25 3〇 Met Leu Leu Gin Arg Se「 Ala 35 〈2 1 〇〉3 < 2 1 1 > 9 3 5 〈2 1 2〉P R T 〈2 1 3〉黏聚腸桿菌 寶裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ( 4 0 0 ) 3 Met Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp 1 5 Gly Ala Asn Gin Ser Tyr lie Glu Gin 20 25 Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp 35 40 Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gin 50 55 Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala 65 70 Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin 85 Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin 100 105 Gly Ley'Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala ^ * 115 120 Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu 130 135
Leu Asp Ser 10 Leu Tyr Glu
Ser Trp
Asp Phe 30 A「g Se「 Met Phe Gin 45 Ala Thr
Phe His Ser 60 Se「 Arg Tyr 75 Val Lys Val 90 Glu Ala Asn Asp Leu Asp Ser Phe Asn U0
Thr Ser Leu Gin Leu Aspno Pro Ala 125 Val Gly
Leu Ala 15 Leu Thr Gin Leu Arg Glu Se「Val 80 Leu He 95 Pro Leu Phe H-is Ser Phe # 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -49 - 1250211
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明説明（）
Ala lie Gly Lys Glu Th「Met Lys，Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu 145 150 155 160
Lys Gin Th「Ty「Cys Gly Se「lie Gly Ala Glu Ty「Met His He Asn 165 170 175
Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp He Gin Gin Arg lie Glu Se「Gly Ala 180 185 190
Ser Gin Th「Se「Phe Se「Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu 195 200 205
Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly AT a Lys Phe Pro 210 215 220
Gly Ala Lys A「g Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp A"la Leu Val Pro Met 225 230 235 240
Leu Arg Glu Met lie Arg His Ala Gly Lys Se「Gly Th「Arg Glu Val 245 250 255
Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu lie Asn Val 260 265 270
Leu Gly Lys Lys Pro G〕n Asp Leu Phe Asp Glu Phe Se「 Gly Lys His 275 280 285
Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser 290 295 300
Se「Asp lie Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe 305 310 315 320
Asn Pro Se「His Leu Glu lie Val Ser Pro Val Val Met Gly Se「Val 325 330 335
Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu 340 345 350
Pro lie Thr lie His Gly Asp Ala Ala Val lie Gly Gin Gly Val Val .355 360 365
Gin Glu Th「Leu Asn Met Se「Gin Ala A「g Gly Tyr Glu Val Gly Gly 370 375 380
Th「Val Arg lie Val lie Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn 385 390 395 400
Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp lie Gly Lys Met 405 410 415
Val Leu Ala Pro lie Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val 420 425 430
Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg 435 440 445
Asp Val Phe He Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu 450 455 460
Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys He Lys 465 470 475 480
Lys His Pro Thr Pro Arg Lys lie Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu 485 490 495
Gly Val Ala Se「Gin Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Ty「Arg 500 505 510
Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met 515 520 525
Se「 Leu Hiέ Se「 Phe Thr T「p Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu T卬 Asp 53Θ- 535 540
Glu Pro Tyr Pro Ala Gin Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala 545 550 555 560 -50 張尺度適财關緖準（格(210X297公釐） 1250211 A7 B7 48五、發明説明（） Leu A「g lie Se「Gin Val Pro Glu Gin lie Glu Val Gin Se「Arg Val 565 570 575 Ala Lys lie Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala 580 585 590 Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Ty「Ala Th「Leu Val Asp 595 600 605 Glu Gly lie Pro Val A「g Leu Ser Gly G〕u Asp Se「Gly A「g Gly Th「 610 615 620 Phe Phe His A「g His Ala Val Val His Asn Gin Ala Asn Gly Se「Th「 625 630 635 640 Ty「Th「Pro Leu His His lie His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys V_al 645 650 655 Trp Asp Ser Val Leu Se「 Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly 660 665 670 Ty「Ala Th「Ala Glu Pro A「g Val Leu Thr He lYp Glu Ala Gin Phe 675 680 685 Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin Val Val lie Asp Gin Phe He Ser 690 695 700 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ser Gly Glu Gin Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu 705 710 715 720 Pro His Gly Tyr Glu Gly Gin Gly Pro Glu His Ser Se「Ala A「g Leu 725 730 735 Glu Arg Tyr Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Val 740 745 750 Pro Ser Thr Pro Ala Gin Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gin Ala Leu 755 760 765 Arg Gly Met A「g Arg Pro Leu Val Val Met Se「 Pro Lys Ser Leu Leu 770 775 780 Arg His Pro Leu Ala lie Se「Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Se「 785 790 795 800 Phe Gin Pro Ala He Gly Glu lie Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val 805 810 815 Lys A「g Val Val Leu Cys Se「Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu 820 825 830 Gin Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala lie Val Arg He Glu 835 840 845 Gin Leu Tyr Pro Phe Pro His Gin Ala Val Gin Glu Ala Leu Lys Ala 850 855 860 Ty「Ser His Val Gin Asp Phe Val lYp Cys Gin Glu Glu Pro Leu Asn 865 870 875 880 Gin Gly Ala T「p Tyr Cys Se「 Gin His His Phe Arg Asp Val Val Pro 885 890 895 Phe Gly Ala Thr Leu A「g Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Se「Ala Ser Pro 900 905 910 Ala Val Gly Tyr Met Ser Val Wis Gin Gin Gin Gin Gin Asp Leu Val 915 920 925 Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn 930 935 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-51 - -裝---- 訂 1250211 A7 B7 五、發明説明（）<21〇>4 <211) 407 <212) P R T 〈2 1 3〉黏聚腸桿菌 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 〈4 0 〇 > 4 Met Se「Se「Val Asp lie Leu Val Pro Asp Leu P「o Glu Ser Val Ala 1 5 10 15 Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro' Gly Asp Ala Val Ser 20 25 30 Arg Asp Glu Val He Val Glu lie Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu 35 40 45 Val P「o Ala Se「Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gin lie Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80 Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Se「Asn Asp Thr 85 90 95 Thr Pro Ala Gin A「g Gin Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp 100 105 110 Ala Leu Ser P「〇 Ala lie Arg Arg Leu lie Ala Glu His Asn Leu Asp 115 120 125 Ala Ala Gin He Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu 130 135 140 Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gin Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gin Gin Pro Val Ala Asn Arg 165 170 175 Se「 Glu Lys A「g Val Pro Met Th「 Arg Leu A「g Lys A「g Val Ala Glu 180 185 190 A「g Leu Leu Glu Ala Lys Asn Se「 Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn 195 200 205 Glu lie Asn Met Lys Pro lie Met Asp Leu Arg Lys Gin Ty「 Gly Asp 210 215 220 Ala Phe Glu Lys A「g His Gly Val A「g Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr 225 230 235 240 He Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser lie Asp Gly Glu Asp Val Val Ty「His Asn Tyr Phe Asp Val Ser 260 265 270 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -52 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250211 A7 B7 — 五、發明説明（） lie Ala Val Se「Th「Pro A「g Gb Leu Val Th「Pro Val Leu A「g Asp 275 280 285
Val Asp Ala Leu Se「Met Ala Asp lie Glu Lys Lys lie Lys Glu Leu 290 295 300
Ala Val Lys Gly A「g Asp Gly Lys Leu Th「 Val Asp Asp Leu Th「 Gly 305 310 315 320
Gly Asn Phe Th「lie Th「Asn Gly Gly Val Phe Gly Se「Leu Met Se「 325 330 335
Thr Pro lie lie Asn Pro Pro Gin Ser Ala He Leu Gly Met His Ala 340 345 350 lie Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gin Val Val lie Leu Pro 355 360 365
Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu lie Asp Gly Arg 370 375 380
Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro 385 390 395 400
Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val 405 〈210〉5 <211)40 (212) P R T 〈2 1 3〉黏聚腸桿菌 〈4 0 〇〉5
Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin Leu Phe Ala Arg Jyr Gly 1 5 10 15
Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr* Ala Cys Thr Thr Pro A「g Glu Ala Glu 20 25 30
Glu Ala Ala Ser Lys lie Gly Ala -35 40 〈2 1 〇〉6 〈2 1 1〉3 〇
〈2 1 2〉D N A 〈2 1 3〉人造序列 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2iOX 297公釐） -53 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
511250211 A7 B7 五、發明説明（） 〈 2 2 0〉 〈2 2 3〉人造序列之描述：引子 〈4〇〇〉6 gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg 〈2 1 〇 > 7 <211)30 〈212〉D N A 〈2 1 3〉人造序列 ( 2 2 0 ) 〈2 2 3〉人造序列之描述：引子 ( 4 0 0 ) 7 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt I裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標李（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -54 -

Claims (1)

1250211? 年 倏 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 1 · 一種醱酵生產L -麩胺酸之方法，其包含在酸鹼 値調至沈澱L -麩胺酸之酸鹼値的培養液中培養黏聚腸桿 菌以生產且累積L -麩胺酸並於該培養液中沈澱L -麩胺 酸，其中該黏聚腸桿菌可在內含飽和濃度L -麩胺酸和碳 源之培養液中且在酸鹼値3 . 0至5 · 〇下代謝該碳源， 並能在該酸鹼値下於該培養液中累積L -麩胺酸並使其量 超過L -麩胺酸的飽和濃度量，其中該黏聚腸桿菌具有至 少一種下述之特性： (a )提高黏聚腸桿菌催化L -麩胺酸生合成反應之 酵素活性，其中該酵素係選自下述之至少一種：檸檬酸合 成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及麩胺酸脫氫酶；以及 (b )降低或缺乏黏聚腸桿菌催化L -麩胺酸生合成 的分支路徑並產生非L -麩胺酸之化合物的反應之酵素活 性。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該黏聚腸桿 菌可在培養液中生長。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該酸鹼値不 高於5 .〇。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該催化L 一 麩胺酸生合成之分支路徑並產生非L -麩胺酸之化合物的 酵素係α —酮基戊二酸脫氫酶。 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該黏聚腸桿 菌含有突變，該突變使其在內含醣類之培養液中培養時， 所分泌的細胞外黏性物質較野生菌株爲少。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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