ES2269047T3 - Procedimiento para la produccion de acido l-glutamico por fermentacion acompañada de precipitacion. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de acido l-glutamico por fermentacion acompañada de precipitacion. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación, que comprende cultivar un microorganismo en un medio líquido cuyo pH es ajustado a un pH en el que el ácido L-glutámico se precipite, para producir y acumular ácido L-glutámico y precipitar ácido L-glutámico en el medio que contiene una fuente de carbono, en el que el pH es de 3, 0 a 5, 0, en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH de 3, 0 a 5, 0 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono, y presenta la capacidad de acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.
Description
Procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico por fermentación acompañada de
precipitación.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico por fermentación acompañada de
precipitación. El ácido L-glutámico se utiliza
ampliamente como material de condimento, etcétera.
El ácido L-glutámico se produce
generalmente mediante procedimientos de fermentación, utilizando las
bacterias denominadas corineformes que producen ácido
L-glutámico y que pertenecen al género
Brevibacterium, Corynebacterium o Microbacterium, o
sus dos cepas mutantes (Amino Acid Fermentation, págs
195-215, Gakkai Shuppan Center, 1986). Como
procedimientos para la producción de ácido
L-glutámico mediante fermentación utilizando otras
cepas bacterianas se conoce un procedimiento que utiliza un
microorganismo que pertenece al género Bacillus, Streptomyces,
Penicillium o similar (patente US nº 3.220.929), un
procedimiento que utiliza un microorganismo que pertenece al género
Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, o similares
(patente US nº 3.563.857), un procedimiento que utiliza un
microorganismo que pertenece al género Bacillus, Pseudomonas,
Serratia, Aerobacter aerogenes (al que se hace referencia
habitualmente como Enterobacter aerogenes) o similar
(Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) nº
32-9393), un procedimiento que utiliza una cepa
mutante de Escherichia coli (Solicitud de Patente Japonesa
abierta al público (Kokai) nº 5-244970) y así
sucesivamente. Además, los inventores de la presente invención han
propuesto un procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico utilizando un microorganismo que
pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea
(solicitud de patente japonesa abierta al público nº
2000-106869).
Además, se han dado a conocer varias técnicas
para mejorar la capacidad para producir el ácido
L-glutámico potenciando actividades de las enzimas
biosintéticas del ácido L-glutámico utilizando las
técnicas del ADN recombinante. Por ejemplo, se ha informado de que
la introducción de un gen que codifica la citrato sintasa derivada
de Escherichia coli o de Corynebacterium glutamicum
fue efectiva para la potenciación de la capacidad de producción del
ácido L-glutámico en las bacterias
Corynebacterium o Brevibacterium (publicación de
patente japonesa nº 7-121228). Además, la solicitud
de patente japonesa abierta al público nº 61-268185
da a conocer una célula que aloja ADN recombinante que contiene un
gen de la glutamato deshidrogenasa derivado de las bacterias
Corynebacterium. Además, la solicitud de patente japonesa
abierta la público nº 63-214189 da a conocer una
técnica para mejorar la capacidad de producción del ácido
L-glutámico amplificando un gen de la glutamato
deshidrogenasa, un gen de la isocitrato deshidrogenasa, un gen de la
aconitato hidratasa y un gen de la citrato sintasa.
Aunque la productividad del ácido
L-glutámico ha aumentado considerablemente mediante
la cría de los microorganismos mencionados anteriormente o la mejora
de los procedimientos de producción, para responder a un aumento
posterior de la demanda en el futuro, es necesario el desarrollo de
procedimientos que produzcan ácido L-glutámico más
eficientemente con un coste más bajo.
Se conoce un procedimiento en el que la
fermentación se lleva a cabo cristalizando los
L-aminoácidos que se acumulan en el cultivo
(solicitud de patente japonesa abierta al público nº
62-288). En este procedimiento, la concentración de
L-aminoácidos en el cultivo se mantiene por debajo
de un cierto nivel precipitando los L-aminoácidos
acumulados en el cultivo. Específicamente, el
L-triptófano, la L-tirosina o la
L-leucina se precipitan durante la fermentación,
ajustando la temperatura o el pH del cultivo, o añadiendo un agente
activo superficial al medio.
Aunque se conoce, tal como se ha descrito
anteriormente, un procedimiento de fermentación con
L-aminoácidos precipitantes, los aminoácidos
apropiados para este procedimiento, son los de solubilidad acuosa
relativamente baja, y no se conocen ejemplos de aplicación del
procedimiento a aminoácidos altamente solubles en agua tal como el
ácido L-glutámico. Además, el medio debe tener un pH
bajo para precipitar el ácido L-glutámico. Sin
embargo, las bacterias que producen ácido
L-glutámico tales como las mencionadas
anteriormente, no pueden desarrollarse bajo condiciones ácidas, y
por tanto, la fermentación del ácido L-glutámico se
lleva a cabo bajo condiciones de neutralidad (patentes US nº
3.220.929 y nº 3.032.474; Chao K.C. & Foster J.W., J.
Bacteriol., 77, páginas 715-725 (1959)). Así, la
producción del ácido L-glutámico por fermentación
acompañada de precipitación no se conoce. Además, se sabe que el
crecimiento de la mayoría de las bacterias acidófilas es inhibido
por los ácidos orgánicos tales como el ácido acético, el ácido
láctico y el ácido succínico (Yasuro Oshima Ed., "Extreme
Environment Microorganism Handbook" p. 231, Science Forum;
Borichewski R.M., J. Bacteriol., 93, pág 597-599
(1967), etc). Por tanto, se considera que muchos microorganismos son
susceptibles al ácido L-glutámico, que es asimismo
un ácido orgánico, bajo condiciones ácidas, y no han habido
informaciones de que se intentara la investigación de
microorganismos que mostraban capacidad productora del ácido
L-glutámico bajo condiciones ácidas.
En la situación habitual mencionada
anteriormente, un objetivo de la presente invención consiste en
investigar y criar un microorganismo que produzca ácido
L-glutámico bajo condiciones de pH bajo y
proporcionar un procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico utilizando un microorganismo obtenido
mediante fermentación con precipitación del ácido
L-glutámico.
\newpage
Los inventores de la presente invención
consideraron durante el estudio para la mejora de la productividad
del ácido L-glutámico mediante fermentación, que la
inhibición de la producción por el ácido L-glutámico
acumulado en un medio a una alta concentración, constituía una de
las obstrucciones para la mejora de la productividad. Por ejemplo,
las células tienen un sistema secretor y un sistema de toma para el
ácido L-glutámico. Sin embargo, si el ácido
L-glutámico, una vez secretado al medio, se
incorpora otra vez a las células, no sólo falla eficientemente la
producción, sino que, como resultado, se inhiben asimismo las
reacciones biosintéticas del ácido L-glutámico. Para
evitar la inhibición de la producción por dicha acumulación del
ácido L-glutámico a alta concentración, los
inventores de la presente invención rastrearon microorganismos que
pueden proliferar bajo condiciones ácidas y en la presencia de una
alta concentración de ácido L-glutámico. Como
resultado, aislaron con éxito microorganismos que tenían dichas
propiedades a partir del suelo, y por tanto, cumplieron con la
presente invención.
Así, la presente invención proporciona lo
siguiente:
- (1)
- Un procedimiento para la producción de ácido L-glutámico mediante fermentación, que comprende cultivar un microorganismo en un medio líquido del cual se ajusta el pH a un pH en el que el ácido L-glutámico se precipite, para producir y acumular ácido L-glutámico y precipitar ácido L-glutámico en el medio que contiene una fuente de carbono, en el que el pH está entre 3,0 y 5,0,
- en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH comprendido entre 0,3 a 0,5 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono y posee una capacidad para acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.
- (2)
- El procedimiento según (1), en el que dicho microorganismo posee por lo menos una de las siguientes características:
- (a)
- el microorganismo potencia la actividad de una enzima que cataliza una reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico; y
- (b)
- el microorganismo disminuye o es deficitario en la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico.
- (3)
- El procedimiento según (2), en el que la enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico, es por lo menos una seleccionada de entre citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
- (4)
- El procedimiento según cualquiera de los de (1) a (3), en el que la enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico, es la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa.
- (5)
- El procedimiento según cualquiera de (1) a (4), en el que el microorganismo pertenece al género Enterobacter.
- (6)
- El procedimiento según (5), en el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans.
- (7)
- El procedimiento según (6), en el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans (AJ13601) FERM BP-7207.
- (8)
- El procedimiento según (6), en el que el microorganismo posee una mutación que causa menos secreción extracelular de un material viscoso, comparado con una cepa tipo salvaje cuando se cultiva en un medio que contiene un sacárido.
- (9)
- Procedimiento de cribado para un microorganismo, que comprende el cribado de un microorganismo apropiado para producir ácido L-glutámico mediante fermentación con ácido L-glutámico precipitante en un medio líquido de pH 3,0-5,0, que comprende inocular una muestra que contenga microorganismos, en un medio ácido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y una fuente de carbono, y seleccionando una cepa que pueda metabolizar la fuente de carbono.
- (10)
- El procedimiento según (9), en el que una cepa que puede crecer en el medio se selecciona como la cepa que puede matabolizar la fuente de carbono.
- (11)
- Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico mediante fermentación, que comprende el inicio del cultivo de un microorganismo en un medio líquido a un pH neutro y finalizando dicho cultivo a un pH al cual el ácido L-glutámico se precipita,
- en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH de entre 3,0 y 5,0 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y de la fuente de carbono, y posee capacidad para acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.
- (12)
- El procedimiento según (11), en el que el pH del cultivo e controla introduciendo gas amoníaco en el medio.
- (13)
- Microorganismo que tiene el número de registro FERM BP-7207.
Según el procedimiento de la presente invención,
el ácido L-glutámico puede producirse mediante
fermentación con precipitación de ácido L-glutámico.
Como resultado, el ácido L-glutámico en el medio se
mantiene por debajo de una cierta concentración, y el ácido
L-glutámico puede obtenerse sin sufrir la inhibición
del producto por el ácido L-glutámico a una alta
concentración.
La fig 1 muestra un mapa de restricción de un
fragmento de ADN derivado de Enterobacter Agglomerans
pTWVEK101.
pTWVEK101.
La fig 2 muestra la comparación de la secuencia
aminoácida deducida a partir de la secuencia nucleótida del gen
sucA derivado de Enterobacter Agglomerans y del
derivado de Escherichia coli. Secuencia superior:
Enterobacter Agglomerans, secuencia inferior: Escherichia
coli (lo mismo se aplicará en adelante en la presente
memoria).
La figura 3 muestra la comparación de la
secuencia aminoácida deducida de la secuencia nucleótida del gen
sucB derivado de Enterobacter Agglomerans y de la
derivada de Escherichia coli.
La figura 4 muestra la comparación de la
secuencia aminoácida deducida de la secuencia nucleótida del gen
sucC derivado de Enterobacter Agglomerans y de la
derivada de Escherichia coli.
La figura 5 muestra la comparación de la
secuencia aminoácida deducida de la secuencia nucleótida del gen
sdhB derivado de Enterobacter Agglomerans y de la
derivada de Escherichia coli.
La fig 6 muestra la construcción del plásmido
pMWCPG que tiene un gen gltA, un gen ppc y un gen
gdhA.
La figura 7 muestra la construcción del plásmido
RSF-Tet que posee el origen de replicación del
plásmido RSF1010 de amplio espectro hospedador y un gen de
resistencia a la tetraciclina.
La figura 8 muestra la construcción del plásmido
RSFCPG que posee el origen de replicación del plásmido RSF1010 de
amplio espectro hospedador, un gen de resistencia a la tetraciclina,
un gen gltA, un gen ppc y un gen gltA.
La figura 9 muestra la construcción del plásmido
pSTVCB que tiene un gen gltA.
En adelante, la presente invención se explicará
detalladamente.
El microorganismo utilizado en el procedimiento
de la presente invención es un microorganismo que (1) puede
metabolizar una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0 en un medio
líquido que contiene ácido L-glutámico a una
concentración de saturación y la fuente de carbono y (2) posee la
capacidad para acumular el ácido L-glutámico en una
cantidad que excede la cantidad que corresponde a la concentración
de saturación en el medio líquido al pH.
El término "concentración de saturación"
significa una concentración del ácido L-glutámico
disuelta en un medio líquido cuando éste está saturado con ácido
L-glutámico.
A continuación, se describirá un procedimiento
para el cribado de un microorganismo que puede metabolizar una
fuente de carbón en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación y la
fuente de carbono a un pH comprendido entre 3,0 y 5,0. Se inocula
una muestra que contiene microorganismos en un medio líquido que
contiene ácido L-glutámico a una concentración de
saturación y una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0,
seleccionándose una cepa que pueda metabolizar la fuente de carbono.
El microorganismo se utiliza para producir ácido
L-glutámico mediante fermentación con precipitación
del ácido L-glutámico. Si el pH es demasiado alto,
se convierte en difícil dejar que el microorganismo produzca
suficiente ácido L-glutámico para precipitación. Por
tanto, el pH está preferentemente en el intervalo mencionado
anteriormente.
Si el pH de una solución acuosa que contiene
ácido L-glutámico disminuye, la solubilidad del
ácido L-glutámico disminuye significativamente
aproximadamente el pKa del grupo \gamma-carboxilo
(4,25, 25ºC). La solubilidad se convierte en la más baja en el punto
isoeléctrico (pH 3,2) y el ácido L-glutámico que
excede la cantidad correspondiente a la concentración de saturación,
precipita. Aunque depende de la composición del medio, el ácido
L-glutámico se disuelve habitualmente en una
cantidad de 10 a 20 g/l a un pH de 3,2, de 30 a 40 g/l a un pH de
4,0 y de 50 a 60 g/l a un pH de 4,7, a aproximadamente 30ºC. El pH
no se hace inferior a 3,0, porque el efecto de precipitación del
ácido L-glutámico se estabiliza por debajo de un
cierto valor.
Además, la expresión de que un microorganismo
"puede metabolizar la fuente de carbono" significa que puede
proliferar o puede consumir la fuente de carbono aunque incluso no
pueda proliferar, es decir, indica que cataboliza las fuentes de
carbono tales como sacáridos o ácidos orgánicos. Específicamente,
por ejemplo, si un microorganismo prolifera cuando se cultiva en un
medio líquido que contiene ácido L-glutámico con una
concentración de saturación a un pH de 5,0 a 4,0, preferentemente a
un pH de 4,5 a 4,0, más preferentemente a un pH de 4,3 a 4,0, más
preferentemente todavía a un pH de 4,0, a una temperatura apropiada,
por ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a 4 días, este
microorganismo puede metabolizar la fuente de carbono en el medio.
Además, por ejemplo, incluso si un microorganismo no prolifera
cuando es cultivado en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación a un
pH de 4,3 a 4,0, preferentemente pH de 4,5 a 4,0, más
preferentemente de 4,3 a 4,0, aún más preferentemente pH de 4,0 a
una temperatura adecuada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC a 50ºC durante 2 a
4 días, el microorganismo que consume la fuente de carbono en el
medio es el que puede metabolizar la fuente de carbono en el
medio.
El microorganismo que puede metabolizar la
fuente de carbono incluye un microorganismo que puede desarrollarse
en el medio líquido.
La expresión de que un microorganismo "puede
desarrollarse" significa que puede proliferar o puede producir
ácido L-glutámico aunque incluso no pueda
proliferar. Específicamente, por ejemplo, si un microorganismo
prolifera cuando se cultiva en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico con una concentración de saturación a un
pH de 5,0 a 4,0, preferentemente a un pH de 4,5 a 4,0, más
preferentemente a un pH de 4,3 a 4,0, más preferentemente todavía a
un pH de 4,0, a una temperatura apropiada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC o
50ºC durante 2 a 4 días, este microorganismo puede desarrollarse en
el medio. Además, por ejemplo, incluso si un microorganismo no
prolifera cuando se cultiva en un medio líquido sintético que
contiene ácido L-glutámico con una concentración de
saturación a un pH de 5,0 a 4,0, preferentemente a un pH de 4,5 a
4,0, más preferentemente a un pH de 4,3 a 4,0, más preferentemente
todavía a un pH de 4,0, a una temperatura apropiada, por ejemplo,
28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a 4 días, el microorganismo que aumenta
la cantidad del ácido L-glutámico en el medio es que
puede desarrollarse en el medio.
La selección descrita anteriormente puede
repetirse dos o más veces bajo idénticas condiciones o cambiando el
pH o la concentración del ácido L-glutámico. Puede
llevarse a cabo una selección inicial en un medio que contenga ácido
L-glutámico a una concentración menor que la
concentración de saturación, y puede realizarse entonces una
selección subsiguiente en un medio que contenga ácido
L-glutámico con una concentración de saturación.
Además, pueden seleccionarse cepas que muestren propiedades
favorables tales como una tasa superior de proliferación.
Además de las propiedades descritas
anteriormente, el microorganismo que se utiliza en el procedimiento
de la presente invención posee capacidad para acumular el ácido
L-glutámico en una cantidad que excede a la que
corresponde a la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en un medio líquido. El pH del medio
líquido mencionado anteriormente es preferentemente el mismo o es
próximo al del medio que se utiliza para el cribado de un
microorganismo que posee la propiedades mencionadas anteriormente
(1). Habitualmente, un microorganismo se convierte en susceptible al
ácido L-glutámico a una concentración alta, pues el
pH se hace más bajo. Por tanto, es preferible que el pH no sea bajo
desde el punto de vista de la resistencia al ácido
L-glutámico, pero se prefiere que lo sea desde el
punto de vista de la producción del ácido
L-glutámico con su precipitación. Para satisfacer
estas condiciones, el pH es del orden de 3 a 5, preferentemente de
4,0 a 5,0, más preferentemente de 4,0 a 4,7, más preferentemente
todavía de 4,0 a 4,5, particularmente preferido de 4,0 a 4,3.
Como microorganismo que se utiliza en el
procedimiento de la presente invención o por consiguiente sus
materiales de cría, pueden mencionarse, por ejemplo, microorganismos
que pertenecen al género Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus,
Bacillus, Saccharomyces, o similares. Entre estos, se prefieren
los microorganismos que pertenecen al género Enterobacter. De
aquí en adelante, los microorganismos de la presente invención se
explicarán principalmente respecto a los microorganismos que
pertenecen al género Enterobacter, pero la presente invención
puede aplicarse a microorganismos que pertenecen a otros géneros y
que no están limitados al género Enterobacter.
Como microorganismos que pertenecen a
Enterobacter, pueden mencionarse específicamente
Enterobacter Agglomerans, preferentemente la cepa AJ13355 de
Enterobacter Agglomerans. Esta cepa se aisló de un suelo en
Iwata-shi, Shizuoka, Japón, como una cepa que puede
proliferar en un medio que contiene ácido
L-glutámico y una fuente de carbono a un pH
bajo.
Las propiedades fisiológicas de AJ13355 son las
siguientes:
- (1)
- Tinción Gram: negativa
- (2)
- Comportamiento respecto al oxígeno: anaeróbico facultativo
- (3)
- Catalasa: positivo
- (4)
- Oxidasa: negativa
- (5)
- Capacidad reductora del nitrato: negativa
- (6)
- Ensayo de Voges-Proskauer: positivo
- (7)
- Ensayo del Rojo de metilo: negativo
- (8)
- Ureasa: negativo
- (9)
- Producción de indol: positiva
- (10)
- Motilidad:móvil
- (11)
- Producción de H_{2}S en medio TSI: débilmente activa
- (12)
- \beta-galactosidasa: positiva
- (13)
- Propiedad asimiladora de sacáridos:
- Arabinosa: positiva
- Sacarosa: positiva
- Lactosa: positiva
- Xilosa: positiva
- Sorbitol: positiva
- Inositol: positiva
- Trehalosa: positiva
- Maltosa: positiva
- Glucosa: positiva
- Adonitol: negativa
- Rafinosa: positiva
- Salicina: negativa
- Melibiosa: positiva
- (14)
- Propiedad asimiladora del glicerol: positiva
- (15)
- Propiedades asimiladoras de los ácidos orgánicos:
- Acido cítrico: positiva
- Acido tartárico: negativa
- Acido glucónico: positiva
- Acido acético: positiva
- Acido galónico: negativa
- (16)
- Arginina deshidratasa: negativa
- (17)
- Ornitina descarboxilasa: negativa
- (18)
- Lisina descarboxilasa: negativa
- (19)
- Fenilalanina desaminasa: negativa
- (20)
- Formación de pigmento: amarillo
- (21)
- Capacidad de licuefacción de la gelatina: positiva
- (22)
- pH del Crecimiento: el desarrollo es posible a un pH de 4,0, con un buen crecimiento a un pH de entre 4,5 y 7.
- (23)
- Temperatura de crecimiento: buen crecimiento a 25ºC, buen crecimiento a 30ºC, buen crecimiento a 37ºC. el crecimiento es posible a 42ºC, el crecimiento no es posible a 45ºC.
Basándose en estas propiedades bacteriológicas,
se determinó AJ13355 como Enterobacter Agglomerans.
El Enterobacter Agglomerans AJ13355 se
depositó en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International trade and Industry (código
postal: 305-8566, 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón) el 19 de febrero de 1998, recibiendo un número de registro
FERM P-16644. Se transfirió a continuación a un
depósito internacional según lo que estipula el Tratado de Budapest
de 11 de enero de 1999 y recibió un número de registro
FERM-BP-6614.
El microorganismo que se utiliza en el
procedimiento de la presente invención puede ser un microorganismo
que posee originalmente una capacidad productora de ácido
L-glutámico o uno que tiene capacidad productora de
ácido L-glutámico que se imparte o potencia mediante
cría, utilizando el tratamiento mutacional, las técnicas del ADN
recombinante, o similares.
La capacidad productora de ácido
L-glutámico puede ser impartida o potenciada
aumentando, por ejemplo, la actividad de una enzima que cataliza una
reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico.
La actividad productora del ácido L-glutámico puede
asimismo potenciarse disminuyendo la actividad de una enzima que
cataliza una reacción que se ramifica a partir de la vía
biosintética del ácido L-glutámico y que produce un
compuesto distinto al ácido L-glutámico, o que hace
que la actividad sea deficitaria.
Como enzimas que catalizan una reacción para la
biosíntesis del ácido L-glutámico pueden mencionarse
la glutamato deshidrogenasa (a la que en adelante se denominará
también "GDH"), glutamina sintetasa, glutamato sintasa,
isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa (a
la que en adelante se llamará también "CS"), fosfoenolpiruvato
carboxilasa (a la que en adelante de denominará asimismo
"PEPC"), piruvato deshidrogenasa, piruvato quinasa, enolasa,
fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, fructosa bisfosfato
aldolasa, fosfofructoquinasa, flicosa fosfato isomerasa y así
sucesivamente. Entre estas enzimas, se prefieren uno, dos o tres de
CS, PEPC y GDH enzimas. Además, se prefiere que las actividades de
las tres enzimas, CS, PEPC y GDH, se potencien en el microorganismo.
En particular, se prefiere CS de Brevibacterium
lactofermentum porque no presenta inhibición por el ácido
\alpha-cetoglutárico, el ácido
L-glutámico y el NADH.
Para potenciar la actividad de CS, PEPC o GDH,
por ejemplo, un gen que codifica CS, PEPC o GDH puede clonarse en un
plásmido apropiado y un microorganismo huésped puede transformarse
con el plásmido obtenido. El número de copias del gen que codifica
CS, PEPC o GDH (en adelante, abreviado como "gen gltA",
"gen ppc" y "gen gdhA" respectivamente) en
la célula de la cepa transformada, aumenta, dando lugar a un aumento
de la actividad de CS, PEPC o GDH.
Los genes gltA, gen ppc y gen
gdhA clonados se introducen en la cepa parental inicial
mencionada anteriormente, solos, o en una combinación arbitraria de
dos o tres tipos de ellos. Cuando dos o tres tipos de los genes se
introducen, dos o tres tipos de los genes pueden clonarse en un tipo
de plásmido e introducirse en el huésped, o clonarse separadamente
en dos o tres tipos de plásmidos que pueden coexistir e introducirse
en el huésped.
Dos o más tipos de genes que codifican enzimas
del mismo tipo, pero que provienen de distintos microorganismo,
pueden introducirse en el mismo huésped.
Los plásmidos descritos anteriormente no están
particularmente limitados, ya que son autónomamente replicables en
las células de un microorganismo que pertenece a, por ejemplo, el
género Enterobacter o similar, sino que, por ejemplo, pueden
mencionarse pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399,
pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184
y así sucesivamente. Además de estos, pueden utilizarse asimismo los
vectores de ADN fágico.
La transformación puede llevarse a cabo, por
ejemplo, mediante el procedimiento de D.M. Morrison (Methods in
Enzymology, 68, 326 (1979)), el procedimiento en el que la
permeabilidad del ADN aumenta tratando a las células de la bacteria
receptora con cloruro de calcio (Mandel M. y Higa A., J.J. Mol.
Biol., 53, 159 (1970)), la electroporación (Miller J.H., "A short
Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, U.S.A: 1992), o similar.
La actividad de CS, PEPC o GDH puede aumentar
asimismo dejando que copias múltiples de un gen gltA, de un
gen ppc o de un gen gdhA se encuentren en el ADN
cromosómico de la cepa parental inicial mencionada anteriormente
gltA, que se convierte así en huésped. Para introducir copias
múltiples del gen A, del gen ppc o del gen gdhA en el
ADN cromosómico de un microorganismo que pertenece al género
Enterobacter o similar, puede utilizarse una secuencia de la
cual existen copias múltiples en el ADN cromosómico, tales como el
ADN repetitivo y las repeticiones inversas que se encuentran en el
extremo de un transposón. Alternativamente, pueden introducirse
copias múltiples de los genes en el ADN cromosómico utilizando la
transferencia de un transposón que contenga el gen gltA, el
gen ppc o el gen gdhA. Como resultado, aumenta el
número de copias del gen gltA, del gen ppc o del gen
gdhA, en una célula de la cepa transformada, aumentando de
este modo la actividad de CS, PEPC o GDH.
Como organismos para constituir una fuente del
gen gltA, del gen ppc o del gen gdhA de los
cuales aumenta el número de copias, puede utilizarse cualquier
organismo siempre que posea actividad CS, PEPC o GDH. Entre otros,
las bacterias, que son procariotas, por ejemplo, se prefieren las
que pertenecen a los géneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium y
Bacillus. Como ejemplos específicos, pueden mencionarse
Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum y así
sucesivamente. El gen gltA, el gen ppc o el gen
gdhA pueden obtenerse a partir del ADN cromosómico de los
microorganismos descritos anteriormente.
El gen gltA, el gen ppc y el gen
gdhA pueden obtenerse utilizando una cepa mutante que es
deficitaria en la actividad de CS, PEPC o GDH, para aislar un
fragmento de ADN que complemente la auxotrofia del ADN cromosómico
de los microorganismos mencionados anteriormente. Ya que las
secuencias nucleótidas de estos genes de Escherichia coli y
Corynebacterium se han dilucidado ya (Biochemistry, 22, págs
5243-5249 (1983); J. Biochem., 95, págs
909-916 (1984); Gene, 27, págs
193-199 (1984); Microbiology, 140, págs
1817-1828 (1994); Mol. Gen.Genet., 218, págs
330-339 (1989); Molecular Microbiology, 6, págs
317-326 (1992), pueden obtenerse también mediante
PCR, utilizando cebadores sintetizados basados en cada secuencia
nucleótida y con ADN cromosómico como matriz.
La actividad de CS, PEPC o GDH puede aumentarse
asimismo potenciando la expresión del gen gltA, del gen
ppc o del gen gdhA además de la amplificación génica
anteriormente mencionada. Por ejemplo, la expresión puede
potenciarse reemplazando un promotor para el gen gltA, el gen
ppc o el gen gdhA con otros promotores más potentes.
Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el
promotor trc, el promotor tac, el promotor P_{R} y
el promotor P_{L} del fago lambda se conocen como promotores más
potentes. El gen gltA, el gen ppc y el gen
gdhA, de los cuales se reemplaza el promotor, son clonados en
un plásmido e introducidos en el microorganismo huésped, o
introducidos en el ADN cromosómico del microorganismo huésped
utilizando ADN repetitivo, repeticiones inversas, transposón o
similares.
La actividad de CS, PEPC o GDH puede potenciarse
asimismo reemplazando el promotor del gen gltA, del gen
ppc o del gen gdhA en el cromosoma con otros
promotores más potentes (véase WO 87/03006 y la solicitud de patente
japonesa abierta al público nº 61-268183), o
insertando un promotor más potente por encima de la secuencia
codificante de cada gen (véase Gene, 29, págs
231-241 (1984)). Específicamente, puede realizarse
la recombinación homóloga entre el ADN que contiene el gen
gltA, el gen ppc y el gen gdhA de los cuales se
reemplaza el promotor con uno más potente o una parte del mismo y
el gen correspondiente en el cromosoma.
Ejemplos de la enzima que cataliza una reacción
que se ramifica a partir de la vía biosintética del ácido
L-glutámico y que produce un compuesto distinto al
ácido L-glutámico, incluyen la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (a la que en
adelante se hará referencia como "\alphaKGDH"), isocitrato
liasa, fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa, acetohidroxiácido
sintasa, aetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato
deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa, 1-pirrolin
deshidrogenasa y así sucesivamente. Entre estas enzimas, la
\alphaKGDH es la preferida.
Para obtener una disminución o un déficit en la
actividad de las enzimas mencionadas anteriormente en un
microorganismo que pertenece al género Enterobacter o
similar, puede introducirse en los genes de la enzimas antes
mencionadas, mediante un procedimiento habitual de mutagénesis o de
ingeniería genética, una mutación que provoque la disminución o el
déficit en la actividad intracelular de la enzima.
Ejemplos del procedimiento mutagenético
incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilicen la irradiación
con rayos X o ultravioleta, procedimientos que utilicen el
tratamiento con un agente mutagénico tal como la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
y así sucesivamente. El sitio en el que se introduce la mutación en
el gen puede ser una región codificante que codifique una proteína
enzimática, o una región que regule la expresión, tal como un
promotor.
Ejemplos de los procedimientos de ingeniería
genética incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilicen la
recombinación génica, la transducción, la fusión celular y así
sucesivamente. Por ejemplo, un gen de resistencia a un medicamento
se inserta en un gen diana clonado para preparar un gen que ha
perdido su función (gen defectuoso). A continuación este gen
defectivo se introduce en una célula de un microorganismo huésped, y
el gen diana en el cromosoma es reemplazado con el gen defectuoso
mencionado anteriormente utilizando la recombinación homóloga
(perturbación génica).
La disminución o la deficiencia en la actividad
intracelular de la enzima diana y el grado de disminución de la
actividad puede determinarse midiendo la actividad enzimática de un
extracto celular o de su fracción purificada obtenida a partir de
una cepa candidata, y comparándola con la de una cepa salvaje. por
ejemplo, la actividad \alphaKGDH puede medirse mediante el
procedimiento de Reed et al (Reed L.J. y Mukherjee B.B.,
Methods in Enzymology, 13, págs 55-61 (1969)).
Dependiendo de la enzima diana, la cepa mutante
diana puede seleccionarse basándose en el fenotipo de la cepa
mutante. Por ejemplo, una cepa mutante que es deficitaria en la
actividad \alphaKGDH o disminuye la actividad de LKGDH, no puede
proliferar, o muestra una tasa de proliferación marcadamente
disminuida en un medio mínimo que contiene glucosa o un medio mínimo
que contiene ácido acético o ácido L-glutámico como
una fuente exclusiva de carbono bajo condiciones aeróbicas. Sin
embargo, la proliferación normal puede llevarse a cabo incluso bajo
las mismas condiciones añadiendo ácido succínico o lisina, metionina
y ácido diaminopimélico a un medio mínimo que contenga glucosa.
Utilizando estos fenómenos como indicadores, pueden seleccionarse
las cepas mutantes con una actividad \alphaKGDH disminuida o
deficitaria.
En el documento WO 95/34672 se describe
detalladamente un procedimiento para preparar la cepa deficitaria en
el gen \alphaKGDH de Brevibacterium lactofermentum
utilizando la recombinación homóloga. Procedimientos similares
pueden aplicarse a otros microorganismos.
Además, técnicas tales como la clonación génica
y la fragmentación y unión del ADN, la transformación y así
sucesivamente, se describen detalladamente en Molecular Cloning, 2ª
edición, Cold Spring Harbor Press, 1989 y así sucesivamente.
Como un ejemplo específico de una cepa mutante
deficitaria en la actividad \alphaKGDH o con una actividad
\alphaKGDH disminuida, obtenida tal como se ha descrito
anteriormente, puede mencionarse la Enterobacter Agglomerans
AJ13356. El Enterobacter Agglomerans AJ13355 se depositó en
el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (código
postal: 305-8566, 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón) el 19 de febrero de 1998, recibiendo el número de registro
FERM BP-6615. Se transfirió a continuación a un
depósito internacional según lo estipulado por el Tratado de
Budapest de 11 de enero de 1999 y recibió el número de registro
BP-6615. El Enterobacter Agglomerans AJ13356
es deficitario en la actividad \alphaKGDH como resultado de la
perturbación del gen de la subunidad \alphaKGDH-E1
(SucA).
Cuando Enterobacter Agglomerans, un
ejemplo del microorganismo utilizado en la presente invención, se
cultiva en un medio que contiene un sacárido, se secreta
extracelularmente un material viscoso, que da lugar a una escasa
eficiencia de la operación. Por tanto, cuando se utiliza
Enterobacter Agglomerans que presenta dicha propiedad de
secretar el material viscoso, es preferible utilizar una cepa
mutante que secreta una cantidad menor de material viscoso que la
cepa salvaje. Ejemplos de procedimientos de mutagénesis incluyen,
por ejemplo, procedimientos que utilizan la irradiación con rayos X
o rayos ultravioleta, procedimientos que utilizan el tratamiento con
un agente mutagénico tal como la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
y así sucesivamente. Puede seleccionarse una cepa mutante con una
disminución de la secreción del material viscoso inoculando células
bacterianas mutagenizadas en un medio que contiene un sacárido, por
ejemplo, una placa con el medio LB que contiene 5 g/l de glucosa,
cultivándola con una inclinación de 45 grados aproximadamente y
seleccionando una colonia que no muestre deslizamiento del
líquido.
En la presente invención, la transmisión o
potenciación de la capacidad productora del ácido
L-glutámico y la transmisión de otras propiedades
favorables tales como la mutación para una menor secreción viscosa
descrita anteriormente, puede llevarse a cabo en un orden
arbitrario.
Cultivando el microorganismo utilizado en el
procedimiento de la presente invención en un medio líquido del cual
se ajusta el pH a un pH en el que el ácido
L-glutámico precipita, puede producirse y acumularse
el ácido L-glutámico en el medio, que se precipita
en éste. El ácido L-glutámico puede precipitar
asimismo iniciando el cultivo a un pH neutral y finalizándolo
entonces a un pH en el que precipite el ácido
L-glutámico.
El pH al cual precipita el ácido
L-glutámico significa aquél en el que el ácido
L-glutámico precipita cuando el microorganismo
produce y acumula el ácido L-glutámico.
Como medio mencionado anteriormente puede
utilizarse si se requiere un medio habitual de nutrientes que
comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales
minerales y nutrientes traza orgánicos tales como aminoácidos y
vitaminas, de manera que el pH se ajuste a un pH al que precipite el
ácido L-glutámico. Puede utilizarse así mismo un
medio sintético o un medio natural. La fuente de carbono y la fuente
de nitrógeno utilizada en el medio puede ser cualesquiera de las
utilizadas por la cepa cultivada.
Como fuentes de carbono, se utilizan sacáridos
tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa,
galactosa, hidrolizado de almidón y molasas. Además, pueden
utilizarse ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido
cítrico, cada uno solo o en combinación con otra fuente de
carbono.
Como fuente de nitrógeno, se utilizan amonio,
sales amónicas tales como sulfato amónico, carbonato amónico,
cloruro amónico, fosfato amónico, acetato amónico, nitratos y así
sucesivamente.
Como nutrientes traza orgánicos, aminoácidos,
vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, se utilizan los que
contienen estas sustancias como peptonas, casaminoácidos, extractos
de levadura y productos de descomposición de las proteínas de soja.
Cuando se utiliza una cepa mutante auxotrófica que requiere un
aminoácido para la metabolización, debe añadirse el nutriente
necesario.
Como sales minerales se utilizan fosfatos, sales
de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso y
y así sucesivamente.
Como procedimiento de cultivo, se lleva a cabo
habitualmente el cultivo oxigenado, controlando que la temperatura
de fermentación esté comprendida entre 20 y 42ºC y el pH esté
comprendido entre 3 y 5, preferentemente entre 4 y 5, más
preferentemente entre 4 y 4,7, particularmente, de manera
preferente, entre 4 y 4,5. Así, después de entre aproximadamente 10
horas y 4 días de cultivo, se acumula en el cultivo una cantidad
sustancial de ácido L-glutámico. El ácido
L-glutámico acumulado que excede de la cantidad
correspondiente a la concentración de saturación, precipita en el
medio.
Después de que el cultivo ha finalizado, el
ácido L-glutámico que ha precipitado en el cultivo,
puede recuperarse mediante centrifugación, filtración o similares.
El ácido L-glutámico disuelto en el medio puede
recuperarse según procedimientos conocidos. Por ejemplo, el ácido
L-glutámico puede aislarse concentrando el caldo de
cultivo para cristalizarlo o aislarlo mediante cromatografía de
intercambio iónico o procedimiento similar. El ácido
L-glutámico que ha precipitado en el caldo de
cultivo puede aislarse conjuntamente con el ácido
L-glutámico que se ha disuelto en el medio después
de que ha cristalizado.
Según el procedimiento de la presente invención,
el ácido L-glutámico que excede de la cantidad que
corresponde a la concentración de saturación, precipita, y la
concentración del ácido L-glutámico disuelto en el
medio se mantiene a un nivel constante. Por tanto, puede reducirse
la influencia del ácido L-glutámico sobre el
microorganismo, a una concentración alta. De acuerdo con esto, se
hace posible criar un microorganismo que posee además la capacidad
mejorada de producir el ácido L-glutámico. Además,
ya que el ácido L-glutámico precipita como
cristales, se suprime la acidificación del caldo de cultivo por
acumulación de ácido L-glutámico, y por tanto, la
cantidad de álcali utilizada para mantener el pH del cultivo, puede
reducirse significativamente.
En adelante, la presente invención se explicará
más específicamente haciendo referencia a los ejemplos
siguientes.
Se llevó a cabo el cribado de un microorganismo
que posee resistencia al ácido L-glutámico en un
entorno ácido de la manera siguiente: cada una de las 500 muestras
obtenidas del entorno natural, incluyendo el suelo, frutas, plantas,
aguas fluviales, en una cantidad de 1 g, se suspendió en 5 ml de
agua esterilizada, de los cuales 200 \mul se aplicaron sobre 20 ml
de medio sólido, ajustándose el pH a 4,0 con HCl. La composición del
medio fue: 3 g/l de glucosa, 1 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,2 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,2 g/l
de NaCl, 0,1 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2}O,
0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/L de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}2H_{2}O, 50 \mug/l de biotina, 50 \mug/l de
pantotenato de calcio, 50 \mug/l de ácido fólico, 50 \mug/l de
inositol, 50 \mug/l de niacina, 50 \mug/l de ácido
p-aminobenzoico, 50 \mug/l de clorhidrato de
piridoxina, 50 \mug/l de riboflavina, 50 \mug/l de clorhidrato
de tiamina, 50 ml de cicloheximida, 20 g/l de agar.
Los medios en placa sobre los cuales se
sembraron las muestras mencionadas anteriormente se incubaron a 28º
37ºC, o 50ºC, durante 2 y 4 días, obteniéndose 378 cepas, cada una
de las cuales formó una colonia.
A continuación, cada una de las cepas obtenidas
tal como se ha descrito anteriormente, se inoculó en un tubo de
ensayo de 16,5 cm de longitud y de 14 mm de diámetro, que contenía 3
ml de medio líquido (Ajustado al pH 4,0 con HCl), que contenía una
concentración de saturación de ácido L-glutámico y
se cultivó a 28º 37ºC, o 50ºC, entre 24 horas y 3 días con
agitación. Entonces, se seleccionaron las cepas que se
desarrollaron. La composición del medio mencionado fue la siguiente:
40 g/l de glucosa, 20 g/l de (NH_{4})_{2} SO_{4}, 0,5
g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5
g/l de NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 0,72
mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/l de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de
levadura.
Así, se obtuvieron con éxito 78 cepas de
microorganismos que presentaban resistencia al ácido
L-glutámico en un medio ácido.
Los diversos microorganismos que poseen
resistencia al ácido L-glutámico en un medio ácido,
que se obtuvieron tal como se ha descrito anteriormente, se
inocularon cada uno en un tubo de ensayo de 16,5 cm de largo y 14 mm
de diámetro, que contenía 3 ml de medio (ajustado a un pH de 4,0 con
HCl), que se obtuvo añadiendo 20 g/l de ácido glutámico y 2 g/l de
glucosa a medio M9 (Sambrook, J., Fritsh, E.F. y Maniatis, T.,
"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989), midiéndose la turbidez del medio a lo largo del tiempo para
seleccionar cepas que mostraran una tasa de crecimiento favorable.
Como resultado, como cepa que mostraba un crecimiento favorable, se
obtuvo la cepa AJ13355 de un suelo en Iwata-shi,
Shizuoka, Japón. Esta cepa se determinó como Enterobacter
Agglomerans basándose en sus propiedades bacteriológicas
descritas anteriormente.
Ya que la cepa AJ13355 de Enterobacter
Agglomerans secreta extracelularmente un material viscoso cuando
se cultiva en un medio que contiene un sacárido, la eficiencia
operativa no es favorable. Por tanto, se obtuvo una cepa con una
secreción de material menos viscoso mediante el procedimiento de
irradiación ultravioleta (Miller, J.H. et al., "A Short
Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual", pág 150, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1992).
La cepa AJ13355 de Enterobacter
Agglomerans se irradió con rayos ultravioleta durante 2 minutos
a una distancia de 60 cm de una lámpara ultravioleta de 60 vatios,
cultivándose en medio LB durante la noche para fijar la mutación. La
cepa mutada se diluyó e inoculó en medio LB que contenía 5 g/l de
glucosa y 20 g/l de agar, de forma que se desarrollaran
aproximadamente 100 colonias por placa, cultivándose a 30ºC durante
la noche e inclinando la placa aproximadamente 45 grados,
seleccionándose entonces 20 colonias que no mostraran deslizamiento
del material viscoso.
Como cepa que satisfacía las condiciones de que
ninguna reversión al tipo original apareció incluso después de 5
veces de sulbcultivo en medio LB que contenía 5 g/l de glucosa y 20
g/l de agar, y de que pudiera observarse un crecimiento equivalente
al de la cepa original en el medio LB, se seleccionó la cepa SC17 a
partir de las cepas escogidas anteriormente, añadiendo medio LB que
contenía 5 g/l de glucosa y medio M9 (Sambrook, J et al,
"Molecular Cloning", 2ª edición, Cold Spring Harbor Press,
1989) más 20 g/l de ácido L-glutámico y 2 g/l de
glucosa, de los cuales se ajustó el pH a 4,5 con HCl.
Se preparó, a partir de la cepa SC17 de
Enterobacter Agglomerans, una cepa deficitaria en
\alphaKGDH con un sistema biosintético potenciado de ácido
L-glutámico.
El gen sucAB de la cepa AJ13355 de
Enterobacter Agglomerans se clonó seleccionando un fragmento
de ADN que complementaba la propiedad no asimiladora de ácido
acético de la cepa de Escherichia coli deficitaria en el gen
subunitario \alphaKGDH-E1 (al que en adelante se
denominará "sucA") del ADN cromosómico de la cepa
AJ13355 de Enterobacter Agglomerans.
El ADN cromosómico de la cepa AJ13355 de
Enterobacter Agglomerans se aisló mediante un procedimiento
utilizado habitualmente cuando el ADN cromosómico se extrae de
Escherichia coli (Text for Bioengineering Experiments,
editado por the Society for Biosciencie and Bioengineering, Japón,
pág 97-98, Bifukan, 1992). pTWV228 (resistente a la
ampicilina) utilizado como un vector, estuvo comercialmente
disponible a partir de Takara Shuzo Co., Ltd.
Los ADN cromosómicos de la cepa AJ13355 digerido
con EcoT221 y pTWV228 digerida con PstI se unieron utilizando
la T4 ligasa y se utilizaron para transformar la cepa JRG465 de
Escherichia coli deficitaria en sucA (Herbert, J.
et al, Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). A partir de las
cepas transformantes obtenidas anteriormente, se seleccionó una cepa
que se desarrollaba en un medio mínimo de acetato, extrayéndose de
ella un plásmido que se denominó pTWVEK101. La cepa JRG465 de
Escherichia coli que albergaba pTWVEK101 recuperó la
auxotrofia para el ácido succínico o la L-lisina y
la L-metionina, además de la propiedad asimiladora
del ácido acético esto sugiere que pTWVEK101 contiene el gen
sucA de Enterobacter Agglomerans.
La Fig 1 muestra el mapa de restricción de un
fragmento de ADN derivado de Enterobacter Agglomerans en
pTWVEK101. La secuencia nucleótida determinada de la porción
sombreada en la Fig 1, se muestra como SEC ID nº: 1. En esta
secuencia, se encontraron secuencias nucleótidas que se consideran
son dos ORF de longitud completa y dos secuencias nucleótidas que se
consideran secuencias parciales de los ORF. Las SEC ID nº 2 a nº 5
muestran secuencias aminoácidas que pueden ser codificadas por estos
ORF o secuencias parciales en un orden a partir del extremo 5'. Como
resultado de la investigación de homologías para éstas, se reveló
que la porción de la que se determinaron las secuencias nucleótidas,
contenía una secuencia parcial de extremo 3' del gen de la proteína
succinato deshidrogenasa hierro-azufre
(sdhB), sucA de longitud total y el gen subunitario
\alphaKGDH-E2 (sucB), y la secuencia
parcial del extremo 5' del gen de la subunidad \beta de la
succinil CoA sintetasa (sucC). Los resultados de comparación
de las secuencias aminoácidas deducidas a partir de estas secuencias
nucleótidas con las derivadas de Escherichia coli (Eur. J.
Biochem., 141, págs 351-359 (1984); Eur. J.
Biochem., 141, págs 361-374 (1984); Biochemistry,
24, págs 6245-6252 (1985)) se muestran en las Figs 2
a 5. De este modo, cada una de las secuencias aminoácidas mostró una
homología muy intensa. Además, se encontró que un conjunto de
sdhB-sucA-sucB-sucC
se constituyó en el cromosoma de Enterobacter Agglomerans así
como en Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, págs
351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, págs
361-374 (1984); Biochemistry, 24, págs
6245-6252 (1985)).
La recombinación homóloga se llevó a cabo
utilizando el gen sucAB de Enterobacter Agglomerans
obtenido tal como se describió anteriormente para obtener una cepa
deficitaria en \alphaKGDH de Enterobacter Agglomerans.
Después de que pTWVEK101 fue sometido a
digestión con SphI para extirpar un fragmento que contenía
sucA, el fragmento se redondeó en su extremo con el fragmento
Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd), y se unió con pBR322 digerido con
EcoRI y redondeado en el extremo con el fragmento Klenow,
utilizando la T4 ADN ligasa (Takara Shuzo Co., Ltd). El plásmido
obtenido se sometió a digestión en el sitio de reconocimiento
BglII enzimático de restricción, que se sitúa sustancialmente
en el centro de sucA utilizando esta enzima, se redondeó en
su extremo con el fragmento Klenow, y se unió entonces otra vez
empleando T4 ADN ligasa. Se consideró que el gen sucA no
funcionó debido a que se introdujo una mutación por cambio en el
marco de lectura en el sucA del plásmido nuevamente
construido mediante el procedimiento anteriormente mencionado.
El plásmido construido tal como se ha descrito
anteriormente se sometió a digestión con una enzima de restricción
ApaLI, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para
recuperar un fragmento de ADN que contenía sucA en el que se
introdujo la mutación por cambio en el marco de lectura y un gen de
resistencia a la tetraciclina derivado de pBR322. El fragmento
recuperado de ADN se unió otra vez utilizando la T4 ADN ligasa para
construir un plásmido para interrumpir el gen \alphaKGDH.
El plásmido para interrumpir el gen \alphaKGDH
obtenido tal como se describió anteriormente, se utilizó para
transformar la cepa SC17 de Enterobacter Agglomerans mediante
electroporación (Miller, J.H. et al., "A Short Course in
Bacterial Genetics; Handbook", pág 279, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, U.S.A. 1992), y una cepa en la que sucA en
el cromosoma se reemplazó con un mutante tipo 1 mediante
recombinación homóloga del plásmido, se obtuvo utilizando la
resistencia a la tetraciclina como un indicador. La cepa obtenida se
denominó como SC17sucA.
Para confirmar que la cepa SC17sucA era
deficitaria en la actividad \alphaKGDH, la actividad enzimática se
midió mediante el procedimiento de Reed et al (Reed, L.J. y
Mukherjee, B.B., Methods in Enzymology, 13, págs
55-61 (1969)), hasta la fase logarítmica de
crecimiento. Como resultado, se detectó la actividad \alphaKGDH de
0,073 (\DeltaABS/min/mg proteína) a partir de la cepa SC17,
mientras que no se detectó la actividad de \alphaKGDH a partir de
la cepa SC17sucA, confirmándose de este modo que sucA
era deficitaria tal como se había previsto.
A continuación, un gen de la citrato sintasa, un
gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y un gen de la glutamato
deshidrogenasa derivados de Escherichia coli se introdujeron
en la cepa SC17sucA.
Los procedimientos para preparar un plásmido que
tenga un gen gltA, un gen ppc y un gen gdhA
serán explicados haciendo referencia a las Figuras 6 y 7.
Un plásmido que tenga un gen gdhA
derivado de Escherichia coli, pBRGDH (solicitud de patente
japonesa abierta al público nº 7-203980), se sometió
a digestión con HindIII y SphI, redondeándose ambos
extremos mediante tratamiento con la T4 ADN polimerasa,
purificándose y recuperándose entonces el fragmento de ADN que tiene
gel gen gdhA. Separadamente, un plásmido que tenía un gen
gltA y un gen ppc derivados de Escherichia
coli, pMWCP (WO 97/08294), se digirió con XbaI, y entonces los
dos extremos se redondearon utilizando la T4 ADN polimerasa. Éste se
mezcló con el fragmento de ADN purificado mencionado anteriormente
que poseía el gen gdhA y se unió utilizando la T4 ligasa para
obtener un plásmido pMWCPG, que correspondió a pMWCP conteniendo
además el gen gdhA
(Fig 6).
(Fig 6).
Al mismo tiempo, el plásmido pVIC40 (solicitud
de patente japonesa abierta al público nº 8-047397)
teniendo el origen de replicación del plásmido RSF1010 de amplio
espectro de huésped, se sometió a digestión con NotI, tratado
con T4 ADN polimerasa y digerido con PstI. pBR322 se digirió con
EcoT14I, tratado con T4 ADN polimerasa y digerido con PstI.
Ambos productos se mezclaron y se unieron utilizando la T4 ligasa
para obtener un plásmido RSF-Tet que tenía el origen
de replicación de RSF1010 y un gen de resistencia a la tetraciclina
(Fig 7).
A continuación, pMWCPG se sometió a digestión
con EcoRI y PstI y purificándose y recuperándose un fragmento de ADN
que poseía el gen gltA, el gen ppc y el gen
gdhA. RSF-Tet se sometió igualmente a
digestión con EcoRI y PstI, purificándose y recuperándose un
fragmento de ADN con el origen de replicación de RSF1010. Ambos
productos se mezclaron y se unieron utilizando la T4 ligasa para
obtener un plásmido RSFCPG, que correspondió a
RSF-Tet conteniendo el gen gltA, el gen
ppc y el gen gdhA. (Fig 8). Se confirmó que el
plásmido RSFCPG obtenido expresaba el gen gltA, el gen
ppc y el gen gdhA, mediante la complementación de la
auxotrofia de la cepa deficitaria en los genes gltA,
ppc y gdhA derivada de Escherichia coli y la
medición de cada actividad enzimática.
Un plásmido que tenía el gen gltA
derivado de Brevibacterium lactofermentum se construyó de la
forma siguiente: Se llevó a cabo la PCR utilizando los ADN cebadores
que poseían las secuencias nucleótidas representadas por SEC ID nº 6
y nº 7, que se prepararon basándose en la secuencia nucleótida del
gen gltA de Corynebacterium glutamicum (Microbiology,
140, págs 1817-1828 (1994)), y en el ADN cromosómico
del Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como matriz, para
obtener un fragmento del gen gltA de aproximadamente 3 kb. Este
fragmento se insertó en un plásmido pHSG399 (obtenido de Takara
Shuzo Co., Ltd), fue digerido con SmaI para obtener un plásmido
pHSGCB (Fig 9). A continuación, pHSGCB se digirió con HindIII, y el
fragmento de cerca de 3 kb del gen gltA extirpado se insertó
en un plásmido pSTV29 (obtenido a partir de Takara Shuzo Co., Ltd.),
digiriéndose otra vez con HindIII para obtener un plásmido pSTVCB
(Fig 9). Se confirmó que el plásmido pSTVCB obtenido expresaba el
gen gltA, midiendo la actividad enzimática en la cepa AJ13355
de Enterobacter Agglomerans.
La cepa SC17sucA de Enterobacter
Agglomerans se transformó con RSFCPG mediante electroporación
para obtener una cepa transformante SC17sucA/RSFCPG que presenta
resistencia a la tetraciclina. Además, la cepa
SC17sucA/
RSFCPG se transformó con pSTVCB mediante electroporación para obtener una cepa transformante SC17sucA/
RSFCPG + pSTVCB que poseía resistencia alcloranfenicol. (4) Adquisición de la cepa con una mejoría de la resistencia al ácido L-glutámico en un entorno de pH bajo.
RSFCPG se transformó con pSTVCB mediante electroporación para obtener una cepa transformante SC17sucA/
RSFCPG + pSTVCB que poseía resistencia alcloranfenicol. (4) Adquisición de la cepa con una mejoría de la resistencia al ácido L-glutámico en un entorno de pH bajo.
Una cepa con una mejoría de la resistencia al
ácido L-glutámico a alta concentración en un entorno
de pH bajo (a la que, en adelante, se hará referencia como ``cepa
resistente a una alta concentración de Glu a un pH bajo), se aisló a
partir de la cepa sC17sucA/RSFCPG+pSTVCB de Enterobacter
Agglomerans.
La cepa sC17sucA/RSFCPG+pSTVCB se cultivó
por la noche a 30ºC en medio LBG (10 g/l de triptona, 5 g/l de
extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, 5g/l de glucosa) y las células
lavadas con solución salina se diluyeron apropiadamente y sembradas
en un medio M9-E (4 g/l de glucosa, 17 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5
g/l de NaCl, 1 g/l de NH_{4}Cl, 10 mM de MgSO_{4}, 10 \muM de
CaCl_{2}, 50 mg/l de L-lisina, 50 mg/l de
L-metionina, 50 mg/l de ácido
DL-diaminopimélico, 25 mg/l de tetraciclina, 25 mg/l
de cloranfenicol, 30 g/l de ácido L-glutámico,
ajustado a pH 4,5 con amoníaco acuoso). La colonia se apreció
después de cultivo a 32ºC durante 2 días, obteniéndose como una cepa
resistente a Glu a alta concentración a un pH bajo.
Para la cepa obtenida, se midió el nivel de
crecimiento en el medio líquido M9-E y se ensayó la
capacidad productora del ácido L-glutámico en un
tubo de ensayo de gran volumen de 50 ml que contenía 5 ml de medio
de ensayo productor de ácido L-glutámico (40 g/l de
glucosa, 20 g/l de (NH_{4})SO_{4}, 0,5 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4,} 0,5 g/l de
NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 0,72
mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/l de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura,
200 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 200 mg/l de
L-metionina, 200 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol.
Una cepa que exhibía el mejor nivel de crecimiento y la misma
capacidad productora de ácido L-glutámico que la de
su cepa parental, la cepa SC17/RSFCPG+pSTVCB, se denominó como
Enterobacter Agglomerans AJI3601. La cepa AJ13601 fue
depositada en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (código
postal: 305-8566, 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón) el 18 de agosto de 1999, recibiendo el número de registro
FERM P-17516. Se transfirió entonces a un depósito
internacional bajo las previsiones del Tratado de Budapest del 6 de
julio de 2000 y recibió un número de registro FERM
BP-7207.
La cepa AJ13601 de Enterobacter
Agglomerans se inoculó en un recipiente de fermentación de 1 L
que contenía 300 ml de medio que incluía (40 g/l de glucosa, 20 g/l
de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4} 0,5 g/l de
NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 0,72
mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64mg/l de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura,
200 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 200 mg/l de
L-metionina, 200 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y
se cultivó a 34ºC y a un pH de 6,0 durante 14 horas. El pH del
cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio.
El cultivo obtenido tal como se ha descrito
anteriormente se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos, y las
células recuperadas se inocularon en un recipiente fermentador de 1l
que contenía 300 ml de medio que contenía (40 g/l de glucosa, 5 g/l
de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de
NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}\dot4H_{2}O,
2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura,
600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de
L-metionina, 600 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y
se cultivó a 34ºC y a un pH de 4,5 durante 14 horas para producir el
ácido L-glutámico. El pH del cultivo se controló
introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había
añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente
600 g/l de glucosa.
Como resultado del cultivo para la producción
del ácido L-glutámico llevado a cabo durante 50
horas tal como se ha descrito anteriormente, se precipitaron en el
recipiente de fermentación una cantidad sustancial de cristales de
ácido L-glutámico. La Tabla 1 muestra la
concentración del ácido L-glutámico disuelto en el
líquido de cultivo en ese momento y la concentración de ácido
L-glutámico medida disolviendo los cristales en 2 M
de hidróxido potásico. Los cristales de ácido
L-glutámico se recuperaron a partir del cultivo
mediante decantación después de que el cultivo se dejara en posición
vertical.
Concentración del ácido L-glutámico disuelta en el líquido de cultivo | 51 g/l |
Cantidad del ácido L-glutámico que precipitó como cristales | 67 g/l |
Concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo cristales | 118 g/l |
Se llevó a cabo el experimento siguiente para
confirmar que la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans
presentaba todavía una capacidad de producción del ácido
L-glutámico, incluso bajo la condición de que los
cristales del ácido L-glutámico estuvieran
presentes.
La cepa AJ13601 de Enterobacter
Agglomerans se inoculó en un recipiente de fermentación de 1 l
que contenía 300ml de medio que incluía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4,} 0,5 g/l de
NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2}O,
0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/l de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura,
200 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 200 mg/l de
L-metionina, 200 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y
se cultivó a 34ºC y a un pH de 6,0 durante 14 horas. El pH del
cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. El
cultivo obtenido tal como se ha descrito anteriormente se centrifugó
a 5.000 rpm durante 10 minutos, y las células recuperadas se
inocularon en un medio en el que el ácido
L-glutámico estaba presente como cristales. El medio
utilizado contenía 40 g/l de glucosa, 5 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de
NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2},
2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura,
600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de
L-metionina, 600 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol,
añadiéndose cristales de ácido L-glutámico hasta 40
g/l. Las células se inocularon en un recipiente fermentador de 1l
que contenía 300 ml de este medio y se cultivó a 34ºC y a un pH de
4,3 durante 14 horas para producir el ácido
L-glutámico. El pH del cultivo se controló
introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había
añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente
600 g/l de glucosa. En este medio, sólo 39 g/l del ácido
L-glutámico añadido se disolvieron a un pH de 4,3,
encontrándose como cristales 1 g/l restante.
Como resultado del cultivo para la producción
del ácido L-glutámico llevado a cabo durante 53
horas tal como se ha descrito anteriormente, se precipitaron en el
recipiente de fermentación una cantidad sustancial de cristales de
ácido L-glutámico. La Tabla 2 muestra la
concentración del ácido L-glutámico disuelto en el
líquido de cultivo, la cantidad de ácido L-glutámico
presente como cristales en ese momento y la concentración del ácido
L-glutámico medida disolviendo los cristales en una
solución 2M KOH. Los cristales de ácido L-glutámico
se recuperaron a partir del cultivo mediante decantación después de
que el cultivo se dejara en posición vertical. Los resultados
mostraron que la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans
acumulaba ácido L-glutámico y precipitaba sus
cristales incluso cuando los cristales de ácido
L-glutámico se encontraban presentes.
Concentración del ácido L-glutámico disuelta en el líquido de cultivo | 39 g/l |
Cantidad del ácido L-glutámico que precipitó como cristales | 119 g/l |
Concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo cristales | 158 g/l |
Cantidad de cristales de ácido L-glutámico producida nuevamente por el cultivo principal | 118 g/l |
La cepa AJ13601 de Enterobacter
Agglomerans puede crecer no sólo en un pH ácido, sino también en
un pH neutro. Por tanto, se confirmó de la siguiente forma que los
cristales de ácido L-glutámico podían asimismo
precipitarse iniciando el cultivo a un pH neutro y permitiendo la
producción de ácido L-glutámico durante el cultivo,
de forma que el pH de éste disminuyera espontáneamente.
Células de una placa (de 8,5 cm de diámetro) de
la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans, cultivadas en
medio LBG agar (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura,
10 g/l de NaCl, 5 g/l de glucosa, 15 g/l de agar) que contenía 25
mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol a
30ºC durante 14 horas, se inocularon en un recipiente fermentador de
1l que contenía 300 ml de medio que contenía 40 g/l de glucosa, 5
g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura, 600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de L-metionina, 600 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, iniciándose el cultivo a 34ºC y a un pH de 7,0. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente 600 g/l de glucosa.
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura, 600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de L-metionina, 600 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, iniciándose el cultivo a 34ºC y a un pH de 7,0. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente 600 g/l de glucosa.
Como el ácido L-glutámico se
acumula, el pH desciende espontáneamente. La cantidad del gas
amoníaco que se introdujo se ajustó de manera que el pH pudiera
descender gradualmente desde 7,0 a 4,5 durante el período entre 15
horas y 24 horas después del inicio del cultivo, convirtiéndose en
4,5 a las 24 horas después del inicio del cultivo. Después, el
cultivo continuó durante 12 horas.
Como resultado del cultivo para la producción de
ácido L-glutámico llevado a cabo durante 36 horas
tal como se ha descrito anteriormente, una cantidad sustancial de
los cristales del ácido L-glutámico se precipitaron
en el recipiente fermentador. La Tabla 3 muestra el caldo de
cultivo, la cantidad de ácido L-glutámico que se
encontraba como cristales en ese momento y la concentración de ácido
L-glutámico medida disolviendo los cristales en una
solución 2 M KOH. Los cristales del ácido
L-glutámico se recuperaron a partir del cultivo
mediante decantación después de que el cultivo se dejara en posición
vertical.
Concentración del ácido L-glutámico disuelta en el líquido de cultivo | 45 g/l |
Cantidad del ácido L-glutámico que precipitó como cristales | 31 g/l |
Concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo cristales | 76 g/l |
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la producción de
ácido L-glutámico por fermentación acompañada de
precipitación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 11-234806
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-08-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-78771
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-03-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter Agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(121)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (322)..(3129)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3145)..(4368)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4437)..(4556)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter Agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter Agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter Agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter Agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacaata gccygaatct gttctggtcg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico por fermentación, que comprende cultivar
un microorganismo en un medio líquido cuyo pH es ajustado a un pH en
el que el ácido L-glutámico se precipite, para
producir y acumular ácido L-glutámico y precipitar
ácido L-glutámico en el medio que contiene una
fuente de carbono,
en el que el pH es de 3,0 a 5,0,
en el que dicho microorganismo puede metabolizar
una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0 en un medio líquido que
contiene ácido L-glutámico a una concentración de
saturación y la fuente de carbono, y presenta la capacidad de
acumular ácido L-glutámico en una cantidad que
exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación
en el medio líquido al pH.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho microorganismo presenta por lo menos una de las
características siguientes:
- (a)
- el microorganismo es potenciado en la actividad de una enzima que cataliza una reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico ; y
- (b)
- el microorganismo es disminuido o es deficitario en la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del
ácido L-glutámico, es por lo menos una seleccionada
de entre citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato
deshidrogenasa.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima que cataliza la reacción
que se ramifica a partir de la vía biosintética del ácido
L-glutámico y que produce el compuesto distinto al
ácido L-glutámico, es la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el microorganismo pertenece al
género Enterobacter.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans
(AJ13601) FERM BP-7207.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que el microorganismo presenta una mutación que causa menos
secreción extracelular de un material viscoso comparado con una cepa
de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio que contiene un
sacárido.
9. Procedimiento de cribado para un
microorganismo, que comprende el cribado de un microorganismo
apropiado para producir ácido L-glutámico mediante
fermentación con ácido L-glutámico que precipita en
un medio líquido de pH 3,0-5,0, que comprende
inocular una muestra que contenga microorganismos en un medio ácido
que contiene ácido L-glutámico a una concentración
de saturación y una fuente de carbono, y seleccionar una cepa que
pueda metabolizar la fuente de carbono.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que una cepa que puede crecer en el medio se selecciona como la
cepa que puede metabolizar la fuente de carbono.
11. Procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico por fermentación, que comprende el
inicio del cultivo de un microorganismo en un medio líquido a un pH
neutro y la finalización de dicho cultivo a un pH al cual el ácido
L-glutámico se precipita,
en el que dicho microorganismo puede metabolizar
una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0 en un medio líquido que
contiene ácido L-glutámico a una concentración de
saturación y la fuente de carbono, y presenta la capacidad de
acumular ácido L-glutámico en una cantidad que
exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación
en el medio líquido al pH.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el pH del cultivo se controla introduciendo gas amoníaco en
el medio.
13. Microorganismo que tiene el número de
registro FERM BP-7207.
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