ES2220639T3 - Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos no proteinogenos. - Google Patents

Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos no proteinogenos.

Info

Publication number
ES2220639T3
ES2220639T3 ES01120750T ES01120750T ES2220639T3 ES 2220639 T3 ES2220639 T3 ES 2220639T3 ES 01120750 T ES01120750 T ES 01120750T ES 01120750 T ES01120750 T ES 01120750T ES 2220639 T3 ES2220639 T3 ES 2220639T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fermentation
process according
para
uelm
delm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01120750T
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Dr. Maier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Original Assignee
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH filed Critical Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2220639T3 publication Critical patent/ES2220639T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D257/04—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/55—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/04—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D233/06—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/08—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms with alkyl radicals, containing more than four carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/12—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms with alkyl radicals, containing more than four carbon atoms, directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D233/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/26—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/32—One oxygen, sulfur or nitrogen atom
    • C07D239/38—One sulfur atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/04—1,2,3-Triazoles; Hydrogenated 1,2,3-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/16—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D249/18—Benzotriazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D263/54—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles
    • C07D263/56—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D263/54—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles
    • C07D263/58—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D271/06—1,2,4-Oxadiazoles; Hydrogenated 1,2,4-oxadiazoles
    • C07D271/07—1,2,4-Oxadiazoles; Hydrogenated 1,2,4-oxadiazoles with oxygen, sulfur or nitrogen atoms, directly attached to ring carbon atoms, the nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/30—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/64—Benzothiazoles with only hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D277/62—Benzothiazoles
    • C07D277/68—Benzothiazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 2
    • C07D277/70—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/34—Sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Proceso para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de una cepa de microorganismo con un alelo cys-E caracterizado porque durante la fermentación se añade dosificadamente un compuesto nucleófilo en tales cantidades a la mezcla de reacción de fermentación, que ésta conduce a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos por la cepa de microorganismo.

Description

Proceso para la preparación por fermentación de L-aminoácidos no proteinógenos.
La invención se refiere a un proceso para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de microorganismos, así como a L-aminoácidos obtenidos por el proceso.
Los aminoácidos no proteinógenos son aminoácidos que no se emplean en la naturaleza como unidades básicas para la biosíntesis de proteínas y por ello están claramente delimitados de los 20 aminoácidos proteinógenos. Se trata preferiblemente de derivados de L-alanina sustituidos en \beta.
Los aminoácidos no proteinógenos representan compuestos interesantes p.ej. para la preparación de materiales farmacéuticos y agroquímicos activos. Los mismos pueden imitar como material activo o como parte de un material activo en cierto modo de mimetismo particular la estructura de los aminoácidos naturales y causar con ello por ejemplo en interacciones con receptores una modulación de la reacción natural. Adicionalmente, aquéllos pueden servir de un modo muy general como compuestos quirales en el marco del "conjunto quiral" como unidades básicas para la síntesis.
Los procesos de producción conocidos hasta ahora para aminoácidos no proteinógenos en forma enantioméricamente pura se basan en su mayoría en síntesis complejas que, además, en la mayoría de los casos permiten acceder solamente a un compuesto determinado. Solamente un pequeño número de procesos hacen posible por el intercambio simple de una materia prima la preparación de compuestos diferentes.
En la mayoría de los casos se trata de síntesis químicas, que por su parte transcurren ya a partir de unidades básicas quirales o implican la disociación de un racemato.
Como alternativa se han descrito también algunos procesos enzimáticos. Así, con ayuda de transaminasas se pueden preparar a partir de \alpha-cetoácidos con ácido L-glutámico como donante de amino diversos aminoácidos no proteinógenos. Otro proceso utiliza hidantoinasas en combinación con carbamoilasas. Los procesos enzimáticos son sin embargo asimismo intensivos en costes, dado que tienen que proporcionarse las enzimas respectivas y éstas exhiben como catalizadores solamente un tiempo de vida limitado (REM et al., Biotechnology 1996, Vol. 6, págs. 505-560).
Por el contrario, serían particularmente sencillos y económicos procesos para la preparación de aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de microorganismos. Tales procesos implican, sin embargo, el riesgo de que el aminoácido no proteinógeno producido interfiera con el metabolismo de los aminoácidos naturales y se produzcan por consiguiente inhibiciones del crecimiento. Hasta ahora se conoce en este campo temático un solo proceso para la fermentación directa de D-aminoácidos (documento WO 98/14602). Esta solicitud describe la preparación de D-aminoácidos por medio de microorganismos recombinantes, en los cuales se ha incorporado un gen de D-aminotransferasa y un gen de L-aminodesaminasa. Adicionalmente, Saito et al. (Biol. Pharm. Bull. 1997, 20: 4753) describen la producción del aminoácido vegetal no proteinógeno L-pirazolilalanina por expresión de genes vegetales en Escherichia coli. Los rendimientos son sin embargo demasiado bajos para una producción comercial con < 1 g/l y los costes son muy altos en el caso del empleo descrito de L-serina como materia prima.
Los documentos Denk D. et al.: "L-Cysteine Biosynthesis in Escherichia coli: Nucleotide Sequence and Expression of the Serine Acetyltransferase (CYSE) Gene from the Wild-Type and a Cysteine-Excreting Mutant", Journal of General Microbiology, Society for Microbiology, Reading, GB, vol. 133, no. 3, 1 de marzo de 1987, páginas 515-525, Nakamori, et al.: "Overproduction of L-cysteine and L-cystine by Escherichia coli strains with a genetically altered serme acetyltransferase", Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, US, vol. 64, no. 5, 5 de mayo de 1998, páginas 1607-1611 y Topczewski, et al.: "Cloning and characterization of the Aspergillus nidulans cysB gene encoding cysteine synthase" Current Genetics, Nueva York, NY, US, vol 31, no. 4, abril de 1997, páginas 348 - 356 describen microorganismos con un metabolismo descontrolado de la cisteína, que encuentran aplicación para la preparación de aminoácidos naturales.
Objeto de la presente invención es proporcionar un proceso eficiente para la producción de una serie de L-aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa.
Este objetivo se resuelve por fermentación de una cepa de microorganismo con un alelo cys-E modificado, y se caracteriza porque durante la fermentación se añade dosificadamente un compuesto nucleófilo en tales cantidades a la mezcla de la reacción de fermentación, que ésta conduce a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos por la cepa del microorganismo.
Preferiblemente, al final de la fermentación, los L-aminoácidos no proteinógenos se separan de la mezcla de la reacción de fermentación respectiva por métodos conocidos en sí mismos.
Se ha encontrado sorprendentemente que en la fermentación de cepas de microorganismos con metabolismo descontrolado de la cisteína intervienen en lugar de sulfuro una serie de otros compuestos nucleófilos muy eficientemente en el metabolismo de los aminoácidos y los productos de reacción respectivos se segregan en el medio de cultivo. Ventajosamente, en este caso se puede emplear glucosa como fuente de carbono económica.
Por la dosificación de compuestos nucleófilos correspondiente a la invención durante la fermentación se forman por consiguiente L-aminoácidos no proteinógenos. Preferiblemente se añade por esta razón durante la fermentación un compuesto nucleófilo que interviene en el metabolismo de los aminoácidos.
Preferiblemente, se añaden compuestos nucleófilos, que comprenden un resto seleccionado del grupo
H --- S ---, --- 
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{H}{}}}
--- N 
\biequal
, --- 
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{H}{}}}
--- O ---
De modo particularmente preferido, se añade a la mezcla de reacción de fermentación un compuesto nucleófilo seleccionado del grupo siguiente:
- tiol de la fórmula general (1):
(1)H-S-R_{1}
donde R^{1} significa un resto alquilo, alcoxi, arilo o heteroarilo monovalente sustituido o no sustituido con 15 átomos C como máximo;
- azol de la fórmula general (2) o (3):
1
así como sus ésteres, éteres o sales,
donde X e Y son iguales o diferentes y significan CR^{4} o N y R^{4} significa -H, -COOH, -OH, -NH_{2}, -NO_{2}^{-}, -SH, -SO_{3}^{-} , -F, -Cl, -Br, -I, C_{1}-C_{5}-alquilcarbonilo- o R^{1}, y R^{1} tiene el significado mencionado para la fórmula (1) y
donde R^{2} y R^{3} son iguales o diferentes y significan R^{4} o donde C^{1} y C^{2} en la fórmula (3) en lugar de los sustituyentes R^{2} y R^{3} están unidos por medio de un puente [-CR^{5}R^{6}-]_{a}, siendo a igual a 1, 2, 3 ó 4 para formar un anillo, donde
R^{5} y R^{6} son iguales o diferentes y significan R^{4} y uno o más grupos [-CR^{5}R^{6}-] no contiguos pueden estar sustituidos por oxígeno, azufre o un resto imino sustituido opcionalmente con C_{1}-C_{5}-alquilo, y
dos grupos [-CR^{5}R^{6}-] contiguos pueden estar sustituidos por un grupo [-CR^{5}=CR^{6}-] o por un grupo [-CR^{5}=N-] ;
- isoxazolinona de la fórmula general (4) o (5):
2
así como sus ésteres, éteres o sales,
donde X, R^{1}, R^{2} y R^{3} tienen el significado ya mencionado y donde C^{1} y C^{2} en la fórmula (5) en lugar de los sustituyentes R^{2} y R^{3} pueden estar unidos por medio de un puente definido como para la fórmula (3) para formar un anillo.
Ejemplos de tioles son compuestos seleccionados del grupo de 2-mercaptoetanol, 3-mercaptopropanol, ácido 3-mercaptopropiónico, ácido 3-mercapto-l-propanosulfónico, ácido mercaptoetanosulfónico, 2-mercaptoetilamina, ácido tioglicólico, ácido tioláctico, ácido tioacético, ácido mercaptosuccínico, ácido mercaptopirúvico, ditiotreitol, ditioeritritol, 1-tioglicerina, tiofenol, 4-fluoro-tiofenol, 4-mercaptofenol, p-tiocresol, ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, 2-mercaptotiazol, 2-mercaptotiazolina, 2-mercaptoimidazol, 3-mercapto-1,2,4-triazol, 2-tiofeno-tiol, 2-mercaptopiridina, 2-mercaptopirimidina, 2-tio-citosina, ácido 2-mercaptonicotínico, 2-mercapto-l-metil-imidazol, 2-mercaptobenzotiazol, 2-mercaptobenzoxazol y 6-mercaptopurina.
Ejemplos de azoles son compuestos seleccionados del grupo de 1,2-pirazol, 3-metilpirazol, 4-metilpirazol, 3,5-dimetilpirazol, 3-aminopirazol, 4-aminopirazol, ácido pirazol-4-carboxílico, ácido pirazol-3,5-dicarboxílico,1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, 3-amino-1,2,4-triazol, 1,2,3,4-tetrazol, indazol, ácido indazol-3-carboxílico,ácido indazol-5-carboxílico, 5-aminoindazol, benzotriazol, ácido benzotriazol-5-carboxílico, 5-aminobenzo-triazol, aminopirazolopirimidina, 8-azaguanina y 8-azaadenina.
Ejemplos de isoxazolinonas son compuestos seleccionados del grupo de isoxazolin-2-ona, 4-metilisoxazolin-2-ona, 5-metilisoxazolin-2-ona, 4,5-dimetilisoxazolin-2-ona y 1,2,4-oxadiazolidin-3,5-diona.
Cepas de microorganismos con metabolismo descontrolado de la cisteína, que se pueden emplear en el proceso correspondiente a la invención, son conocidas por la técnica anterior. Las mismas se caracterizan por una producción endógena de O-acetil-L-serina incrementada frente a la cepa de tipo salvaje - el precursor biosintético inmediato de L-cisteína. Como es sabido, en un microorganismo en el último paso de la biosíntesis de la cisteína, por la actividad de las O-acetil-serina-sulfhidrilasas la función del grupo acetilo de la O-acetil-L-serina se sustituye por una función tiol y se forma con ello Lcisteína. Este tipo de reacción se designa como \beta-sustitución, dado que se efectúa un intercambio de un grupo funcional en el átomo de carbono \beta del aminoácido.
Preferiblemente, en el proceso correspondiente a la invención se emplea una de las cepas de microorganismos siguientes:
-
cepas con alelos cysE modificados como se describen por ejemplo en los documentos WO 97/15673 o Nakamori S. et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 o Takagi H. et al., 1999, FEBS Lett. 452: 323-327, o
-
cepas que contienen el gen Efflux, como se describen por ejemplo en el documento EP 0885962 Al, o
-
cepas con una actividad CysB modificada como se describen en la solicitud de patente alemana DE 19949579, o
-
cepas que se producen con empleo de métodos de mutagénesis inespecíficos combinados con métodos de escrutinio para la superproducción de cisteína o degradación reducida de la cisteína, como se describe por ejemplo en WO 97/15673 o en Nakamori S et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611.
Tales cepas se caracterizan porque las mismas, en caso de adición suficiente de una fuente de azufre inorgánico como p.ej. sulfato o tiosulfato, segregan cantidades significativas de L-cisteína o un derivado de ella en el medio de cultivo. Por la dosificación de acuerdo con la invención de un compuesto nucleófilo durante la fermentación, este compuesto interviene en la sustitución \beta y conduce con ello a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos.
En el caso de cepas de microorganismos que no poseen un metabolismo descontrolado de la cisteína (p.ej. los organismos de tipo salvaje habituales) un procedimiento de este tipo conduce a la disminución de la biosíntesis de cisteína y con ello a una inhibición del crecimiento. Por consiguiente no pueden formarse aminoácidos no proteinógenos en cantidades significativas.
Dado que las cepas empleadas de acuerdo con la invención exhiben sin embargo un metabolismo descontrolado de la cisteína y por consiguiente un nivel endógeno alto de O-acetil-L-serina, se hace posible la producción de los L-aminoácidos no proteinógenos en grandes cantidades. Simultáneamente se asegura además una formación suficiente de L-cisteína a fin de garantizar el crecimiento celular del microorganismo.
Preferiblemente se emplean cepas de microorganismos de la clase Escherichia coli, que poseen un metabolismo descontrolado de la cisteína.
Preferiblemente se trata en este caso de cepas de Escherichia coli como se describen por ejemplo en WO 97/15673 o en EP 0885962 Al (correspondiente a la solicitud con el Número de Serie SN 09/097759) o en DE 19949579. Según los procesos descritos en estas solicitudes de patente, puede descontrolarse en cualesquiera cepas el metabolismo de la cisteína por transformación con un plásmido, que lleve p.ej. un alelo cysE resistente a la retroalimentación y/o un gen Efflux.
El proceso correspondiente a la invención para la preparación de los L-aminoácidos no proteinógenos con ayuda de una cepa de microorganismo se lleva a cabo en un fermentador de una manera conocida en sí misma pero con adición suplementaria de un compuesto nucleófilo.
El cultivo de la cepa de microorganismo en el fermentador se realiza como cultivo continuo, como cultivo por lotes o preferiblemente como cultivo "fed-batch". De modo particularmente preferido, se dosifican una fuente de C y un compuesto nucleófilo de manera continua durante la fermentación.
La dosificación del compuesto nucleófilo comienza después de la inoculación o preferiblemente después de una fase de crecimiento. De modo particularmente preferido, la dosificación comienza 6-ocho horas después del comienzo de la fermentación y dura hasta el final de la fermentación.
La cantidad de compuesto nucleófilo añadida depende de su toxicidad para el microorganismo y se mueve en el intervalo de 10 a 1000 mmol por litro de volumen inicial del medio de fermentación. Es especialmente preferida una dosificación de 50 a 500 mmol por litro de volumen inicial del medio de fermentación.
Como fuentes de C para la fermentación sirven preferiblemente azúcares, alcoholes-azúcar, o ácidos orgánicos. De modo particularmente preferible en el proceso correspondiente a la invención se emplean como fuentes de C glucosa, lactosa o glicerina.
Se prefiere la dosificación de glucosa en una forma que asegure que el contenido del fermentador se mantiene durante la fermentación dentro de un intervalo de 0,1-50 g/l. Es particularmente preferible un intervalo de 0,5-10 g/l.
Como fuente de N se emplean en el proceso correspondiente a la invención preferiblemente amoniaco, sales de amonio o hidrolizados de proteínas.
Como otras adiciones de medio pueden añadirse sales de los elementos fósforo, azufre, cloro, sodio, magnesio, nitrógeno, potasio, calcio, hierro y, en trazas (es decir en concentraciones de µM), sales de los elementos molibdeno, boro, cobalto, manganeso, cinc y níquel.
Adicionalmente, pueden añadirse al medio ácidos orgánicos (p.ej. acetato, citrato), aminoácidos (v.g. isoleucina) y vitaminas (p.ej. B1, B6).
Como fuentes de nutrientes complejas pueden emplearse p.ej. extracto de levadura, agua de maceración de maíz, harina de soja o extracto de malta. El valor de pH del medio de fermentación está comprendido en el intervalo de 4-10. Se prefiere un intervalo de 6-8. Es particularmente preferido un intervalo de pH de 6,5 a 7,5.
La temperatura de incubación es 15-45°C, se prefiere una temperatura comprendida entre 30 y 37°C.
La fermentación se realiza preferiblemente en condiciones de crecimiento aerobias. El aporte de oxígeno en el fermentador se realiza con aire comprimido o con oxígeno puro.
Los microorganismos que se fermentan según el proceso descrito, segregan en un tiempo de fermentación de 1 a 4 días los L-aminoácidos no proteinógenos correspondientes con alta eficiencia en el medio de cultivo.
En el caso de alimentación de una sustancia nucleófila, los microorganismos con metabolismo descontrolado de la cisteína segregan durante la fermentación aminoácidos no proteinógenos de la fórmula general (6) en configuración L:
(6)H_{2}N --- 
\melm{\delm{\para}{\delm{CH _{2} }{\delm{\para}{Z}}}}{C}{\uelm{\para}{COOH}}
--- H
donde Z es un resto monovalente seleccionado de las fórmulas (7) a (13)
3
así como sus ésteres, éteres o sales,
y R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, X e Y tienen el significado ya mencionado para las fórmulas (1) a (5).
El proceso correspondiente a la invención permite por primera vez preparar 1,2,3,4-tetrazol-1-il-L-alanina (14) o 1,2,3,4-tetrazol-2-il-L-alanina (15) con inclusión de sus ésteres, éteres o sales, así como 1,2,3-triazol-1-il-L-alanina (16) o 1,2,3-triazol-2-il-L-alanina (17) con inclusión de sus ésteres, éteres o sales,
4
5
donde R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} tienen el significado ya mencionado para las fórmulas (1) a (5).
El proceso correspondiente a la invención permite preparar además por primera vez S-heteroaril-L-cisteínas de la fórmula (18)
(18)H_{2}N---
\melm{\delm{\para}{\delm{CH _{2} }{\delm{\para}{\delm{S}{\delm{\para}{R ^{7} }}}}}}{C}{\uelm{\para}{COOH}}
---H
donde R^{7} tiene el significado siguiente:
pirrolilo, pirazolilo, tiazolilo, oxazolilo, furanilo, piridinilo, pirazinilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo y purinilo.
La invención concierne por consiguiente a los compuestos mencionados.
Compuestos particularmente preferidos son:
-
1,2,3-benzotriazol-1-il-L-alanina (R^{2} y R^{3} son iguales y significan [-CR^{5}=CR^{6}-], donde R^{5} y R^{6} son iguales a H y R^{2} y R^{3} están unidos para formar un anillo aromático),
-
1,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina (R^{2} y R^{3} son iguales y significan [-CR^{5}=CR^{6}-], donde R^{5} y R^{6} son iguales a H y H y R^{2} y R^{3} están unidos para formar un anillo aromático),
-
5-carboxi-1,2,3-benzotriazol-l-il-L-alanina (R^{2} y R^{3} son diferentes y significan [-CR^{5}=CR^{6}-], donde R^{5} y R^{6} en el caso de R^{3} son iguales a H y en el caso de R^{2} R^{5} es igual a H y R^{6} es igual a -COOH, y R^{2} y R^{3} están unidos para formar un anillo aromático),
-
5-carboxi-1,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina (R^{2} y R^{3} son diferentes y significan [-CR^{5}=CR^{6}-], donde R^{5} y R^{6} en el caso de R^{3} son iguales a H y en el caso de R^{2} R^{5} es igual a H y R^{6} es igual a -COOH, y R^{2} y R^{3} están unidos para formar un anillo aromático),
-
tiazol-2-il-L-cisteína,
-
piridin-2-il-L-cisteína.
Preferiblemente, el producto después de la separación de la biomasa por métodos conocidos (p.ej. filtración, centrifugación) se aísla del sobrenadante de cultivo. Tales métodos para el aislamiento de aminoácidos son conocidos asimismo por los expertos. Los mismos comprenden p.ej. extracción, adsorción, cromatografía de intercambio iónico, precipitación y cristalización.
Los ejemplos siguientes sirven para ilustración adicional de la invención. La cepa bacteriana Escherichía coli W3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306, que se empleó para la realización de los ejemplos, se depositó en el DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) bajo el número DSM 13495 de acuerdo con el tratado de Budapest.
Ejemplo 1 Precultivo de la cepa de producción
Como precultivo para la fermentación se inocularon 20 ml de medio LB (10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 g/l NaCl), que contenía adicionalmente 15 mg/l tetraciclina, con la cepa W3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 (descrita en EP 0885962 Al, y se incubaron a 30°C y 150 rpm en una máquina de sacudidas. Después de siete horas, la mezcla de reacción total se transfirió a 100 ml de medio SM1 (12 g/l K_{2}HPO_{4}; 3 g/l KH_{2}PO_{4}; 5 g/l 
\hbox{(NH _{4} )
 _{2} SO _{4} ;}
0,3 g/l MgSO_{4} x 7H_{2}O; 0,015 g/l CaCl_{2} x 2H_{2}O; 0,002 g/l FeSO_{4} x 7H_{2}O; 1 g/l citrato trisódico x 2H_{2}O; 0,1 g/l NaCl; 1 ml/l solución de elementos traza constituida por 0,15 g/l Na_{2}MoO_{4} x 2H_{2}O; 2,5 gil Na_{3}BO_{3}; 0,7 g/l CoCl_{2} x 6H_{2}O; 0,25 g/l CuSO_{4} x 5 H_{2}O; 1,6 g/l MnCl_{2} x 4H_{2}O; 0,3 g/l ZnSO_{4} x 7H_{2}O), que se había complementado con 5 g/l glucosa; 0,5 mg/l vitamina B_{1} y 15 mg/l tetraciclina. La incubación subsiguiente se realizó a 30°C durante 17 horas a 150 rpm. Ejemplo 2 Preparación por fermentación de S-[2,3-dihidroxi-4-mercaptobutil]-L-cisteína
Como fermentador sirvió un aparato Biostat M de la firma Braun Biotech (Melsungen, Alemania) con un volumen de cultivo máximo de 2 l. El fermentador se inoculó con el precultivo descrito en el Ejemplo 1 (densidad óptica a 600 nm de aprox. 3) con 900 ml de medio de fermentación (15 g/l glucosa; 10 g/l triptona; 5 g/l extracto de levadura; 5 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}; 1,5 g/l KH_{2}PO_{4}; 0,5 g/l NaCl; 0,3 g/l MgSO_{4} x 7H_{2}O; 0,015 g/l CaCl_{2} x 2H_{2}O; 0,075 g/l FeSO_{4} x 7H_{2}O; 1 g/l citrato trisódico x 2H_{2}O y 1 ml/l solución de elementos traza (véase arriba), 5 mg/l vitamina B1 y 15 mg/l tetraciclina, ajustado a pH 7,0 con amoniaco al 25%). Durante la fermentación se ajustó una temperatura de 32°C y el valor de pH se mantuvo constante en un valor de 7,0 por dosificación de amoniaco al 25%. El cultivo se gasificó a 1,5 vol/vol/min con aire comprimido esterilizado, y se agitó con una velocidad de rotación del agitador de 200 rpm. Después de la disminución de la saturación con oxígeno a un valor de 50%, se aumentó la velocidad de rotación por medio de un aparato de control hasta un valor de 1200 rpm, a fin de mantener la saturación de oxígeno en un 50% (determinada con una sonda de pO2, calibrada a 100% de saturación para 900 rpm).
Después de ocho horas se realizó una dosificación de una solución 1M de ditiotreitol con un régimen de 2 mmol/h. Se alimentó glucosa a partir de una solución madre al 56%, tan pronto como el contenido del fermentador hubo disminuido desde 15 g/l inicialmente a aprox. 5-10 g/l. La alimentación de glucosa se realizó con un régimen de flujo de 8-14 ml/h, manteniéndose constante la concentración de glucosa entre 0,5 y 10 g/l. La determinación de glucosa se realizó con el analizador de glucosa de la firma YSI (Yellow Springs, Ohio, EE.UU.).
La duración de la fermentación fue 4-ocho horas. Después de este tiempo se tomaron muestras y se separaron las células del medio de cultivo por centrifugación. El sobrenadante de cultivo resultante se separó por HPLC en fase inversa en una columna C18(2) LUNA de 5 \mu (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Como eluyente se utilizó ácido fosfórico diluido (0,1 ml de ácido fosfórico concentrado/1) a un régimen de flujo de 0,5 ml/min. Se eluyó S-mercaptodihidroxibutil-L-cisteína con un tiempo de retención de 86,7 min. El rendimiento fue 2,5 g/l.
Ejemplo 3 Preparación por fermentación de S-fenil-L-cisteína
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una suspensión 1M de Na-tiofenol con un régimen de 2 mmol/h. Se eluye la S-fenil-L-cisteína por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2, con un tiempo de retención de 88 min. El rendimiento fue 2,1 g/l.
Ejemplo 4 Preparación por fermentación de 1,2-pirazolil-L-alanina
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una solución 1M de 1,2-pirazol con un régimen de 4 mmol/h. Se eluye 1,2-pirazolil-L-alanina por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 8,4 min. El rendimiento fue 6,1 g/l.
Ejemplo 5 Preparación por fermentación de 1,2,4-triazolil-L-alanina
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una solución 1M de 1,2,4-triazol con un régimen de 4 mmol/h. Se eluye 1,2,4-triazol-l-il-L-alanina por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 5,8 min. El rendimiento fue 4,6 g/l.
Ejemplo 6 Preparación por fermentación de 1,2,3,4-tetrazolil-L-alanina
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una solución 1M de 1,2,3,4-tetrazol con un régimen de 4 mmol/h. En la fermentación se forman los dos isómeros 1,2,3,4-tetrazol-l-il-L-alanina y 1,2,3,4-tetrazol-2-i1-L-alanina. Éstos se eluyen por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 5,4 ó 5,7 min. El rendimiento fue, como suma de ambos isómeros, 3,9 g/l.
Ejemplo 7 Preparación por fermentación de 5-carboxi-1,2,3-benzotriazolil-L-alanina
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una suspensión de ácido 1,2,3-benzotriazol-5-carboxílico 1M en NaOH 0,5M con un régimen de 4 mmol/h.
En la fermentación se forman los tres isómeros 5-carboxi-1,2,3-benzotriazol-l-il-L-alanina, 5-carboxi-1,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina y 5-carboxi-1,2,3-benzotriazol-3-il-L-alanina, siendo sin embargo el producto principal 5-carboxi-1,2,3-benzotriazol-2-il-L-alanina. Éste se eluye por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 67,5 min. El rendimiento fue 5,2 g/l.
Ejemplo 8 Preparación por fermentación de 1,2,4-oxadiazolidin-2,5-dionil-L-alanina (= ácido quisquálico)
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una solución 2M de 1,2,4-oxadiazolidin-2,5-diona en dimetilsulfóxido con un régimen de 2 mmol/h.
El ácido quisquálico se eluye por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 5,6 min. El rendimiento 2,2 g/l.
Ejemplo 9 Aislamiento de 1,2-pirazolil-L-alanina a partir del caldo de fermentación
En primer lugar, se separaron las células por centrifugación de 0,6 1 de caldo de fermentación a 5000 g. El sobrenadante se mezcló con 10 g de carbón activo para la decoloración, se agitó durante 2 h a la temperatura ambiente y se filtró seguidamente. La solución obtenida se ajustó con NaOH 2M a un valor de pH de 6,0, se cargó a una columna de intercambio de cationes Amberjet 1200/H+ (Rohm and Haas S.A., Chauny, Francia; 250 ml de lecho de gel) y las sustancias fijadas se eluyeron con NaCl 1M. Se reunieron las fracciones de elución (500 ml), se ajustaron con NaOH 2M a un valor de pH de 6,0 y se concentraron hasta 100 ml. La muestra se guardó durante 16 horas a 4°C. El material cristalizado resultante se obtuvo por filtración, se lavó con 50 ml de etanol y se secó seguidamente.
Ejemplo 10 Preparación por fermentación de S-tiazol-2-il-L-cisteína
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas, se realizó una dosificación de una solución 1M de 2-mercaptotiazol con un régimen de 2 ml/h. La S-tiazol-2-il-L-cisteína se eluye por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 33,7 min. EL rendimiento fue 6,1 g/l.
Ejemplo 11 Preparación por fermentación de S-1,2,4-triazol-3-il-L-cisteína
Las bacterias se cultivaron como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Después de ocho horas se realizó una dosificación de una solución 1M de 3-mercaptotriazol con un régimen de 2 mmol/h. La S-tiazol-2-il-L-cisteína se eluye por el método HPLC descrito en el Ejemplo 2 con un tiempo de retención de 8,2 min. El rendimiento fue 5,5 g/l.

Claims (19)

1. Proceso para la preparación de L-aminoácidos no proteinógenos por fermentación directa de una cepa de microorganismo con un alelo cys-E caracterizado porque durante la fermentación se añade dosificadamente un compuesto nucleófilo en tales cantidades a la mezcla de reacción de fermentación, que ésta conduce a la producción de L-aminoácidos no proteinógenos por la cepa de microorganismo.
2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque al final de la fermentación los L-aminoácidos no proteinógenos se separan de la mezcla de reacción de fermentación por métodos conocidos en sí mismos.
3. Proceso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se dosifica un compuesto nucleófilo que contiene un resto seleccionado del grupo
H --- S ---, --- 
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{H}{}}}
--- N 
\biequal
, --- 
\uelm{N}{\uelm{\para}{\uelm{H}{}}}
--- O ---
4. Proceso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se añade un compuesto nucleófilo seleccionado del grupo siguiente:
-tiol de la fórmula general (1):
(1)H-S-R^{1}
donde R^{1} significa un resto alquilo, alcoxi, arilo o heteroarilo monovalente sustituido o no sustituido con 15 átomos C como máximo;
- azol de la fórmula general (2) o (3):
6
así como sus ésteres, éteres o sales,
donde X e Y son iguales o diferentes y significan CR^{4} o N y R^{4} significa -H, -COOH, -OH, -NH_{2}, -NO_{2}^{-}, -SH, -SO_{3}^{-}, -F, -Cl, -Br, -I, C_{1}-C_{5}-alquilcarbonilo- o R^{1}, y R^{1} tiene el significado mencionado para la fórmula (1) y
donde R^{2} y R^{3} son iguales o diferentes y significan R^{4} o donde C^{1} y C^{2} en la fórmula (3) en lugar de los sustituyentes R^{2} y R^{3} están unidos por medio de un puente [-CR^{5}R^{6}-]_{a}, siendo a igual a 1, 2, 3 ó 4 para formar un anillo, donde
R^{5} y R^{6} son iguales o diferentes y significan R^{4} y uno o más grupos [-CR^{5}R^{6}-] no contiguos pueden estar sustituidos por oxígeno, azufre o un resto imino sustituido opcionalmente con C_{1}-C_{5}-alquilo, y
dos grupos [-CR^{5}R^{6}-] contiguos pueden estar sustituidos por un grupo [-CR^{5}=CR^{6}-] o por un grupo [-CR^{5}=N-];
- isoxazolinona de la fórmula general (4) o (5):
7
así como sus ésteres, éteres o sales,
donde X, R^{1}, R^{2} y R^{3} tienen el significado ya mencionado y donde C^{1} y C^{2} en la fórmula (5) en lugar de los sustituyentes R^{2} y R^{3} pueden estar unidos por medio de un puente definido como para la fórmula (3) para formar un anillo.
5. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se emplea en el proceso correspondiente a la invención una cepa de microorganismo seleccionada del grupo de las cepas siguientes: cepas con alelos cysE modificados; cepas que contienen el gen Efflux; cepas con una actividad CysB modificada; cepas que se obtienen con empleo de métodos de mutagénesis inespecíficos combinados con métodos de escrutinio para superproducción de cisteína o degradación disminuida de la cisteína.
6. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como cepa de microorganismo se emplea una cepa de Escherichia coli.
7. Proceso según las reivindicaciones 1, 5 ó 6, caracterizado porque el cultivo de la cepa de microorganismo en el fermentador se realiza como cultivo continuo, como cultivo por lotes o como cultivo "fed-batch".
8. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se dosifican continuamente una fuente de C y un compuesto nucleófilo durante la fermentación.
9. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la dosificación del compuesto nucleófilo se inicia 6-ocho horas después del comienzo de la fermentación y dura hasta el final de la fermentación.
10. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cantidad de compuesto nucleófilo añadido oscila en el intervalo de 10 a 1000 mmol por litro de volumen inicial del medio de fermentación.
11. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque como fuente de C se emplean azúcares, alcoholes-azúcar o ácidos orgánicos.
12. Proceso según la reivindicación 11, caracterizado porque la dosificación de la fuente de C se realiza en una forma que asegura que el contenido de glucosa en el fermentador se mantiene en un intervalo de 0,1-50 g/l.
13. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque como fuente de N se emplean amoniaco, sales de amonio o hidrolizados de proteínas.
14. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el valor de pH del medio de fermentación se mantiene en el intervalo de 4-10 y la temperatura de incubación es 15-45°C.
15. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se conduce en condiciones de crecimiento aerobias.
16. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el L-aminoácido no proteinógeno, después de la separación de la biomasa de la mezcla de reacción de fermentación por filtración o centrifugación, se aísla del sobrenadante de cultivo por extracción, adsorción, cromatografía de intercambio iónico, precipitación o cristalización.
17. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque, en cuanto al L-aminoácido no proteinógeno se trata de un aminoácido de la formula general (6) en configuración L:
(6)H_{2}N --- 
\melm{\delm{\para}{\delm{CH _{2} }{\delm{\para}{Z}}}}{C}{\uelm{\para}{COOH}}
--- H
donde Z es un resto monovalente seleccionado de las fórmulas (7) a (13)
8
así como sus ésteres, éteres o sales,
y R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, X e Y tienen el significado ya mencionado para las fórmulas (1) a (5).
18. Compuesto seleccionado del grupo 1,2,3,4-tetrazol-1-il-L-alanina (14), 1,2,3,4-tetrazol-2-il-L-alanina (15), 1,2,3-triazol-1-il-L-alanina (16) y 1,2,3-triazol-2-íl-L-alanina (17) con inclusión de sus ésteres, éteres o sales,
9 
\vskip1.000000\baselineskip
10
donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, y R^{4} tienen el significado ya mencionado en la reivindicación 4.
19. Derivado de S-heteroaril-L-cisteína de la fórmula
H_{2}N --- 
\melm{\delm{\para}{\delm{CH _{2} }{\delm{\para}{\delm{S}{\delm{\para}{R ^{7} }}}}}}{C}{\uelm{\para}{COOH}}
--- H
donde R^{7} tiene el significado siguiente: resto pirrolilo, pirazolilo, tetrazolilo, tiazolilo, oxazolilo, furanilo, piridinilo, pirazinilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo y purinilo.
ES01120750T 2000-09-21 2001-09-06 Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos no proteinogenos. Expired - Lifetime ES2220639T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10046934A DE10046934A1 (de) 2000-09-21 2000-09-21 Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
DE10046934 2000-09-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2220639T3 true ES2220639T3 (es) 2004-12-16

Family

ID=7657192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01120750T Expired - Lifetime ES2220639T3 (es) 2000-09-21 2001-09-06 Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos no proteinogenos.

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6756216B2 (es)
EP (1) EP1191106B1 (es)
JP (1) JP4240864B2 (es)
KR (1) KR100475985B1 (es)
CN (1) CN1250735C (es)
AT (1) ATE265541T1 (es)
AU (1) AU758402B2 (es)
BR (1) BR0104188A (es)
CA (1) CA2357469A1 (es)
DE (2) DE10046934A1 (es)
DK (1) DK1191106T3 (es)
ES (1) ES2220639T3 (es)
HU (1) HUP0103764A2 (es)
MX (1) MXPA01009508A (es)
PL (1) PL349759A1 (es)
RU (1) RU2226550C2 (es)
SK (1) SK286163B6 (es)
TW (1) TWI258507B (es)
ZA (1) ZA200107763B (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6579705B2 (en) * 2001-04-04 2003-06-17 Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids
WO2004041274A1 (en) * 2002-11-05 2004-05-21 Arena Pharmaceuticals, Inc. Benzotriazoles and methods of prophylaxis or treatment of metabolic-related disorders thereof
DE10331291A1 (de) * 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
CA2799154A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Abbvie Inc. Indazole inhibitors of kinase
US8889730B2 (en) 2012-04-10 2014-11-18 Pfizer Inc. Indole and indazole compounds that activate AMPK
CA2905242C (en) 2013-03-15 2016-11-29 Pfizer Inc. Indole compounds that activate ampk
CN103614428B (zh) * 2013-06-26 2017-08-04 山东鲁抗医药股份有限公司 一种发酵生产l‑色氨酸的方法
DE102013219016A1 (de) 2013-09-20 2015-03-26 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids
US10773049B2 (en) 2016-06-21 2020-09-15 Ventec Life Systems, Inc. Cough-assist systems with humidifier bypass
WO2023094010A1 (de) 2021-11-29 2023-06-01 Wacker Chemie Ag Verfahren zur herstellung von taurin
WO2023094011A1 (de) 2021-11-29 2023-06-01 Wacker Chemie Ag Verfahren zur herstellung von l-cysteinsäure

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE23331T1 (de) * 1979-11-30 1986-11-15 Fujisawa Pharmaceutical Co 5-thio-tetrazolverbindungen und ihre herstellung.
US4420477A (en) * 1979-11-30 1983-12-13 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Cephem compounds
DE3070258D1 (en) * 1979-11-30 1985-04-11 Fujisawa Pharmaceutical Co Cephem compounds, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JPS57120421A (en) * 1981-01-16 1982-07-27 Tokai Kasei Kogyo Kk Manufacture of foamed product lined with core material
CA1292200C (en) * 1987-04-24 1991-11-19 Tatsuo Miyazawa Method for producing protein containing nonprotein amino acids
KR0130196B1 (ko) * 1990-02-15 1998-04-03 도바 다다스 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 발효법
US5646167A (en) * 1993-01-06 1997-07-08 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamix acids
DE19539952A1 (de) * 1995-10-26 1997-04-30 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten
US5728555A (en) * 1996-09-30 1998-03-17 Monsanto Company Preparation of d-amino acids by direct fermentative means
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
DE19726083A1 (de) 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
JP3966583B2 (ja) * 1997-06-23 2007-08-29 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JPH11106398A (ja) * 1997-10-01 1999-04-20 Morinaga Milk Ind Co Ltd ペプチド誘導体および抗真菌剤
US6191168B1 (en) * 1998-06-02 2001-02-20 Edward Rubenstein Methods for the use of nonprotein amino acids as therapeutic agents
DE19849625A1 (de) * 1998-10-28 2000-05-04 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren
DE19949579C1 (de) * 1999-10-14 2000-11-16 Consortium Elektrochem Ind Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten

Also Published As

Publication number Publication date
EP1191106A1 (de) 2002-03-27
PL349759A1 (en) 2002-03-25
US6756216B2 (en) 2004-06-29
US20020039767A1 (en) 2002-04-04
KR100475985B1 (ko) 2005-03-10
SK13482001A3 (sk) 2002-04-04
AU758402B2 (en) 2003-03-20
US6939967B2 (en) 2005-09-06
SK286163B6 (sk) 2008-04-07
JP2002165598A (ja) 2002-06-11
MXPA01009508A (es) 2003-05-19
ATE265541T1 (de) 2004-05-15
EP1191106B1 (de) 2004-04-28
TWI258507B (en) 2006-07-21
US20050222426A1 (en) 2005-10-06
DE50102109D1 (de) 2004-06-03
BR0104188A (pt) 2002-05-07
CA2357469A1 (en) 2002-03-21
CN1344801A (zh) 2002-04-17
DE10046934A1 (de) 2002-04-18
JP4240864B2 (ja) 2009-03-18
DK1191106T3 (da) 2004-08-16
CN1250735C (zh) 2006-04-12
KR20020023130A (ko) 2002-03-28
US7015331B2 (en) 2006-03-21
RU2226550C2 (ru) 2004-04-10
AU7556201A (en) 2002-03-28
HUP0103764A2 (en) 2006-01-30
US20040197879A1 (en) 2004-10-07
ZA200107763B (en) 2002-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7015331B2 (en) Non-proteinogenic L-amino acids
JP4173777B2 (ja) 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法
JP2006325607A (ja) 非タンパク質ｌ−アミノ酸の製造方法
ES2268504T3 (es) Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-metionina.
US9074230B2 (en) Method for producing L-cystine by fermentation under controlled oxygen saturation
KR20140007504A (ko) 발효에 의한 천연 ｌ-시스테인의 생성 방법
ES2222407T3 (es) Proceso para la produccion de o-acetil-l-serina por fermentacion.
JP6744997B2 (ja) Ｏ−ホスホセリンを生産するエシェリキア属微生物及びこれを用いたｏ−ホスホセリンまたはｌ−システインを生産する方法
JP2015528301A (ja) Ｌ−システインおよび該アミノ酸の誘導体の発酵生産方法
DE10116881A1 (de) Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
DE10121515A1 (de) Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren